專利名稱：表沒食子兒茶素(egc)單體的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從綠茶提取物中分離純化表沒食子兒茶素(EGC)單體的方法，屬于食品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
兒茶素類物質(zhì)具有明顯的抗衰老、防癌抗突變、去脂減肥、降低血糖、血脂和膽固醇、預(yù)防心血管疾病等藥理功能，已廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健和日用化工等領(lǐng)域 (王婧，高玉堂.茶多酚抗癌的流行病學(xué)研究[J].腫瘤，2011，31 (6): 553-556;劉學(xué)銘，梁世中.茶多酚的保健和藥理作用及應(yīng)用前景[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1998， 24 (5) 47-51, 71 ； Yokozawa Tx, Dong Ex, Nakagawa Tx, el al. In vitro and in vivo studies on the radical scavenging activity of tea [J]. J Agric Food Chem, 1998,46(6) :2143-2150)。2006年10月，美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)茶多酚作為新的處方藥，用于局部(外部)治療由人類乳頭瘤病毒引起的生殖器疣，這是FDA根據(jù)1962 年藥品修正案條例首個(gè)批準(zhǔn)上市的植物(草本)藥(黃芳華.從美國首個(gè)被批準(zhǔn)植物藥探討中藥藥代動力學(xué)研究與評價(jià)策略[J].中國中藥雜志，2010，35(7):932-935).過去的二十年中，由于有關(guān)茶多酚/兒茶素的保健與藥理功能研究的突破，不僅擴(kuò)大了綠茶在國際市場上的份額，而且極大地推進(jìn)了茶葉提取物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為茶葉功能成分的研究與開發(fā)奠定了良好的產(chǎn)業(yè)與市場基礎(chǔ)，目前，我國已經(jīng)形成年產(chǎn)約5000噸茶多酚/兒茶素的產(chǎn)業(yè)規(guī)模。兒茶素粗品傳統(tǒng)的提取分離工藝主要包括離子沉淀法、有機(jī)溶劑萃取法和吸附柱色譜法(黃思勇，金顯平，康振興，干國平.茶葉下腳料中茶多酚的提取純化工藝研究[J]·湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(4): 30-32;張盛，劉仲華，黃建安，劉愛玲，施兆鵬.吸附樹脂法制備高純兒茶素的研究[J].茶葉科學(xué)，2002,22 (2) :125-130;胡莉娟. 綠茶中茶多酚的提取工藝研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26 03):^6-4 )。兒茶素藥理保健功能研究與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中最令人注目的是表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC，分子式C15H14O7)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，因而成為兒茶素單體分離、純化與臨床應(yīng)用研究的焦點(diǎn)。但是由于茶葉的成分復(fù)雜，從茶葉中制取高純度的兒茶素單體具有相當(dāng)難度。其技術(shù)難點(diǎn)是精細(xì)分離，同時(shí)還應(yīng)防止有效物及茶葉賦有的天然風(fēng)味不被破壞和損失，加工過程盡量采用低溫。目前國內(nèi)外比較成功的應(yīng)用于EGCG單體分離制備的工藝主要包括高速逆流色譜萃取、模擬移動床色譜分離等技術(shù)(Zhang Ying, Shi Zhao-peng, Nie Hong-yong, et al. Preparative Isolation and Purification of Catechins from Green Tea Extract by Preparative Counter-current Chromatography [J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Science), 2003， 29(5): 408-411，417 ；黃永東，江和源，江用文，等.傳統(tǒng)SMB、Varicol和Partial-discard工藝分離純化ECG和EGCG的比較研究[J].