專利名稱：一種制備麥白霉素的新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵新技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微生物生產(chǎn)麥白霉素的方法。
背景技術(shù)：
麥白霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類多組分抗生素,有效成分主要為麥迪霉素Al和吉他霉素A6兩個組分，根據(jù)中國藥典2005版要求麥白霉素中麥迪霉素Al的組分不得低于35.0%,中國要求2010版將其要求提高到麥白霉素中麥迪霉素Al的組分不得低于48%，吉他霉素A6的組分不得低于12%。為此，給麥白霉素生產(chǎn)企業(yè)帶來了新的要求。麥白霉素系生米卡鏈霉菌在代謝過程中產(chǎn)生的16元環(huán)內(nèi)酯抗生素，是臨床上常用的一種廣譜抗菌藥，主要用于耐青霉素的葡萄球菌、鏈球菌和肺炎桿菌等感染的治療。抗菌性能與紅霉素相似，對葡萄球菌、鏈球菌、白喉桿菌、肺炎鏈球菌、百日咳桿菌、支原體等有抗菌作用?？诜蘸螅瑥V泛分布于各器官中，以肝、肺、脾中較高，膽汁中有很高濃度，尿中濃度很低，不能透過正常腦膜?？勺鳛榧t霉素的替代品，應用于敏感菌所致的口咽部、呼吸道、皮膚和軟組織，膽道等部位感染。據(jù)估計現(xiàn)臨床使用量在20億元人民幣左右。現(xiàn)階段，麥白霉素原料的生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法，但工業(yè)化生產(chǎn)工藝相對國外還比較落后，主要表現(xiàn)為:菌株發(fā)酵濃度低、發(fā)酵、提取工藝成本高、有機溶劑回收工藝復雜、能耗高、易造成環(huán)境污染等，難以滿足制劑開發(fā)的需要。針對上述不足，本發(fā)明以生米卡鏈霉菌為出發(fā)菌株，采用秈米粉水解液替代原有的發(fā)酵工藝中的碳源，增加發(fā)酵濃度，同時選用多烷基醇和烴類混合物替代現(xiàn)有的提取溶劑，降低了麥白霉素的提取成本和溶劑使用量，增加了麥白霉素產(chǎn)品總收率，生物效價高于中國藥典2010版要求。本發(fā)明解決了現(xiàn)行生產(chǎn)工藝產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染嚴重等缺點，更加適合工業(yè)化生產(chǎn)。
三、發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新穎的麥白霉素制備方式，其中包括新的麥白霉素發(fā)酵培養(yǎng)基和簡潔的麥白霉素提取方式。通過研究發(fā)現(xiàn),利用生米卡鏈霉菌(Streptomyces mycarofaciens)發(fā)酵生產(chǎn)麥迪霉素Al，A2, A3, A4，吉他霉素A6等，其中麥迪霉素Al和吉他霉素A6為麥白霉素的主要有效物，本發(fā)明根據(jù)麥迪霉素Al和吉他霉素A6的合成原理，改變常用的發(fā)酵碳源，提高麥迪霉素Al和吉他霉素A6的含量，同時，通過改變萃取溶液和萃取方法得到高提取率的麥白霉素。在本發(fā)明中，利用秈米粉水解液作為碳源，提高了菌絲生長速度，以及麥迪霉素Al和吉他霉素A6的單位發(fā)酵量；發(fā)酵結(jié)束后采用萃取和反萃取的方法，提高了有效物質(zhì)的提取率。
具體實施例方式下面結(jié)合實例對本發(fā)明技術(shù)方案進一步詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實例中所描述的方法，一般本行業(yè)技術(shù)人員均能讀懂。實施例1種子培養(yǎng)培養(yǎng)基:秈米粉水解液13%，蔗糖1%，蛋白胨0.2%，硫酸銨0.1%，磷酸二氫鉀
