專利名稱：三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子 PtALF-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)重要海水養(yǎng)殖品種。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大以及集約化程度不斷提高，由細(xì)菌、真菌等引起的多種疾病在三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體中頻頻爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了三疣梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。由于對(duì)三疣梭子蟹的免疫系統(tǒng)缺乏深入了解，目前蟹病的防治仍主要采用傳統(tǒng)抗生素藥物防治，但長(zhǎng)期盲目濫用藥物，造成抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，非但難以有效地控制病情，反而帶來(lái)資金的浪費(fèi)，蟹品質(zhì)的下降，環(huán)境污染及對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅等不良后果。因此，這就迫切需要從三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型的抗菌藥物進(jìn)行免疫防治?？怪嗵且蜃?ALF)是一種能夠結(jié)合脂多糖(LPS)并中和其毒性作用的小分子抗菌肽，因其作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同，細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)正常真核細(xì)胞無(wú)毒害，日益受到廣泛關(guān)注。ALF最初是從美洲鱟中發(fā)現(xiàn)，它可以結(jié)合LPS，并對(duì)R型革蘭氏陰性菌有明顯的抑制生長(zhǎng)作用。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，鱟ALF結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基， 它們形成二硫鍵所限制的β折疊區(qū)域即為L(zhǎng)PS結(jié)合域。體外合成鱟ALF的LPS結(jié)合域，證明其確實(shí)可以與LPS結(jié)合，能夠在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，有助于保護(hù)小鼠免受內(nèi)毒素的攻擊。隨后，從對(duì)蝦、螯蝦、蟹等甲殼動(dòng)物中也鑒定或克隆出多種抗脂多糖因子。研究表明這些甲殼動(dòng)物ALF的表達(dá)水平在細(xì)菌刺激后明顯上調(diào)，其重組蛋白能夠抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，提示ALF在甲殼動(dòng)物固有免疫中發(fā)揮重要作用。到目前為止，關(guān)于三疣梭子蟹抗脂多糖因子的報(bào)道較少。因此，識(shí)別、定性抗菌效應(yīng)分子-抗脂多糖因子對(duì)研究三疣梭子蟹的免疫防御機(jī)制和進(jìn)行病害防治具有重要的理論和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2 基因?yàn)樾蛄斜鞸EQ ID No. 1中的堿基序列所示。三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因編碼蛋白所述PtALF-2基因編碼蛋白為序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。
三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因編碼蛋白的應(yīng)用所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因的重組表達(dá)產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、免疫增強(qiáng)劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因的重組表達(dá)產(chǎn)物可作為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌藥物。所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、愛(ài)德華氏菌， 革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)(EST)、RACE技術(shù)從三疣梭子蟹中克隆到PtALF-2 基因cDNA全長(zhǎng)序列，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼PtALF-2成熟肽的基因片段并將其克隆到 pET32a(+)表達(dá)載體中，在大腸桿菌BL21(DE;3)-plysS實(shí)現(xiàn)體外重組表達(dá)。重組蛋白經(jīng) TALON柱純化和透析復(fù)性后，對(duì)革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、 革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為 1. 02μΜ、2· 04μΜ、4· 07 μ Μ、16. 30μΜ、65· 19 μ M ；而對(duì)真菌畢赤酵母沒(méi)有明顯的抑制作用。本發(fā)明基因及其重組蛋白在藥物生產(chǎn)、免疫增強(qiáng)劑、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產(chǎn)中的應(yīng)用，另外還可以進(jìn)一步研究三疣梭子蟹免疫防御機(jī)制提供基礎(chǔ)，并為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑。


圖1為本發(fā)明實(shí)例提供的純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2編碼成熟肽的基因擴(kuò)增產(chǎn)物(其中，M =DNA marker, 1 成熟肽的基因擴(kuò)增產(chǎn)物)。圖2為本發(fā)明實(shí)例提供的誘導(dǎo)和純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2重組蛋白(其中M 蛋白marker ;1 未誘導(dǎo)菌體中表達(dá)的蛋白；2 :IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白；3 純化的重組蛋白)。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。本發(fā)明中的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2的cDNA序列克隆包括下列步驟a)三疣梭子蟹總RNA的提取及mRNA的純化；b)三疣梭子蟹cDNA文庫(kù)構(gòu)建；c)三疣梭子蟹cDNA文庫(kù)EST序列的大規(guī)模測(cè)定；d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtALF-2基因片段的篩選；e) RACE擴(kuò)增獲得PtALF-2的全序列以及全序列的驗(yàn)證。實(shí)施例1.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因?yàn)镾EQ ID No. 1中所示的堿基序列。序列表SEQ ID No. 1 為:ggggagtcac tatccgaggt accccaaaga gggacatcaa aagcattgaagactacgcaa ctaaacttcg ctcaag atg egg aaa ggg gtg gtgacc ggc ctg ttc gtg gcg ctg gtg gtg atg tgt ctg tac ttgccc cag ccc tgc gag get cag tat gaa get ctg acg get get
