專(zhuān)利名稱(chēng)：一種適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品的制備方法，特別涉及一種適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白的樣品制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)自本世紀(jì)初開(kāi)展克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖以來(lái)，其養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，占地面積已超過(guò)了 300萬(wàn)畝，年產(chǎn)量超過(guò)50萬(wàn)噸，成為我國(guó)淡水蝦類(lèi)的重要新興水產(chǎn)養(yǎng)殖資源。隨著國(guó)內(nèi)消費(fèi)量和加工出口數(shù)量的增加，克氏原螯蝦的野生資源數(shù)量明顯減少，因此，提高人工養(yǎng)殖產(chǎn)量以滿足市場(chǎng)的需求已成為廣大養(yǎng)殖戶(hù)及科技工作者為之奮斗的共同目標(biāo)和重要課題。我國(guó)的克氏原螯蝦雖然已形成了規(guī)?；a(chǎn)，但是制約該蝦產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的技術(shù)瓶頸尚未得到有效的解決，其中比較突出的問(wèn)題有克氏原螯蝦規(guī)模化養(yǎng)殖的苗種配套技術(shù)問(wèn)題、苗種繁育率問(wèn)題、親蝦和蝦苗放養(yǎng)成活率問(wèn)題等等。開(kāi)展克氏原螯蝦卵巢發(fā)育機(jī)制的研究，不僅是解決上述瓶頸問(wèn)題的有效途徑，另一方面，對(duì)于該物種種質(zhì)資源的保護(hù)及其品種的遺傳改良等具有非常積極的意義。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白作為研究對(duì)象的研究開(kāi)展得較少，且主要是利用克隆技術(shù)對(duì)組織中單一性功能蛋白進(jìn)行純化及展開(kāi)性質(zhì)研究，通過(guò)類(lèi)似方法無(wú)法達(dá)到全面獲取克氏原螯蝦卵巢組織發(fā)育分子構(gòu)成，并研究其發(fā)育機(jī)制的目的。宏蛋白質(zhì)組學(xué)是最近幾年被提出的新概念，其定義是指對(duì)某一特定環(huán)境中個(gè)體(器官、組織、細(xì)胞等) 的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的分析和鑒定。宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略主要包括環(huán)境總蛋白的提取制備、蛋白質(zhì)分離、以及蛋白質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)分析等步驟。應(yīng)用宏蛋白質(zhì)組學(xué)理論和思想，利用雙向電泳技術(shù)對(duì)克氏原螯蝦卵巢組織所有可溶性蛋白進(jìn)行高分辨率分離，能為后續(xù)通過(guò)質(zhì)譜分析手段大規(guī)模鑒定發(fā)育相關(guān)基因，并進(jìn)一步了解其基因性質(zhì)奠定基礎(chǔ)。選擇合適的樣品制備方法是雙向電泳成功的關(guān)鍵因素之一，制備方法選擇不當(dāng)， 會(huì)造成大量鹽離子和其它干擾物質(zhì)殘留，嚴(yán)重影響等電聚焦，從而影響雙向電泳的結(jié)果。蝦類(lèi)卵巢組織中的所有可溶性蛋白必須盡可能地從組織中利用破碎、裂解、并適當(dāng)?shù)木彌_體系中提取出來(lái)，要在盡可能去除多糖、脂類(lèi)、核酸等干擾性雜質(zhì)的同時(shí)，盡量避免目標(biāo)蛋白樣品的降解和丟失。迄今為止，沒(méi)還有適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白的樣品制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可有效去除鹽離子、多糖、脂類(lèi)、核酸等干擾電泳效果的物質(zhì)，能夠更加徹底地去除上述雜質(zhì)的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白的處理方法，以得到更適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白的樣品的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備方法，其特征是包括以下步驟(1)稱(chēng)取克氏原螯蝦新鮮成熟卵巢組織500mg，放入預(yù)冷至0 _20°C的研缽中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；(2)向步驟(1)中的15mL離心管中加入上述克氏原螯蝦新鮮成熟卵巢組織4 6 倍體積的、冰水混合液中預(yù)冷至0°C的、以丙酮為溶劑的溶液A，充分混勻，于0 -20°c放置 2 4h，0 20°C、12000 15000r/min離心20 30min，收集所得沉淀物；所述以丙酮為溶劑的溶液A中的溶質(zhì)為0. 01 0. 03mmol/L的二硫蘇糖醇、體積濃度為15% 20%的三氯乙酸；(3)向步驟(2)所得沉淀物中加入2mL冰水混合液中預(yù)冷至0°C的以丙酮為溶劑的溶液B，充分混勻，于0 -20°C放置2 4h，0 _20°C、12000 15000r/min離心20 30min,收集所得沉淀物；用上述以丙酮為溶劑的溶液B重復(fù)清洗沉淀一次，于0 _20°C低溫靜置揮發(fā)殘留丙酮3 證，得蛋白沉淀；所述以丙酮為溶劑的溶液B中的溶質(zhì)為0. 