0.1%，其余為蒸餾水。①斜面種子培養(yǎng)用接種針取保藏的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，于28°C下培養(yǎng)7d。②一級種子培養(yǎng)液250mL的搖瓶內(nèi)加入50mL的種子培養(yǎng)基,滅菌冷卻后接一環(huán)生長良好的斜面培養(yǎng)物，于 28°C下，200r/min 培養(yǎng) 48h。③二級種子培養(yǎng)液5L的搖瓶內(nèi)加入3L的種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入60mL —級種子培養(yǎng)液，于28°C 下，200r/min 培養(yǎng) 48h。④三級種子培養(yǎng)液15L的搖瓶內(nèi)加入9L的種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入2.7L 二級種子培養(yǎng)液，于28°C 下，200r/min 培養(yǎng) 48h。發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基:秈米粉水解液13%，硫酸銨0.1 %，磷酸二氫鉀0.1 %，碳酸鈣
0.05%，其余為蒸餾水。50L全自動發(fā)酵罐內(nèi)加入25L發(fā)酵培養(yǎng)基和適量的消泡劑，0.1MPa下滅菌30min，冷卻至28°C，接入8.0L三級種子培養(yǎng)液，通氣量為0.8-1.0V/V/min，攪拌速度為500_700r/min,發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵48h后，離心獲得麥白霉素發(fā)酵液。麥白霉素的提?、佥腿≡谳腿」迌?nèi)加入定量的麥白霉素發(fā)酵液，用20 %的NaOH溶解調(diào)節(jié)pH值至8.0-9.0，再加入2倍體積的異辛醇和異辛烷(V/V = 4: I)的萃取溶液，升溫至35-40°C振蕩30min，使之充分混勻，靜置分層，收集有機溶液部分，獲得麥白霉素的萃取液。②反萃取在反萃取罐內(nèi)加入定量的麥白霉素萃取液，后加入2倍體積的鹽酸溶液(pH =
1.2-1.5)，常溫下振蕩30min，使之充分混勻，靜置分層，去有機溶液層，收集獲得麥白霉素反萃取液。③制備取定量麥白霉素反萃取液,加入堿液靜置過夜進行結(jié)晶，后抽濾獲得麥白霉素結(jié)晶，干燥后獲得麥白霉素成品，麥白霉素的總收率為67%，麥白霉素的生物效價為IlOOu/
mLo根據(jù)中國藥典2010版檢測，麥迪霉素Al含量為49%，吉他霉素A6含量為13%。實施例2種子培養(yǎng)同實例1發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:秈米粉水解液15 %，硫酸銨0.3 %，磷酸二氫鉀0.1 %，碳酸鈣
0.08%，其余為蒸餾水。100L全自動發(fā)酵罐內(nèi)加入50L發(fā)酵培養(yǎng)基和適量的消泡劑，0.1MPa下滅菌30min，冷卻至28°C，接入16.0L三級種子培養(yǎng)液，通氣量為1.1_1.2V/V/min，攪拌速度為500-700r/min,發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵72h后，離心獲得麥白霉素發(fā)酵液。麥白霉素的提取①萃取在萃取罐內(nèi)加入定量的麥白霉素發(fā)酵液，用碳酸氫鈉飽和溶液調(diào)節(jié)pH值至
8.0-9.0,再加入1.5倍體積的異丙醇和丙烷(V/V = 5:1)的萃取溶液，升溫至35_40°C振蕩30min，使之充分混勻，靜置分層，收集有機溶液部分，獲得麥白霉素的萃取液。②反萃取在反萃取罐內(nèi)加入定量的麥白霉素萃取液，后加入1.8倍體積的鹽酸溶液(pH =
1.2-1.5)，常溫下振蕩30min，使之充分混勻，靜置分層，去有機溶液層，收集獲得麥白霉素反萃取液。③制備取定量麥白霉素反萃取液,加入堿液靜置過夜進行結(jié)晶，后抽濾獲得麥白霉素結(jié)晶，干燥后獲得麥白霉素成品，麥白霉素的總收率為66%，麥白霉素的生物效價為1050u/`mLo根據(jù)中國藥典2010版檢測，麥迪霉素Al含量為50%，吉他霉素A6含量為12%。實施例3種子培養(yǎng)同實例I發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基:秈米粉水解液17 %，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.7%，碳酸鈣0.2%，其余為蒸餾水。100L全自動發(fā)酵罐內(nèi)加入50L發(fā)酵培養(yǎng)基和適量的消泡劑，0.1MPa下滅菌30min，冷卻至28°C，接入16.0L三級種子培養(yǎng)液，通氣量為1.0-1.2V/V/min，攪拌速度為500-700r/min，發(fā)酵溫度為28°C，，離心獲得麥白霉素發(fā)酵液。麥白霉素的提?、佥腿≡谳腿」迌?nèi)加入定量的麥白霉素發(fā)酵液，用碳酸氫鈉飽和溶液調(diào)節(jié)pH值至
