專利名稱：高純度白鮮堿單體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效成分的分離純化方法，具體為從中藥白鮮皮中分離制備高純度白鮮堿單體的方法。
背景技術(shù)：
白鮮皮為蕓香科植物白鮮(Mictrnms dasycarpus Turcz.)的根皮，具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒等功效，可用于治療濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風(fēng)疹、皮膚搔癢、疥癬、黃疽和急慢性肝炎等疾病。白鮮堿(Dictamnine)為白鮮皮的主要化學(xué)成分，具有強心、收縮平滑肌、松弛血管、抗真菌、DNA光毒性、抗血小板聚集、昆蟲拒食等作用，并且是一種潛在的保鮮劑。
OCH3
Z、丫人丫八、目前國內(nèi)尚未有對白鮮堿單體進行分離的專利，現(xiàn)有關(guān)于白鮮堿單體分離制備的文獻方法主要采用反復(fù)硅膠柱層析和kphadex LH-20凝膠柱色譜，其局限性是費時費力、 污染環(huán)境、樣品純度低，而且反復(fù)柱層析對樣品有不可逆性吸附作用，分離得到白鮮堿單體制備效率低、成本較高，難以發(fā)展成為制備量大的分離技術(shù)。高速逆流色譜(High-speed Counter-current Chromatography, HSCCC )是近 30 年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，它避免了固態(tài)支持體或載體帶來的樣品易被死吸附、損耗和變性等各種問題，使用其它液相色譜法進行制備型分離時，其分配效率會顯著降低，溶劑消耗量大，HSCCC保證較高峰型分辨度，分離量大、樣品無損失、回收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。高速逆流色譜能直接進大量粗提樣品或合成混合物，分離結(jié)果能達到相當(dāng)高的純度，已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域化學(xué)物質(zhì)的制備分離和純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將柱色譜層析和高速逆流色譜法有機的結(jié)合在一起，充分發(fā)揮它們各自的優(yōu)勢，開發(fā)出一種制備成本低于現(xiàn)有技術(shù)，操作簡便，效率高，可以較大批量從中藥白鮮皮中，分離制備出純度大于99%白鮮堿單體的分離制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種高純度白鮮堿單體的制備方法，它包括以下步驟
(1)采用有機溶劑對白鮮皮進行提取，將提取液真空濃縮成浸膏，得總提取物；
(2)將所得總提取物用柱色譜單次層析，進行初步純化，收集含有白鮮堿的組分，合并，蒸干溶劑，得白鮮堿粗分物；
(3)采用高速逆流色譜法純化白鮮堿粗分物，分離制得純度高于99%的白鮮堿單體。本方案的具體特點還有，步驟(1)中有機溶劑為石油醚或乙醚。柱色譜層析采用的固定相為顆粒度為50 400目的硅膠，流動相由組分A和B組成的二元混合液，A組分為石油醚；B組分為乙酸乙酯；A與B的體積比為1 10 :1。步驟(3)中高速逆流色譜法采用的精制溶劑體系由E、F、C、D四個組分構(gòu)成，E組分可選自石油醚或正己烷，F(xiàn)組分為乙酸乙酯或者乙酸丙酯，C組分為甲醇或者乙醇，D組分為水，E、F、C、D的體積比為1 :0. 5 2 :0. 5 3 :0. 5 2。精制溶劑體系中正己烷乙酸乙酯甲醇水=1 :1 :1. 2 :1。具體而言，步驟如下
1.總粗提物的制備白鮮皮藥材粉碎后，用有機溶劑提取3次，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏。2.白鮮堿粗分物的獲取取提取所得浸膏，進行單次硅膠柱層析，流動相用不同比例的二元混合液，A組分為石油醚；B組分為乙酸乙酯。A與B的體積比為1 10 :1。3.高速逆流色譜法純化白鮮堿將硅膠分離的白鮮堿粗分物進行高速逆流色譜法分離，溶劑體系由四個組分構(gòu)成，E組分可選自石油醚、正己烷等醚類或烷烴類，F(xiàn)組分可選自乙酸乙酯、乙酸丙酯等脂肪酯類，C組分可選自甲醇、乙醇等脂肪醇，D組分為水，優(yōu)選正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系，E、F、C、D的體積比為1 :0. 5 2 :0. 5 3 :0. 5 2。 具體過程為配制溶劑系統(tǒng)，充分搖勻后靜置，待分層后，將上下相分開；用泵將溶劑系統(tǒng)的上相注入高速逆流色譜儀的分離柱；取溶劑系統(tǒng)的上相和下相溶解白鮮堿粗分物樣品； 開啟逆流色譜儀，注入溶劑系統(tǒng)的下相進行平衡；溶劑系統(tǒng)達到流體動力學(xué)平衡后，注入樣品溶液；用紫外檢測器檢測洗出液，根據(jù)所得的色譜圖收集目標組分。