專利名稱：改進(jìn)的色譜介質(zhì)的制備方法以及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過自由基聚合來制備具有共價鍵合的聚合物配體鏈的單分散大孔聚合介質(zhì)的改進(jìn)方法。所述介質(zhì)可以用于色譜純化，獲得具有改進(jìn)的蛋白質(zhì)結(jié)合容量、 動力學(xué)性質(zhì)和選擇性的聚合物載體，本發(fā)明還涉及所述介質(zhì)的制備和使用方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代衛(wèi)生保健當(dāng)中，由活性有機(jī)體制得的治療用蛋白質(zhì)的重要性在日益提高。 這些蛋白質(zhì)提供了很多優(yōu)于常規(guī)藥物的優(yōu)點，包括對目標(biāo)疾病的專一性和功效的提高。哺乳動物的免疫系統(tǒng)使用很多蛋白質(zhì)來控制和消除疾病威脅。隨著基因和蛋白質(zhì)工程學(xué)的發(fā)展，人們能夠開發(fā)出許多“設(shè)計的”或者重組蛋白質(zhì)療法。這些療法可能基于單獨的蛋白質(zhì)、 化學(xué)改性的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或蛋白質(zhì)結(jié)合體。在這些生物藥物的生產(chǎn)中，人們廣泛地采用色譜分離。隨著工業(yè)日趨成熟，如果能夠采用新穎的/先進(jìn)的技術(shù)和方法來提高分離效果，將使得生物藥物制造商能夠?qū)⑦@些藥物以更低的價格提供給更多的病人。用來純化蛋白質(zhì)的常用色譜法包括親和色譜法、生物親和色譜法、離子交換色譜法、反相色譜法、疏水性相互作用色譜法、親水性相互作用色譜法、尺寸排阻色譜法和混合模式色譜法(包括樹脂的上述種類的組合)等。這些種類的色譜的應(yīng)用和效率取決于溶質(zhì)分子與色譜系統(tǒng)的固定相(色譜介質(zhì))之間的表面-表面相互作用的選擇性，所述溶質(zhì)分子和固定相各自都與液體流動相發(fā)生相互作用。很多種固定相色譜載體材料可以在市場上購得。將產(chǎn)品與雜質(zhì)成功分離的關(guān)鍵通常在于以下對象的正確組合固定相、基礎(chǔ)基質(zhì) (化學(xué)組成和孔結(jié)構(gòu))和配體性質(zhì)(配體種類、配體密度、孔結(jié)構(gòu)、配體分布、配體長度和材料組成)，以及流動相或者溶液性質(zhì)(緩沖劑種類、PH和電導(dǎo)性)。基礎(chǔ)基質(zhì)和配體的具體設(shè)計得到了色譜介質(zhì)，色譜介質(zhì)的特征包括一些關(guān)鍵屬性，包括蛋白質(zhì)結(jié)合容量、處理通量、選擇性、床滲透性和化學(xué)穩(wěn)定性。純化方法包括主要結(jié)合產(chǎn)品(結(jié)合和洗脫)、主要結(jié)合雜質(zhì)(流過)以及上述情況的組合(所謂的弱分配等)。在設(shè)計這些技術(shù)的時候，最關(guān)鍵的一點是控制上述色譜介質(zhì)的性質(zhì)，以便能夠進(jìn)行和確?？煽康姆蛛x，以得到純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)品?？梢栽诤芏喾N聚合物載體或基礎(chǔ)基質(zhì)上進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。用于樹脂或珠粒結(jié)構(gòu)的常用材料包括多糖(瓊脂糖、纖維素)、合成聚合物(聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基醚和聚丙烯酰胺)以及陶瓷材料，例如二氧化硅、氧化鋯和孔受控的玻璃。這些材料主要通過孔徑通常約為200- 3000A的“擴(kuò)散孔”吸附蛋白質(zhì)。薄膜和整體料也常用于色譜，特別是用于流通應(yīng)用。