專利名稱：由冷沉淀制備凝血因子Ⅷ、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液制品領(lǐng)域，特別涉及一種能從冷沉淀制備三種血液制品的工藝方法。
背景技術(shù)：
冷沉淀新鮮冰凍血漿低溫融化后析出的一種沉淀組分，富含凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白。血漿中約一半的凝血因子VDI和纖維蛋白原，以及絕大部分的纖維結(jié)合蛋白會富集在冷沉淀當中。凝血因子VDI是治療甲型血友病唯一的特效藥，在臨床上有巨大的應(yīng)用價值。纖維蛋白原是治療先天性和獲得性纖維蛋白原缺乏癥的首選藥物。纖維結(jié)合蛋白在治療皰疹性角膜潰瘍方面也有較高的臨床價值。目前世界上幾乎所有的血漿來源的凝血因子VDI都是從冷沉淀制備得到的；纖維蛋白原多數(shù)是由Cohn氏組分I制備得到的，也有少部分是由冷沉淀制備得到的；纖維結(jié)合蛋白在臨床上則直接由冷沉淀代替。關(guān)于冷沉淀制備凝血因子VDI或者纖維蛋白原的報道非常多，而且許多技術(shù)方案已經(jīng)在商業(yè)上得到實施。制備纖維結(jié)合蛋白的技術(shù)方案也非常多，多數(shù)為明膠親和層析。但是由于技術(shù)的局限性，還沒有任何一種技術(shù)方案可以由冷沉淀先后制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白三種血液制品。因為在目前已有的技術(shù)方案中，都著眼于一種制品的分離提取和純化，其他成分都作為雜蛋白被去除，很難再得到利用。在冷沉淀中，凝血因子VDI是一種微量蛋白，而纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白含量要相對豐富的多。因此如果兼顧纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的收率，那么凝血因子VDI的收率就會很容易受到影響，這也是目前沒有任何已報道的工藝可以同時純化這三種蛋白質(zhì)制品的原因之一。在現(xiàn)有的血液制品工藝當中，冷沉淀多用于凝血因子VDI的制備，因為凝血因子VDI 是一種更加珍貴、經(jīng)濟價值更高的蛋白質(zhì)。由于技術(shù)的限制，纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白都會被拋棄。在純化凝血因子VDI的過程中，要通過沉淀技術(shù)將含量相對高得多的纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白從溶液中析出，從而提高凝血因子VDI的純度。常用的沉淀技術(shù)有甘氨酸沉淀、PEG沉淀、乙醇沉淀、低pH沉淀等。甘氨酸沉淀法需要消耗大量的甘氨酸，成本較高，而且凝血因子VDI會共沉淀而導致收率降低；PEG沉淀法和乙醇沉淀法存在PEG殘留或者蛋白質(zhì)變性的問題；低PH法會導致纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白沉淀不完全，純化效果不好。例如發(fā)明專利(申請公布號101703763A)公開了一種制備纖維蛋白原的方法，利用冷沉淀經(jīng)過陰離子交換層析法和甘氨酸沉淀法制備纖維蛋白原，無法獲得凝血因子VDI和纖維結(jié)合蛋白；發(fā)明專利(專利號03115784. X)公開了一種制備纖維結(jié)合蛋白的方法，以冷沉淀為原料經(jīng)過酒精沉淀、PEG沉淀和陰離子交換層析，制得纖維結(jié)合蛋白，但是也無法獲得冷沉淀中富含的凝血因子VDI、纖維蛋白原。
血漿(特別是人血漿)或者血漿組分是非常寶貴和稀有的資源，只有盡可能的分離純化出有醫(yī)療價值的蛋白質(zhì)成分，才能提高血漿的有效利用率。這一類的制備技術(shù)顯然無法使冷沉淀中的各種有用成分得到充分的利用，實現(xiàn)冷沉淀中多種血漿蛋白的綜合開發(fā)和利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一套完整的分離純化工藝，能夠從冷沉淀中先后分別制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白，共三種血液制品。