4. HPLC分析及HSCCC峰的鑒定利用高效液相色譜(HPLC)分析提取物。高效液相色譜條件島津Siim pack VP-ODS柱6 mmX250 mm)，紫外檢測波長236 nm，柱溫 25°C，流速1.0 mL/min，進樣量10 μ L，流動相采用甲醇水=60 :40。HSCCC峰的鑒定應(yīng)用Agilent 5973N質(zhì)譜儀和Varian 600 MHz核磁共振波譜儀分別進行MS，1H-NMR和13C-NMR譜的測定。本發(fā)明的優(yōu)點是分離效果好、效率高、白鮮堿單體產(chǎn)品的純度達到99%以上，白鮮堿單體的制備成本遠低于現(xiàn)有技術(shù)，是一種經(jīng)濟、高效的從白鮮皮藥材中分離制備高純度白鮮堿單體的方法。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；圖2為實施例1的高速逆流色譜圖；圖3為實施例2 的高速逆流色譜圖；圖4為粗提物的高效液相色譜圖；圖5為白鮮堿單體的高效液相色譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明進行說明。實施例1 如圖1白鮮堿單體制備流程圖所示。1.取白鮮皮藥材10 kg粉碎后用石油醚回流提取3次(每次2 h)，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，得到白鮮皮總提取物101. 7 g。2.將上述石油醚總提取物進行單次硅膠柱層析(8. OX 110 cm，硅膠量2 kg, 200-300目)，采用不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，高效液相色譜跟蹤檢測石油醚/ 乙酸乙酯溶劑洗脫3:1至2:1部分，合并含有白鮮堿組分，得到白鮮堿粗分物11. 2 g。3.應(yīng)用高速逆流色譜分離純化白鮮堿粗分物
溶劑系統(tǒng)為正己烷乙酸乙酯甲醇水=1 1 :1. 2 1,高速逆流色譜儀柱體積為沈0 mL，上樣量500 mg，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動相，流速2.0 mL/min，固定相保留率65%，檢測波長254 nm。具體的操作步驟是按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時間后將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動相，取500 mg白鮮堿粗提物溶解于5 mL上相和5 mL下相的混合物中待用。采用北京艾美林公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為^OmL)等組成，首先使進樣閥處于進樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達SOOrpm時，設(shè)置流動相流速為2. 0 mL/min,開始泵流動相，達到流體動力學(xué)平衡后，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進入色譜分離柱。然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖2)接收收目標成分，得白鮮堿單體245 mg, HPLC分析純度為99. 8%0利用高效液相色譜分析分離物，液相條件島津Siim pack VP-ODS柱(4. 6 mmX250 mm)，紫外檢測波長236 nm，柱溫25°C，流速1. 0 ml/min，進樣量10 yL，流動相為甲醇水=60 :40ο結(jié)構(gòu)鑒定對分離得到的白鮮堿應(yīng)用進行Agilent 5973N質(zhì)譜儀和Varian 600 MHz核磁共振波譜儀分別進行MS，1H-NMR和13C-NMR譜的測定，所得數(shù)據(jù)如下
白色粉末，ESI-MS (positive mode), m/z 200.0 [M+H]+. 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 4.43 (3H, s, OCH3), 7.06 (1H, d, /=3.0 Hz, H_3)，7.44 (1H, t, /=7.8 Hz, H-6), 7.61 (1H, d, /=3.0 Hz, H_2)，7.68 (1H, t, /=7.8 Hz, H_7)，8.01 (1H, d, /=2.4 Hz, H-8), 8. 25 (1H, d, /=8.4 Hz, H_5). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ ppm: 143.5 (C_2)，104.7 (C_3)，118.6 (C_3a)，156.9 (C_4)，103.4 (C_4a)，122.4 (C-5), 123.7 (C-6), 129.7 (C_7), 127.6 (C_8)，145.5 (C_8a)，163.8 (C_9a)，59.0 (OCH3)。實施例2