荼葉科學(xué)，2011，31 (3) :201_210)。研究表明，EGC 在誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡(David Vergotej CTecile Cren-Oliv^ej Val'erie Chopin, et al. ( )-Epigallocatechin (EGC) of green tea induces apoptosis of human breastcancer cells but not of their normal counterparts [J]· Breast Cancer Research and Treatment, 2002, 76: 195-201 )，食品抗氧化、抑菌上具有顯著功效(Zhen-Yu Chen, Li-Ya Wang, Ping Tim Chan, et al. Antioxidative activity of green tea catechin extract compared with that of rosemary extract [J]. JOURNAL OF THE AMERICAN OIL CHEMISTS' SOCIETY, 1998，75(9) : 1141-1145)，同時(shí)可降低茶飲料苦澀味，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，為茶葉提取物深度開發(fā)與利用提供了新的途徑。迄今，國內(nèi)外尚未有EGC單體分離純化方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從綠茶提取物中分離純化表沒食子兒茶素單體的方法，該方法簡便，單體提取率及產(chǎn)品純度高，制備周期短，成本低。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種從綠茶提取物中分離純化表沒食子兒茶素單體的方法，該方法包括如下步驟
(1)加入純水溶解綠茶提取物茶多酚，配置成濃度為5%(w/v)的溶液，加入檸檬酸調(diào)節(jié) PH,值4.0 5.0，保持溫度35 401，茶湯料液備用；
(2)按照茶湯料液0.02%(w/v)的重量加入單寧酶，靜置酶解，間歇攪拌；離心過濾，取澄清液噴霧干燥，得到噴霧干粉；
(3)加入水溶解上述噴霧干粉配置成濃度為3%(w/v)的上柱料液，吸附樹脂柱分離純化，解吸溶劑為乙醇，高效外循環(huán)濃縮回收乙醇至酒精度<5，再用反滲透膜濃縮解吸餾分， 將濃縮后的解吸餾分離心、噴霧干燥得到干燥產(chǎn)品；
(4)將上述干燥產(chǎn)品用3、倍量(w/v)95%乙醇溶解，放置，結(jié)晶，將晶體冷凍干燥，得白色固體，即為表沒食子兒茶素單體。本發(fā)明方法的第(2)步中，加入單寧酶酶解，可以將表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (EGCG)水解成為表沒食子兒茶素(EGC)和沒食子酸，從而提高粗品中EGC的含量，為后續(xù)樹脂分離工藝提供較高含量底物，同時(shí)減少分離過程中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的影響。上述的方法，(2)步中所述單寧酶的酶活力為200— 500 U/mg,為諾維信公司的 NS-33049,酶活力 2 U/mg ；Fluka 公司的 Tannase，酶活力 314U/ mg ；或 Kikkoman 公司的 Tannase，酶活力500U/ mg產(chǎn)品之一。上述的方法，第(2)步中，加入單寧酶，靜置酶解4小時(shí)，間歇30分鐘攪拌5分鐘； 1000 r/min離心過濾，內(nèi)襯200目絹布袋，取澄清液用離心噴霧塔噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度 160°C 180°C，排風(fēng)溫度 70°C 80°C。
上述的方法，第(3)步所述的吸附樹脂柱分離純化，其中，樹脂用量40倍EGC粗品重量；上柱流速1. 0 BV/h ；解吸溶劑2BV 60%乙醇；解吸流速1. 0BV/h,收集乙醇解吸餾分，高效外循環(huán)濃縮回收乙醇至酒精度<5，溫度控制在45°C以下，真空度控制在-0. OSMpa 以下，再用反滲透膜濃縮時(shí)操作溫度控制在40°C以下，進(jìn)膜壓力控制在15 Bar以下；所述吸附樹脂為HP20、NKA-9、聚酰胺或HPD100之一。上述的方法，第(4)步中，放置溫度為4°C，結(jié)晶，濾紙常壓過濾后將晶體冷凍干燥，產(chǎn)品首先降溫至-40°C預(yù)凍結(jié)，然后開始抽真空，真空度至30 時(shí)開始加熱升華干燥，控制產(chǎn)品溫度不超過20°C，干燥時(shí)長12 1他。