常規(guī)的薄膜組合物包括合成聚合物，例如聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚醚砜，、尼龍和多糖，例如纖維素。人們已經(jīng)由以下材料開發(fā)出了整體料聚苯乙烯、多糖、聚甲基丙烯酸酯和其他合成聚合物、多糖和陶瓷。薄膜和整體型色譜與珠粒的區(qū)別在于，前者將蛋白質(zhì)吸附在相同的“對流孔”中，所述對流孔控制薄膜和整體料的滲透性。常規(guī)的薄膜和整體型對流孔的孔徑約為0.6-10微米?？梢酝ㄟ^各種開發(fā)成熟的技術(shù)向這些基材添加配體。通過使用聚合配體“觸手(tentacle) ”或“延伸劑(extender) ”改進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)合容量和改進(jìn)樹脂選擇性的做法包括例如通過接枝將聚合配體偶聯(lián)在基礎(chǔ)基質(zhì)上，所述配體從基礎(chǔ)基質(zhì)的表面延伸出來。聚合配體延伸劑通常能夠產(chǎn)生更大的結(jié)合容量和動力學(xué)性質(zhì)，這是因為目標(biāo)分子結(jié)合到聚合配體上的現(xiàn)象超過了蛋白質(zhì)在聚合物載體表面上的單層吸附，因此延伸劑增大了配體可達(dá)性。人們已經(jīng)開發(fā)出了兩種用來接枝聚合物延伸劑的標(biāo)準(zhǔn)方法，以便在聚合物載體上形成表面延伸劑，所述聚合物載體是例如用于分離蛋白質(zhì)等的色譜中的那些，這兩種方法是1)通過表面基團(tuán)接枝單體于載體(“接枝單體于”)，2)通過活性基團(tuán)將預(yù)先形成的聚合物接枝到載體(“接枝聚合物到”)。采用自由基聚合反應(yīng)對來自聚合材料的單體進(jìn)行接枝是一種開發(fā)成熟的技術(shù)。一般來說，所述反應(yīng)可以由聚合表面材料引發(fā)，或者由溶液中的引發(fā)劑引發(fā)?？梢酝ㄟ^暴露于活性環(huán)境，例如溫度、輻射、金屬氧化或通過吸附的引發(fā)性物質(zhì)的引發(fā)作用，在表面產(chǎn)生自由基，從而實現(xiàn)從表面引發(fā)自由基聚合。但是，這些“接枝單體于” 的方法需要特別的設(shè)備嚴(yán)格控制溶液條件和/或需要以一定的方式對載體進(jìn)行預(yù)先活化， 例如用可聚合的連接劑、引發(fā)物質(zhì)或特定的官能團(tuán)進(jìn)行預(yù)處理，因而使這種方法的實施變得復(fù)雜而耗時。US5453186揭示了由多孔材料接枝聚合物的方法。本領(lǐng)域揭示了一種將聚合物配體接枝在包括雙羥基官能團(tuán)的聚合物載體上的方法?，F(xiàn)有技術(shù)揭示的方法通過使用氧化還原聚合反應(yīng)來控制鏈長度，在包括羥基的載體上接枝。Ce(IV)氧化還原法在惰性氣氛下使用鈰(IV)鹽對來自聚合物載體表面的聚合配體進(jìn)行接枝。通過控制單體的含量以及加入混合物的鈰鹽濃度來控制聚合物配體鏈長度。盡管現(xiàn)有技術(shù)揭示了自聚合材料接枝聚合物的方法，但是該方法需要用特定的官能團(tuán)對聚合物載體進(jìn)行預(yù)處理。人們需要一種具有以下特點的方法，該方法可以從工藝中省去此額外的預(yù)處理步驟，同時能夠保持所得到的總體聚合色譜材料的性能。將聚合配體添加到聚合載體材料表面，提供了改進(jìn)的蛋白質(zhì)結(jié)合容量、蛋白質(zhì)結(jié)合動力學(xué)性質(zhì)，以及蛋白質(zhì)選擇性的潛在的變化。但是，隨著蛋白質(zhì)分離的要求變得更高， 人們更迫切需要開發(fā)出新的技術(shù)和方法，以制造新穎的聚合結(jié)構(gòu)。因此，人們需要開發(fā)出具有改進(jìn)的蛋白質(zhì)結(jié)合性質(zhì)和蛋白質(zhì)選擇性的更寬范圍的聚合載體基材，用于蛋白質(zhì)分離?；谝陨纤龅膶梢杂糜诘鞍踪|(zhì)分離、具有改進(jìn)的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和樹脂選擇性的新的聚合基材的需求，我們開發(fā)出了一種用來將聚合配體接枝在聚合載體基材上的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于色譜的吸附劑材料，其包括固定在聚合載體上的聚合配體，其中所述聚合載體包括合適的自由基接枝位點，另外，所述聚合配體通過一個或多個共價鍵連接于所述聚合載體的合適的自由基接枝位點。
