專利名稱：一種運(yùn)載豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白的納米載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種運(yùn)載特定蛋白的載體，特別是一種可以運(yùn)載豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白的納米載體。
背景技術(shù)：
在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中均需要使用某種載體來(lái)運(yùn)載化學(xué)藥品或特定的蛋白，本領(lǐng)域的工作者仍在嘗試尋找這一類的高效的運(yùn)載工具。
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的病原之一，PCV2基因組編碼11個(gè)閱讀框架，其中了解比較清楚的ORF I由 945個(gè)堿基組成，編碼參與病毒復(fù)制A的Rep蛋白；0RF2由705個(gè)堿基組成，編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap，其在病毒感染誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起重要作用。研究表明，Cap蛋白中含有中和抗原表位，在對(duì)Cap和Rep蛋白的免疫原性比較中發(fā)現(xiàn),Cap蛋白為主要免疫原,而Rep蛋白僅有微弱的免疫原性，因此，0RF2已成為目前構(gòu)建PCV2重組疫苗的首選靶基因。
近年來(lái)，研究者嘗試用生物可降解材料制作的微粒，如藻酸鹽微粒、聚乳酸微粒、 脂質(zhì)體微粒等包裹并投遞蛋白疫苗，初步研究發(fā)現(xiàn)微粒載體的應(yīng)用可減少免疫次數(shù)，產(chǎn)生佐劑效應(yīng)，增強(qiáng)免疫效果，提高免疫覆蓋率。但研究也發(fā)現(xiàn)，用這些微粒做載體時(shí)，抗原包裹過(guò)程中所使用的有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致承載的蛋白質(zhì)抗原變性而失活，而且這類微粒由于其粒徑小，比表面積大，易于粘接與團(tuán)聚，其次這類微粒的穩(wěn)定性及抗原釋放速率機(jī)制以及微粒的粒徑大小、均勻程度、表面形態(tài)等參數(shù)均難以或還不清楚，這些缺點(diǎn)也限制了這類載體作為蛋白疫苗運(yùn)載系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用。
具有多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒(HMSN)是一類具有多種優(yōu)勢(shì)的納米材料， 這些優(yōu)勢(shì)包括無(wú)毒的自然屬性、良好的表面穿透性、比表面積大、可調(diào)的孔結(jié)構(gòu)、良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性以及可修飾的化學(xué)表面等，這些特性使中空多孔硅納米顆粒(HMS N)成為運(yùn)載多種化學(xué)物或藥物的最佳載體。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供硅納米顆粒的用途，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供這種納米顆粒承載豬圓環(huán)病毒PCV2GST-0RF2表位蛋白的方法。
本發(fā)明所述的多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒(HMSNs)用途是將其用于運(yùn)載豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白，而這種納米載體顆粒的直徑為100 200nm ;更進(jìn)一步講，本發(fā)明所述的運(yùn)載豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白的納米顆粒載體可在制備豬圓環(huán)病毒疫苗中應(yīng)用。
本發(fā)明所述的納米載體在承載PCV2GST-0RF2表位蛋白時(shí)是將具有多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒溶于pH 7. O的磷酸緩沖液中配制成多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒的懸液，再在其中加入PCV2GST-0RF2表位蛋白，室溫下充分?jǐn)嚢?，使多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒充分吸咐蛋白。
本發(fā)明的納米載體承載PCV2GST-0RF2表位蛋白的最佳方法是所配制的多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒懸液的濃度為10mg/mL，然后在IOmL懸液中加入O. 5mg的 PCV2GST-ORF2蛋白，使多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒充分進(jìn)行吸咐PCV2GST-ORF2蛋白。
