專(zhuān)利名稱(chēng)：乙酰化過(guò)低和過(guò)高的腦膜炎球菌莢膜糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腦膜炎球 菌莢膜糖及其偶聯(lián)衍生物的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多糖是重要的生物分子，它們廣泛地應(yīng)用于預(yù)防和治療疾病的制藥工業(yè)。例如，莢膜多糖在抗帶莢膜的細(xì)菌，如腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis))、肺炎球菌(肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae))和Hib (B型流感嗜血菌(Haemophilus infiuenzae))的疫苗中使用多年。為增強(qiáng)莢膜多糖，特別是在兒童中的免疫原性，開(kāi)發(fā)了偶聯(lián)疫苗。這些疫苗含有與載體蛋白偶聯(lián)的莢膜糖[例如，參考文獻(xiàn)1-3]。偶聯(lián)將不依賴(lài)于T的抗原轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾?lài)于T的抗原。腦膜炎奈瑟球菌血清群W135( "Menff 135")的莢膜糖含有唾液酸-半乳糖二糖單位的聚合物— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)- a -(2 — 6)-D-Gal- a -(I —其中“Neu”指通常稱(chēng)為唾液酸的神經(jīng)氨酸。類(lèi)似地，腦膜炎奈瑟球菌血清群Y (MenY)的莢膜糖含有唾液酸-葡萄糖二糖單位的聚合物— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)- a -(2 — 6)-D-Glc- a -(I —實(shí)質(zhì)上，這些莢膜糖在一些唾液酸殘基的一些7和9位發(fā)現(xiàn)是0-乙?；?。W135糖的0-乙?；趨⒖嘉墨I(xiàn)4中“首次報(bào)道”，該文獻(xiàn)報(bào)道了在0-7和0-9位的0-乙?；?。雖然作者注意到以前的工作表明0-乙?；?-7、0/ -3或0' -4位發(fā)生，但血清群Y糖的0-7和0-9位也觀察到乙酰化。參考文獻(xiàn)5報(bào)道了糖的0-乙?；康倪M(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)5報(bào)道就血清群W135而言，“有越來(lái)越多的證據(jù)顯示0-乙?；谝l(fā)保護(hù)性抗體應(yīng)答中不重要”。相反，參考文獻(xiàn)6報(bào)道“有證據(jù)表明0-乙?；绊懚嗵且呙绲拿庖咴浴?。假定“CPS[莢膜多糖]的0-乙?；谝l(fā)保護(hù)性免疫力中不重要”，然而參考文獻(xiàn)5的作者研究了血清群W135和Y的乙?；?。他們的研究結(jié)果表明這兩種血清群于室溫在堿性條件下保存9天后0-乙?；療o(wú)變化。參考文獻(xiàn)7報(bào)道于四價(jià)多糖疫苗中的“W135和Y菌株的0-乙?；癄顟B(tài)”以前“未報(bào)道”。作者在參考文獻(xiàn)8中繼續(xù)報(bào)道“關(guān)于血清群W135和Y的0-乙?；癄顟B(tài)知之甚少”，并且他們說(shuō)進(jìn)一步的工作“可增進(jìn)對(duì)最優(yōu)化疫苗制劑的了解”，然而這種進(jìn)一步工作的本質(zhì)和可能的了解并未詳細(xì)描述。參考文獻(xiàn)9報(bào)道血清群W135的“0-乙?；c疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)聯(lián)性尚未確定”。參考文獻(xiàn)6同意“0-乙?；瘜?duì)血清群W-135或Y多糖的免疫原性的影響尚未獲得”的論據(jù)(2004年I月)。
對(duì)血清群W135和Y的這種誤解和信息的缺乏與當(dāng)前用作糖疫苗的兩種其它血清群完全不同。腦膜炎奈瑟球菌血清群C莢膜多糖的0-乙?；町愐褟V泛報(bào)道[10、11]，但似乎對(duì)免疫原性無(wú)任何負(fù)面影響，因?yàn)镸en jugate 和NeisVac-C 產(chǎn)品均是有效的。相反，血清群A多糖的脫-0-乙?；c“免疫原性的顯著降低”有關(guān)[12]。本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于生產(chǎn)免疫原性組合物，特別是當(dāng)偶聯(lián)于載體蛋白和腦膜炎血清群W135和Y時(shí)的莢膜糖衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
盡管0-乙?；谀X膜炎球菌血清群W135和Y疫苗中的作用不確定，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)0-乙酰化實(shí)際上是有關(guān)的，特別是在制備偶聯(lián)疫苗期間。本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)來(lái)源于MenW135和MenY并改變唾液酸殘基7和9位的0-乙?；降男揎椙v膜糖可用于制造免疫原性組合物。相對(duì)于未修飾的天然糖，本發(fā)明的衍生物在與載體蛋白偶聯(lián)期間擇優(yōu)選擇。此外，與天然多糖相比，這些衍生物的偶聯(lián)物顯示提高了免疫原性。修飾的糖因此，本發(fā)明提供修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)糖中<的唾液酸殘基在7位是0-乙?；?；和/或(b)糖中> y%的唾液酸殘基在9位是0-乙酰化的。類(lèi)似地，本發(fā)明提供修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)糖中的唾液酸殘基在7-位是0-乙?；?；和/或(b)糖中> 7%或< 2%的唾液酸殘基在9位是
0-乙?；?。X的值取決于血清群就血清群W135而言，X是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5 或 0);就血清群Y而言，X是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5或0)。y的值也取決于血清群就血清群W135而言，y是26或更多(例如，27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、
56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、
81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100);就血清群 Y 而言，y 是 29 或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、