在本發(fā)明的第二個方面，提供了一種制備用于色譜的吸附劑材料的方法，該方法包括(i)提供聚合載體，所述聚合載體包括合適的自由基接枝位點；(ii)通過官能單體的聚合產(chǎn)生聚合配體；以及(iii)引發(fā)所述聚合載體與所述聚合配體之間的反應(yīng)；其中，所述聚合配體與所述聚合載體上的合適的自由基接枝位點反應(yīng)。在本發(fā)明的第三個方面，提供了一種從混合物分離化合物的方法，該方法包括⑴提供混合物；以及(ii)使所述混合物與用于色譜的吸附劑材料接觸，所述吸附劑包括固定在聚合載體上的聚合配體，其中，所述聚合載體包括合適的自由基接枝位點，另外，所述聚合配體通過一個或多個共價鍵連接于所述聚合物載體的合適的自由基接枝位點。
具體實施例方式在本文中，所有的范圍都包都其所有的子范圍。例如，范圍"1-10"包括最小值1 和最大值10之間(包括端值)的任意和全部的子范圍，也即是說，在等于或大于最小值(1) 和等于或小于最大值(10)之間的任意、全部的子范圍，例如5. 5-10。如本文中所用，單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代形式，除非文中另有明確說明。在本文中，術(shù)語“聚合物配體”和“聚合配體”是同義詞，術(shù)語“聚合載體”和“聚合物載體”也是同義詞。在本文中，術(shù)語“優(yōu)選”、“更優(yōu)選”和“最優(yōu)選”不是為了指出一定更佳的形式，而
是表示較寬的范圍或組之內(nèi)合適的更窄的范圍。與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，本發(fā)明不需要對聚合載體進(jìn)行預(yù)處理或向聚合載體添加可聚合的連接劑。通過官能單體和/或鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑聚合反應(yīng)產(chǎn)生的聚合配體將與聚合載體和/或聚合載體主鏈上的合適的自由基接枝位點反應(yīng)，形成共價連接。引發(fā)劑將引發(fā)單體在溶液中的聚合反應(yīng)，在聚合載體的合適的自由基接枝位點處接枝在表面上。本發(fā)明的聚合載體包括任意具有合適表面的聚合材料，所述合適表面用來接枝具有自由基部分的聚合配體。盡管本發(fā)明不需要可聚合的連接劑，但是本發(fā)明的體系也可以包含可聚合的連接基，只要不會帶來任何破壞作用。本發(fā)明的聚合載體可以通過懸浮聚合、 乳液聚合或分散聚合或其組合來制備。所述聚合載體材料可以是顆粒材料，或者為小塊、片材、管狀、棒狀或毛細(xì)涂層的形式。較佳的是，所述載體材料是顆粒材料，其體均粒度優(yōu)選約為0. 5-1500微米，優(yōu)選約為 0. 7-800微米，最優(yōu)選約為10-150微米。所述顆粒優(yōu)選基本為球形。所述顆粒材料優(yōu)選包括孔。所述顆粒載體材料的孔徑、孔體積和比表面積可以根據(jù)使用的載體材料的種類、用來連接在載體上的聚合物的特性以及使用時所需的分離特性變化。顆粒狀微粒的孔徑可以約為 20-4000 A,優(yōu)選約為200-4000 A，最優(yōu)選約為300-1500 A?？左w積適合約為0. 1-4毫升 /克，優(yōu)選約為0. 3-2毫升/克，最優(yōu)選約為0. 5-1. 5毫升/克。比表面積優(yōu)選約為1-1000米7克，優(yōu)選約為25-700米7克，最優(yōu)選約為50-500米7克?？梢杂糜诒景l(fā)明的其他“聚合載體”或“基礎(chǔ)基質(zhì)”包括但不限于任何具有擴(kuò)散孔的材料?？