專利名稱：固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于白藜蘆醇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及白藜蘆醇的制備方法。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(化學名為芪三酚)是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮多酚類化合物，是植物在受到應激時自身合成的一種抗毒素，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑。主要有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保護肝臟、保護心血管和抗心肌缺血等功能，被廣泛應用于食品保健品、化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域。目前白藜蘆醇的生產(chǎn)主要是植物提取法。提取白藜蘆醇的植物有葡萄、花生、桑葚、虎杖等。然而，植物中的白藜蘆醇含量非常低，使得其分離純化成本偏高。而白藜蘆醇類似物白藜蘆醇苷在植物中的含量為白藜蘆醇的7 12倍，如果將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，白藜蘆醇的產(chǎn)率可大大提高。酶法水解白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，因條件溫和，反應產(chǎn)物較單一，產(chǎn)率高，而被廣泛采用?，F(xiàn)有的制備白藜蘆醇的方法，如2008年9月3日公開的公開號為CN101255449的 “β-葡萄糖苷酶在轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇中的應用”專利，公開的是以含白藜蘆醇苷的植物為原料，先利用微生物法發(fā)酵制得β -葡萄糖苷酶，再經(jīng)酶轉(zhuǎn)化、離心、乙醇提純而得產(chǎn)品。該方法的主要缺點是①利用微生物法發(fā)酵制得的葡萄糖苷酶在水解反應中是以游離狀態(tài)發(fā)揮催化作用，游離狀態(tài)的酶在水溶液中不穩(wěn)定，對熱、強酸、強堿、高離子濃度、及有機溶劑等均敏感，容易失活。②游離狀態(tài)的酶難以與反應產(chǎn)物分離，導致產(chǎn)物純化困難，增加生產(chǎn)成本。③游離狀態(tài)的酶只能使用一次，酶的用量較大，不利于節(jié)約能源。④ 不能連續(xù)進行生產(chǎn)，延長了生產(chǎn)周期，對原料的利用率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有制備白藜蘆醇方法的不足之處，提供一種固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法。具有操作簡單實用、設備通用、酶穩(wěn)定性好、重復利用率高、節(jié)約能源、無有害物質(zhì)排放，清潔安全，生產(chǎn)成本低，可連續(xù)生產(chǎn)等特點。本發(fā)明的主要原理是在適宜條件下，以二醛類化合物與接枝賴氨酸殼聚糖微球的游離氨基及β-葡萄糖苷酶的游離氨基發(fā)生交聯(lián)反應，就將游離β-葡萄糖苷酶束縛于接枝賴氨酸殼聚糖微球載體，即制備出固定化酶；固定化酶具備與游離酶同樣的水解特性， 可反復使用，連續(xù)水解白藜蘆醇苷，生成白藜蘆醇。實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法，以市售的賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂、β -葡萄糖苷酶、白藜蘆醇苷和XAD-7HP大孔吸附樹脂為原料，先制備出固定化β -葡萄糖苷酶，后裝柱成柱式酶反應器，再經(jīng)連續(xù)水解，吸附，洗脫，結(jié)晶得到白藜蘆醇產(chǎn)品。其具體步驟如下(1)配制β -葡萄糖苷酶緩沖溶液以市售的β -葡萄糖苷酶為原料，按照β -葡萄糖苷酶的質(zhì)量(mg)緩沖溶液體積(L)比為1 0.5 1.5的比例，將β-葡萄糖苷酶加入緩沖溶液中，攪拌混合均勻，就制備出β-葡萄糖苷酶緩沖溶液。其中，所述的緩沖溶液為PH值6.0 8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。(2)制備固定化β -葡萄糖苷酶第(1)步完成后，以市售的賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹為原料，按照賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂的質(zhì)量(g)第(1)步制備出得β-葡萄糖苷酶緩沖溶液的體積(HiL) 的戊二醛溶液的體積(mL)比為1 10 20 1 3的比例， 先將賴氨酸修飾的殼聚糖微球陽離子交換樹脂加入到β-葡萄糖苷酶緩沖溶液中，攪拌吸附1 3小時后再加入戊二醛溶液，反應1 3小時后將反應產(chǎn)物放置于真空過濾器中，進行真空過濾，分別收集濾液和濾渣。對于收集的濾液，用于回收緩沖溶液。