專利名稱：Itpka基因及其表達蛋白在制備及篩選抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ITPKA基因及其表達蛋白在制備及篩選抗癌藥物中的應(yīng)用，特別是 ITPKA基因及其表達蛋白在制備及篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是目前人類主要致死疾病之一，其致死率在各種疾病中排在前三位。全世界每年有數(shù)以千萬計的人死于腫瘤，給人類的健康、社會的發(fā)展造成了難以挽回的重大損失。 隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，在我國腫瘤發(fā)病率居高不下，目前有癌癥患者接近一千萬人，死亡率高達30%，并且新增患者數(shù)目急劇增加。腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者死亡的主要原因。因此有效地抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移對于提高腫瘤的治療效果和患者的存活率具有至關(guān)重要的作用。目前臨床治療腫瘤的主要方法如手術(shù)切除、放療和化療都不能有效地抑制腫瘤對臨近組織的侵襲和遠端轉(zhuǎn)移，并且放療和化療過程嚴重損害人體的正常細胞， 從而導致癌癥的死亡率居高不下，五年存活率僅不到30%。研究可以有效抑制腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的新方法，成為攻克腫瘤疾病，有效治療腫瘤的新途徑。隨著對于腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機制和原理研究的深入，利用生物醫(yī)學的方法治療腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移取得了顯著進展， 特別是針對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中重要分子的靶向治療方法成為最有研究潛力的熱門領(lǐng)域。發(fā)現(xiàn)重要的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移標志性靶分子，是有效實現(xiàn)靶向治療的重要前提。關(guān)于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的治療靶點已經(jīng)有相關(guān)報道，它們參與或調(diào)控了腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程， 并且針對靶點設(shè)計了新藥。但是目前應(yīng)用于抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物仍遠不能滿足臨床的需要，因此研制新型抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物具有十分重要的意義。目前沒有ITPKA蛋白在腫瘤治療靶標方面的研究報道。制備或篩選能夠有效抑制腫瘤臨近組織侵襲和遠距離轉(zhuǎn)移的藥物，關(guān)鍵是找到有效的靶向蛋白。在找到有效蛋白作為靶標的前提條件下，才能通過篩選的方法和策略獲得高度特異性結(jié)合靶蛋白的靶向藥物。此外，篩選出的靶向藥物的藥效是否理想也是直接取決于靶蛋白在生理過程中發(fā)揮的功能。因此，篩選治療腫瘤的藥物關(guān)鍵是找到有效蛋白作為靶標。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ITPKA基因及其表達蛋白在抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。術(shù)語解釋ITPKA蛋白人體內(nèi)表達的肌醇l，4，5-trisphosphate 3激酶A。表達蛋白=ITPKA基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后的蛋白因子，即ITPKA蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明基于發(fā)明人的以下的幾個方面的發(fā)現(xiàn)作為前提ITPKA基因是一個在神經(jīng)元和睪丸中特異性表達，在其他組織中不表達的微絲成束蛋白的基因片斷。但是在多種常見的癌癥如肺癌等發(fā)病初期，ITPKA蛋白發(fā)生急劇高水平異位表達并且是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程的重要作用蛋白。在體外細胞實驗中，當癌細胞中IPTKA蛋白表達水平顯著提高時， 癌細胞形態(tài)發(fā)生改變，形成由大量肌動蛋白細胞骨架構(gòu)成的突出物，細胞運動能力明顯增強；反之，當顯著降低癌細胞中ITPKA蛋白表達水平時，癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力隨之降低或消失。在癌癥治療過程中，ITPKA蛋白的表達水平與臨床抗癌藥物抑制腫瘤發(fā)展的治療效果呈顯著相關(guān)。ITPKA蛋白作為腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移的標志，參與了腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過程，因此可以用作臨床腫瘤診斷和/或治療中的靶向蛋白，用于檢測抗癌藥效及篩選制備抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的新型藥物。ITPKA蛋白促進癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移主要是通過以下兩種機制完成的(1)不依賴于細胞生長因子的方式ITPKA蛋白通過直接調(diào)控肌動蛋白細胞骨架， 誘導細胞形成大量的突出物如絲狀偽足以促進腫瘤細胞的運動能力。