一種由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，制備步驟包括冷沉淀溶解、凝膠吸附、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白沉淀析出、兩步離子交換層析和甘氨酸/氯化鈉沉淀法，以及病毒滅活。一種由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，制備步驟包括冷沉淀用注射用水溶解后，在適當?shù)臈l件下用DEAE Sephadex A50凝膠進行吸附，吸附后的溶液調(diào)節(jié)至合適的PH、電導率和溫度，纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白形成沉淀析出，離心分離沉淀和上清液。上清液經(jīng)過S/D病毒滅活和離子交換層析純化得到凝血因子VIL沉淀再溶解后，經(jīng)過離子交換層析分為流穿液和洗脫液。流穿液經(jīng)過S/D病毒滅活和2次甘氨酸沉淀得到純化的纖維蛋白原；洗脫液經(jīng)過巴氏滅活得到纖維結(jié)合蛋白。一種由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，包括以下具體步驟
(1)冷沉淀用注射用水在15 35°C范圍內(nèi)攪拌溶解，用0.lmol/L的乙酸調(diào)節(jié)pH值為 6. 6 7.0，電導率小于4 mS/cm，加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝膠，攪拌吸附40 60分鐘，離心除去凝膠和未溶解的沉淀；
(2)步驟1中離心后的上清液再用0.lmol/L的乙酸調(diào)節(jié)pH值為6. 2飛.5，并降低溫度至12 18°C，纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白會形成沉淀，可以通過離心分離沉淀，而凝血因子 VDI則留在上清液當中；
(3)步驟2中離心后的上清液富含凝血因子通，經(jīng)過澄清過濾后，加入1%的聚山梨酸酯-80和0. 3%的磷酸三丁酯孵育6小時，可以有效滅活潛在的脂包膜病毒，如HBV 等；
(4)步驟3中經(jīng)過病毒滅活的溶液經(jīng)過弱陰離子交換層析，可以吸附其中的凝血因子通，大部分雜蛋白從層析柱上流穿，吸附后的層析柱經(jīng)過洗滌可以除去殘留的雜蛋白和聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用適當?shù)南疵撘嚎梢詮膶游鲋舷聪履蜃油ǎ?jīng)過濃縮、配制、除菌、分裝、凍干、100°C /30min干熱病毒滅活，即可得到凝血因子VDI制品；
(5)步驟2中離心所得的沉淀含纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白，用含氯化鈉、枸櫞酸鈉和鹽酸精氨酸的緩沖液溶解后，經(jīng)過澄清過濾，加入1%的聚山梨酸酯-80和0. 3%的磷酸三丁酯，孵育6小時，可以有效滅活潛在的脂包膜病毒，如HBV等；
(6)步驟5中經(jīng)過病毒滅活的溶液經(jīng)過弱陰離子交換層析，可以吸附其中的纖維結(jié)合蛋白，大部分纖維蛋白原則從層析柱上流穿，吸附后的層析柱經(jīng)過洗滌可以洗掉少量被吸附的纖維蛋白原和殘留的聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用適當?shù)南疵撘嚎梢詮膶游鲋舷聪吕w維結(jié)合蛋白，經(jīng)過6°C /IOh巴氏滅活后，再經(jīng)過濃縮、配制、除菌、分裝可以制成注射液或者滴眼液；
(7)步驟6中層析柱上的流穿液和洗滌液富含纖維蛋白原，向其中加入甘氨酸 (0. 5^1. 5mol/L)和氯化鈉(1. (Γ2. lmol/L)，纖維蛋白原形成沉淀，通過離心分離沉淀，將聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯留在上清液當中；
(8)將步驟7中所得的纖維蛋白原沉淀溶解后，再加入甘氨酸和氯化鈉，再次離心分離沉淀，進一步降低聚山梨酸酯-80和磷酸三丁酯的殘留量；