8.0-9.0，再加入3倍體積的辛醇和航空煤油(V/V = 5: 2)的萃取溶液，升溫至35_40°C振蕩30min，使之充分混勻，靜置分層，收集有機溶液部分，獲得麥白霉素的萃取液。②反萃取在反萃取罐內(nèi)加入定量的麥白霉素萃取液，后加入3倍體積的磷酸溶液(pH =
1.2-1.5)，常溫下振蕩30min，使之充分混勻，靜置分層，去有機溶液層，收集獲得麥白霉素反萃取液。③制備取定量麥白霉素反萃取液,加入堿液靜置過夜進行結(jié)晶，后抽濾獲得麥白霉素結(jié)晶，干燥后獲得麥白霉素成品，麥白霉素的總收率為69%，麥白霉素的生物效價為1050u/mLo根據(jù)中 國藥典2010版檢測，麥迪霉素Al含量為49 %，吉他霉素A6含量為12 %。
權(quán)利要求
1.一種制備麥白霉素的新工藝，具體包括:將生米卡鏈霉菌(Streptomycesmycarofaciens)以8% _15%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,在含有水溶性較強的氮源和碳源培養(yǎng)基中，在24-28 °C、自然pH，轉(zhuǎn)速500-700rpm下培養(yǎng)2_8天，得到麥白霉素發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)萃取和反萃取后得到麥白霉素，其麥迪霉素Al含量> 49%，吉他霉素A6含量> 12%。
2.如權(quán)利要求1所述的生米卡鏈霉菌在發(fā)酵制備麥白霉素的應用中，其特征在于所述的培養(yǎng)基中有效成分含量如下:
3.如權(quán)利要求1所述的萃取過程包括:發(fā)酵完成后，過濾，調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH值在7.0-9.0的范圍，加入數(shù)倍體積的多烷基醇和烴類的萃取溶劑，升溫、振蕩，收集有機相，得到麥白霉素萃取液。
4.權(quán)利要求1所述的反萃取過程包括:在反萃取罐中加入定量的麥白霉素萃取液，力口入數(shù)倍體積的無機酸溶液，振蕩、靜置，收取無機相，加入堿液靜置過夜結(jié)晶，得麥白霉素結(jié)晶，干燥后得麥白霉素成品。
5.權(quán)利要求3所述的多烷基醇包括:異丙醇、異辛醇、辛醇、異丁醇等。
6.權(quán)利要求3所述的烴類包括但不局限于丁烷、異辛烷、航空煤油、苯、甲苯等。
7.權(quán)利要求3所述的多烷基醇和烴類所組成的萃取溶劑的體積比為1: 6-4: 1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以生米卡鏈霉菌發(fā)酵制備麥白霉素的方法。所述方法包括采用新的發(fā)酵基配方發(fā)酵生米卡鏈霉菌，提高麥迪霉素A1和吉他霉素A6的含量，發(fā)酵完成后，利用萃取和反萃取的方法，采用新的混合萃取劑進行萃取，提高萃取率，經(jīng)自動結(jié)晶后析出麥白霉素；本發(fā)明采用新的發(fā)酵基配方生產(chǎn)麥白霉素，簡化麥白霉素提取工藝；具有操作簡單方便、節(jié)能、等特點，采用本發(fā)明所生產(chǎn)出的麥白霉素符合中國藥典2010版的相關(guān)要求，可適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號C07H1/08GK103103236SQ201110358920
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者許荔新, 朱睿 申請人:華遠醫(yī)藥研究院有限公司