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明方法以綠茶提取物為原料，聯(lián)用單寧酶酶解工藝，經(jīng)過單寧酶酶解，吸附樹脂柱色譜與反滲透膜濃縮技術(shù)，從綠茶提取物中分離純化表沒食子兒茶素(EGC純度>98%)單體，優(yōu)化了產(chǎn)品分離純化工藝流程，單體提取率及產(chǎn)品純度高。產(chǎn)品沒有傳統(tǒng)茶葉提取物的苦澀味，具有醇和回甘的滋味和良好的溶解性，是高效型功能飲料開發(fā)的首選原料。由于其風(fēng)味上具有較好的中和性，也是許多功能食品開發(fā)的重要原料，可單獨(dú)或者與維生素類物質(zhì)復(fù)配應(yīng)用于食品、藥品和保健品領(lǐng)域。方法簡便，制備周期短，成本低，符合環(huán)保和安全的要求，適宜規(guī)模型工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。從綠茶提取物中分離純化表沒食子兒茶素單體的方法，該方法包括如下步驟
1、利用單寧酶將綠茶提取物中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)轉(zhuǎn)化為表沒食子兒茶素(EGC)
(1)加入純水溶解綠茶提取物95%茶多酚(95%茶多酚購自長沙三福生物科技有限公司，其中總兒茶素含量為76. 50%，EGC含量為5. 60%，EGCG含量為43. 80%)，配置成濃度為5% (w/v)的溶液，加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH= 4. 20，保持溫度37土 1°C，茶湯料液備用；
(2)按照茶湯料液0.02% (w/v)的重量加入單寧酶，靜置酶解4小時(shí)，間歇30分鐘攪拌 5分鐘；1000 r/min三足離心機(jī)離心過濾，內(nèi)襯200目絹布袋，取澄清液用離心噴霧塔噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度160°C 180°C，排風(fēng)溫度70°C 80°C，一級旋風(fēng)分離器每隔30分鐘取出噴霧干粉。上述的單寧酶為諾維信公司的NS-33049，酶活力2 U/mg ;Fluka公司的 Tannase，酶活力 314U/ mg ；或 Kikkoman 公司的 Tannase，酶活力 500U/ mg 產(chǎn)品之一。2、將上述噴霧干粉經(jīng)吸附樹脂柱色譜分離純化
(1)純水溶解噴霧干粉配置成濃度為3%(w/v)的上柱料液，吸附樹脂柱分離純化(吸附樹脂為HP20、NKA-9、聚酰胺或HPD100之一；樹脂用量40倍EGC粗品重量；上柱流速1. 0 BV/h ；解吸溶劑:2BV 60%乙醇；解吸流速1. OBV/h)；
(2)收集解吸餾分，高效外循環(huán)濃縮回收乙醇至酒精度<5，再采用反滲透膜系統(tǒng)進(jìn)一步濃縮解吸餾分，反滲透膜操作溫度控制在40°C以下，進(jìn)膜壓力控制在15 Bar以下(具體操作可參考孫艷娟，朱躍進(jìn)，李大偉，等.膜分離技術(shù)在香菇速溶茶開發(fā)中的應(yīng)用研究 [J].中國茶葉加工，2010, (4): 42-45 ；鄭遠(yuǎn)斌，郁軍，陳添順，等.冷凍干燥工藝原理及相關(guān)設(shè)備裝置[J].速溶羅漢果粉的研制，2010，31(18): 450-452)。離心、噴霧干燥得到干燥產(chǎn)品。3、將上述干燥產(chǎn)品用3、倍量(w/v) 95%乙醇溶解，4°C放置結(jié)晶處理，濾紙常壓過濾后將晶體冷凍干燥，具體過程是首先將產(chǎn)品降溫至-40°C預(yù)凍結(jié)，然后開始抽真空， 真空度至30 時(shí)開始加熱升華干燥，控制產(chǎn)品溫度不超過20°C，干燥時(shí)長12 1他(具體操作可參考朱傳江.冷凍干燥工藝原理及相關(guān)設(shè)備裝置[J].齊魯藥事，2006，25(8):503-504 ；徐成海，張世偉，關(guān)奎之，等.幾種物料的冷凍干燥實(shí)驗(yàn)[J].真空與低溫， 1998，4(3): 161-164;沈善明.熱敏性藥品的干燥[J].醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)，2010，31(6): 1-4)，得白色固體。4、將第3步得到的白色固體與表沒食子兒茶素(EGC)標(biāo)準(zhǔn)品(購自美國 Sigma-Aldrich 公司，C15H14O7,M. W. 306. 27，編號E3768，純度彡 95%(HPLC))對照鑒定并經(jīng)高效液相色譜法分析檢測(具體鑒定、檢測方法可參考丁平平，李延芳，宋航，等.兒茶素單體的分析方法比較[J].四川化工，2005，8 (4): 38-41 ；吳迪，楊麗珠，仇佩虹，等. 茶中兒茶素的分離分析方法研究進(jìn)展[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(4): 468-472;劉婷，楊紅梅，郭啟雷，等.