(9)步驟8中所得的纖維蛋白原沉淀溶解，經(jīng)過濃縮、配制、除菌、分裝、凍干、 IOO0C /30min干熱病毒滅活，即可得到纖維蛋白原制品。以上步驟中所述“離心”是血液制品行業(yè)中通用的固液分離技術(shù)，一般采用連續(xù)流離心機(管式離心機)，轉(zhuǎn)速為通常14000轉(zhuǎn)/分，進液速度通常為廣2. 5L/min。所述脂包膜病毒滅活，即通常所說的有機溶劑/去污劑法病毒滅活技術(shù)，有機溶劑一般采用磷酸三丁酯，去污劑一般采用聚山梨酸酯-80或者Triton X-100。在孵育6小時，對脂包膜病毒的滅活效果已經(jīng)得到有效驗證。所述“100°C /30min干熱病毒滅活”和“巴氏滅活”也是血液制品行業(yè)通用的病毒滅活技術(shù)，可以有效滅活多種脂包膜和非脂包膜病毒。所述“澄清過濾”是生物制藥行業(yè)熟知的深層過濾或膜過濾技術(shù)。所述“濃縮、配制、除菌、分裝、凍干” 都是制藥行業(yè)熟知的技術(shù)或者操作方法。步驟1中所述冷沉淀和注射用水的比例在1:2 1:5之間，以1:3最佳。所述比例是指質(zhì)量比。步驟1中所述DEAE Sephadex A50凝膠的添加量為每千克冷沉淀廣2g干膠。干膠需經(jīng)過溶脹和平衡后才能使用。溶脹方法參照DEAE Sephadex A50凝膠使用說明書。平衡方法為將含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、3(T80mmOl/L氯化鈉、pH為6. 6^7. 0的平衡液加入溶脹好的凝膠中，攪拌均勻并平衡1(Γ20分鐘，抽濾除去平衡液，再添加新的平衡液，反復平衡3 5次。步驟2中所述調(diào)節(jié)pH過程，加乙酸的速度為10(T300ml/min，使用噴霧的方式最佳。步驟3和步驟5中所述的澄清過濾，要求濾膜具有一定的過濾精度。一般要求 ^ 0. 5微米。步驟4中所述的弱陰離子交換層析可以采用Toyopeal DEAE-650M凝膠或者 DEAE-Sepharase Fast Flow凝膠。層析柱規(guī)模按照每升柱床體積廣3千克冷沉淀計算。 凝膠裝填入層析柱，需經(jīng)過平衡。平衡液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、5(T80mmOl/L氯化鈉、 80 120讓01/1甘氨酸，？!1為6.6 7.0。需平衡3飛個柱床體積。將步驟3中經(jīng)過滅活的溶液泵入平衡好的層析柱。然后依次用洗滌液和洗脫液沖洗層析柱。洗滌液含l(T30mmOl/L 枸櫞酸鈉、8(Tl50mmOl/L氯化鈉、8(Tl20mmOl/L甘氨酸，pH為6. 6^7. 0。洗滌至少3個柱床體積，直至波長^Onm的紫外吸收值恢復或者接近基線水平。洗脫液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、20(T250mmol/L氯化鈉、8(Tl20mmol/L甘氨酸，pH為6. 6 7. 0。根據(jù)波長^Onm的紫外吸收值收集洗脫峰，收獲純化的凝血因子VDI濃縮物。層析過程的線流速可參照所使用的凝膠的說明書，一般控制在10(Tl50Cm/h為宜。步驟5中所述的溶解液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、5(T80mmOl/L氯化鈉、 l(T30mmOl/L鹽酸精氨酸，ρΗ8. 0、. 5。溶解過程溫度以2(T35°C為宜。每公斤沉淀添加溶解液5 15公斤為宜。溶解后電導率控制在6. 0 9· 0 mS/cm, pH控制在7. 5 8. 0。
步驟6中所述的弱陰離子交換層析可以采用Toyopeal DEAE-650M凝膠或者 DEAE-Sepharase Fast Flow凝膠。層析柱規(guī)模按照每升柱床體積0. 8 2千克冷沉淀計算。 凝膠裝填入層析柱，需經(jīng)過平衡。平衡液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、5(T80mmOl/L氯化鈉、 10 30mmOl/L鹽酸精氨酸，pH為7. 5 8. 0，電導率控制在6. 0 9· 0 mS/cm。需平衡3 5個柱床體積。將步驟5中經(jīng)過滅活的溶液泵入平衡好的層析柱，收集流穿液。然后用平衡液沖洗層析柱(洗滌過程)。洗滌至少3個柱床體積，直至波長^Onm的紫外吸收值恢復或者接近基線水平。收集洗滌液，并與流穿液混合。洗脫液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、25(T350mmOl/ L氯化鈉pH為6. 5^7. 5。根據(jù)波長^Onm的紫外吸收值收集洗脫峰，收獲純化的纖維結(jié)合蛋白濃縮物。層析過程的線流速可參照所使用的凝膠的說明書，一般控制在10(Tl50Cm/h 為宜。步驟7和8中所述的甘氨酸和氯化鈉可以事先配制成高濃度的母液，然后泵入制品中，使甘氨酸和氯化鈉的最終濃度分別達到0. 5^1. 5mol/L和1. (Γ2. lmol/L,也可以直接向制品中加入粉末狀或者細顆粒狀的甘氨酸和氯化鈉，使其最終濃度分別達到 0. 5^1. 5mol/L 和 1. (Γ2. lmol/L 即可。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