att ttg aca aag ctg tea aaa atg tgg cac agt gac act ctgaat ttc ttg ggc cac acc tgc cac gtc age cgt act ccg acggtc aag cgc ttt aag ctg tac tgg aag ggc aag ttt tgg tgtcct ggt tgg gcg cct ttc agt ggc act tcg agg acc aag ageagg tea gga tea gcc aga gag gcc acc aag agt ttt gtg gaccaa get tta cag cgc aga ctt ate acg cag caa gaa gcg gacctc tgg ctg aag ggg taa tgggtgctca cgccgatgca tggggaggaggccgagtggg aggagagtga agataaagaa gaaatgactt gtgtctgatctaaaacgagt ttttaaaatt tttttatttc cagttataca ElCCclCclclCclclcaactgctag tactgcatta ttactgattg taagaagtat tttgaactaaaagtaatttc agataatggc tgttaatatt aaggaaatac atgtaattgtattggaaagt atcctaactg aagcattttc tattttccta tccttttctttcctctcttt catgtctgcc tataacattc cggattaatg aacgaaaaaatgatagaaag aaaagtaaaa tacaactgaa taaatgtcaa aggaagcaatcttgaaattt agttcaaacg taaaaaaacg aaaaatctta ttttcattatttagaataaa ccaaatatac aagactcatg cttgcgttat tatgaaagtctgaagaaaaa cccgagatga aaatgaatgc acgagtctta attgtgcatgaaatgttgga aggaatggat tgaacgctga ttgagatctg aaatattcatatgactttca gttgcgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa(a)序列特征 長(zhǎng)度1078bp (有效長(zhǎng)度 77-448) 類型堿基序列 鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(f)特異性名稱CDS構(gòu)建具體操作如下1.三疣梭子蟹總RNA的提取及mRNA的純化利用hvitrogen公司的Trizol試 劑提取三疣梭子蟹總RNA，利用QIAGENE公司的Oligitex mRNA純化試劑盒純化mRNA。2.三撫梭子蟹cDNA文庫(kù)構(gòu)建利用Clontech公司的Creator Smart cDNA Library Construction Kit試劑盒使用說(shuō)明構(gòu)建cDNA文庫(kù)。以純化后的mRNA為模板， SMART IV Oligonucleotide(5‘ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG 3')和CDS III/3'PCR Primer (5‘ ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) 30N_iN 3')為引物，在反 轉(zhuǎn)錄酶(MMLV reverse transcriptase)作用下轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈。用 5' PCRPrimer ( 5' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3‘)和 CDSII1/3' PCR Primer (5‘ ATTCTAGAGGCCGAGGCG GCCGACATG-d(T) 30N 3')為引物經(jīng) long distance (LD-PCR)合成 cDNA 第二鏈。雙鏈cDNA(ds cDNA)在45°C條件下經(jīng)蛋白酶K(0. 8mg/ml)消化20min，然后用Sf Π酶進(jìn)行酶切， 酶切產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit回收1-31Λ的片段。將回收的片段與載體pDNR-LIB連接后純化，通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37°C條件下220rpm/min培養(yǎng)lh，加入終體積20%的甘油，即為全長(zhǎng)cDNA 原始文庫(kù)。3.三疣梭子蟹cDNA文庫(kù)EST序列的大規(guī)模測(cè)定文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，使用載體通用引物M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')在ABI3730xl測(cè)序儀上進(jìn)行序列測(cè)定，將得到的原始峰圖文件(*. abl，*. abd文件)數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(*. seq) 和質(zhì)量文件(*. seq. qual)，依據(jù)質(zhì)量文件提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除低質(zhì)量的堿基，用cross-match程序屏蔽數(shù)據(jù)中的載體序列，從得到的數(shù)據(jù)中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于Q13(準(zhǔn)確率大于95% )且長(zhǎng)度大于IOObp的序列作為EST數(shù)據(jù)，具體《基因表達(dá)序列(EST)數(shù)據(jù)分析手冊(cè)》(胡松年著，浙江大學(xué)出版社，2005年)。4.三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtALF-2基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲得的Contigs與 Singletons在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn和BLASTx分析，結(jié)果顯示在EST序列中發(fā)現(xiàn)了與擬穴青蟹抗脂多糖因子相似性較高(69%)的序列，根據(jù)相似性分析結(jié)果確定了三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因的EST序列。5.