專利名稱：一種單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，涉及一種單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法。
背景技術：
胸腺五肽(Thymopentin, TP5 )是人工合成小分子多肽，其氨基酸序列為 Arg-Lys-Asp-Val-Tyr，與內源性的胸腺生成素II具有相同的調節(jié)機體免疫平衡的生物活性。對于多種免疫功能紊亂或低下，TP5都能通過促進或抑制的雙向調節(jié)作用使免疫功能趨于正常。目前，臨床上用于治療腫瘤、自身免疫疾病等。但是TP5注射于人體后很快由蛋白酶和氨肽酶降解，藥物原型的半衰期僅為30秒。目前臨床應用的僅有凍干粉針劑和溶液型注射劑，因此，對于需要長期用藥患者，TP5只能采取頻繁注射或靜脈滴注的方式給藥。 因此迫切需要研制新的長效制劑產品。聚乙二醇(PEG)是一種高分子聚合物，無毒，無免疫原性，很容易經(jīng)腎排出體外。藥物的聚乙二醇修飾，即PEG化是將活化的聚乙二醇通過化學方法偶聯(lián)到蛋白質、多肽、小分子有機藥物和脂質體上，從而提高藥物在血漿中的穩(wěn)定性，減少藥物的酶解，降低藥物的免疫原性，使母體藥物在輸送、療效和體內半衰期等方面都有顯著改善，從而提高其臨床價值和商業(yè)價值。蛋白質或多肽分子中存在多個氨基，隨機修飾方法對某些蛋白質多肽藥物的改善并不能達到預期的效果，修飾后成分復雜、分離困難、藥物活性大大下降、有效成分少等。通過定點修飾的方式，PEG修飾劑可以避免隨機修飾的盲目性，這樣既不影響蛋白質多肽活性中心結構又能選擇性干擾某些抗原位點，從而達到特定的修飾目的。采用定點修飾方式所得目標修飾產物一般具備修飾度(即每個偶合物上平均偶聯(lián)PEG分子的個數(shù))明顯降低、產物種類減少、活性保留較好、免疫原性大大降低等特點，同時又便于分離純化。中國專利CNlO 1870732A公開了一種采用固-液結合法進行單聚乙二醇化胸腺五肽合成方法，該方法先采用液相將PEG(5000da)修飾劑定點修飾到胸腺五肽2位賴氨酸的側鏈氨基(ε_ΝΗ2)上得到Lys(PEG)，再經(jīng)過固相四步縮合反應切割得到 mPEG(5000da)-TP5，改善了原母體藥物胸腺五肽的生物降解速度快、酶解穩(wěn)定性差、生物半衰期短等缺點。但是，該方法的反應要在先已縮合的Lys(PEG)高分子的wang樹脂上進行， 反復縮合脫除Fmoc等操作。由于wang樹脂作為載體高分子和PEG(5000da)高分子之間的空間位阻過大，而脫除Fmoc與空間位阻有關，反應條件受空間位阻條件的限制，因此脫 Fmoc保護不但受到wang樹脂載體的空間位阻而且還有PEG(5000da)高分子的空間位阻的限制，導致脫除FMOC單元很難進行。同時，在固相wang樹脂上和PEG高分子之間進行下一步單元的氨基酸縮合反應也很難進行，合成單元要反復操作，導致了原料的大量浪費，得到 PEG化胸腺五肽的產率也只有1
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中存在的問題，提供一種反應容易、成本低、產率高的合成單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的方法。本發(fā)明合成單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的方法，包括以下工藝步驟 (1)固相合成帶保護基的胸腺五肽
將經(jīng)二氯甲烷處理的Fmoc-Tyr (tBu)-Wang樹脂用N，N-二甲基甲酰胺洗滌后，用含哌啶的二甲基甲酰胺溶液脫Fmoc保護基，得到脫保護的樹脂Tyr(tBU)-Wang ；將氨基酸 Fmoc-Val-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、羥基苯并三唑依次溶解于 DMF，加二異丙基乙胺啟動活化酯后，加入到上述脫保護的樹脂Tyr(tBU)-Wang中；在氬氣保護下，室溫攪拌反應4(Γ90分鐘，抽濾、洗滌，至此一個循環(huán)完成，得到Fmoc保護的二肽樹脂；順次改變上述氨基酸為 Fmoc-Asp (OBzl) -OH, Fmoc-Lys (BOC) -OH, Z-Arg (NO2) -0Η,重復上述步驟 3 次，得到含保護基的 Z-Arg(NO2)-Iys (Boc) -Asp (oBzl)-Val-Tyr (tBu)樹脂； 用二氯甲烷、甲醇交替洗滌，抽干后，加入切割試劑，于(T5°C反應3飛小時，收集切割劑，旋干，用(T5°C的冷乙醚沉淀粗肽，除去乙醚后，用體積濃度1(Γ20%冰醋酸水溶液溶解粗肽， 冷凍干燥，純化，得到帶保護基的胸腺五肽Z-Arg (NO2) -Iys-Asp (oBzl) -Val-Tyr。所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液中，哌啶與二甲基甲酰胺的體積比為1:0. 5 1:4。所述氨基酸的用量為Fmoc-Tyr (tBu) -Wang樹脂摩爾量的0. 5、倍。所述苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的用量為氨基酸0. 5、倍。所述1-羥基苯并三唑的用量為氨基酸0. 5、倍。所述二異丙基乙胺用量為氨基酸的廣3倍。所述切割試劑是由三氟乙酸、雙蒸水、三異丙基硅烷以95:2. 5:2. 5的體積比組成的混合液；所述切割試劑的用量為5 30 ml / g Fmoc-Tyr (tBu)-Wang樹脂。(2)液相合成聚乙二醇化胸腺五肽