1、可以按照先后順序分別從冷沉淀中分離提取凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白共3種有用的血液制品。大大提高了血漿的利用率。2、三種制品的生產(chǎn)可以利用相同的設(shè)備，如和纖維蛋白原的生產(chǎn)可以共用沉淀反應(yīng)罐和離心機；凝血因子VDI和纖維結(jié)合蛋白的生產(chǎn)可以共用層析柱(兩種制品使用相同的離子交換凝膠)。3、三種制品可以同時獲得較高的收率和純度。4、以DEAE Sephadex A50凝膠代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝中的氫氧化鋁凝膠來吸附冷沉淀中殘留的凝血因子11、訓、僅、乂具有以下優(yōu)點A50凝膠吸附凝血因子Ι1、νπ、 χ、χ的專一性優(yōu)于氫氧化鋁凝膠；Α50凝膠由專業(yè)的供應(yīng)商提供，質(zhì)量可控性好，批間差異小；氫氧化凝膠需要現(xiàn)場制備，而現(xiàn)場制備的凝膠相應(yīng)的濃度、純度等質(zhì)量可控性不高，而且容易隨制備原料混入鈣、鎂等金屬離子(凝血因子激活劑)。5、本發(fā)明人經(jīng)充分研究確認，各種凝血因子的吸附效果依賴于不同的吸附方法和吸附條件等因素的相互結(jié)合，才能達到本發(fā)明所需吸附效果，從而篩選確定了最佳工藝條件。6、本發(fā)明人經(jīng)充分研究確認，三種蛋白質(zhì)(特別是凝血因子VID高收率和純化效果依賴于沉淀方法，溫度、ΡΗ、電導率值的最佳組合，才可以保證三種蛋白質(zhì)(特別是凝血因子 W)具有較高的收率和純化效果，從而篩選確定了最佳工藝條件。7、本發(fā)明人經(jīng)充分研究確認，兩種蛋白質(zhì)的純化依賴于離子交換層析條件，電導率和PH值最佳組合，才能達到本發(fā)明所需效果，從而篩選確定了最佳工藝條件。
具體實施例方式實例1
第一步取冷沉淀10kg，加入30kg30°C的注射用水，攪拌溶解1小時。用噴霧的方式加入0. lmol/L的乙酸，加乙酸的速度為120ml/min，調(diào)節(jié)pH值為6. 9，調(diào)節(jié)電導率小于4 mS/ cm，用去乙酸約1. 4L。加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝膠，攪拌吸附40分鐘，采用連續(xù)流離心機(管式離心機)離心除去凝膠和少量未溶解的沉淀，收集上清液。在第一步之前應(yīng)作如下準備稱取DEAE Sephadex A50凝膠(干膠)20g。干膠置于燒杯中，加入80mmol/L氯化鈉溶液IL溶脹6小時。配制平衡液20mmol/L枸櫞酸鈉、 60!1111101/1氯化鈉、 !1為6.9。棄去燒杯中上層溶脹液，保留下層凝膠，再加入IL平衡液，攪拌均勻，并平衡1(Γ20分鐘，抽濾除去平衡液，再添加新的平衡液，反復平衡3飛次。第二步收集第一步中的上清液40.5kg。以200 ml/min的速度繼續(xù)噴霧加 0. lmol/L的乙酸約1.81^，調(diào)節(jié)？!1至6.2。加乙酸的同時用冰水浴降溫，調(diào)節(jié)溫度至16°C。 溫度和PH達到要求后離心分離沉淀(稱為酸沉淀)和上清液。第三步收集第二步所得上清液35kg，用Milligard 1. 2/0. 5 μ m濾芯過濾。向濾液中加入1%的聚山梨酸酯-80和0. 3%的磷酸三丁酯，混合均勻，24°C孵育6小時，滅活病毒。第四步用Toyopeal DEAE-650M凝膠裝填層析柱，柱床體積為5L(柱床高度10cm， 直徑25cm)。配制平衡液10mmol/L枸櫞酸鈉、80mmol/L氯化鈉、80mmol/L甘氨酸，pH為 6.8。需平衡5個柱床體積。將第三步中滅活后的溶液用蠕動泵泵入層析柱，流速為0.5L/ min.然后依次用洗滌液和洗脫液沖洗層析柱。洗滌液含lOmmol/L枸櫞酸鈉、150mmol/L氯化鈉、120mmol/L甘氨酸，pH為6. 8。