三疣梭子蟹PtALF-2基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆根據(jù)與 PtALF-2基因同源的EST序列設(shè)計(jì)特異弓丨物Fl (5 ‘ CCAGTTATACAACCACAACA 3 ‘)和Rl(5 ‘ TTCAGTTAGGATACTTTCCA 3 ‘)，分別利用載體通用引物 M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')禾口 M13R(5' CAGGAAACAGCTATGACC 3')進(jìn) 亍 3'禾口 5'末端的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用Axygen膠回收試劑盒進(jìn)行 PCR產(chǎn)物回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Transl-Tl (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，挑選陽(yáng)性克隆用載體引物Μ13-47 和RV-M進(jìn)行測(cè)序，所得結(jié)果經(jīng)Wired/Wirap軟件進(jìn)行拼接，得到三疣梭子蟹PtALF-2基因全長(zhǎng)cDNA序列見(jiàn)SEQ ID No. 1。6.三疣梭子蟹PtALF-2基因cDNA全長(zhǎng)的驗(yàn)證在測(cè)序拼接的PtALF-2 全長(zhǎng)序列上設(shè)計(jì)一對(duì)引物F2(5 ‘ GCATTGAAGACTACGCAACTAAAC 3 ‘)和 R2(5' ATCAGCGTTCAATCCATTCCTTCC 3')，以cDNA為模板進(jìn)行全長(zhǎng)的驗(yàn)證。測(cè)序及分析同 5。3' RACE擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件25 μ 1反應(yīng)體系
6IOxPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5 μ 1
dNTP (IOmM)0. 5 μ 1
引物 Π (5μΜ)Ιμ
引物 M13R(5)iM)1 μ 1
cDNA文庫(kù)模板1 μ 1
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
ddH2017. 3μ 1 反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為:94°C變性:3min ；94°C變性30s，58. 5°C退火50s，72°C延伸lmin，;34個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0
5' RACE擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 25 μ 1反應(yīng)體系
IOxPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5 μ 1
dNTP (IOmM)0. 5 μ 1
引物 Μ(5μΜ)1μ 1
引物 M13F(5(jM)1 μ 1
cDNA文庫(kù)模板1 μ 1
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
ddH2017. 3μ 1 反應(yīng)在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為94°C變性:3min ；94°C變性30s，57°C退火50s，72°C延伸lmin，;34個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0
全長(zhǎng)驗(yàn)證的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為 25 μ 1反應(yīng)體系
IOxPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5 μ 1
dNTP (IOmM )0. 5 μ 1引物 F2 (5μΜ)Ιμ
引物 R2 (5μΜ)1μ 1
CDNA文庫(kù)模板1 μ 1
Taq DNA 聚合時(shí)(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
ddH2017. 3 μ 1反應(yīng)在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為94°C變性:3min ；94°C變性30s，55°C退火50s，72°C延伸lmin，;34個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0序列表SEQ ID No. 1從三疣梭子蟹中克隆到PtALF_2基因cDNA全長(zhǎng)1078bp，其中開(kāi)放閱讀框372bp，5'非翻譯區(qū)76bp，3'非翻譯區(qū)618bp，有多聚腺苷酸尾巴。實(shí)施例2.
三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2序列表SEQ ID No. 1所述堿基序列，所述的氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所述。序列表SEQ ID No. 2 為Met Arg LysGly Val ValThr GlyLeuPheValAlaLeuValValMet
Cys Leu TyrLeu Pro GlnPro CysGluAlaGlnTyrGluAlaLeuThr
Ala Ala IleLeu Thr LysLeu SerLysMetTrpHisSerAspThrLeu
Asn Phe LeuGly His ThrCys HisValSerArgThrProThrValLys
Arg Phe LysLeu Tyr TrpLys GlyLysPheTrpCysProGlyTrpAla
Pro Phe SerGly Thr SerArg ThrLysSerArgSerGlySerAlaArg
Glu Ala ThrLys Ser PheVal AspGlnAlaLeuGlnArgArgLeulie
Thr Gln GlnGlu Ala AspLeu TrpLeuLysGly其具有完整的編碼蛋白含有123個(gè)氨基酸，其中編碼序列的146個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，成熟肽包含97個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量為11. 15kDa，等電點(diǎn)為10. M。成熟肽具有典型的抗脂多糖因子模式結(jié)構(gòu)兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基和保守單元W(T)CPGWT(A),兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，構(gòu)成一個(gè)典型的β發(fā)夾結(jié)構(gòu)。三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2重組蛋白的獲得，具體操作如下根據(jù)SEQ ID No. 2對(duì)應(yīng)的cDNA序列，設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶BamHI和BioI酶切位點(diǎn)的特異性引物 F3 (5 ‘ GGATCCCAGTATGAAGCTCTGACGG 3')和 R3 (5 ‘ CTCGAGTTACC CCTTCAGCCAGAGGTCC 3')，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼PtALF-2成熟肽的基因片段(參見(jiàn)圖 1), β,Ι^ TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中 于， 反應(yīng)條件為94°C變性:3min ；94°C變性30s，58 °C退火50s，72 °C延伸30s，34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。