高效液相色譜法測定茶飲料中兒茶素[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2009， 28: 277480 ；谷勛剛，蔡繼寶，張正竹，等.HPLC-DAD分析紅茶兒茶素類物質(zhì)和咖啡因的方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，37 (1): 5-10)。鑒定、檢測結(jié)果為所述白色固體，分子量為306，(_) ESI-MS :305 [Μ — H]_， 熔點(diǎn)208 210°C.比旋光度-50° (C=0. 04, EtOH)，分子式為C15H14O7，表明所述白色固體為EGC單體，而且純度彡98%。
權(quán)利要求
1.一種從綠茶提取物中分離純化表沒食子兒茶素單體的方法，其特征在于包括如下步驟(1)加入純水溶解綠茶提取物茶多酚，配置成濃度為5%(w/v)的溶液，加入檸檬酸調(diào)節(jié) pH值4. 0 5. 0，保持溫度35 40°C，茶湯料液備用；(2)按照茶湯料液0.02%(w/v)的重量加入單寧酶，靜置酶解，間歇攪拌；離心過濾，取澄清液噴霧干燥，得到噴霧干粉；(3)加入水溶解上述噴霧干粉配置成濃度為3%(w/v)的上柱料液，吸附樹脂柱分離純化，解吸溶劑為乙醇，高效外循環(huán)濃縮回收乙醇至酒精度<5，再用反滲透膜濃縮解吸餾分， 將濃縮的解吸餾分離心、噴霧干燥，得到干燥產(chǎn)品；(4)將上述干燥產(chǎn)品用3 4倍量(w/v)95%乙醇溶解，放置，結(jié)晶，將晶體冷凍干燥， 得白色固體，即為表沒食子兒茶素單體。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(2)步中所述單寧酶的酶活力為 200—500 U/mg。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述單寧酶為諾維信公司的NS-33049， 酶活力 2 U/mg ;Fluka 公司的 Tannase，酶活力 314U/ mg ；或 Kikkoman 公司的 iTannase, 酶活力500U/ mg產(chǎn)品之一。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(2)步中，加入單寧酶，靜置酶解4小時(shí)，間歇30分鐘攪拌5分鐘；1000 r/min離心過濾，內(nèi)襯200目絹布袋，取澄清液用離心噴霧塔噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度160°C 180°C，排風(fēng)溫度70°C 80°C。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(3)步所述的吸附樹脂柱分離純化，其中，樹脂用量40倍EGC粗品重量；上柱流速1. 0 BV/h ；解吸溶劑2BV 60%乙醇；解吸流速1. OBV/h，反滲透膜濃縮時(shí)操作溫度控制在40°C以下，進(jìn)膜壓力控制在15 Bar以下。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述吸附樹脂為HP20、NKA-9、聚酰胺或 HPD100其中之一。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第(4)步中，放置溫度為4°C，結(jié)晶，濾紙常壓過濾后將晶體冷凍干燥，產(chǎn)品首先降溫至-40°C預(yù)凍結(jié)，然后開始抽真空，真空度至 30Pa時(shí)開始加熱升華干燥，控制產(chǎn)品溫度不超過20°C，干燥時(shí)長12 16h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從綠茶提取物中分離純化表沒食子兒茶素單體的方法，本發(fā)明方法以綠茶提取物為原料，經(jīng)過單寧酶酶解，吸附樹脂柱色譜吸附后以含水乙醇洗脫，收集富含表沒食子兒茶素(EGC)解吸餾分，高效外循環(huán)濃縮回收乙醇,再用反滲透膜低溫濃縮，結(jié)晶處理，最終冷凍干燥得到高純度的表沒食子兒茶素(EGC)單體。本發(fā)明方法簡便，單體提取率及產(chǎn)品純度高，制備周期短，成本低，適宜規(guī)模型工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07D311/62GK102443614SQ201110353889
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者劉仲華, 劉愛玲, 張盛, 肖文軍 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)