梢杂糜诒景l(fā)明的用于聚合物載體或基礎(chǔ)基質(zhì)的優(yōu)選材料包括多糖、合成聚合物、 瓊脂糖、纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯基醚以及上述材料的雜合物或其組合。本發(fā)明的聚合載體具有合適的自由基接枝位點，這些自由基接枝位點允許聚合配體通過共價鍵鍵合。自由基聚合配體接枝反應(yīng)過程中的溫度適合約為0-100°C，優(yōu)選15-50°C，或者為 50-90°C。所述反應(yīng)混合物適合保持在空氣氣氛中，但是可以在惰性氣氛下進(jìn)行。在一些實施方式中，所述聚合配體可以包含官能團(tuán)?？梢杂糜诒景l(fā)明的“官能團(tuán)” 的例子包括但不限于離子交換基團(tuán)、生物親和性基團(tuán)、疏水性基團(tuán)、親硫性相互作用基團(tuán)、 螯合或螯合性基團(tuán)、與目標(biāo)化合物具有所謂的η-η相互作用的基團(tuán)、氫鍵基團(tuán)、親水性基團(tuán)，以及能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為另外的官能團(tuán)的非官能單體或中間單體(例如，甲基丙烯酸縮水甘油酯，其可以轉(zhuǎn)化為離子交換配體)，以及它們的混合物?？梢杂糜诒景l(fā)明的“聚合配體”的例子包括但不限于包含以下基團(tuán)的聚合物離子交換基團(tuán)、疏水性相互作用基團(tuán)、親水性相互作用基團(tuán)、親硫性相互作用基團(tuán)、金屬親和性基團(tuán)、親和性基團(tuán)、生物親和性基團(tuán)、混合形式的基團(tuán)，還包括能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他官能團(tuán)的非官能聚合物或中間聚合物(例如聚甲基丙烯酸縮水甘油酯，其能夠轉(zhuǎn)化為離子交換聚合配體)，以及它們的混合物。可以用于本發(fā)明的一些優(yōu)選的配體包括但不限于包含以下基團(tuán)的聚合物強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)，例如磺丙基、磺酸；強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)，例如氯化三甲基銨；弱陽離子交換基團(tuán)，例如羧酸；弱陰離子交換基團(tuán)，例如N，N- 二乙基氨基乙基。在此化學(xué)領(lǐng)域的一些實施方式中，在制備聚合配體的過程中向反應(yīng)介質(zhì)中加入鏈轉(zhuǎn)移劑可能是有益的。合適的鏈轉(zhuǎn)移劑包括例如鹵代甲烷、二硫化物、硫醇和金屬絡(luò)合物。 其他合適的鏈轉(zhuǎn)移劑包括各種包含至少一個容易被抽提的氫原子的其它化合物，以及它們的混合物。鏈轉(zhuǎn)移劑可以一次或多次加入，或者以線性或非線性的形式連續(xù)加入，可以在大部分或整個反應(yīng)期間加入，或者在反應(yīng)期間的有限的部分加入。向反應(yīng)中加入鏈轉(zhuǎn)移劑的量可以為0. 01% -15%，更優(yōu)選為0. 1% _3%，最優(yōu)選約為0. -1%。可以用于本發(fā)明的“自由基引發(fā)劑”的例子包括但不限于能夠與乙烯基單體反應(yīng)而形成聚合配體的任意自由基引發(fā)劑，例如過氧化物，如氫過氧化叔丁基、氫過氧化枯烯； 過乙酸化物，例如過乙酸、氯過苯甲酸；過硫酸鹽，例如過硫酸銨、過硫酸鈉、過二硫酸鉀； 偶氮引發(fā)劑，例如4，4’ -偶氮二(4-氰基戊酸)、Irgacure ^59[紐約州霍桑市汽巴-嘉吉公司(Ciki-Geigy，Hawthorn，N. Y.)]、鹽酸2，2'-偶氮二(2-脒基-丙烷)，等等，以及它們的混合物。所述接枝反應(yīng)可以通過本領(lǐng)域已知的方法引發(fā)，優(yōu)選采用熱引發(fā)(加熱) 或紫外輻射。所述自由基引發(fā)劑可以是水溶性或油溶性的。