本發(fā)明用多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒(HMSN)承載PCV2GST-0RF2表位蛋白， HMSN作為載體可有效防止蛋白酶對(duì)承載蛋白制劑的降解并使承載的蛋白緩慢釋放，從而達(dá)到持久免疫刺激的效果，為提高疫苗的效力提供條件。
相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，用多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒作為豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白載體，充分利用利用了空心球狀硅納米顆粒具有的高承載量和控釋特性，可以實(shí)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白在免疫小鼠體內(nèi)緩慢釋放，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效果。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表明，與直接以PCV2GST-0RF2表位蛋白免疫小鼠相比，承載了 PCV2GST-0RF2表位蛋白的HMSN能夠誘導(dǎo)持續(xù)的抗體免疫反應(yīng)和較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而這種緩釋特性在蛋白疫苗載體應(yīng)用中的具有明顯的優(yōu)勢(shì)。


圖1為本發(fā)明所使用的中空多孔硅納米顆粒的電鏡圖，其中(a)為掃描電鏡圖， (b)為透視電鏡的圖，圖中的納米粒的直徑大約為100 200nm。
圖2 為 SDS-PAGE 和 western-bloting 對(duì)純化 GST-0RF2-E 蛋白的鑒定，圖中A 圖為純化蛋白洗脫后的SDS-PAGE圖，其中.Lane1:為第一次洗脫；Lane 2為第二次洗脫； Lane 3為第三次洗脫；B為用GST單克隆抗 體對(duì)純化蛋白的鑒定，其中=Lane I為純化蛋白，Lane 2為pGEX+T-l空載體對(duì)照。
圖3為中空多孔硅納米顆粒(HMSNs)吸附結(jié)合蛋白的規(guī)律曲線，其中標(biāo)記圓點(diǎn)的線、標(biāo)記三角的線及標(biāo)記菱形的線分別代表吸附濃度為l、5、10mg/mL的HMSNs。
圖4為HMSNs體外控釋蛋白的規(guī)律曲線。
圖5為小鼠血清抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)。
圖6為T淋巴細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)。
圖7為T淋巴細(xì)胞亞群，其中圖7的上圖為⑶4+分布，下圖為⑶8+分布。
圖8為小鼠血清的INF- Y的ELISA檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
I)合成中空多孔硅納米顆粒(HMSNs)
本發(fā)明中應(yīng)用的HMSN合成方法如文獻(xiàn)Guo H，Qian H，Sun S，Sun D，Yin H， Cai X, Liu Z, Wu J, Jiang T, Liu X. Hollow mesoporous silica nanoparticles for intracellular delivery of fluorescent dye. Chem Cent J. 2011,5(1) :1 中所述。具體步驟如下取14mL無(wú)水乙醇和26. 5mL去離子H2O混合，攪拌使其混勻并加入0. 5mLTE0S和 0. 08g CTAB，隨后加入0. 5mL 25%的氨水并在室溫條件下持續(xù)攪拌3h。將混合好的乳濁液 8000 10000rpm/min離心10 15min,棄去上清,用去離子水洗沉淀3次。將沉淀取出置于馬弗爐中200°C煅燒6h然后再600°C煅燒6h后得產(chǎn)物粉末。將合成好的粉末狀HMSN溶解到0. OlM PBS(pH7. 4)中，以掃描電鏡和透視電鏡觀察其顆粒形態(tài)。從電鏡圖片可見(jiàn)所合成的納米顆粒為中空球形顆粒，直徑大小約為200nm，表面為疏松多孔結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。
2) PCV2GST-0RF2表位蛋白的表達(dá)和純化
本發(fā)明釆用的融合蛋白PCV2GST-0RF2表位蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化如文獻(xiàn)Sun SQ, Guo HC，Sun DH, Yin SH,Shang YJ, Cai XP, Liu XT. Development and validation of an ELISA using a protein encoded by 0RF2antigenic domain of porcine circovirus type 2. Virol J. 2010，7 :274.中所述，具體方法為將陽(yáng)性克隆菌以1: 100接種于LB培養(yǎng)基(100 μ g/mL ampicillin),于 37°C搖培(250rpm/min)直至菌液的 0D600nm 值介于 0. 6-0. 8，以IPTG(終濃度0. 1M)誘導(dǎo)表達(dá)，37°C搖培3h后收菌，PCV2GST-0RF2融合蛋白應(yīng)用 MagnetGST Glutathione Particles(Promega)進(jìn)行純化。對(duì)洗脫得到的 PCV2GST-0RF2 融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白純化效果良好，大小約29KDa， 參見(jiàn)圖2?！?br> 3) HMSNs 承載 PCV2GST-0RF2 表位蛋白