01 0. 03mmol/L的二硫蘇糖醇；(4)向步驟(3)中制得的蛋白沉淀中加入600 μ L的樣品裂解液，室溫下充分裂解 2 池，得蛋白質(zhì)混合液；所述樣品裂解液以體積百分含量0. 5% 1 %的IPG緩沖液為溶劑，其中含有6 8mol/L尿素、0. 02g/mL的CHAPS、10 μ L/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0. 002g/mL的溴酚藍(lán)；(5)將步驟(4)中蛋白混合液于4 6°C、12000 15000r/min離心20 30min, 收集上清液，即為適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品。所述步驟O)以丙酮為溶劑的溶液A中二硫蘇糖醇的含量為0. 02mmol/L，加入三氯乙酸至其終體積濃度為20%。所述步驟(3)中所述以丙酮為溶劑的溶液B中二硫蘇糖醇的含量為0. 02mmol/L。所述步驟(4)中樣品裂解液組成為8mol/L尿素、0. 02g/mL的CHAPS、10 μ L/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0. 002g/mL的溴酚藍(lán)，溶劑為體積百分含量為0. 5%的IPG緩沖液。所述步驟(2)中以丙酮為溶劑的溶液A加入量為克氏原螯蝦新鮮成熟卵巢組織體積的5倍。使用的樣品裂解液中，尿素作為變性劑能夠破壞蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，打斷非共價(jià)連接。CHAPS是一種兼性去污劑，它能打斷蛋白質(zhì)分子或亞基間的疏水作用，增加蛋白質(zhì)的溶解性。二硫蘇糖醇可以打斷二硫鍵，并使所有蛋白處于還原狀態(tài)。PMSF是一種蛋白酶抑制劑，能有效抑制絲氨酸蛋白酶以及巰基蛋白酶的酶活，防止目標(biāo)蛋白的降解。IPG緩沖液能通過(guò)電荷間的相互作用減少蛋白質(zhì)結(jié)合，從而達(dá)到增加蛋白可溶性的目的。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用三氯乙酸-丙酮法沉淀蛋白質(zhì)，可以有效去除鹽離子、多糖、脂類(lèi)、核酸等干擾電泳效果的物質(zhì)。同時(shí)，本發(fā)明在提取蛋白的過(guò)程中，增加了丙酮清洗的次數(shù)，從而能夠更加徹底地去除上述雜質(zhì)。本發(fā)明制備適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白的方法快速可靠、簡(jiǎn)單易行，可獲得較高質(zhì)量且重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜，便于后續(xù)的質(zhì)譜分析鑒定，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1為利用本發(fā)明制備的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品的雙向電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有不能領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。應(yīng)理解，以下實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何形式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11、克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備(1)稱(chēng)取發(fā)育期克氏原螯蝦新鮮卵巢組織500mg，先放入_20°C預(yù)冷的研缽中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；(2)向步驟(1)離心管中加入5倍體積預(yù)冷的以丙酮為溶劑的溶液A(其中含有0. 02mmol/L的二硫蘇糖醇、終體積濃度為20%的三氯乙酸)，充分混勻，于_20°C放置 2h, -20°C>12000r/min 離心 20min，收集沉淀；(3)向步驟⑵沉淀中加入2mL冰水混合液中預(yù)冷至0°C的以丙酮為溶劑的溶液 B (其中含有0. 02mmol/L的二硫蘇糖醇)，充分混勻，于_20°C放置2h，-20°C、12000r/min離心20min，收集沉淀。采用預(yù)冷的以丙酮為溶劑的溶液B重復(fù)清洗沉淀一次，于_20°C低溫靜置揮發(fā)殘留丙酮4h;(4)向步驟(3)中制得的蛋白沉淀中加入600μ L的樣品裂解液(其中含有8mol/L 尿素、0. 02g/mL的CHAPSU0 μ L/mL的PMSF、體積百分含量為0. 5%的IPG緩沖液、0. 002g/ mL的溴酚藍(lán))，室溫下充分裂解池；(5)將步驟(4)中蛋白混合液于4°C、12000r/min離心30min，收集上清液。此上清液即為適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品。2、雙向電泳檢測(cè)(1)按照《雙向電泳操作手冊(cè)》進(jìn)行水化上樣和等電聚焦。在ImmobiIine干膠條再泡脹盤(pán)中加入含IOOyg克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品，將IPG干膠條(7cm，pH 3 10)水平放入其中，加入少量IPG覆蓋液，水化過(guò)夜。水化過(guò)夜后的膠條轉(zhuǎn)移到Ktan IPGphor膠條槽中，進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦程序設(shè)置為①乂印，300VX !；②Gradient， 1000VX 0. 5h ；(3) Gradient, 5000V XL 5h ；④ St 印，5000V，2500vh。