(2)在受到生長因子激發(fā)的細胞中，ITPKA蛋白通過催化產(chǎn)生大量的1，3，4，5_四磷酸肌醇并抑制肌醇磷酸-5-磷酸酶的活性等方式使細胞中大量鈣離子進入細胞，通過細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路進一步增強了 ITPKA蛋白誘發(fā)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力。發(fā)明詳述本發(fā)明技術(shù)方案如下ITPKA基因在制備或篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。抑制ITPKA基因表達的基因片段shRNAl，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。抑制ITPKA基因表達的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述基因片段shRNAl和/或基因片段shRNA2在制備或篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。ITPKA蛋白在制備或篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，ITPKA蛋白作為制備或篩選治療腫瘤藥物的靶向蛋白。ITPKA蛋白作為腫瘤靶向蛋白篩選用于腫瘤治療的藥物，篩選得到的抗腫瘤藥物可以是單克隆抗體，或者其他類型的與ITPKA蛋白結(jié)合的分子，如多肽或小分子藥物等。此外，可以將一些治療性物質(zhì)偶聯(lián)于與ITPKA具有高親和力的靶向藥物上以達到治療的效果，如將放射性核素偶聯(lián)于抗ITPKA蛋白的單克隆抗體上，這些技術(shù)均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。ITPKA蛋白的抗體在制備或篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用
上述ITPKA蛋白的抗體為ITPKA蛋白的單克隆抗體，制備步驟如下(1)利用ITPKA蛋白免疫動物，獲得免疫血清；(2)測定步驟(1)制得的免疫血清中抗ITPKA蛋白的抗體的有效濃度，收集滴度達到IO8以上的免疫血清；(3)利用ITPKA蛋白對步驟⑵制得的免疫血清進行抗原親和層析純化，得到特異性識別目標靶蛋白ITPKA蛋白的抗體。所述測定為間接ELISA法測定。所述ITPKA蛋白，制備步驟如下1)利用ITPKA cDNA連接pET28b載體構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3感受態(tài)細胞，鑒定陽性克隆菌株；2)將陽性菌株接種在含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床200rpm
4過夜培養(yǎng)；然后按體積比1 100的比例稀釋到含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C搖床200rpm培養(yǎng)約3小時，當菌液OD6tltl值達到0. 6-0. 8時，加入終濃度為400mM的 IPTG誘導劑，16°C搖床200rpm誘導培養(yǎng)20h，離心收集誘導菌體；3)將步驟( 制得的誘導菌體重懸后，利用超聲波方法破碎，離心，將上清液通過鎳親和層析柱方法純化得到高純度的ITPKA蛋白，將得到的ITPKA蛋白在50mM KCl、5mM Tris-HClpH 8. 0的緩沖液中透析，即得。上述腫瘤細胞為皮膚癌、肺癌、乳腺癌或肝癌細胞，優(yōu)選皮膚癌細胞。根據(jù)業(yè)內(nèi)共知的規(guī)律，本發(fā)明所述的技術(shù)方案可以用于高表達ITPKA蛋白癌癥的治療及藥物篩選。有益效果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要參與靶向蛋白ITPKA蛋白。在臨床診斷和治療腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，結(jié)合本發(fā)明的技術(shù)方案可以將ITPKA蛋白作為腫瘤標記分子、抗癌藥效檢測標記分子和癌癥治療的靶向蛋白進行應(yīng)用。本發(fā)明為制備抗癌藥物及抗癌藥物的篩選提供了新的途徑。


圖1、利用ITPKA蛋白多抗免疫組化的方法對正常組織和肺癌組織、乳腺癌組織、 肝癌組織中的ITPKA蛋白表達水平進行檢測的柱狀圖；圖2、用ITPKA蛋白多抗免疫組化檢測人體肺癌附近正常組織、肺癌組織中心、肺癌侵襲前沿和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的電子顯微鏡照片；其中A、癌旁正常組織；B、癌中心；C、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移；圖3、顯示用ITPKA蛋白多抗免疫組化檢測人體肺癌附近正常組織、肺癌組織中心、肺癌侵襲前沿和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達情況的柱狀圖；圖4、ITPKA蛋白多抗免疫組化檢測不同抗癌藥物治療效果與其抑制ITPKA表達能力的相關(guān)性的柱狀圖；圖5A、基因片段shRNAl和基因片段shRNA2抑制腫瘤細胞YES2侵襲轉(zhuǎn)移能力的柱狀圖；圖5B、基因片段shRNAl和基因片段shRNA2抑制腫瘤細胞EC9706-P4侵襲轉(zhuǎn)移能力的柱狀圖；圖5C、基因片段shRNAl和基因片段shRNA 2抑制腫瘤細胞在轉(zhuǎn)染裸鼠體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力，其對應(yīng)的轉(zhuǎn)染鼠生存天數(shù)的柱狀圖；圖6A、濃度梯度的兔免疫血清和純化ITPKA鼠多抗蛋白抑制腫瘤細胞遷移能力的柱狀圖；圖6B、濃度梯度的兔免疫血清和純化ITPKA鼠多抗蛋白抑制腫瘤細胞在裸鼠肺中形成病灶能力的柱狀圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。實施例1腫瘤抗原的制備利用分子生物學的方法，通過如下方法表達并純化得到了 ITPKA蛋白
