專利名稱：自然偶聯(lián)法制備艾塞那肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽藥物的制備方法，尤其涉及自然偶聯(lián)法制備艾塞那肽的方法。
背景技術(shù)：
艾塞那肽，英文名為exenatide，其分子結(jié)構(gòu)為 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-S er-Asp-Leu-Ser-LyS-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Ly s-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。艾塞那肽是由美國(guó)禮來(lái)公司與Amylin公司共同研發(fā)的第一個(gè)腸降血糖素類似物，是人工合成的由39個(gè)氨基酸組成的多肽，與內(nèi)源性腸降血糖素如胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)作用相似，具有促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌，恢復(fù)第一時(shí)相胰島素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，減慢胃內(nèi)容物的排空，改善胰腺β細(xì)胞的功能等作用?，F(xiàn)有技術(shù)US69M^4、US7157555、US6902744中，艾塞那肽的制備均采用固相合成的方法。此種方法由于艾塞那肽是含有39個(gè)氨基酸的長(zhǎng)肽，存在技術(shù)難度大、合成周期長(zhǎng)、 生產(chǎn)成本高、過(guò)程中間體因?yàn)椴荒芗兓瘞?lái)的產(chǎn)物純度不高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)等問(wèn)題。W02011006644A2專利中報(bào)道了采用固液結(jié)合的方法進(jìn)行艾塞那肽的合成。將艾塞那肽分為1-10、11-21、22-四、30-39四個(gè)片段，固相方法分別合成出每個(gè)全保護(hù)肽片段，然后將幾個(gè)片段在液相中偶聯(lián)得到艾塞那肽。這種方法由于每個(gè)片段都是全保護(hù)肽，因此存在疏水性強(qiáng)、肽鏈溶解性差、片段純化困難、片段間偶聯(lián)效率低下等問(wèn)題。艾塞那肽的現(xiàn)有合成方法存在操作繁瑣，合成周期長(zhǎng)，廢液多，不利于環(huán)保，成本高昂以及不利于大規(guī)模生產(chǎn)的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
1)將艾塞那肽分成M條肽片段，M = 2或3 ；其中有L條N端為Thr或Ser肽片段， L = 1或2，T條構(gòu)成艾塞那肽所需的其他肽片段，L+T = M ；用固相合成方法獲得所述的M 條側(cè)鏈全保護(hù)的肽片段；2)將偶聯(lián)于步驟1) N端為Thr或kr肽片段N端的肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)； 脫除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，形成肽片段C端乙縮醛結(jié)構(gòu)；3)脫除N端為Thr或Ser肽片段的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和N段保護(hù)基團(tuán)，得N端為Thr 或Ser肽片段；4)利用步驟2)所述的肽片段C端乙縮醛結(jié)構(gòu)以及步驟3)所述的N端為Thr或 Ser肽片段在液相中偶聯(lián)得到N端保護(hù)的艾塞那肽；5)除去N端氨基保護(hù)基，純化處理得艾塞那肽。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟1)所述固相合成方法，所使用的樹(shù)脂為氨基樹(shù)脂或2-CTC樹(shù)脂，其中氨基樹(shù)脂適用于含有艾塞那肽C端酰胺結(jié)構(gòu)的固相合成，氨基樹(shù)脂包括 Sieber 樹(shù)脂、Rink Amide 樹(shù)脂或 Rink Amide-MBHA 樹(shù)脂。
2-CTC樹(shù)脂適用于C端為羧基結(jié)構(gòu)的肽片段固相合成。在片段肽合成過(guò)程中需要在弱酸情況下將肽鏈片段從樹(shù)脂裂解下來(lái)而不影響氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。而這些側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在C端的羧基結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為乙縮醛結(jié)構(gòu)以前是必須存在的，用來(lái)保證乙酸醛結(jié)構(gòu)產(chǎn)生在C端羧基而不是在側(cè)鏈羧基上。申請(qǐng)人意外的發(fā)現(xiàn)， 2-CTC樹(shù)脂能夠滿足該合成反應(yīng)的要求。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟1)中，參與片段偶聯(lián)的Thr或Ser使用氨基保護(hù)基團(tuán)，氨基保護(hù)基團(tuán)為Boc。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟將1)中，將肽片段從樹(shù)脂上裂解下來(lái)所用的弱酸為TFE。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟2)中，肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)，所使用的醛為水楊醛。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟2)包括如下步驟2a)將偶聯(lián)于步驟1)N端為Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)； 其中，肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)，所使用的醛為水楊醛。2b)采用酸裂解將所有片段的側(cè)鏈保護(hù)基脫除，形成側(cè)鏈未保護(hù)肽片段。其中，將保護(hù)基脫除的酸為TFA。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟4)中，在液相中偶聯(lián)得到N端保護(hù)的艾塞那肽，溶劑為吡啶/醋酸。本發(fā)明中M條肽片段選自以下肽片段結(jié)構(gòu)SEQ ID No. 1 =His-Gly-Glu-Gly-OHSEQ ID No. 2 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-V al-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 3 =Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 4=His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-OHSEQ ID No. 5 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-L eu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No6 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va I-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 7 =Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 8 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-OHSEQ ID No. 9 :Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P he-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 10 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 11 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-OHSEQ ID No. 12 =Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 13 =Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OH