對于收集的濾渣， 按照濾渣的質(zhì)量(g)緩沖溶液體積(mL)之比為1 10 50的比例，用緩沖溶液對糖渣進行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣。再按洗滌后的濾渣的質(zhì)量(g)緩沖溶液的體積(mL)之比為1 10 50的比例，再用緩沖溶液對洗滌后的濾渣進行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣。如此重復，直至洗滌液中檢測不出酶蛋白質(zhì)為止。最后合并各次收集的洗滌液和第( 步收集的濾液，用于回收緩沖溶液。對于洗滌后的濾渣，即為制得的固定化β-葡萄糖苷酶，用于組裝固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器。其中，所述的緩沖溶液為ρΗ值6. 0 8. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(3)制備白藜蘆醇苷水解液第( 步完成后，以市售的白藜蘆醇苷為原料，先將第( 步制得的固定化葡萄糖苷酶裝入夾套保溫層析柱中，升溫至30 60°C，就組裝出固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器，用于水解白藜蘆醇苷。再按照市售的白藜蘆醇苷的質(zhì)量(g)乙醇體積濃度為 30 50%的乙醇溶液體積(L)之比為1 0. 5 1. 5的比例，將市售的白藜蘆醇苷加入到乙醇溶液中，攪拌至溶解，就制備出白藜蘆醇苷溶液，用于制備白藜蘆醇水解液。然后，將制得的白藜蘆醇苷溶液泵入到組裝的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器中，控制白藜蘆醇苷溶液的泵入速度為固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器體積(mL)的2 6倍/小時(BV/h)， 進行連續(xù)水解反應26 40小時。分別收集固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器的流出液和固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器，對于收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器，可再生利用；對于收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器的流出液，即為白藜蘆醇苷水解液，用于吸附分離白黎蘆醇。(4)再生固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器第C3)步完成后，向第C3)步收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器中，泵入純凈水進行清洗，控制純凈水泵入速度為固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器體積(mL)的2 6倍/小時(BV/h)，直至清洗液中無白藜蘆醇苷和白黎蘆醇時止，分別收集清洗液和清洗后的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器。對收集的清洗液，因含有大量的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇，用于下步處理；對收集的清洗后的固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器，即為再生的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器，可再使用。使用后又用純凈水清洗再生，又再使用。如此使用-清洗再生-再使用……，可反復使用，充分利用固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器， 且清洗液又回收利用。因此，操作簡便，又降低了生產(chǎn)成本，并有利于環(huán)保。(5)制備白藜蘆醇晶體
第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附樹脂為原料，先將市售活化的XAD-7HP大孔吸附樹脂裝入中壓層析柱中，先泵入第C3)步收集的白藜蘆醇苷水解液，控制白藜蘆醇苷水解液泵入速度為XAD-7HP大孔吸附樹脂柱體積的2 6倍/小時(BV/h)， 直至流出液中出現(xiàn)白藜蘆醇為止。分別收集流出液和吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱，對于收集的流出液，含有葡萄糖，用于制備葡萄糖酸。再將收集的吸附白藜蘆醇的 XAD-7HP大孔吸附樹脂柱泵入等樹脂柱體積的蒸餾水進行洗滌，用于洗滌夾雜于樹脂間的雜質(zhì)。分別收集洗滌液及洗滌后的吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱。收集的洗滌液，用于第(3)步配制白藜蘆醇苷溶液。