專利名稱：毒死蜱半抗原、毒死蜱完全抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毒死蜱半抗原、毒死蜱完全抗原、毒死蜱半抗原制備方法及毒死蜱完全抗原的制備方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，用于制備特異識(shí)別化學(xué)農(nóng)藥毒死蜱的高效抗體與研制可以快速檢測毒死蜱殘留的免疫速測試劑盒。
背景技術(shù)：
毒死蜱[(*10印71^作8，0，0-二乙基-0-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯]，商品名為毒死蜱、樂斯本、白蟻清等，毒死蜱原藥為白色顆粒狀晶體，室溫下穩(wěn)定，有硫醇?xì)馕?，比?.398 (43.5°C )，熔點(diǎn)41.5 43.5°C，在水中溶解度為1.2 X 10_5g/kg，溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。通過觸殺、胃毒和熏蒸三種作用方式防治糧食、果樹、蔬菜和其他經(jīng)濟(jì)作物的害蟲，經(jīng)過皮膚、呼吸道以及腸胃吸收等途徑進(jìn)入人體后，可與膽堿酯酶迅速結(jié)合，形成磷酰化膽堿酯酶，使其失去催化水解乙酰膽堿的能力，導(dǎo)致大量的乙酰膽堿在體內(nèi)蓄積，并抑制僅有的乙酰膽堿酯酶活力，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)及膽堿能神經(jīng)過度興奮而出現(xiàn)中毒癥狀，長期作用人體還可引起致畸、致癌、致突變危害。毒死蜱目前廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，作為一種廣譜型有機(jī)磷酸酯類殺蟲劑，是甲胺磷和甲基對(duì)硫磷等高毒農(nóng)藥的新型高效、低毒替代品種之一，也是安全農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留監(jiān)控的重要品種。而且，環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)毒死蜱殘留的情況也日趨嚴(yán)重，對(duì)人們的健康構(gòu)成了潛在的威脅。目前，我國主要采用儀器法檢測如氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)。儀器檢測法存在樣品前處理繁瑣、檢測時(shí)間長、儀器貴重等缺點(diǎn)，所以在我國無法得到廣泛應(yīng)用，并且不符合現(xiàn)場檢測:“在短時(shí)間內(nèi)低成本對(duì)大量樣品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測和篩選”的要求。酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)，是將免疫技術(shù)與現(xiàn)代測試手段相結(jié)合而建立的一種超微量的測定方法，具有成本低、速度快、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單的特點(diǎn)，適合大批量樣品的快速分析。而免疫學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)是相應(yīng)的高特異性、高親和力的抗體的制備，而毒死蜱作為小分子化合物，本身不具備免疫原性，因此，其半抗原的結(jié)構(gòu)改造和全抗原合成是建立免疫速測技術(shù)的關(guān)鍵和難點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種毒死蜱半抗原。本發(fā)明的第二個(gè)目的提供一種毒死蜱半抗原的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的提供一種毒死蜱完全抗原。本發(fā)明的第四個(gè)目的提供一種毒死蜱完全抗原的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
一種毒死蜱半抗原，具有式I結(jié)構(gòu):
權(quán)利要求
1.一種毒死蜱半抗原，具有式I結(jié)構(gòu):
2.式I所示毒死蜱半抗原的制備方法，由如下步驟組成: 向圓底三口瓶中加入50mL含1.20g的3-巰基丙酸無水乙醇溶液、1.04gNa0H，加熱攪拌至NaOH完全溶解，加入50mL毒死蜱(3.51g)無水乙醇溶液，60°C攪拌反應(yīng)1.5h，反應(yīng)完畢后，趁熱過濾反應(yīng)混合物，濾液減壓濃縮蒸干得白色固體，加入50mL 5 % NaHCO3溶液溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，30mL正己烷萃取，棄去有機(jī)相；濃鹽酸調(diào)節(jié)水相pH = 3，二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相并用無水Na2SO4干燥過夜，減壓濃縮近干得淡黃色固體，利用硅膠柱分離純化，洗脫液為正己烷/乙酸乙酯=1/2，收集目標(biāo)物，減壓濃縮蒸干得淡黃色固體，-20°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下密封保存。
3.—種毒死蜱完全抗原，具有式II結(jié)構(gòu):
4.式II結(jié)構(gòu)的一種毒死蜱完全抗原的制備方法，由如下步驟組成:20.0mg羧基化毒死蜱半抗原，9.2mgEDC和5.6mg NHS溶于400 μ L無水DMF，室溫?cái)嚢?2h，4000rpm離心5min，收集上清液-M 200 μ L上清液，加入2.7mL 10mg/mL BSA硼酸鹽緩沖液(0.2M，pH =·9.0)中，室溫500rpm攪拌4h ;另取200 μ L上清液，加入1.2mL 15mg/mL OVA硼酸鹽緩沖液(0.2M，pH = 9.0)中，室溫500rpm攪拌3.5h ;待上述反應(yīng)完成后，裝入透析袋中，Tris-HCl緩沖液(0.lmol/L, pH = 8)中透析3d，每天換透析液2次，透析完成后凍干，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種毒死蜱半抗原、毒死蜱完全抗原及其制備方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明首先合成毒死蜱的羧基化產(chǎn)物，經(jīng)核磁氫譜、ESI鑒定并純化后，利用EDC法與載體蛋白BSA進(jìn)行偶聯(lián)，經(jīng)MOLDI-TOF鑒定成功合成了毒死蜱人工完全抗原，制備方法簡單有效，成本低廉，合成的毒死蜱人工完全抗原可以應(yīng)用于制備特異識(shí)別化學(xué)農(nóng)藥毒死蜱的高效抗體與研制快速檢測毒死蜱殘留的免疫速測試劑盒。
文檔編號(hào)C07K14/765GK103172674SQ20111044060
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者高志賢, 寧保安, 彭媛, 劉晶, 孫思明, 柳明, 白家磊, 張亦紅 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所