98,99或 100)。z 值是 27 或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5 或 0)。優(yōu)選X >m，其中選自0、0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10。優(yōu)選z > p，其中 p 選自0,0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10。本發(fā)明的糖更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供任選與載體蛋白偶聯(lián)的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其中該糖含有n個(gè)或更多個(gè)二糖重復(fù)單元{[唾液酸]-[己糖]}，其中己糖是半乳糖或葡萄糖，n是1-100的整數(shù)，并且其中(a)在所述n個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中< x%的唾液酸殘基在7、位是O-乙?；?；和/或 (b)當(dāng)己糖是半乳糖時(shí)，在所述n個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中> y%的唾液酸殘基在9位是0-乙?；?，并且當(dāng)己糖是葡萄糖時(shí)，在所述n個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中彡或彡z %的唾液酸殘基在9位是0-乙?；?。X值取決于己糖當(dāng)己糖是半乳糖時(shí)，X是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5 或 0);當(dāng)己糖是葡萄糖時(shí)，X是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5或0)。y的值取決于己糖當(dāng)己糖是半乳糖時(shí)，y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、
32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、
57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、
82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100)；當(dāng)己糖是葡萄糖時(shí)，y 是 29 或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、
98,99或 100)。z 值是 27 或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、
10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5 或 0)。如上定義的，優(yōu)選x>m。如上定義的，優(yōu)選z >p。唾液酸殘基優(yōu)選是N-乙酰神經(jīng)氨酸。當(dāng)己糖是半乳糖時(shí)，{[唾液酸]-[己糖]} 二糖單元優(yōu)選是— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)- a -(2 — 6)-D-Gal- a - (I —當(dāng)己糖是葡萄糖時(shí)，{[唾液酸]-[己糖]} 二糖單元優(yōu)選是— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)- a -(2 — 6)-D-Glc- a -(I —修飾的腦膜炎球菌莢膜糖優(yōu)選與載體蛋白偶聯(lián)。在這種偶聯(lián)物中(i)優(yōu)選2-9%之間、更優(yōu)選4-8%之間、還要優(yōu)選5-7%之間、再優(yōu)選約6%的唾液酸殘基在7位0-乙?；?ii)優(yōu)選35-55%之間、更優(yōu)選40-50%之間、還要優(yōu)選42-46%之間、再優(yōu)選約43%(當(dāng)己糖是Gal)或約45% (當(dāng)己糖是Glc)的唾液酸殘基在9位0-乙?；?。本發(fā)明也提供包含a分子個(gè)血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖的組合物，其中每個(gè)莢膜糖分子的唾液酸殘基的平均數(shù)目是b，并且其中(a)組合物中< x%的a *b個(gè)血清群W135唾液酸殘基在7位0-乙酰化；和/或(b)組合物中> y%的a *b個(gè)血清群W135唾液酸殘基在9位0-乙?；?，并且其中x、y和z如上定義。本發(fā)明也提供包含a分子個(gè)血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖的組合物，其中每個(gè)莢膜糖分子的唾液酸殘基的平均數(shù)目是b，并且其中(a)組合物中彡x%的a *b個(gè)血清群Y唾液酸殘基在7位0-乙?；?；和/或(b)組合物中彡y%或彡z %的a *b個(gè)血清群Y唾液酸殘基在9位0-乙?；?并且其中x、y和z如上定義。所述種群中的糖可偶聯(lián)于蛋白質(zhì)運(yùn)載體和/或游離于溶液中。本發(fā)明的糖或偶聯(lián)物優(yōu)選是純化的形式，例如基本上在沒(méi)有天然多糖的情況下。結(jié)構(gòu)表示 本發(fā)明提供一種任選偶聯(lián)于載體蛋白的糖，該糖含有n個(gè)或更多個(gè)以下二糖重復(fù)單元
權(quán)利要求
1.一種修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)所述糖中< 29%的唾液酸殘基在7位是O-こ?；模缓?或(b)所述糖中彡26%的唾液酸殘基在9位是O-こ?；?。
2.一種修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)所述糖中<9%的唾液酸殘基在7位是O-こ酰化的；和/或(b)所述糖中彡29%或彡27%的唾液酸殘基在9位是O-こ酰化的。
3.如權(quán)利要求I或2所述的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其特征在于，所述糖中>O %的唾液酸殘基在7位是O-こ?；?。
4.如權(quán)利要求I或2所述的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其特征在于，所述糖中>O %的唾液酸殘基在9位是O-こ?；?。
5.一種任選偶聯(lián)于載體蛋白的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其中所述糖含有η個(gè)或更多個(gè)ニ糖重復(fù)單元 {[唾液酸]-[己糖]}， 其中的己糖是半乳糖或葡萄糖，η是1-100的整數(shù)，并且其中 (a)在所述η個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中<χ%的唾液酸殘基在7位是O-こ?；?；和/或 (b)當(dāng)己糖是半乳糖時(shí)，在所述η個(gè)或更多個(gè)重復(fù)単元中>的唾液酸殘基在9位是O-こ?；模⑶耶?dāng)己糖是葡萄糖時(shí)，在所述η個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中> 7%或< ζ%的唾液酸殘基在9位是O-こ?；?， 其中當(dāng)己糖是半乳糖時(shí)，X是29且y是26 ;當(dāng)己糖是匍萄糖時(shí)，x是9、y是29且z是27。