將引發(fā)劑以0.01%-5%、更優(yōu)選0. -2%的量加入反應(yīng)中?？梢杂脕碇苽浔景l(fā)明的聚合配體的“官能單體”或“接枝單體混合物”的例子包括但不限于甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺和丙烯酰胺。所述官能單體包括但不限于丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、氯化-[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]三甲基銨、2-丙烯酰氨-乙醇酸、衣康酸或乙基乙烯基酮、甲基丙烯酸縮水甘油酯、N, N- 二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥丙酯、N-苯基丙烯酰胺、羥乙基丙烯酰胺，以及它們的組合O在本文所述的接枝方法中，當(dāng)在溶液中引發(fā)聚合物配體的聚合的時候，對條件的限制要比從聚合物載體表面生長聚合配體的條件限制寬松?？梢詫⒔宦?lián)劑、支化劑和非官能單體連接于聚合配體，用來控制聚合配體的形貌或相互作用。但是，這些交聯(lián)劑或支化劑在聚合配體上的量很低，適合< 5%，更優(yōu)選 < 1 %。合適的交聯(lián)劑或支化劑包括但不限于單體，例如二甲基丙烯酸乙二酯、二乙烯基苯、 丙基三甲基丙烯酸三甲酯和亞甲基二丙烯酸酯，或者多官能鏈轉(zhuǎn)移劑。本發(fā)明還包括在色譜分離法中將吸附劑材料用于色譜。這些色譜分離法可以是例如低壓液相色譜、中壓液相色譜、HPLC、超臨界流體色譜(SFC)和模擬移動床(SMB)。本發(fā)明還包括一種從混合物分離化合物的方法，該方法包括使所述混合物與本發(fā)明的用于色譜的吸附材料接觸。本發(fā)明的主要優(yōu)點是利用配體接枝形成高容量離子交換樹脂，該樹脂用于分子 (更具體來說是生物分子)的色譜俘獲和/或純化。測試方法攝取結(jié)合容量的測定溶液1 (50mM Tris/HCl, pH 8. 8)的制備將12. 1克三(羥甲基)氨基甲烷[購自費舍爾科學(xué)公司(Fisher Scientific)] 加入2升的容量瓶中。將0. OlN的HCl溶液(購自費舍爾科學(xué)公司)注入容量瓶至2升的刻度。給容量瓶蓋上蓋子，對其中的物料進(jìn)行振搖。將該溶液靜置5分鐘，再次檢查溶液的體積。再加HC1，將體積調(diào)節(jié)到2升的刻度。測得pH為8. 8士0.05。給溶液貼上標(biāo)簽，放入 4°C的冰箱保存。溶液2的制備2毫升/毫升的BSA[得自牛血清的白蛋白，購自希格瑪-艾爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)]溶液。在玻璃廣口瓶中稱取0. 806克BSA，將其加入403克溶液1中。輕輕混合該物料， 以使其溶解。將溶液靜置0. 5小時，以確保BSA完全溶解。BSA容量攝取程序?qū)?毫升去離子水緩慢地加入一個Bio-Rad Poly-Pr印色譜柱中，以免夾雜空氣。 標(biāo)記水的高度。將端塞從柱子取下。在通風(fēng)櫥中將所述柱子與總管相連。向所述柱子中加入更多的去離子水，對柱子施加輕微的真空，直至柱子底部保留1-2厘米的水以免夾雜空氣。將實施例7的漿狀溶液加入所述柱子中。始終在樹脂上方保持水頭。在柱子中測得1 毫升的樹脂。施加輕度真空，除去樹脂上方的溶液，僅在樹脂上方留下1-2厘米的溶液。當(dāng)樹脂水平位置落至低于1毫升標(biāo)記以下的時候，在施加額外的真空的條件下，加入更多的樹脂漿液。所述樹脂珠粒從來不接觸空氣。填充的1毫升樹脂用大約10毫升的去離子水淋洗，以代替漿狀溶液，將液體排出，直至水位在填充床上方1-2厘米處。然后用10毫升的實施例6的溶液1沖洗填充的1毫升樹脂。通過抽真空將溶液1從柱子中除去，將空氣抽過柱子1分鐘。將包含濕餅的一次性柱子從總管取下。用刮刀將從柱子中取出的濕餅轉(zhuǎn)移到8盎司的玻璃瓶中，加入200毫升溶液2 毫克/毫升BSA溶液)。將玻璃瓶中的樣品輕輕振搖18小時。18小時之后，將樣品從振蕩器取出，讓樹脂沉淀15分鐘。