SEQ ID No. 14=Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 15 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-N H2SEQ ID No. 16 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH20作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟5)中，除去N端氨基保護(hù)基，純化處理得艾塞那肽；N端氨基保護(hù)基為Fmoc，采用DBLK脫除，所述DBLK由體積比為1 4的哌啶和DMF 組成。純化處理為本領(lǐng)域常用的技術(shù)手段，必要時(shí)可以包括凍干?，F(xiàn)有技術(shù)多肽液相片段偶聯(lián)時(shí)，由于合成時(shí)選擇性的問(wèn)題，肽鏈片段的氨基酸側(cè)鏈必須保護(hù)以防止偶聯(lián)位點(diǎn)出現(xiàn)差錯(cuò)。由于片段的氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)切枰Ｗo(hù)的，肽片段溶解度很低；如果側(cè)鏈不保護(hù)進(jìn)行合成，必須是肽鏈含有Cys這個(gè)偶聯(lián)位點(diǎn)，由于含有Cys的肽鏈相對(duì)較少，限制了技術(shù)的使用。艾塞那肽肽鏈中含有多fkr/Thr，本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)，采用N端含有Ser或Thr的肽鏈可以在不保護(hù)側(cè)鏈的情況下選擇性的進(jìn)行片段偶聯(lián)，乙縮醛結(jié)構(gòu)主要的作用在于保證片段偶聯(lián)時(shí)的選擇性。進(jìn)行側(cè)鏈不保護(hù)合成的優(yōu)點(diǎn)在于，解決了片段的溶解、純化等問(wèn)題，提高了收率。并且對(duì)偶聯(lián)時(shí)的效率有了極大的提高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是操作簡(jiǎn)單，合成周期短，成本低，中間體易純化，后處理容易，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，最終產(chǎn)品純度高，利于艾塞那肽的大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1 本發(fā)明總的工藝流程圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。氨基樹(shù)脂和2-CTC樹(shù)脂購(gòu)自天津南開(kāi)和成有限公司，各種保護(hù)氨基酸購(gòu)自吉爾生化有限公司。說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用英文縮寫的含義列于下表中說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義列于下表中
權(quán)利要求
1.一種艾塞那肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)將艾塞那肽分成M條肽片段，M=2或3；其中有L條N端為Thr或Ser肽片段，L=I或 2，T條構(gòu)成艾塞那肽所需的其他肽片段，L+T=M ；用固相合成方法獲得所述的M條側(cè)鏈全保護(hù)的肽片段；2)將偶聯(lián)于步驟1)N端為Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)；脫除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，形成肽片段C端乙縮醛結(jié)構(gòu)；3)脫除N端為Thr或Ser肽片段的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和N段保護(hù)基團(tuán)，得N端為Thr或kr 肽片段；4)利用步驟2)所述的肽片段C端乙縮醛結(jié)構(gòu)以及步驟3)所述的N端為Thr或Ser肽片段在液相中偶聯(lián)得到N端氨基保護(hù)的艾塞那肽；5)除去N端氨基保護(hù)基，純化處理得艾塞那肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述固相合成方法，所使用的樹(shù)脂為氨基樹(shù)脂或2-CTC樹(shù)脂，其中氨基樹(shù)脂適用于含有艾塞那肽C端酰胺結(jié)構(gòu)的固相合成，2-CTC樹(shù)脂適用于C端為羧基結(jié)構(gòu)的肽片段固相合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于氨基樹(shù)脂包括Sieber樹(shù)脂、Rink Amide 樹(shù)脂或 Rink Amide-MBHA 樹(shù)脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于參與片段偶聯(lián)的Thr或Ser使用氨基保護(hù)基團(tuán)，氨基保護(hù)基團(tuán)為Boc。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)，所使用的醛為水楊醛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟5)所述N端氨基保護(hù)基為 Fmoc，脫除試劑為DBLK。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于M條肽片段選自以下肽片段結(jié)構(gòu) SEQ ID No. 1 =His-Gly-Glu-Gly-OHSEQ ID No. 2 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-A rg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OH SEQ ID No. 3 =Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 SEQ ID No. 4 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-OHSEQ ID No. 5 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P he-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No6 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ar g-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OH SEQ ID No. 7 =Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 SEQ ID No. 8 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-OHSEQ ID No. 9 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-I Ie-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 10 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 11 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-OHSEQ ID No. 12 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 13 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 14 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 15 Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 16 :Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 O
8.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的制備方法，其特征在于N端為Thr或Ser肽片段為SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 12，構(gòu)成艾塞那肽所需的其他肽片段SEQ ID No. 11。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種制備艾塞那肽的方法，包括以下步驟1)將艾塞那肽分成若干條肽片段，其中有N端為Thr或Ser肽片段以及構(gòu)成艾塞那肽所需的其他肽片段，用固相合成方法獲得；2)將偶聯(lián)于步驟1)N端為Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)；脫除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；3)脫除N端為Thr或Ser肽片段的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和N段保護(hù)基團(tuán)；4)利用步驟2)所述的肽片段以及步驟3)所述肽片段在液相中偶聯(lián)得到N端保護(hù)的艾塞那肽；5)除去N端氨基保護(hù)基，純化處理得艾塞那肽；該工藝具有反應(yīng)操作簡(jiǎn)單、中間體可控、反應(yīng)周期短、收率高、成本低等特點(diǎn)，具有可觀的經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K1/06GK102532302SQ201110396050
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者劉建, 唐洋明, 宓鵬程, 袁建成, 馬亞平 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司