以氯仿、二氧六環(huán)、DMF的混合溶液(氯仿、二氧六環(huán)、DMF以1:4:廣4:8:1的體積比混合)為溶劑，在堿性條件下，使帶保護基的胸腺五肽(Z-Arg (NO2) -Iys-Asp (oBzl) -Val-Tyr) 與單甲氧基聚乙二醇修飾劑(mPEG-SPA)以3:廣20: 1的摩爾比，在室溫反應M 48小時； 反應結束后，除去溶劑，反應產物用水溶解，過濾掉水不溶物，純化，冷凍干燥得中間產物Z-Arg (NO2) -Iys (mPEG) -Asp (oBzl) -Val-Tyr。(3)鈀碳催化氫化
以無水甲醇為溶劑，在鈀碳的作用下，使中間產物Z-Arg (NO2) -Iys (mPEG) -Asp (oBzl)-Val-Ty在室溫下催化氫化3 6小時，得到目標產物Arg-lys (mPEG) -Asp-Val-Tyr。所述鈀碳與中間產物的質量比為1:0. 5 1:5。本發(fā)明合成的產物通過核磁共振氫譜、MALDI-T0F質譜、氨基酸N端測序，確定產物的結構為H-Arg-Lys (mPEG)-ASp-Val-Tyr-0H，說明目標產物合成成功。本發(fā)明相對現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點
1、本發(fā)明先采用固相合成技術合成含保護基的TP5，避免了現(xiàn)有技術方法脫除FMOC單元操作難以進行的缺點；再采用液相合成技術將修飾化的聚乙二醇(mPEG-SPA)定點連接到賴氨酸側鏈氨基上，一方面達到了定點修飾的目的，另一方面，液相環(huán)境避免了固相wang 樹脂載體的空間位阻；最后鈀碳催化氫化一步脫除所有的保護基得到具有長效作用的聚乙二醇化的胸腺五肽，合成過程簡便，成本低，產率高(總產率為20%以上)，便于工業(yè)化生產。2、本發(fā)明合成的聚乙二醇化的胸腺五肽不易被體內蛋白酶水解，由于分子量大，可顯著降低腎清除率，大大延長體內循環(huán)時間，從而達到顯著延長半衰期、提高機體的生物利用度。3、本發(fā)明合成目標產物結構準確，合成路線成熟，穩(wěn)定，該路線為更高分子量的 PEG以及分支型的PEG修飾提供新策略。
附圖的說明


圖1為本發(fā)明實施例1步驟(1)得到的帶保護基的胸腺五肽的ESI-MS表征； 圖2為本發(fā)明實施例1步驟(2)得到的聚乙二醇化胸腺五肽的結構表征； 圖3、4為本發(fā)明實施例1步驟(3)得到的鈀碳催化氫化產物的結構表征。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明合成單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的方法作進一步說明。實施例1
(1)固相合成帶保護基的胸腺五肽
A 將 Fmoc-Tyr (tBu)-Wang 樹脂 1. 5g (1%DVB, 100-200 目，S=O. 3mmol/g)在二氯甲烷 (DCM)浸泡30分鐘，抽干，二甲基甲酰胺(DMF)洗滌(洗三次，每次三分鐘)后；將哌啶與二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液(哌啶/ 二甲基甲酰胺=1/4 (ν/ν))加入到上述洗滌后的樹脂中，機械攪拌30分鐘，脫Fmoc保護基，DMF洗滌(洗三次，每次三分鐘)，得到脫保護的樹脂 Tyr (tBu) -Wango加入茚檢試劑(5%茚三酮醇溶液)，沸水中加熱三分鐘，顯藍色，F(xiàn)moc基脫除完全。B 將氨基酸 FMOC-Val-OH 458mg (1. 35mmol,3eq))、苯并三氮唑-N, N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU) 512. 06mg(l. 35mmol, 3eq) ,1-羥基苯并三唑(HoBt) 182. 66mg(l. 35mmol, 3eq)、依次溶解于DMF，加446 μ L 二異丙基乙胺(DIEA)啟動活化酯后， 加入到上述脫保護的樹脂Tyr(tBU)-Wang中；反應體系用氬氣保護，機械攪拌45分鐘，抽干，DMF溶液洗三次，每次三分鐘；茚檢試劑檢測無色，得到FMOC-Val-Tyr (tBu) -Wang 二肽樹脂，至此一個循環(huán)完成。將FMOC-Val-Tyr (tBu) -Wang 二肽樹脂用同樣的方法脫Fmoc保護基，得到脫保護的 Val-Tyr (tBu)-Wang 樹脂；將 FMOC-Asp (0 1)-OH 601. 