對于收集的洗滌后吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP 大孔吸附樹脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附樹脂質(zhì)量(g)乙醇體積濃度為50 90%的乙醇溶液體積(mL)之比為1 40 80的比例，向洗滌后的吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱泵入流速為2 6倍樹脂體積/小時(BV/h)的乙醇溶液。分別收集洗脫流出液和洗脫吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂。對于收集的洗脫吸附有白藜蘆醇的 XAD-7HP大孔吸附樹脂，用蒸餾水進行洗滌再生，分別收集洗滌液和洗滌后的XAD-7HP大孔吸附樹脂。對收集的洗滌后得XAD-7HP大孔吸附樹脂，即為再生XAD-7HP大孔吸附樹脂，可再使用。使用后，再用蒸餾水洗滌再生，再次使用，如此可反復使用；然后合并洗脫流出液和再生XAD-7HP大孔吸附樹脂的洗滌液，并將該合并液泵入真空濃縮器中，在真空度為-0. 6 -0. 9MPa，溫度為75 90°C下，進行真空濃縮，直至濃縮液中無乙醇氣味時為止， 分別收集白藜蘆醇濃縮液和蒸發(fā)液(即回收的乙醇)。對于回收的乙醇，調(diào)節(jié)其濃度后可再次用于洗脫白藜蘆醇；最后將收集的白藜蘆醇濃縮液，泵入結(jié)晶罐中，進行結(jié)晶M 36小時。結(jié)晶完成后，進行過濾，分別收集濾渣和濾液。對于收集的濾液，為結(jié)晶母液，可用于與第(5)中收集的洗脫流出液和再生XAD-7HP大孔吸附樹脂的洗滌液合并后再結(jié)晶，再用于制備白藜蘆醇晶體。對于收集的晶體，置于真空烘箱中，于60-80°C干燥2-3小時，就制備出純度高達98-99 %的白藜蘆醇晶體產(chǎn)品。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，主要有以下效果(1)本發(fā)明生產(chǎn)過程的加工工藝和設備通用性強，操作簡單實用。本發(fā)明僅使用酶水解、真空過濾、真空濃縮等通用設備及簡單工藝，總體節(jié)約能源，生產(chǎn)成本低。(2)本發(fā)明的生產(chǎn)過程反應條件溫和，節(jié)約能源；工藝全過程無廢物排放，全部物料都采用循環(huán)后回收利用，并進一步降低生產(chǎn)成本，有利于保護環(huán)境。(3)本發(fā)明制備出固定化葡萄糖苷酶催化劑，顯著增加了葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性，可在更廣泛的條件下使用。固定化葡萄糖苷酶可反復使用，再生效果好，減少了對酶的需求量，再進一步降低了生產(chǎn)成本，有利于可持續(xù)發(fā)展。(4)本發(fā)明實現(xiàn)了白藜蘆醇苷在固定化β -葡萄糖苷酶樹脂柱中連續(xù)進行水解反應，減少了生產(chǎn)周期與工藝步驟，提高了轉(zhuǎn)化效率，降低了生產(chǎn)成本，能實現(xiàn)白藜蘆醇的規(guī)模化生產(chǎn)與連續(xù)生產(chǎn)，便于推廣使用。(5)本發(fā)明制得的固定化β -葡萄糖苷酶反應器和吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂能反復再生利用，進一步降低了生產(chǎn)成本，并有利于環(huán)境保護。本發(fā)明可廣泛應用于制備白藜蘆醇，采用本發(fā)明制備出的白藜蘆醇產(chǎn)品可廣泛應用于食品保健、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)中。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
，進一步說明本發(fā)明。實施例1—種固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法，具體步驟如下(1)配制β -葡萄糖苷酶緩沖溶液以市售的β -葡萄糖苷酶為原料，按照β -葡萄糖苷酶的質(zhì)量(mg)緩沖溶液體積(L)比為1 0.5的比例，將β-葡萄糖苷酶加入緩沖溶液中，攪拌混合均勻，就制備出 β -葡萄糖苷酶緩沖溶液。其中，所述的緩沖溶液為PH值6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。(2)制備固定化β -葡萄糖苷酶第(1)步完成后，以市售的賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹為原料，按照賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂的質(zhì)量(g)第(1)步制備出的β-葡萄糖苷酶緩沖溶液的體積(mL) 的戊二醛溶液的體積(mL)比為1 10 1的比例，先將賴氨酸修飾的殼聚糖微球陽離子交換樹脂加入到葡萄糖苷酶緩沖溶液中，攪拌吸附1小時后再加入戊二醛溶液，反應1小時后將反應產(chǎn)物放置于真空過濾器中，進行真空過濾，分別收集濾液和濾渣。對于收集的濾液，用于回收緩沖溶液。對于收集的濾渣，按照濾渣的質(zhì)量(g)緩沖溶液體積(mL)之比為1 10的比例，用緩沖溶液對濾渣進行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣。再按洗滌后的濾渣的質(zhì)量(g)緩沖溶液的體積(mL)之比為 1 10的比例，再用緩沖溶液對洗滌后的濾渣進行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣。 