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在培養(yǎng)18小時之后，測量過濾后的上清液BSA溶液在278納米處的紫外吸收結(jié)果，由此測定BSA結(jié)合容量。用裝有溶液1的比色皿對紫外分光光度計調(diào)零。測量所有的樣品、標(biāo)樣溶液和參比樣⑷kpharose 快速流動離子交換樹脂，購自GE健康護(hù)理公司(GE Healthcare)]在278納米處的吸光度。BSA結(jié)合容量的計算記錄樣品和參比樣未結(jié)合BSA條件下的值⑴Sepharose FF)。用以下公式來確定結(jié)合容量方程式1BSA容量=WOO-(樣品毫克/毫升X200)] Xl毫升=毫克BSA/毫升樹脂實施例實施例160微米GMA/GlyDMA多孔陰離子型交換劑的制備向裝有頂掛式攪拌器、冷凝器和溫度探針的250毫升的玻璃反應(yīng)器中加入50克單一尺寸的GMA/GlyDM/U60微米聚GMA-GlyDMA珠粒，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和甘油-1，3-二甲基丙烯酸酯(GlyDMA)，其通過美國專利申請第11/521668號的實施例25 “制備60微米的GMA/EGDMA聚合物樹脂”所述的方法制備]，共聚物濕餅(約25%固體)，向該反應(yīng)器中的所述濕餅添加18克75%的氯化(3-丙烯酰氨丙基)-三甲基銨(購自希格瑪-艾爾德里奇化學(xué)公司)。然后向反應(yīng)器中加入0.6克過硫酸銨[購自阿科有機(jī)-費舍爾科學(xué)公司(Acros organics-Fisher Scientif ic) ]、0. 6 克二鹽酸 2，2-偶氮二 (2-甲基丙脒)(購自希格瑪-艾爾德里奇化學(xué)公司)和68克去離子水。在攪拌條件下，反應(yīng)器在25°C的溫度下保持30分鐘。在空氣中，在45分鐘的時間內(nèi)將反應(yīng)器加熱至80°C。反應(yīng)器在空氣中，在80°C保持5小時，然后冷卻至50°C。使用60 毫升的加液漏斗，在1小時時間內(nèi)加入120毫升去離子水，在攪拌的條件下保持50°C的恒定溫度。使用500毫升的玻璃料布氏漏斗對反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，對聚合物溶液的珠粒進(jìn)行洗滌。使用1升去離子水。在樹脂上測量了牛血清白蛋白(BSA)的平衡結(jié)合容量。BSA容量為141毫克/毫升。實施例2使用N，N, N, N-四甲基乙二胺進(jìn)行60微米GMA/GlyDMA多孔陰離子型交換劑的制備在裝有頂掛式攪拌器、冷凝器和溫度探針的250毫升玻璃反應(yīng)器中加入50克單一尺寸的GMA/GlyMA共聚物濕餅(約25%的固體)，向該反應(yīng)器中的該濕餅加入30克75% 的氯化(3-丙烯酰氨丙基)三甲基銨(購自希格瑪-艾爾德里奇化學(xué)公司)。然后向反應(yīng)器中加入0. 6克過硫酸銨(購自阿科有機(jī)-費舍爾科學(xué)公司(Acros organics-Fisher Scientific) ),0.6克二鹽酸2，2-偶氮二甲基丙脒)(購自希格瑪-艾爾德里奇化學(xué)公司)、20微升的N，N, N, N-四甲基乙二胺(購自希格瑪-艾爾德里奇化學(xué)公司)和68克去離子水。在攪拌的同時，反應(yīng)器的溫度在25°C保持30分鐘，然后在空氣中，在45分鐘內(nèi)將反應(yīng)器加熱至80°C。反應(yīng)器在空氣中，在80°C保持5小時，然后冷卻至50°C。使用60毫升的加液漏斗，在1小時時間內(nèi)加入120毫升去離子水，在攪拌的條件下保持50°C的恒定溫度。使用500毫升的玻璃料布氏漏斗對反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，對珠粒進(jìn)行洗滌，使其不含聚合物溶液。