如圖1白鮮堿單體制備流程圖所示。1.取白鮮皮藥材10 kg粉碎后用乙醚回流提取3次(每次2 h)，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，得到白鮮皮總提取物152. 4 g。2.將上述乙醚總提取物進行單次硅膠柱層析(8. OX 110 cm，硅膠量2. 5 kg, 200-300目)，采用不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，高效液相色譜跟蹤檢測石油醚/ 乙酸乙酯溶劑洗脫3:1至2:1部分，合并含有白鮮堿組分，得到白鮮堿粗分物12.3 g。
3.分離所選溶劑系統(tǒng)為石油醚乙酸乙酯乙醇水=1 :0.9 :1. I :1，其余步驟同實施例I。得到純度為99. 6%的白鮮堿單體224 mg，高速逆流色譜分離紫外光譜圖見圖3。實施例3
分離所選溶劑系統(tǒng)為石油醚乙酸丙酯乙醇水=1 0.71 :0. 7，其余步驟同實施例 I。得到純度為99. 2%的白鮮堿單體231 mg。實施例4
分離所選溶劑系統(tǒng)為正己烷乙酸乙酯甲醇水=1 1 1. I 0. 9，其余步驟同實施例 I。得到純度為99. 5%的白鮮堿單體236 mg。實施例5
分離所選溶劑系統(tǒng)為石油醚乙酸丙酯甲醇水=1 :0. 8 :0. 9 :0. 8，其余步驟同實施例I。得到純度為99. 2%的白鮮堿單體221 mg。實施例6
分離所選溶劑系統(tǒng)為正己烷乙酸乙酯乙醇水=1 :0. 9 1 1. 1，其余步驟同實施例
I。得到純度為99. 4%的白鮮堿單體229 mg。實施例7
分離所選溶劑系統(tǒng)為正己烷乙酸丙酯乙醇水=1 :0. 7 :0. 9 :1. 2，其余步驟同實施例I。得到純度為99. 5%的白鮮堿單體232 mg。
權(quán)利要求
1.一種高純度白鮮堿單體的制備方法，其特征是它包括以下步驟(1)采用有機溶劑對白鮮皮進行提取，將提取液真空濃縮成浸膏，得總提取物；(2)將所得總提取物用柱色譜單次層析，進行初步純化，收集含有白鮮堿的組分，合并， 蒸干溶劑，得白鮮堿粗分物；(3)采用高速逆流色譜法純化白鮮堿粗分物，分離制得純度高于99%的白鮮堿單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度白鮮堿單體的制備方法，其特征是步驟(1)中有機溶劑為石油醚或乙醚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度白鮮堿單體的制備方法，其特征是柱色譜層析采用的固定相為顆粒度為50 400目的硅膠，流動相由組分A和B組成的二元混合液，A組分為石油醚；B組分為乙酸乙酯；A與B的體積比為1 10 :1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度白鮮堿單體的制備方法，其特征是步驟(3)中高速逆流色譜法采用的精制溶劑體系由E、F、C、D四個組分構(gòu)成，E組分可選自石油醚或正己烷，F(xiàn) 組分為乙酸乙酯或者乙酸丙酯，C組分為甲醇或者乙醇，D組分為水，E、F、C、D的體積比為 1 :0· 5 2 :0· 5 3 :0· 5 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高純度白鮮堿單體的制備方法，其特征是精制溶劑體系中正己烷乙酸乙酯甲醇水=1 1 :1. 2:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高純度白鮮堿單體的制備方法，其特征是精制溶劑系統(tǒng)中石油醚乙酸乙酯乙醇水=1 0.9 1. 1 :1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從中藥白鮮皮中分離制備白鮮堿單體的工藝方法。它的工藝路線是(1)采用有機溶劑提取中藥白鮮皮，得到總提取物；(2)總提取物用單次柱色譜層析，進行初步純化；(3)以高速逆流色譜技術(shù)分離(2)所得樣品，其溶劑系統(tǒng)由常溫常壓下處于液態(tài)的醚或烷烴、脂肪酯、脂肪醇和水組分，醚或烷烴、脂肪酯、脂肪醇和水的體積比為10.5～20.5～30.5～2。由該法分離得到純度高于99%的白鮮堿單體。本方法具有分離量大、操作簡便、快速、回收率高等優(yōu)點，有效降低了白鮮堿單體的制備成本。
文檔編號C07D491/048GK102532147SQ20111045415
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者劉峰, 林小靜, 王岱杰, 王曉, 耿巖玲, 趙恒強 申請人:山東省分析測試中心