洗滌至少3個柱床體積，直至波長^Onm的紫外吸收值恢復或者接近基線水平。洗脫液含10mmol/L枸櫞酸鈉、250mmol/L氯化鈉、120mmol/L甘氨酸，PH為6. 8。根據(jù)波長^Onm的紫外吸收值收集洗脫峰，收獲純化的凝血因子VDI濃縮物約 2. 3L，測定所含凝血因子VDI效價為48IU/ml，比活性為115IU/mg蛋白質(zhì)。經(jīng)過配制、除菌、分裝、凍干、100°C /30min干熱病毒滅活，得到凝血因子VDI制品440瓶(規(guī)格為200IU /IOml/ 瓶)。第五步配制45kg溶解液20mmol/L枸櫞酸鈉、50mmol/L氯化鈉、20mmol/L鹽酸精氨酸，PH8. 5。加入第二步中收集到的4. 95kg酸沉淀(“每公斤沉淀添加溶解液5 15公斤為宜)，3(T35°C攪拌溶解2小時。溶解后電導率為8.5 mS/cm，pH為8.0。溶解后的溶液用過濾精度<0. 5微米的Milligard 1. 2/0. 5 μ m濾芯(Milligard為miIipore公司的過濾產(chǎn)品)過濾。向濾液中加入1%的聚山梨酸酯-80和0. 3%的磷酸三丁酯，混合均勻，24°C孵育6小時，滅活病毒。第六步采用第四步中裝填好的層析柱，按照凝膠說明書再生處理后，采用新的平衡液重新平衡。平衡液20mmol/L枸櫞酸鈉、50mmol/L氯化鈉、20mmol/L鹽酸精氨酸，pH為 8.0，電導率8. 5 mS/cm。平衡5個柱床體積。將第五步中滅活后的溶液用蠕動泵泵入層析柱，流速為0.5L/min。收集流穿液。然后用平衡液沖洗層析柱(洗滌過程)。洗滌至少3個柱床體積。收集第一個柱床體積(約5L)的洗滌液，并與流穿液混合。洗脫液含20mmol/L 枸櫞酸鈉、300mmol/L氯化鈉pH為7. 0。根據(jù)波長^Onm的紫外吸收值收集洗脫峰，收獲純化的纖維結(jié)合蛋白濃縮物4. 1L，含纖維結(jié)合蛋白6. 5g/L，純度為85. 3%。經(jīng)過6°C /IOh巴氏滅活后，再經(jīng)過濃縮、配制、除菌、分裝可以制成注射液或者滴眼液。第七步第六步中收集的流穿液和洗滌液共Mkg，在攪拌的同時，向其中緩慢加入粉末狀的甘氨酸5. 4kg和氯化鈉7. 02kg,繼續(xù)攪拌30min。離心并收集沉淀，得到5. 2kgo
第八步再加入50kg注射用水，25°C攪拌1小時使沉淀完全溶解。在攪拌的同時， 向其中緩慢加入粉末狀的甘氨酸5. 5kg和氯化鈉7. ^cg，繼續(xù)攪拌30min。離心并收集沉淀， 得到4. 9kg。第九步沉淀用注射用水溶解后，經(jīng)過濃縮、配制、除菌、分裝、凍干、100°C /30min 干熱病毒滅活，得到纖維蛋白原制品5 瓶(規(guī)格為0.5g/25ml/瓶)。經(jīng)過檢測，纖維蛋白原純度為98. H在本實例中，IOkg冷沉淀制備得到的產(chǎn)品及其質(zhì)量標準統(tǒng)計如下表
權(quán)利要求
1.一種由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于制備步驟包括冷沉淀溶解、凝膠吸附、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白沉淀析出、兩步離子交換層析和甘氨酸/氯化鈉沉淀法，以及病毒滅活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于冷沉淀用注射用水溶解后，用DEAE Sephadex A50凝膠進行吸附，吸附后的溶液調(diào)節(jié)PH、電導率和溫度，纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白形成沉淀析出，離心分離沉淀和上清液；上清液經(jīng)過S/D病毒滅活和離子交換層析純化得到凝血因子VDI ；沉淀再溶解后，經(jīng)過離子交換層析分為流穿液和洗脫液；流穿液經(jīng)過S/D病毒滅活和2次甘氨酸沉淀得到純化的纖維蛋白原；洗脫液經(jīng)過巴氏滅活得到纖維結(jié)合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟(1)冷沉淀用注射用水在15 35°C范圍內(nèi)攪拌溶解，用0.lmol/L的乙酸調(diào)節(jié)pH值為 6. 6 7. 0，電導率小于4 mS/cm，加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝膠，攪拌吸附40 60分鐘，離心除去凝膠和未溶解的沉淀；(2)步驟1中離心后的上清液再用0.lmol/L的乙酸調(diào)節(jié)pH值為6. 