將HMSNs 溶于 PBS (pH 7. 0)中，配制成 HMSNs 懸液(l，5and 10mg/mL)，將這不同濃度的懸液(IOmL)分別加入0.5mg PCV2GST-0RF2蛋白，在室溫下持續(xù)攪拌(250rpm/min)， 分別收集 30min、lh、2h、4h、8h、16h、24h、32h 不同時(shí)間段的樣品(500 μ L)，IOOOOrpm 離心 5min,用 Micro BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL)檢測(cè)上清中經(jīng)吸附所剩余的蛋白含量。經(jīng)檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，HMSNs吸附蛋白主要在最初的Ih之內(nèi)，隨著時(shí)間的增加吸附速度急劇下降，在經(jīng)過(guò)4h的吸附之后HMSNs結(jié)合蛋白的量已經(jīng)接近飽和。比較三個(gè)不同濃度的HMSNs吸附蛋白的情況發(fā)現(xiàn)，10mg/mL的HMSNs對(duì)PCV2GST-0RF2蛋白的吸附最理想，其最大載量為lSOyg/mL，參見(jiàn)圖3。
4) PCV2GST-0RF2表位蛋白自HMSNs的緩釋規(guī)律
將承載有PCV2GST-0RF2 蛋白的 ImL HMSNs (10mg/mL)溶于 20mL PBS (pH7. 4)中， 超聲使懸液變均一，分裝到10個(gè)2mL的管中在4°C下進(jìn)行釋放，并在不同的時(shí)間(8h、24h、 72h、108h、240h、320h、380h、480h)收取樣品，IOOOOrpm 離心 5min，用 Micro BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL)檢測(cè)經(jīng)HMSNs吸附上清中所剩余的蛋白量。結(jié)果顯示， HMSNs對(duì)蛋白的釋放可以分為三個(gè)階段在最初的8小時(shí)，蛋白釋放速度很快，隨后釋放速度趨于平緩，到400h時(shí)蛋白的釋放基本終止，上清中蛋白的含量不再有明顯的變化，參見(jiàn)圖4。
5) HMSNs/PCV2GST-0RF2表位蛋白小鼠免疫方案
將21只4周齡的BALb/c鼠分為3組，第一組用HMSNs/PCV2GST_0RF2表位蛋白免疫，第二組直接用PCV2GST-0RF2蛋白免疫、第三組用PBS懸浮的HMSNs顆粒作為對(duì)照進(jìn)行免疫。首先在免疫前對(duì)所有小鼠進(jìn)行斷尾采血，在免疫后第二周開(kāi)始每周對(duì)各組小鼠進(jìn)行采血收集血清檢測(cè)抗體水平及其INF- Y。其中第2、4、6周每組各隨機(jī)收取I只小鼠斷頸處死，取其脾臟分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行淋巴細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)，同時(shí)取一部分淋巴細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞亞群⑶4+、⑶8+分布情況。
6)抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)
將96 孔板(Nunc Maxisorp)用 100 μ L 0. 05Μ 碳酸鈉緩沖液(ρΗ9· 6)稀釋的PCV2GST-0RF2融合蛋白4 °C包被過(guò)夜。PBST清洗3次，孔板用含5 %脫脂奶粉的 PBST (150 μ L) 37°C封閉lh。PBST清洗3遍后，待檢小鼠血清及陽(yáng)性陰性豬血清分別用含 1%脫脂奶粉PBST按1: 100稀釋后，每孔100 μ L加于封閉孔板中，于37°C孵育lh。PBST 清洗3次后，HRP標(biāo)記的二抗(Sigma)用含I %脫脂牛奶的PBST按1: 20000稀釋并每孔100 μ L加于封閉孔板中，于37°C孵育lh. PBST清洗3次后，50 μ L底物溶液(OPD，Sigma) 加于各孔中于37°C孵育15min。然后用50 μ L 2Ν H2SO4加于各孔終止顏色反應(yīng)，于490nm 檢測(cè)光密度(0D值)。結(jié)果顯示，和只用PCV2GST-0RF2表位蛋白免疫的小鼠相比，HMSNs/ PCV2GST-0RF2蛋白免疫組的抗體水平持續(xù)升高，免疫后第三周達(dá)到了最高峰，直至免疫后第五周降至和PCV2GST-0RF2蛋白免疫組相同的抗體水平。而PCV2GST-0RF2蛋白免疫組的抗體水平自免疫后第二周即達(dá)到最高水平，到免疫后第三周即開(kāi)始顯著下降。這說(shuō)明HMSNs 有明顯的蛋白緩釋作用，從而使緩釋的蛋白能夠持久的刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，參見(jiàn)圖5。