使用1升去離子水洗滌珠粒。在樹脂上測量BSA(來自牛血清白蛋白，購自希格瑪-艾爾德里奇公司)批料的平衡結(jié)合容量。牛血清白蛋白BSA容量為188毫克/毫升。實施例3通過水解的共聚物制備60微米GMA/GlyDMA多孔陰離子型交換劑在裝有頂掛式攪拌器、冷凝器和溫度探針的250毫升玻璃反應(yīng)器中加入50克單一尺寸的GMA/GlyMA共聚物濕餅(約25%的固體)，向該反應(yīng)器加入150毫升IM的氫氧化鈉溶液(購自費舍爾科學(xué)公司)。該混合物在25°C攪拌48小時，反應(yīng)混合物用500毫升玻璃料布氏漏斗過濾，以洗滌珠粒，使其不含氫氧化鈉溶液。使用1升去離子水洗滌珠粒。然后，將30克所述濕濾餅材料放回250毫升的玻璃反應(yīng)器中，向反應(yīng)器加入18克 75%的氯化(3-丙烯酰氨丙基)三甲基銨(購自艾爾德里奇化學(xué)公司)。然后向反應(yīng)器中加入0. 36克過硫酸銨(購自阿科有機(jī)-費舍爾科學(xué)公司)、40. 5克去離子水。在攪拌條件下，反應(yīng)器在25°C的溫度下保持30分鐘。在空氣中，在45分鐘的時間內(nèi)將反應(yīng)器加熱至80°C。反應(yīng)器在空氣中，在80°C保持18小時，然后冷卻至50°C。使用60毫升的加液漏斗，在1小時時間內(nèi)加入120毫升去離子水，在攪拌的條件下保持50°C 的恒定溫度。使用500毫升的玻璃料布氏漏斗對反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，對珠粒進(jìn)行洗滌，使其不含聚合物溶液。使用1升去離子水。在樹脂上測量BSA(來自牛血清白蛋白，購自希格瑪-艾爾德里奇公司)批料的平衡結(jié)合容量。牛血清白蛋白BSA容量為101毫克/毫升。實施例460微米GMA/GlyDMA多孔弱堿性陰離子型交換劑的制備向裝有頂掛式攪拌器、冷凝器和溫度探針的250毫升玻璃反應(yīng)器中加入30克單一尺寸的GMA/GlyDMA共聚物濕餅(約25%的固體)。向反應(yīng)器中加入18克N-[3_( 二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(購自艾爾德里奇化學(xué)公司)、0. 36克過硫酸銨(購自阿科有機(jī)-費舍爾科學(xué)公司)和40. 5克去離子水。在室溫下將反應(yīng)器攪拌30分鐘，然后在45分鐘時間內(nèi)將反應(yīng)器加熱至80°C。反應(yīng)器在空氣中，在80°C保持22小時，然后將反應(yīng)器冷卻至50°C。在30分鐘的時間內(nèi)，在攪拌的條件下，通過漏斗加入60毫升去離子水，在恒定溫度下保持50°C。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫。然后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到600毫升的玻璃料布氏漏斗，過濾，直至珠粒不含聚合物溶液。用1升去離子水對珠粒洗滌1小時。BSA容量(牛血清白蛋白)為110毫克/毫升。實施例5使用鏈轉(zhuǎn)移試劑進(jìn)行60微米GMA/GlyDMA多孔陰離子型交換劑的制備在裝有頂掛式攪拌器、冷凝器和溫度探針的2000毫升玻璃反應(yīng)器中加入300克單一尺寸的GMA/GlyMA共聚物濕餅(約25%的固體)，向該反應(yīng)器中的該濕餅加入180克 75%的氯化(3-丙烯酰氨丙基)三甲基銨(購自希格瑪-艾爾德里奇化學(xué)公司)。然后向該反應(yīng)器中加入0. 9克過硫酸銨(阿科有機(jī)-費舍爾科學(xué)公司)、60毫克3-巰基丙酸丁酯 (希格瑪-艾爾德里奇公司)和405克去離子水。在攪拌條件下，反應(yīng)器在25°C的溫度下保持30分鐘。在空氣中，在45分鐘的時間內(nèi)將反應(yīng)器加熱至80°C。反應(yīng)器在空氣中，在80°C保持22小時，然后冷卻至50°C。使用600毫升的加液漏斗，在1小時時間內(nèi)加入500毫升去離子水，在攪拌的條件下保持50°C的恒定溫度。使用2000毫升的玻璃料布氏漏斗對反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，對珠粒進(jìn)行洗滌，使其不含聚合物溶液。使用10升去離子水。BSA(牛血清白蛋白，希格瑪艾爾德里奇公司)批料容量為171毫克/毫升。