2飛.5，并降低溫度至12 18°C，纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白會形成沉淀，可以通過離心分離沉淀，而凝血因子 VDI則留在上清液當中；(3)步驟2中離心后的上清液富含凝血因子通，經(jīng)過澄清過濾后，加入1%的聚山梨酸酯-80和0. 3%的磷酸三丁酯，24°C孵育6小時，可以有效滅活潛在的脂包膜病毒，如HBV 等；(4)步驟3中經(jīng)過病毒滅活的溶液經(jīng)過弱陰離子交換層析，可以吸附其中的凝血因子通，大部分雜蛋白從層析柱上流穿，吸附后的層析柱經(jīng)過洗滌可以除去殘留的雜蛋白和聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用洗脫液可以從層析柱上洗下凝血因子通，經(jīng)過濃縮、配制、除菌、分裝、凍干、100°C /30min干熱病毒滅活，即可得到凝血因子VDI制品；(5)步驟2中離心所得的沉淀含纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白，用含氯化鈉、枸櫞酸鈉和鹽酸精氨酸的緩沖液溶解后，經(jīng)過澄清過濾，加入1%的聚山梨酸酯-80和0. 3%的磷酸三丁酯，24°C孵育6小時，可以有效滅活潛在的脂包膜病毒，如HBV等；(6)步驟5中經(jīng)過病毒滅活的溶液經(jīng)過弱陰離子交換層析，可以吸附其中的纖維結(jié)合蛋白，大部分纖維蛋白原則從層析柱上流穿，吸附后的層析柱經(jīng)過洗滌可以洗掉少量被吸附的纖維蛋白原和殘留的聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用洗脫液可以從層析柱上洗下纖維結(jié)合蛋白，經(jīng)過6°C /IOh巴氏滅活后，再經(jīng)過濃縮、配制、除菌、分裝可以制成注射液或者滴眼液；(7)步驟6中層析柱上的流穿液和洗滌液富含纖維蛋白原，向其中加入甘氨酸和氯化鈉，纖維蛋白原形成沉淀，通過離心分離沉淀，將聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯留在上清液當中；(8)將步驟7中所得的纖維蛋白原沉淀溶解后，再加入甘氨酸和氯化鈉，再次離心分離沉淀，進一步降低聚山梨酸酯-80和磷酸三丁酯的殘留量；(9)步驟8中所得的纖維蛋白原沉淀溶解，經(jīng)過濃縮、配制、除菌、分裝、凍干、 IOO0C /30min干熱病毒滅活，即可得到纖維蛋白原制品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中所述冷沉淀和注射用水的比例在1:2 1:5之間，所述比例是指質(zhì)量比；步驟(1)中所述DEAE Sephadex A50凝膠的添加量為每千克冷沉淀廣2g干膠，干膠需經(jīng)過溶脹和平衡后才能使用，平衡方法為將含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、3(T80mmOl/L 氯化鈉、PH為6. 6^7. 0的平衡液加入溶脹好的凝膠中，攪拌均勻并平衡1(Γ20分鐘，抽濾除去平衡液，再添加新的平衡液，反復平衡3飛次。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中所述冷沉淀和注射用水的比例為1:3。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于步驟(2沖所述調(diào)節(jié)ρΗ過程，加乙酸的速度為10(T300ml/min，使用噴霧的方式最佳；步驟(3)和步驟(5)中所述的澄清過濾，要求濾膜的過濾精度< 0. 5微米。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于步驟(4)中所述的弱陰離子交換層析可以采用Toyopeal DEAE-650M凝膠或者DEAE-kpharase Fast Flow凝膠，層析柱規(guī)模按照每升柱床體積廣3千克冷沉淀計算，凝膠裝填入層析柱，需經(jīng)過平衡，平衡液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、5(T80mmOl/L氯化鈉、8(Tl20mmOl/L甘氨酸，ρΗ為6. 6 7. 