4mg(l. 35mmol, 3eq)、苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU) 512. 06mg (1. ;35mmol，!3eq)、1-羥基苯并三唑(HoBt) 182. 66mg(l. 35mmol, 3eq)依次溶解于DMF，加446 μ L 二異丙基乙胺 (DIEA)啟動活化酯后，加入到脫保護的Val -Tyr (tBu) -Wang樹脂中，反應體系用氬氣保護，機械攪拌45分鐘，抽干，DMF溶液洗三次，每次三分鐘；茚檢試劑檢測無色，得到FMOC-Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu) -Wang三肽樹脂，至此兩個循環(huán)完成。將FMOC- Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu) -Wang 三肽樹脂用同樣的方法脫 Fmoc 保護基，得到脫保護的 Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu) -Wang 三肽樹脂；將 FMOC-Lys (BOC) -OH 633mg(l. 35mmol, 3eq)、苯并三氮唑_N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU) 512. 06mg(l. ;35mmol，!3eq)、1-羥基苯并三唑(HoBt) 182. 66mg(1. ;35mmol，!3eq)、 依次溶解于DMF，加446yL 二異丙基乙胺(DIEA)啟動活化酯后，加入到脫保護的Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu) -Wang三肽樹脂中，反應體系用氬氣保護，機械攪拌45分鐘，抽干，DMF溶液洗三次，每次三分鐘；茚檢試劑檢測無色，得到FMOC-Iys (Boc) -Asp (oBzl)-Val-Tyr (tBu)四肽樹脂，至此三個循環(huán)完成。將FMOC-Iys (Boc) -Asp (oBzl)-Val-Tyr (tBu)四肽樹脂用同樣的方法脫Fmoc保護基，得到脫保護的Iys (Boc) -Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu)四肽樹脂；將 Z-Arg(NO2)-OH 477mg(1. ；35讓ol，!3eq)、苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU) 512. 06mg(l. 35mmol, 3eq) ,1-羥基苯并三唑(HoBt) 182. 66mg(l. 35mmol, 3eq) 依次溶解于DMF，加446 μ L 二異丙基乙胺(DIEA)啟動活化酯后，加入到脫保護的Iys (Boc) -Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu)四肽樹脂中，反應體系用氬氣保護，機械攪拌45分鐘，抽干，DMF溶液洗三次，每次三分鐘；茚檢試劑檢測無色，得到Z-Arg (NO2) -Iys (Boc) -Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu)五肽樹脂，用二氯甲烷、甲醇交替洗滌，抽干后，加入15ml 切割試劑(三氟乙酸(TFA)雙蒸水三異丙基硅烷=95:2. 5 :2.5(v/v))，冰浴反應4小時， 每20分鐘機械攪拌1分鐘；收集切割劑，再用TFA洗滌2次，合并切割劑與TFA，減壓旋轉抽干，用冰乙醚(4(T60ml)沉淀，靜置，吸走上清，加20%冰醋酸水溶液溶解，凍干，用葡聚糖凝膠柱粗處理(葡聚糖凝膠的規(guī)格為G25)，再用半制備高效液相進行純化(液相體系為5% 95%乙腈/水/0. 三氟乙酸，流速為anl/min，時間為60min)，53% ACN出峰，Rt 23.79 min收集主峰，凍干，得到帶保護基的胸腺五肽Z-Arg (NO2)-Iys-Asp (oBzl)-Val-Tyr純品 253. 2mg，產率 59.35%。ESI-MS 表征為=ESI-MS[ M + H ] +949.6 (見圖 1)。固相合成路線如下所示
權利要求
1.一種單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，包括以下工藝步驟(1)固相合成帶保護基的胸腺五肽將經(jīng)二氯甲烷處理的Fmoc-Tyr (tBu)-Wang樹脂用N，N-二甲基甲酰胺洗滌后，用含哌啶的二甲基甲酰胺溶液脫Fmoc保護基，得到脫保護的樹脂Tyr(tBU)-Wang ；將氨基酸 Fmoc-Val-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、羥基苯并三唑依次溶解于 DMF，加二異丙基乙胺啟動活化酯后，加入到上述脫保護的樹脂Tyr(tBU)-Wang中；在氬氣保護下，室溫攪拌反應4(Γ90分鐘，抽濾、洗滌，至此一個循環(huán)完成，得到Fmoc保護的二肽樹脂；順次改變上述氨基酸為 