然后通過(guò)酶切將其克隆到pET3h(+)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)-plysS，測(cè)序確認(rèn)表達(dá)框正確后，接種陽(yáng)性克隆到LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至 0. D. 600 = 0. 4-0. 6，加入IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)4小時(shí)后離心收集菌體。菌體在冰浴條件下用超聲波180W處理30-60min (每次k，間隔k)，離心去掉上清，收集沉淀(含重組蛋白包涵體)。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON柱純化重組產(chǎn)物。將純化的重組蛋白轉(zhuǎn)移到透析袋中，4°C條件下，在含有2mM還原谷胱苷肽、0. 2mM氧化谷胱苷肽、ImM EDTA、50mM Tris_HCl、50mM NaCl、10%甘油和1 %甘氨酸的及梯度降低的尿素 (6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M)的透析復(fù)性液(pH = 8. 0)中透析，使重組蛋白復(fù)性，最后在50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)的緩沖液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析復(fù)性后的重組蛋白經(jīng)PALL公司的Micros印Advance超濾離心濃縮管進(jìn)行濃縮，用碧云天公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2重組蛋白的濃度為3. 76mg/ml (參見(jiàn)圖2)。實(shí)施例3.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2重組蛋白的體外抑菌試驗(yàn)1.微生物的培養(yǎng)及制備溶藻弧菌用TSB培養(yǎng)基^°C，銅綠假單胞菌用TSB培養(yǎng)基37°C，遲緩愛(ài)德華氏菌用LB培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌用LB培養(yǎng)基37°C，藤黃微球菌用LB培養(yǎng)基37°C，畢赤酵母用YPD培養(yǎng)基28 V，上述各菌株用搖床220rpm/min培養(yǎng)使菌濃度達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分別用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)緩沖液稀釋菌體，分別使其每毫升菌液中的菌落數(shù)約為1X103。2.重組蛋白PtALF-2抑菌活性測(cè)定利用上述實(shí)施例所得重組蛋白PtALF_2用 Tris-HCl (50mM,pH = 8. 0)梯度稀釋(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256)后， 取 50μ 1 加到無(wú)菌平底 96 孔板(Costar，F(xiàn)isher)中，50 μ 1 Tris-HCl (50mM, pH = 8. 0) 設(shè)為對(duì)照，然后加入50 μ 1稀釋好的菌懸液，并且混勻。只加入50 μ 1菌液的孔為空白孔。 96孔板在菌液的培養(yǎng)溫度下孵育3小時(shí)后，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基150 μ 1，空白孔加入培養(yǎng)基 200μ 1，孵育過(guò)夜。加溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、畢赤酵母的96孔板在波長(zhǎng)為560nm的可見(jiàn)光下讀數(shù)，加金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的96孔板在波長(zhǎng)為600nm的可見(jiàn)光下讀數(shù)。發(fā)現(xiàn)上述實(shí)施例重組蛋白PtALF-2對(duì)革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌和遲緩愛(ài)德華氏菌、革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度分別為1. 02μΜ、2· 04μΜ、4· 07 μ Μ、16. 30μΜ、65· 19 μ M ；而對(duì)真菌畢赤酵母沒(méi)有明顯的抑制作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因，其特征在于三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因?yàn)樾蛄斜鞸EQ ID No. 1中的堿基序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因編碼蛋白，其特征在于所述PtALF-2基因編碼蛋白為序列表SEQ IDNo. 2中氨基酸序列所示。
3.一種按權(quán)利要求2所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因編碼蛋白的應(yīng)用， 其特征在于所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因的重組表達(dá)產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、免疫增強(qiáng)劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。
4.按權(quán)利要求3所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因編碼蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因的重組表達(dá)產(chǎn)物可作為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌藥物。
5.按權(quán)利要求4所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因編碼蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛(ài)德華氏菌，革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。本發(fā)明利用cDNA文庫(kù)和RACE技術(shù)從三疣梭子蟹中擴(kuò)增到PtALF-2基因cDNA，該基因在三疣梭子蟹免疫防御方面發(fā)揮著重要作用。重組的PtALF-2蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌和遲緩愛(ài)德華氏菌、革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為1.02μM、2.04μM、4.07μM、16.30μM、65.19μM；而對(duì)真菌畢赤酵母沒(méi)有明顯的抑制作用。本發(fā)明為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102337271SQ20111029045
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者劉媛, 崔朝霞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所