專利名稱：一種突變多角體蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種突變多角體蛋白，尤其涉及一種能夠提高目的蛋白得率的的突變多角體蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
由于多角體蛋白具有高效表達(dá)的能力，因此常將其作為一種標(biāo)簽，將不表達(dá)或者難表達(dá)的蛋白基因融合上去，從而使其表達(dá)或者提高其表達(dá)量。同時，可以利用多角體的溶解特性，通過簡單的PH調(diào)節(jié)和差速離心的方法得到比較純的融合蛋白，之后進(jìn)行蛋白酶切得到純的目的蛋白。但是，蛋白酶的最佳作用PH范圍在7. 0-8. 5，而多角體蛋白只有在 ρΗΙΟ. 8時才會溶解，所以在這一條件下進(jìn)行酶切時，蛋白酶喪失活性或者無法達(dá)到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有純化方法中蛋白酶酶切效率較低的不足，本發(fā)明提供一種利用重疊延伸PCR方法得到的突變多角體蛋白。它有效地降低了多角體蛋白的溶解pH，使多角體蛋白在蛋白酶最佳酶切PH條件下處于溶解狀態(tài)；在利用多角體蛋白作為標(biāo)簽純化融合蛋白， 最后通過蛋白酶酶切方法將多角體去除時，蛋白酶就能發(fā)揮其最大活性，從而得到大量的目的蛋白。本發(fā)明解決問題所采用的技術(shù)方案是通過設(shè)計(jì)引物，將pET_28a載體上的所有蛋白標(biāo)簽去除，然后融合進(jìn)去野生型多角體蛋白基因，目的是使得到的表達(dá)產(chǎn)物是不含任何標(biāo)簽蛋白的多角體蛋白。然后，設(shè)計(jì)含突變位點(diǎn)的引物，利用商品化的定點(diǎn)突變試劑盒， 將野生型多角體蛋白氨基酸序列中N端的4個連續(xù)的堿性氨基酸突變?yōu)樗嵝园被?，對這一連接有突變多角體蛋白基因的表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，通過傳統(tǒng)的調(diào)節(jié)PH的方法進(jìn)行純化，并與野生型的多角體蛋白比較，檢測到經(jīng)突變的多角體蛋白在PH8. 5時就處于可溶狀態(tài)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種突變多角體蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。上述突變多角體蛋白的制備方法，包括以下步驟
(a)由PCR擴(kuò)增的方法獲得野生型多角體蛋白基因；
(b)通過設(shè)計(jì)引物，將pET-28a載體上的所有蛋白標(biāo)簽去除，并連接上步驟(a)所得到的多角體蛋白基因，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET-28a-/70從；
(c)利用商品化的定點(diǎn)突變試劑盒，將野生型多角體蛋白氨基酸序列中N端4個連續(xù)的堿性氨基酸突變?yōu)樗嵝园被?，并設(shè)計(jì)含突變位點(diǎn)的引物；
(d)得到重組表達(dá)載體pETj8a-/70從后，利用商品化的定點(diǎn)突變試劑盒，通過步驟(c) 所得突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得完整的含突變位點(diǎn)的重組表達(dá)載體；
(e)將步驟(d)所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得所述突變多角體蛋白。進(jìn)一步地，上述步驟(c)中將野生型多角體蛋白氨基酸序列(如SEQ ID NO 2所示)中的第32-35位4個連續(xù)的堿性氨基酸KRKK突變成了酸性氨基酸ESEE。進(jìn)一步地，上述步驟(e)中得到的突變多角體蛋白在pH8. 5時能溶，而野生型多角體蛋白在PH10.8時能溶。本發(fā)明的有益效果是，一方面既能繼續(xù)利用多角體作為蛋白標(biāo)簽來使不表達(dá)或者難表達(dá)的蛋白得以表達(dá)或者提高其表達(dá)量，另一方面在用蛋白酶將多角體蛋白切除時能使蛋白酶發(fā)揮其最大活性，得到大量的目的蛋白。


圖1是本發(fā)明的pET-28a-/70從質(zhì)粒圖譜；
圖2是本發(fā)明的pETj8a-/ o從重疊延伸PCR圖；M :DNA Ladder Mix ； 1:PCR擴(kuò)增條帶； 圖3是本發(fā)明的突變多角體蛋白表達(dá)圖；M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: pET-28a空載未誘導(dǎo)； 2: pET-28a 空載誘導(dǎo)；3: pET-28a-/ o7A 未誘導(dǎo)；4: pET-28a-/ o7A 誘導(dǎo)； 圖4是本發(fā)明的突變多角體蛋白的pH調(diào)節(jié)M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :pH8. 5，4000rpm上清；2: ρΗ8· 5，4000rpm上清再次用15000rpm
離心后的上清。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的發(fā)明。除非另有說明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 引物設(shè)計(jì)
擴(kuò)增野生型多角體基因，引物設(shè)計(jì)如下
上游引物 F 5，-CATGCr^r^CCAATTATTCATACACCC-3'(斜體表示 Afco I 酶切位點(diǎn)) 下游引物 R 5，-CQGGAr^ATACGCCGGACCAGTGAA-3'(斜體表示 BawR I 酶切位點(diǎn))。實(shí)施例2 =PCR擴(kuò)增野生型多角體基因(如SEQ ID NO=I所示)
以家蠶核型多角體病毒基因組(購自hvitrogen公司)，實(shí)施例1所得的上游引物F、 下游引物R為引物，擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)為，94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s， 55°C退火30s，72°C復(fù)性延伸Imin, 30個循環(huán)，72°C延伸IOmin0在100 μ L的離心管中，加入下列組分 KOD Dash Buffer 5 μ L
2. 5mMdNTPs 1. 5μ L KOD Dash1 μ L
F1 μ L
R1 μ L
模板ι μ L