Fmoc-Asp(OBzl)-OH, Fmoc-Lys (BOC) -OH, Z-Arg (NO2)-0Η，重復上述步驟 3 次，得到含保護基的 Z-Arg(NO2)-Iys (Boc) -Asp (oBzl)-Val-Tyr (tBu)樹脂； 用二氯甲烷、甲醇交替洗滌，抽干后，加入切割試劑，于(T5°C反應3飛小時，收集切割劑，旋干，用(T5°C的冷乙醚沉淀粗肽，除去乙醚后，用體積濃度1(Γ20%冰醋酸水溶液溶解粗肽， 冷凍干燥，純化，得到帶保護基的胸腺五肽Z-Arg (NO2) -Iys-Asp (oBzl) -Val-Tyr ；(2)液相合成聚乙二醇化胸腺五肽以氯仿、二氧六環(huán)、DMF的混合溶液為溶劑，在堿性條件下，使帶保護基的胸腺五肽(Z-A rg (NO2) -Iys-Asp (oBzl) -Val-Tyr )與單甲氧基聚乙二醇修飾劑(mPEG-SPA)以 3 Γ20 1 的摩爾比，在室溫反應對 48小時；反應結束后，除去溶劑，反應產物用水溶解，過濾掉水不溶物，純化，冷凍干燥得中間產物 Z-Arg (NO2) -Iys (mPEG) -Asp (oBzl) -Val-Tyr ；(3)鈀碳催化氫化以無水甲醇為溶劑，在鈀碳作用下，使中間產物Z-Arg (NO2) -Iys (mPEG) -Asp (oBzl) -Va I-Ty在室溫下催化氫化3 6小時，得到目標產物Arg-lys (mPEG) -Asp-Val-Tyr。
2.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，步驟(1)中所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液中，哌啶與二甲基甲酰胺的體積比為1:0. 5 1:4。
3.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，其特征在于步驟 (1)中所述氨基酸的用量為Fmoc-Tyr (tBu)-Wang樹脂摩爾量的0. 5、倍。
4.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，其特征在于步驟 (1)中所述苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的用量為氨基酸0. 5、倍。
5.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，其特征在于步驟 (1)中所述1-羥基苯并三唑的用量為氨基酸0. 5、倍。
6.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，其特征在于步驟 (1)中所述二異丙基乙胺用量為氨基酸的廣3倍。
7.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，其特征在于步驟 (1)中所述切割試劑是由三氟乙酸、雙蒸水、三異丙基硅烷以95:2. 5:2. 5的體積比組成的混合液。
8.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，其特征在于步驟(1)中所述切割試劑的用量為5 30ml / g Fmoc-Tyr (tBu)-Wang樹脂。
9.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，其特征在于步驟(2)中所述氯仿、二氧六環(huán)、DMF的混合溶液中，氯仿、二氧六環(huán)、DMF以1:4:廣4:8:1的體積比混合。
10.如權利要求1所述單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，其特征在于步驟(3)中，所述鈀碳與中間產物的質量比為1:0. 5 1:5。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種單聚乙二醇化定點修飾胸腺五肽的合成方法，屬于生物醫(yī)藥領域。該方法先采用固相合成含保護基的TP5，避免了現(xiàn)有技術方法脫除FMOC單元操作難以進行的缺點；再在液相中將修飾化的聚乙二醇定點連接到賴氨酸側鏈氨基上，達到了定點修飾的目的，同時液相環(huán)境避免了固相wang樹脂載體的空間位阻；最后鈀碳催化氫化一步脫除所有的保護基得到具有長效作用的聚乙二醇化的胸腺五肽，合成過程簡便，成本低，產率高(總產率為20%以上)，便于工業(yè)化生產。本發(fā)明合成的聚乙二醇化的胸腺五肽不易被體內蛋白酶水解，由于分子量大，可顯著降低腎清除率，大大延長體內循環(huán)時間，從而達到顯著延長半衰期、提高機體的生物利用度。
文檔編號C07K1/02GK102443049SQ201110400168
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權日2011年12月6日
發(fā)明者倪京滿, 史敏, 王銳 申請人:倪京滿, 王銳