權(quán)利要求
1.一種用于色譜法的吸附劑材料，其包含固定在聚合載體上的聚合配體，其中，所述聚合載體包含合適的自由基接枝位點，另外，所述聚合配體通過一個或多個共價鍵連接于所述聚合物載體的合適的自由基接枝位點。
2.如權(quán)利要求1所述的用于色譜法的吸附劑材料，其特征在于，所述聚合配體包含自由基物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的用于色譜法的吸附劑材料，其特征在于，所述聚合配體包含官能團(tuán)。
4.如權(quán)利要求1所述的用于色譜法的吸附劑材料，其特征在于，所述聚合配體包含離子交換基團(tuán)、疏水性相互作用基團(tuán)、親水性相互作用基團(tuán)、親硫性相互作用基團(tuán)、金屬親合性基團(tuán)、親合性基團(tuán)、生物親合性基團(tuán)、混合模式基團(tuán)，以及能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為另外的官能團(tuán)的非官能單體或中間單體，以及這些基團(tuán)的組合。
5.如以上權(quán)利要求中任一項所述的用于色譜法的吸附劑材料，其特征在于，所述聚合載體的體均粒度約為0. 5-500微米。
6.一種制備用于色譜法的吸附劑材料的方法，該方法包括(i)提供聚合載體，所述聚合載體包括合適的自由基接枝位點；( )通過官能單體的聚合產(chǎn)生聚合配體；以及(iii)引發(fā)所述聚合載體與所述聚合配體之間的反應(yīng)；其中，所述聚合配體與所述聚合載體上的合適的自由基接枝位點反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求6所述的制備用于色譜法的吸附劑材料的方法，其特征在于，加入自由基引發(fā)劑，以引發(fā)所述聚合載體和聚合配體之間的反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求7所述的制備用于色譜法的吸附劑材料的方法，其特征在于，所述自由基引發(fā)劑是過氧化物、過氧乙酸鹽、過硫酸鹽、偶氮引發(fā)劑或者它們的混合物。
9.如權(quán)利要求6所述的制備用于色譜法的吸附劑材料的方法，其特征在于，所述聚合載體的體均粒度約為0. 5-500微米。
10.如權(quán)利要求6所述的制備用于色譜法的吸附劑材料的方法，其特征在于，通過官能單體聚合產(chǎn)生聚合配體的操作是在存在鏈轉(zhuǎn)移劑的情況下進(jìn)行的。
11.一種從混合物分離化合物的方法，所述方法包括(i)提供混合物；以及(ii)使所述混合物與用于色譜法的吸附劑材料接觸，所述吸附劑材料包含固定在聚合載體上的聚合物配體，其中，所述聚合載體包括合適的自由基接枝位點，另外，所述聚合配體通過一個或多個共價鍵連接于所述聚合物載體的合適的自由基接枝位點。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過自由基聚合來制備具有共價鍵合的聚合物鏈的單分散大孔聚合介質(zhì)的改進(jìn)方法。所述介質(zhì)可以用于色譜純化，獲得具有改進(jìn)的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和樹脂選擇性的聚合物載體，本發(fā)明還涉及所述介質(zhì)的制備和使用方法。
文檔編號C07K1/18GK102343257SQ20111022243
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者J·J·邁克納, M·J·迪茲 申請人:羅門哈斯公司