7) T-淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
分別在2、4、6周隨機(jī)收取I只小鼠將其脫頸處死，然后放入酒精中浸泡5min消毒，無(wú)菌取脾，加入ImL無(wú)血清1640培養(yǎng)液于200目銅網(wǎng)上研磨，用無(wú)血清RPMI 1640 培養(yǎng)液沖洗銅網(wǎng)，將研磨獲得的脾細(xì)胞懸液加入裝有2mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中， 40C 2500r/min離心lOmin，用長(zhǎng)針頭吸出淋巴細(xì)胞層放入新離心管中，用無(wú)Ca2+、Mg2+HankS 液洗兩次并以RPMI 1640培養(yǎng)液混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成IOVmL濃度。將稀釋好的淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞板中(100 μ L/孔)，每個(gè)樣品設(shè)4復(fù)孔，每孔加入GST-0RF2蛋白特異性刺激物10 μ g，同時(shí)以不加刺激物的淋巴細(xì)胞為對(duì)照，培養(yǎng)板在含5 % CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，加入20 μ L MTS/PMS混合試劑 (CellTiter 96Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay,Promega),于 37°C 培養(yǎng)4h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm的光密度值。計(jì)算刺激指數(shù)(stimulation index, SI)。 SI = PCV2刺激孔的平均0D490nm-未刺激組的平均0D490nm/未刺激組的平均0D490nm_空白1640培養(yǎng)液組的平均0D490nm。結(jié)果顯示，HMSNs/PCV2GST_0RF2表位蛋白免疫組小鼠的淋巴細(xì)胞經(jīng)特異的PCV2GST-0RF2蛋白刺激后，T-淋巴細(xì)胞的增值效果高于其他兩個(gè)免疫對(duì)照組，并且到第四周時(shí)顯著升高，而其他實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞免疫水平基本沒(méi)有顯著變化，到免疫后第六周，HMSNs/PCV2GST-0RF2刺激的淋巴細(xì)胞免疫水平雖然降低，但依舊高于其他實(shí)驗(yàn)組，這與抗體效價(jià)的變化規(guī)律基本一致，這說(shuō)明HMSNs作為疫苗載體，不僅能夠持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。而且其誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平能夠較其他實(shí)驗(yàn)組持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，這進(jìn)一步證實(shí)了 HMSNs作為疫苗載體的緩釋特性，參見(jiàn)圖6。
8) T-淋巴細(xì)胞亞群分布檢測(cè)
取脾臟分離淋巴細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至6 X IO6個(gè)/mL。各取100 μ L 分別加入APC標(biāo)記的抗鼠⑶4+、ΡΕ標(biāo)記的抗鼠⑶8+單克隆抗體(APC、PE均購(gòu)自BD公司)， 混勻后置于4°C避光30min,以預(yù)冷的PBS洗兩遍,4°C 2000r/min離心5min,棄上清,沉淀用 350 μ L預(yù)冷的PBS重懸，用流式細(xì)胞儀分析T淋巴細(xì)胞亞群。T-淋巴細(xì)胞亞群⑶4+、⑶8+ 增值分布的結(jié)果顯示，HMSN/PCV2GST-0RF2表位蛋白復(fù)合物能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且其T淋巴細(xì)胞反應(yīng)更傾向于CD8+細(xì)胞亞群，參見(jiàn)圖7，但這種傾向和刺激CD4+細(xì)胞亞群的免疫反應(yīng)沒(méi)有明顯差異。
9) INF- Y 的檢測(cè)