6.如權(quán)利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是半乳糖，在所述η個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中約6%的唾液酸殘基在7位是O-こ酰化的，并且在所述η個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中約43%的唾液酸殘基在9位是O-こ?；?。
7.如權(quán)利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是葡萄糖，在所述η個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中約6%的唾液酸殘基在7位是O-こ?；?，并且在所述η個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元中約45%的唾液酸殘基在9位是O-こ?；?。
8.ー種含有血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖分子的組合物，其中每個(gè)莢膜糖分子的唾液酸殘基平均數(shù)目是b，并且其中(a)組合物中彡29%的a *b個(gè)血清群Wl 35唾液酸殘基在7位O-こ?；?；和/或(b)組合物中彡26%的a · b個(gè)血清群W135唾液酸殘基在9位O-こ酸化。
9.ー種含有血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖分子的組合物，其中每個(gè)莢膜糖分子的唾液酸殘基平均數(shù)目是b，并且其中(a)組合物中< 9%的a · b個(gè)血清群Y唾液酸殘基在7位O-こ?；?；和/或(b)組合物中彡29 %或彡27 %的a · b個(gè)血清群Y唾液酸殘基在9位O-こ酸化。
10.如權(quán)利要求8或9所述的組合物，其特征在于，所述莢膜糖偶聯(lián)于蛋白質(zhì)運(yùn)載體。
11.ー種含有η個(gè)或更多個(gè)以下ニ糖重復(fù)單元的糖
12.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的糖，其特征在于，所述糖具有低于30的平均聚合度。
13.(i)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的糖和(ii)選自白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、流感嗜血菌蛋白D和CRM197的載體蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物。
14.ー種免疫原性組合物，所述組合物含有(a)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的修飾的莢膜糖或偶聯(lián)物，和(b)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述組合物呈含水形式。
16.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述組合物呈凍干形式。
17.如權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來(lái)自血清群C腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖抗原。
18.如權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來(lái)自血清群A腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖抗原。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述血清群A抗原。
20.如權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來(lái)自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的抗原。
21.如權(quán)利要求14-20中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來(lái)自B型流感嗜血菌的糖抗原。
22.如權(quán)利要求14-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來(lái)自肺炎鏈球菌的抗原。
23.如權(quán)利要求14-22中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有ー種或多種以下抗原甲肝病毒的抗原；こ肝病毒的抗原；百日咳博德特菌的抗原；白喉類(lèi)毒素；破傷風(fēng)類(lèi)毒素和/或脊髄灰質(zhì)炎病毒抗原。
24.如權(quán)利要求14-23中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物用作藥物。
25.ー種用于產(chǎn)生哺乳動(dòng)物的抗體應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求14-23中任一項(xiàng)所述的組合物給予哺乳動(dòng)物。
26.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖和/或修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖在生產(chǎn)抗腦膜炎球菌性腦膜炎的藥物中的應(yīng)用。
27.一種制備免疫原性偶聯(lián)物的方法，所述方法包括以下步驟(1)提供起始血清群W135或血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖和載體蛋白，其中一個(gè)或兩個(gè)均是任選修飾的以賦予它/它們與另ー個(gè)的反應(yīng)性；(2)在糖和載體蛋白之間形成共價(jià)鍵；和(3)純化得到的糖偶聯(lián)物，其中，在步驟(I)和(3)之間，起始糖中唾液酸殘基9位的O-こ酰化程度増加。
全文摘要
乙酰化過(guò)低和過(guò)高的腦膜炎球菌莢膜糖。來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌的血清群W135和Y的莢膜糖改變了它們的唾液酸殘基的7和9位的O-乙?；剑⑶铱捎糜诋a(chǎn)生免疫原性組合物。相對(duì)于未修飾的天然糖，本發(fā)明的衍生物在與載體蛋白偶聯(lián)期間擇優(yōu)選擇，并且與天然多糖相比，這些衍生物的偶聯(lián)物顯示提高了免疫原性。
文檔編號(hào)C07H13/06GK102633893SQ201110359118
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2004年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
發(fā)明者F·貝蒂, P·科斯坦蒂諾 申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限公司