(1)提取神經(jīng)元組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得組織cDNA序列。設(shè)計ITPKA特異的引物， 引物序列正向引物 GAATTCATGACCCTGCCCGGGGC ；反向引物 AAGCTTTCATCTCTCAGCCAGGCTGG。 PCR 條件第一步 95°C 5min，第二步 94°C 30sec，第三步 59°C 30sec，第四步 72°C 90sec，第二到第四步30個循環(huán)，72°C IOmin0克隆得到了 ITPKA基因的cDNA編碼序列。通過DNA測序的方法確認序列完全正確。(2)將ITPKA基因的cDNA編碼序列導入pET28b載體構(gòu)建表達載體，然后將表達載體轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21DE3 ；(3)在上述大腸桿菌BL21DE3中添加誘導劑IPTG誘導ITPKA蛋白在宿主細胞中大
量表達；(4)利用超聲波等方法破碎細胞并通過親和層析柱等方法純化得到高純度的 ITPKA蛋白。表達得到的ITPKA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。實施例2ITPKA蛋白多克隆抗體的制備(1)利用實施例1中表達的ITPKA蛋白作為抗原免疫實驗鼠制備抗ITPKA蛋白的多克隆抗體取免疫前血清免疫前自鼠耳靜脈取血備檢，第一次免疫ITPKA蛋白與弗氏佐劑按1:1比例充分混合后，經(jīng)皮內(nèi)注射免疫實驗鼠，每只500 μ g多肽KLH偶聯(lián)物(購自德國默克公司)；第二次免疫第一次免疫兩周后，取500 μ g ITPKA蛋白與弗氏不完全佐劑充分混合后再次經(jīng)皮內(nèi)注射免疫實驗鼠；注射卡介苗第二次免疫后7d，按每只鼠100毫克卡介苗經(jīng)皮下多點注射免疫實驗鼠；第三次免疫自注射卡介苗后1 ld，按每只鼠500 μ g ITPKA蛋白與弗氏不完全佐劑充分混合后經(jīng)淋巴結(jié)注射免疫實驗鼠；(2)效價測定第三次免疫后9到10天自鼠靜脈取血，用來測定免疫血清的抗體滴度，當免疫血清中目標抗體的滴度達到IO8以上時，自鼠靜脈取血，置于直徑為150mm的干凈平皿中，4度過夜；第二天，離心分離血清，得到免疫血清；(3)由于獲得的免疫血清中還含有大量的非特異性的免疫球蛋白，直接用免疫血清進行免疫組化等實驗將產(chǎn)生大量的非特異性干擾信號，影響對檢測的結(jié)果的判斷，因此我們用偶聯(lián)有ITPKA的纖維素膜進行親和層析的方法純化得到了與ITPKA蛋白特異性結(jié)合的抗體。實施例3利用組織芯片檢測ITPKA蛋白在腫瘤組織中的表達升高石蠟包埋的皮膚癌組織制備組織芯片，進行常規(guī)石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。5%過氧化氫室溫10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。切片在枸櫞酸緩沖液 (10mM,pH6. 5)中用微波加熱法進行抗原修復。用20%正常山羊血清室溫封閉20分鐘。棄封閉液，加入1-2微克每毫升抗ITPKA蛋白多克隆抗體，4度孵育過夜。然后用PBS洗5遍， 每遍5分鐘，加入HRP標記的鏈霉卵白素，室溫孵育1小時。利用染料DAB染色，及蘇木素復染，封片后在顯微鏡下觀察檢測結(jié)果。ITPKA蛋白的表達在皮膚癌組織中高水平異位表達。而且ITPKA蛋白在腫瘤中的表達與腫瘤侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理期呈顯著正相關(guān) (表 1)。
表1在58例皮膚癌組織芯片中ITPKA蛋白表達水平與皮膚癌臨床病理特征的相關(guān)性
權(quán)利要求
1.ITPKA基因在制備或篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
2.抑制ITPKA基因表達的基因片段shRNAl，核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
3.抑制ITPKA基因表達的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.權(quán)利要求2所述基因片段shRNAl和/或權(quán)利要求3所述基因片段shRNA2在制備或篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
5.ITPKA蛋白在制備或篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，ITPKA蛋白作為制備或篩選治療腫瘤藥物的靶向蛋白。
7.ITPKA蛋白的抗體在制備或篩選抑制腫瘤細胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述ITPKA蛋白的抗體為ITPKA蛋白的單克隆抗體，制備步驟如下(1)利用ITPKA蛋白免疫動物，獲得免疫血清；(2)測定步驟(1)制得的免疫血清中抗ITPKA蛋白的抗體的有效濃度，收集滴度達到 IO8以上的免疫血清；(3)利用ITPKA蛋白對步驟⑵制得的免疫血清進行抗原親和層析純化，得到特異性識別目標靶蛋白ITPKA蛋白的抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)中的測定為間接ELISA法測定。
10.權(quán)利要求1、4-9中任意一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤細胞為皮膚癌、肺癌、乳腺癌或肝癌細胞，優(yōu)選皮膚癌細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及ITPKA基因及其表達蛋白在制備及篩選抗癌藥物中的應(yīng)用，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供抑制ITPKA基因表達的基因片段shRNA1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；抑制ITPKA基因表達的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明為制備抗癌藥物及抗癌藥物的篩選提供了新的途徑。
文檔編號C07K16/40GK102389574SQ20111028200
公開日2012年3月28日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者謝鈺容 申請人:謝鈺容