0，需平衡3飛個柱床體積，將步驟3中經(jīng)過滅活的溶液泵入平衡好的層析柱，然后依次用洗滌液和洗脫液沖洗層析柱，洗滌液含l(T30mmOl/L 枸櫞酸鈉、8(Tl50mmOl/L氯化鈉、8(Tl20mmOl/L甘氨酸，ρΗ為6. 6^7. 0 ；洗滌至少3個柱床體積，直至波長^Onm的紫外吸收值恢復或者接近基線水平，洗脫液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、20(T250mmol/L氯化鈉、8(Tl20mmol/L甘氨酸，ρΗ為6. 6 7. 0，根據(jù)波長^Onm的紫外吸收值收集洗脫峰，收獲純化的凝血因子VDI濃縮物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于步驟(5)中所述的溶解液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、5(T80mmOl/L氯化鈉、 l(T30mmOl/L鹽酸精氨酸，ρΗ8. (Γ8. 5，溶解過程溫度以2(T35°C為宜，每公斤沉淀添加溶解液5 15公斤為宜，溶解后電導率控制在6. 0 9· 0 mS/cm, ρΗ控制在7. 5 8. 0。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于步驟(6)中所述的弱陰離子交換層析可以采用Toyopeal DEAE-650M凝膠或者DEAE-kpharase Fast Flow凝膠，層析柱規(guī)模按照每升柱床體積0. 8^2千克冷沉淀計算，凝膠裝填入層析柱，需經(jīng)過平衡，平衡液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、5(T80mmOl/L氯化鈉、l(T30mmOl/L鹽酸精氨酸，ρΗ為7. 5 8. 0，電導率控制在6. 0 9· 0 mS/cm,需平衡3 5個柱床體積，將步驟5中經(jīng)過滅活的溶液泵入平衡好的層析柱，收集流穿液，然后用平衡液沖洗層析柱(洗滌過程)，洗滌至少3個柱床體積，直至波長^Onm的紫外吸收值恢復或者接近基線水平，收集洗滌液，并與流穿液混合；洗脫液含l(T30mmOl/L枸櫞酸鈉、25(T350mmOl/L 氯化鈉PH為6. 5^7. 5，根據(jù)波長觀此！!!的紫外吸收值收集洗脫峰，收獲純化的纖維結(jié)合蛋白濃縮物。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的由冷沉淀制備凝血因子通、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法，其特征在于步驟(7)和(8)中所述的甘氨酸和氯化鈉可以事先配制成高濃度的母液，然后泵入制品中，使甘氨酸和氯化鈉的最終濃度分別達到0. 5^1. 5mol/L和 l.(T2. lmol/L，也可以直接向制品中加入粉末狀或者細顆粒狀的甘氨酸和氯化鈉，使其最終濃度分別達到0. 5^1. 5mol/L和1. (Γ2. Imol/L即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及血液制品領(lǐng)域，特別涉及一種能從冷沉淀制備三種血液制品的工藝方法。其目的在于提供一套完整的分離純化工藝，能夠從冷沉淀中先后分別制備凝血因子Ⅷ、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白，共三種血液制品。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)制備步驟包括冷沉淀溶解、凝膠吸附、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白沉淀析出、兩步離子交換層析和甘氨酸/氯化鈉沉淀法，以及病毒滅活。本發(fā)明有益效果可以按照先后順序分別從冷沉淀中分離提取凝血因子Ⅷ、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白共3種有用的血液制品。大大提高了血漿的利用率。
文檔編號C07K14/75GK102295696SQ20111023426
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者喬福鋒, 孫永張, 師秀梅, 席智贏, 張翠萍, 朱孟沼, 李斌, 菅長永, 謝忠兵, 邵玉娟, 鄭志華 申請人:山東泰邦生物制品有限公司