取采自第2、4、6周的小鼠血清，每組隨機(jī)取3個(gè)樣，將其用稀釋液R(IX) I 50 稀釋。采用mouse IFN -y預(yù)包被ELISA kit (Dakewei)檢測(cè)小鼠IFN-Y，根據(jù)實(shí)驗(yàn)孔(空白和標(biāo)準(zhǔn)品)數(shù)量，確定所需的板條數(shù)目。操作步驟如下①分別將稀釋后的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔，樣品加至樣品孔(lOOuL/well)，并以稀釋液R(IX)設(shè)置空白孔。②加入稀釋后的生物素化的抗體(50uL/Well)震蕩混勻后，蓋上封板膜，37°C溫育90min。③棄去孔內(nèi)液體，以I Xwashing buffer洗板(300uL/well),重復(fù)4次,每次拍干。④加入稀釋后的Streptavidin-HRP (100uL/well),蓋上封板膜，37°C溫育30min。⑤棄去孔內(nèi)液體，以 I Xwashing buffer洗板(300uL/well),重復(fù)4次，每次拍干。⑥加入TMB顯色(IOOul/ well), 37°C避光溫育5_30min之間。⑦迅速加入Stop solution (100uL/well)終止反應(yīng)。 ⑧終止后10分鐘內(nèi)，用檢測(cè)波長(zhǎng)(measurement wavelength) 450nm讀值。結(jié)果顯示HMSN/ GST-0RF2蛋白免疫組小鼠的IFN-Y含量明顯高于其他組兩個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明HSMN作為疫苗載體能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生顯著的細(xì)胞因子反應(yīng)，參見(jiàn)圖8。
本發(fā)明首次采用HMSN納米顆粒作為豬圓環(huán)病蛋白疫苗的載體，使承載到納米顆粒上的病毒免 疫原蛋白緩慢釋放，從而獲得持久的抗原刺激和長(zhǎng)時(shí)間的免疫持續(xù)期，為 PCV2的新型疫苗及疫苗載體的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供新的思路，并為HMSN用于疫苗載體提供了實(shí)證。
權(quán)利要求
1.一種具有多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒用于運(yùn)載豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白，這種納米載體顆粒的直徑為100 200nm。
2.權(quán)利要求1所述的運(yùn)載豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白的納米載體在制備豬圓環(huán)病毒疫苗中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的蛋白載體承載豬圓環(huán)病毒PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法，其特征在于將具有多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒溶于pH 7.0的磷酸緩沖液中配制成多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒的懸液，再在其中加入PCV2GST-ORF2表位蛋白，室溫下充分?jǐn)嚢?，使多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒充分吸附蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白載體承載豬圓環(huán)病毒PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法，其特征在于所配制的多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒懸液的濃度為10mg/mL，然后在IOmL懸液中加入0. 5mg的PCV2GST-0RF2表位蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒(HMSNs)一種用途，即將其用于運(yùn)載豬圓環(huán)病毒抗原PCV2GST-ORF2表位蛋白，這種納米載體顆粒的直徑為100～200nm，本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒承載PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法，即將具有所述的硅納米顆粒溶于磷酸緩沖液中，再在其中加入PCV2GST-ORF2表位蛋白，使多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒充分吸咐蛋白。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，用多孔結(jié)構(gòu)的空心球狀硅納米顆粒作為豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白載體，可以實(shí)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒抗原表位蛋白在免疫小鼠體內(nèi)緩慢釋放，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效果。
文檔編號(hào)C07K17/14GK103012594SQ20111028838
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者郭慧琛, 孫世琪, 馮小明, 孫德惠, 劉湘濤, 殷紅 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所