(2)電聚焦結(jié)束后，采用兩步平衡法進(jìn)行平衡，先將IPG膠條放入3mL平衡液I (平衡液 I 配方尿素 72. 07g, SDS 4. Og, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH 8. 8)，甘油 69mL，溴酚藍(lán)貯存液400 μ L，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL加入DTT IOOmg)中，在水平搖床上平衡15min ；再使用平衡液II (平衡液II配方尿素72. 07g, SDS 4. Og, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH 8. 8)，甘油69mL，1 %溴酚藍(lán)貯存液400 μ L，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL 加入IAA 250mg)進(jìn)行第二步平衡，在搖床上平衡15min。(3)平衡后進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12. 5% (IOcmX 7cmX lmm)。 將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，排除膠條與膠面之間的氣泡。以恒流方式進(jìn)行電泳先IOmA電泳lOmin，然后電流調(diào)至20mA。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠底部時(shí)，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。
(4)采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。(5)利用捷達(dá)JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對(duì)脫色后的雙向電泳凝膠進(jìn)行掃描、 拍照。雙向電泳結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明該克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品的制備和分離效果較好，最終得到了分辨率較高，重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜。實(shí)施例21、克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備(1)稱(chēng)取成熟期克氏原螯蝦新鮮卵巢組織500mg，先放入_20°C預(yù)冷的研缽中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；(2)向步驟(1)離心管中加入6倍體積預(yù)冷的以丙酮為溶劑的溶液A(其中含有 0. 03mmol/L的二硫蘇糖醇、終濃度為20%的三氯乙酸)，充分混勻，于_20°C放置4h，-10°C、 15000r/min離心20min，收集沉淀；(3)向步驟(2)沉淀中加入2mL冰水混合液中預(yù)冷至0°C以丙酮為溶劑的溶液 B (其中含有0. 02mmol/L的二硫蘇糖醇)，充分混勻，于_20°C放置3h，-10°C、15000r/min離心20min，收集沉淀。采用預(yù)冷至0°C的以丙酮為溶劑的溶液B重復(fù)清洗沉淀一次，于_10°C 低溫靜置揮發(fā)殘留丙酮4h以上；(4)向步驟(3)中制得的蛋白沉淀中加入600μ L的樣品裂解液(其中含有8mol/L 尿素、0. 02g/mL的CHAPSU0 μ L/mL的PMSF、體積百分含量為0. 8%的IPG緩沖液、0. 002g/ mL的溴酚藍(lán))，室溫下充分裂解池。(5)將步驟(4)中蛋白混合液于4°C、12000r/min離心30min，收集上清液，此上清液即為適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品。2、雙向電泳檢測(cè)(1)按照《雙向電泳操作手冊(cè)》進(jìn)行水化上樣和等電聚焦。在Immobiline干膠條再泡脹盤(pán)中加入含IOOyg克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品，將IPG干膠條(7cm，pH 3 10)水平放入其中，加入少量IPG覆蓋液，水化過(guò)夜。水化過(guò)夜后的膠條轉(zhuǎn)移到Ktan IPGphor膠條槽中，進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦程序設(shè)置為①乂印，300VX !;②Gradient， 1000VX 0. 5h ；(3) Gradient, 5000V XL 5h ；④ Step, 5000V, 2500vho(2)等電聚焦結(jié)束后，采用兩步平衡法進(jìn)行平衡，先將IPG膠條放入3mL平衡液 I (平衡液 I 配方尿素 72. 07g，SDS 4. 0g，1.5M Tris-HCl 6. 7mL (ρΗ8· 8)，甘油 69mL，1 % 溴酚藍(lán)貯存液400 μ L，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL加入DTT IOOmg)中，在水平搖床上平衡15min ；再使用平衡液II (平衡液II配方尿素72. 07g, SDS 4. Og, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH 8. 8)，甘油69mL，1 %溴酚藍(lán)貯存液400 μ L，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL 加入IAA 250mg)進(jìn)行第二步平衡，在搖床上平衡15min。