如此重復，直至洗滌液中檢測不出酶蛋白質(zhì)為止。最后合并各次收集的洗滌液和第(2)步收集的濾液，用于回收緩沖溶液。對于洗滌后的濾渣，即為制得的固定化葡萄糖苷酶， 用于組裝固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器。其中，所述的緩沖溶液為PH值6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(3)制備白藜蘆醇苷水解液第( 步完成后，以市售的白藜蘆醇苷為原料，先將第( 步制得的固定化葡萄糖苷酶裝入夾套保溫層析柱中，升溫至30°C，就組裝出固定化葡萄糖苷酶柱式反應器，用于水解白藜蘆醇苷。再按照市售的白藜蘆醇苷的質(zhì)量(g)乙醇體積濃度為30%的乙醇溶液體積(L)之比為1 0.5的比例，將市售的白藜蘆醇苷加入到乙醇溶液中，攪拌至溶解，就制備出白藜蘆醇苷溶液，用于制備白藜蘆醇水解液。然后，將制得的白藜蘆醇苷溶液泵入到組裝的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器中，控制白藜蘆醇苷溶液的泵入速度為固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器體積(mL)的2倍/小時(BV/h)，進行連續(xù)水解反應沈小時。分別收集固定化葡萄糖苷酶柱式反應器的流出液和固定化葡萄糖苷酶柱式反應器，對于收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器，可再生利用；對于收集的固定化 β -葡萄糖苷酶柱式反應器的流出液，即為白藜蘆醇苷水解液，用于吸附分離白黎蘆醇。(4)再生固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器第C3)步完成后，向第C3)步收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器中，泵入純凈水進行清洗，控制純凈水泵入速度為固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器體積(mL)的2倍 /小時(8V/h)，直至清洗液中無白藜蘆醇苷和白黎蘆醇時止，分別收集清洗液和清洗后的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器。對收集的清洗液，因含有大量的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇，用于下步處理；對收集的清洗后的固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器，即為再生的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器，可再使用。使用后又用純凈水清洗再生，又再使用。如此使用-清洗再生-再使用……，可反復使用，充分利用固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器，且清洗液又回收利用。因此，操作簡便，又降低了生產(chǎn)成本，并有利于環(huán)保。(5)制備白藜蘆醇晶體第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附樹脂為原料，先將市售活化的 XAD-7HP大孔吸附樹脂裝入中壓層析柱中，先泵入第C3)步收集的白藜蘆醇苷水解液，控制白藜蘆醇苷水解液泵入速度為XAD-7HP大孔吸附樹脂柱體積的2倍/小時(BV/h)，直至流出液中出現(xiàn)白藜蘆醇為止。分別收集流出液和吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱， 對于收集的流出液，含有葡萄糖，用于制備葡萄糖酸。再將收集的吸附白藜蘆醇的XAD-7HP 大孔吸附樹脂柱泵入等樹脂柱體積的蒸餾水進行洗滌，用于洗滌夾雜于樹脂間的雜質(zhì)。分別收集洗滌液及洗滌后的吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱。收集的洗滌液，用于第(3)步配制白藜蘆醇苷溶液。對于收集的洗滌后吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附樹脂質(zhì)量(g)乙醇體積濃度為50%的乙醇溶液體積(mL) 之比為1 40的比例，向洗滌后的吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱泵入流速為 2倍樹脂體積/小時(BV/h)的乙醇溶液。分別收集洗脫流出液和洗脫吸附有白藜蘆醇的 XAD-7HP大孔吸附樹脂。對于收集的洗脫吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂，用蒸餾水進行洗滌再生，分別收集洗滌液和洗滌后的XAD-7HP大孔吸附樹脂。對收集的洗滌后得XAD-7HP大孔吸附樹脂，即為再生XAD-7HP大孔吸附樹脂，可再使用。使用后，再用蒸餾水洗滌再生，再次使用，如此可反復使用；然后合并洗脫流出液和再生XAD-7HP大孔吸附樹脂的洗滌液，并將該合并液泵入真空濃縮器中，在真空度為-0. 