加無菌雙蒸水至50 μ L。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時切膠回收目的片段。實(shí)施例3 突變引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)前面所述的原則，將野生型多角體蛋白(如SEQ ID N0:2所示)的N端連續(xù)4個堿性氨基酸KRKK突變?yōu)?個連續(xù)的酸性氨基酸ESEE，用ft~imer5. 0設(shè)計(jì)的引物如下 上游引物 F，5，-GTGCTCCTCGCTCTCGGCGTTTTTGATAAG-3，
下游引物 R’ 5’ -GAGAGCGAGGAGCACCTAGTCGAACATGA -3’(粗體部分為突變位點(diǎn))。實(shí)施例4 構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-/70煬
實(shí)施例2得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)Afco I和漢3 H I雙酶切后的基因片段克隆至經(jīng)Afco I 和漢3 H I雙酶切的載體pETj8aanVitrogen公司)中，使PCR擴(kuò)增的基因連接到載體 pET-28a上，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pETj8a-/70從(見圖1)，經(jīng)酶切分析鑒定基因序列完全正確。實(shí)施例5 重組表達(dá)載體pET-28a-/70煬的突變
得到重組表達(dá)載體pETj8a-/7o從后，利用商品化的定點(diǎn)突變試劑盒(Transgene公司)，通過實(shí)施例3所得突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到完整的含突變位點(diǎn)的表達(dá)載體(其中含有突變多角體蛋白基因片段，如SEQ ID NO :3所示)，結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例6 突變多角體蛋白(如SEQ ID NO 4所示)的表達(dá)
含突變位點(diǎn)的重組表達(dá)載體經(jīng)雙酶切鑒定正確后，又經(jīng)測序，證明其序列與設(shè)計(jì)的突變序列完全相同即突變成功。隨后，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(Invitr0gen公司) 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4h后收集菌體，12000rpm離心lOmin，收集沉淀，加入50 μ L的1 XPBS重懸， 然后加入50 μ L的2Χ上樣緩沖液進(jìn)行樣品制備，取15 μ L走12%的SDS-PAGE蛋白電泳， 并以空的表達(dá)載體作為對照，結(jié)果如圖3所示，突變多角體蛋白(約^kDa)獲得大量表達(dá)。實(shí)施例7 突變多角體蛋白的純化
得到突變多角體蛋白后，利用傳統(tǒng)的調(diào)節(jié)PH的方法進(jìn)行純化，并與野生型的多角體作對比，結(jié)果如圖4所示，表明突變的多角體蛋白溶解性已發(fā)生變化，在ρΗ8. 5的上清中存在很大量，這是野生型多角體所不具備的。本發(fā)明的突變多角體蛋白基因連接目的蛋白基因后，得到的融合蛋白既能利用多角體的性質(zhì)通過PH調(diào)節(jié)和差速離心的方法簡化純化步驟，又能在蛋白酶最佳作用ρΗ條件下進(jìn)行酶切，得到最大量的目的蛋白，極大地提高了目的蛋白的得率。以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)中的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)特征的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些潤飾和改進(jìn)也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種突變多角體蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
2.—種權(quán)利要求1所述突變多角體蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)由PCR擴(kuò)增的方法獲得野生型多角體蛋白基因；(b)通過設(shè)計(jì)引物，將pET-28a載體上的所有蛋白標(biāo)簽去除，并連接步驟(a)所得到的多角體蛋白基因，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET-28a-/70從；(c)利用商品化的定點(diǎn)突變試劑盒，將野生型多角體蛋白氨基酸序列中N端4個連續(xù)的堿性氨基酸突變?yōu)樗嵝园被?，設(shè)計(jì)含突變位點(diǎn)的引物；(d)得到重組表達(dá)載體pETj8a-/70從后，利用商品化的試劑盒，通過步驟(c)所得突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得完整的含突變位點(diǎn)的重組表達(dá)載體；(e)將步驟(d)所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得所述突變多角體蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中將野生型多角體蛋白氨基酸序列中的第32-35位4個連續(xù)的堿性氨基酸KRKK突變成了酸性氨基酸ESEE。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)中得到的突變多角體蛋白在 PH8. 5時能溶，而野生型多角體蛋白在ρΗΙΟ.8時能溶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠提高目的蛋白得率的突變多角體蛋白，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明主要通過構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-polh，然后利用商品化的試劑盒對其進(jìn)行突變得到完整的含突變位點(diǎn)的重組表達(dá)載體，再進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到能夠降低溶解pH的所述突變多角體蛋白。本發(fā)明的突變多角體蛋白基因連接上目的蛋白基因后，得到的融合蛋白既能利用多角體的性質(zhì)通過pH調(diào)節(jié)和差速離心的方法簡化純化步驟，又能在蛋白酶最佳作用pH條件下進(jìn)行酶切，得到最大量的目的蛋白，極大地提高了目的蛋白的得率。
文檔編號C07K14/01GK102516369SQ20111043204
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者張耀洲, 杜君卿, 舒特俊, 陳劍清 申請人:天津耀宇生物技術(shù)有限公司