(3)平衡后進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12. 5% (IOcmX 7cmX lmm)。 將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，排除膠條與膠面之間的氣泡。以恒流方式進(jìn)行電泳先IOmA電泳lOmin，然后電流調(diào)至20mA。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠底部時(shí)，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。(4)采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。(5)利用捷達(dá)JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對(duì)脫色后的雙向電泳凝膠進(jìn)行掃描、
6拍照。 雙向電泳結(jié)果與圖1所示類(lèi)似，結(jié)果表明該克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品的制備和分離效果較好，最終得到了分辨率較高，重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜。
權(quán)利要求
1.一種適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備方法，其特征是包括以下步驟(1)稱(chēng)取克氏原螯蝦新鮮成熟卵巢組織500mg，放入預(yù)冷至(T-20°C的研缽中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中；(2)向步驟(1)中的15mL離心管中加入上述克氏原螯蝦新鮮成熟卵巢組織4飛倍體積的、冰水混合液中預(yù)冷至0°C的、以丙酮為溶劑的溶液A，充分混勻，于(T-20°C放置2、h， 0"20°C> 12000^15000 r/min 離心 20 30min，收集所得沉淀物；所述以丙酮為溶劑的溶液A中的溶質(zhì)為0. 0Γ0. 03 mmol/L的二硫蘇糖醇、體積濃度為15% 20%的三氯乙酸；(3)向步驟(2)所得沉淀物中加入2mL冰水混合液中預(yù)冷至0°C的以丙酮為溶劑的溶液 B，充分混勻，于(T-20°C放置 2 4h，(T-20°C、1200(Tl5000 r/min 離心 20 30 min，收集所得沉淀物；用上述以丙酮為溶劑的溶液B重復(fù)清洗沉淀一次，于(T-20°C低溫靜置揮發(fā)殘留丙酮3、h，得蛋白沉淀；所述以丙酮為溶劑的溶液B中的溶質(zhì)為0.0廣0.03 mmol/L的二硫蘇糖醇；(4)向步驟(3)中制得的蛋白沉淀中加入600PL的樣品裂解液，室溫下充分裂解纊3 h，得蛋白質(zhì)混合液；所述樣品裂解液以體積百分含量0. 59Tl%的IPG緩沖液為溶劑，其中含有6、mol/L 尿素、0. 02 g/mL的CHAPS、10 “L/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0. 002 g/mL的溴酚藍(lán)；(5)將步驟(4)中蛋白混合液于4 6°C、1200(Tl5000r/min離心20 30min，收集上清液，即為適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備方法，其特征是所述步驟(2)以丙酮為溶劑的溶液A中二硫蘇糖醇的含量為0. 02 mmol/L，加入三氯乙酸至其終體積濃度為20%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備方法，其特征是所述步驟(3)中所述以丙酮為溶劑的溶液B中二硫蘇糖醇的含量為0. 02 mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備方法，其特征是所述步驟(4)中樣品裂解液組成為8 mol/L尿素、0.02 g/mL的CHAPS、10 PL/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0. 002 g/mL的溴酚藍(lán)，溶劑為體積百分含量為0. 5%的IPG緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備方法，其特征是所述步驟(2)中以丙酮為溶劑的溶液A加入量為克氏原螯蝦新鮮成熟卵巢組織體積的5倍。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種適合雙向電泳的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品制備方法。該方法選取液氮法充分研磨組織，然后采用三氯乙酸-丙酮法沉淀蛋白質(zhì)，通過(guò)使用含有二硫蘇糖醇和三氯乙酸的預(yù)冷丙酮溶液沉淀蛋白并用含有二硫蘇糖醇的預(yù)冷丙酮溶液數(shù)次洗滌沉淀，最后通過(guò)加入樣品裂解液制備出適合雙向電泳的高質(zhì)量的克氏原螯蝦卵巢組織總蛋白樣品。本發(fā)明制備出雙向電泳樣品的方法快速可靠、簡(jiǎn)單易行，可獲得較高質(zhì)量且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜，便于后續(xù)的生物質(zhì)譜分析鑒定蛋白，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K1/30GK102359901SQ201110285230
公開(kāi)日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者周鑫, 徐增洪, 水燕, 趙朝陽(yáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心