6MPa，溫度為75°C下，進行真空濃縮，直至濃縮液中無乙醇氣味時為止，分別收集白藜蘆醇濃縮液和蒸發(fā)液(即回收的乙醇)。對于回收的乙醇，調(diào)節(jié)其濃度后可再次用于洗脫白藜蘆醇；最后將收集的白藜蘆醇濃縮液，泵入結(jié)晶罐中，進行結(jié)晶M小時。結(jié)晶完成后，進行過濾，分別收集濾渣和濾液。 對于收集的濾液，為結(jié)晶母液，可用于與第(5)中收集的洗脫流出液和再生XAD-7HP大孔吸附樹脂的洗滌液合并后再結(jié)晶，再用于制備白藜蘆醇晶體。對于收集的晶體，置于真空烘箱中，于60°C干燥2小時，就制備出純度高達98%的白藜蘆醇晶體產(chǎn)品。實施例2一種固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法，同實施例1，其中第(1)步中，β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量(mg)緩沖溶液體積(L)比為1 1，緩沖溶液PH值為7.0。第( 步中，賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂的質(zhì)量(g) 葡萄糖苷酶緩沖溶液體積(mL) 的戊二醛溶液體積(mL)比為1 15 2，攪拌吸附時間為 2小時，反應時間為2小時，濾渣的質(zhì)量(g)緩沖溶液體積(mL)之比為1 30，洗滌后的濾渣的質(zhì)量(g)緩沖溶液的體積(mL)之比為1 30，緩沖溶液pH值為7.0。第(3)步中，升溫至45°C，市售的白藜蘆醇苷的質(zhì)量(g)乙醇體積濃度為40% 的乙醇溶液體積(L)之比為1 1，泵入速度為固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器體積(mL) 的4倍/小時，水解反應時間為33小時。第(4)步中，泵入速度為固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器體積(mL)的4倍/小時。第(5)步中，泵入速度為XAD-7HP大孔吸附樹脂柱體積的4倍/小時，XAD-7HP大孔吸附樹脂質(zhì)量(g)乙醇體積濃度為70%的乙醇溶液體積(mL)之比為1 60，泵入流速為4倍樹脂體積/小時，真空度為-0. 7MPa，溫度為83°C，結(jié)晶時間為30小時，干燥溫度為70°C，干燥時間為2. 5小時，產(chǎn)品純度為98. 3%0實施例3—種固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法，同實施例1，其中第(1)步中，β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量(mg)緩沖溶液體積(L)比為1 1.5，緩沖溶液PH值為8.0。第( 步中，賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂的質(zhì)量(g) 葡萄糖苷酶緩沖溶液體積(HiL) 的戊二醛溶液體積(mL)比為1 20 3，攪拌吸附時間為 3小時，反應時間為3小時，濾渣的質(zhì)量(g)緩沖溶液體積(mL)之比為1 50，洗滌后的濾渣的質(zhì)量(g)緩沖溶液的體積(mL)之比為1 50，緩沖溶液pH值為8.0。第(3)步中，升溫至60°C，市售的白藜蘆醇苷的質(zhì)量(g)乙醇體積濃度為50% 的乙醇溶液體積(L)之比為1 1.5，泵入速度為固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器體積 (mL)的6倍/小時，水解反應時間為40小時。第(4)步中，泵入速度為固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器體積(mL)的6倍/小時。 第(5)步中，泵入速度為XAD-7HP大孔吸附樹脂柱體積的6倍/小時，XAD-7HP大孔吸附樹脂質(zhì)量(g)乙醇體積濃度為90%的乙醇溶液體積(mL)之比為1 80，泵入流速為6倍樹脂體積/小時，真空度為-0. 9MPa，溫度為90°C，結(jié)晶時間為36小時，干燥溫度為80°C，干燥時間為3小時，產(chǎn)品純度為99%。
權(quán)利要求
1. 一種固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法，其特征在于所述方法的具體步驟如下(1)配制β-葡萄糖苷酶緩沖溶液以市售的β-葡萄糖苷酶為原料，按照β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量緩沖溶液體積比為 Img 0.5 1.5L的比例，將β-葡萄糖苷酶加入緩沖溶液中，攪拌混合均勻，其中，所述的緩沖溶液為ρΗ值6. 0 8. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液；(2)制備固定化葡萄糖苷酶第(1)步完成后，以市售的賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹為原料，按照賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂的質(zhì)量第(1)步制備出的葡萄糖苷酶緩沖溶液的體積的戊二醛溶液的體積比為Ig 10 20mL 1 3mL的比例，先將賴氨酸修飾的殼聚糖微球陽離子交換樹脂加入到β -葡萄糖苷酶緩沖溶液中，攪拌吸附1 3小時后再加入戊二醛溶液，反應1 3小時后將反應產(chǎn)物放置于真空過濾器中，進行真空過濾， 分別收集濾液和濾渣，對于收集的濾渣，按照濾渣的質(zhì)量緩沖溶液體積之比為Ig 10 50mL的比例，用緩沖溶液對濾渣進行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣，再按洗滌后的濾渣的質(zhì)量緩沖溶液的體積之比為Ig 10 50mL的比例，再用緩沖溶液對洗滌后的濾渣進行洗滌，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣，如此重復，直至洗滌液中檢測不出酶蛋白質(zhì)為止，最后合并各次收集的洗滌液和第(2)步收集的濾液，所述的緩沖溶液為ρΗ值6.0 8. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液；(3)制備白藜蘆醇苷水解液第( 步完成后，以市售的白藜蘆醇苷為原料，先將第( 步制得的固定化葡萄糖苷酶裝入夾套保溫層析柱中，升溫至30 60°C，再按照市售的白藜蘆醇苷的質(zhì)量乙醇體積濃度為30 50%的乙醇溶液體積之比為Ig 0. 5 1. 5L的比例，將市售的白藜蘆醇苷加入到乙醇溶液中，攪拌至溶解，然后，將制得的白藜蘆醇苷溶液泵入到組裝的固定化 β -葡萄糖苷酶柱式反應器中，控制白藜蘆醇苷溶液的泵入速度為固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器體積mL的2 6倍/小時，進行連續(xù)水解反應沈 40小時，分別收集固定化 β-葡萄糖苷酶柱式反應器的流出液和固定化β-葡萄糖苷酶柱式反應器；(4)再生固定化葡萄糖苷酶柱式反應器第( 步完成后，向第C3)步收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反應器中，泵入純凈水進行清洗，控制純凈水泵入速度為固定化β -葡萄糖苷酶柱式反應器體積mL的2 6倍 /小時，直至清洗液中無白藜蘆醇苷和白黎蘆醇時止，分別收集清洗液和清洗后的固定化 β-葡萄糖苷酶柱式反應器；(5)制備白藜蘆醇晶體第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附樹脂為原料，先將市售活化的 XAD-7HP大孔吸附樹脂裝入中壓層析柱中，先泵入第C3)步收集的白藜蘆醇苷水解液，控制白藜蘆醇苷水解液泵入速度為XAD-7HP大孔吸附樹脂柱體積的2 6倍/小時，直至流出液中出現(xiàn)白藜蘆醇為止，分別收集流出液和吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱， 再將收集的吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱泵入等樹脂柱體積的蒸餾水進行洗滌，分別收集洗滌液及洗滌后的吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱，對于收集的洗滌后吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附樹脂質(zhì)量乙醇體積濃度為50 90%的乙醇溶液體積之比為Ig 40 80mL的比例，向洗滌后的吸附白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂柱泵入流速為2 6倍樹脂體積/小時的乙醇溶液， 分別收集洗脫流出液和洗脫吸附有白藜蘆醇的XAD-7HP大孔吸附樹脂，然后合并洗脫流出液和再生XAD-7HP大孔吸附樹脂的洗滌液，并將該合并液泵入真空濃縮器中，在真空度為-0. 6 -0. 9MPa，溫度為75 90°C下，進行真空濃縮，直至濃縮液中無乙醇氣味時為止， 分別收集白藜蘆醇濃縮液和蒸發(fā)液，最后將收集的白藜蘆醇濃縮液，泵入結(jié)晶罐中，進行結(jié)晶M 36小時，結(jié)晶完成后，進行過濾，分別收集濾渣和濾液，對于收集的晶體，置于真空烘箱中，于60-80°C干燥2-3小時，就制備出純度高達98-99%的白藜蘆醇晶體產(chǎn)品。
全文摘要
一種固定化酶連續(xù)水解白藜蘆醇苷制備白藜蘆醇的方法，涉及白藜蘆醇的制備方法。本發(fā)明以市售的賴氨酸修飾的殼聚糖微球陰離子交換樹脂、β-葡萄糖苷酶、白藜蘆醇苷和XAD-7HP大孔吸附樹脂為原料，先制備固定化β-葡萄糖苷酶，后裝柱成柱式酶反應器，再經(jīng)連續(xù)水解、吸附、洗脫、結(jié)晶而得產(chǎn)品。本發(fā)明生產(chǎn)過程的工藝，設備及操作簡單；反應條件溫和，節(jié)約能源；在生產(chǎn)過程中的物料都采用循環(huán)處理回收利用或再生反復使用，無廢物排放，有利于環(huán)境保護；生產(chǎn)成本低，便于推廣應用，有利于可持續(xù)發(fā)展。本發(fā)明可廣泛應用于制備白藜蘆醇，采用本發(fā)明方法制備出的產(chǎn)品，可廣泛應用于醫(yī)藥、食品處理、化妝品等行業(yè)中。
文檔編號C07C39/21GK102492731SQ20111041075
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者周小華, 徐溢, 徐煥煥, 王丹, 蘇昱, 趙紅波 申請人:重慶大學