專利名稱：一種從l-纈氨酸發(fā)酵液中提取l-纈氨酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及氨基酸提取工藝領域，具體提供了一種從L-纈氨酸發(fā)酵液中提取 L-纈氨酸的方法。
背景技術：
L-纈氨酸，學名2-氨基-3-甲基丁酸，是人體八種必需氨基酸之一，與L-亮氨酸、 L-異亮氨酸統(tǒng)稱為支鏈氨基酸。L-纈氨酸可用于配制復合氨基酸輸液，氨基酸輸液是營養(yǎng)劑和代謝改善劑，可用于治療營養(yǎng)不良癥，對外傷、烙傷，手術病人的恢復具有顯著效果。此外，在飼料中L-纈氨酸和L-異亮氨酸均是限制性氨基酸，在L-纈氨酸消耗水平較高時， L-纈氨酸將成為第一限制性氨基酸。目前，L-纈氨酸基本的提取方法有沉淀法，離子交換法及全膜法。沉淀法是根據沉淀劑與L-纈氨酸的特異性結合形成沉淀，然后分離提取，該方法具有收率高、操作簡便等優(yōu)點，但是，存在環(huán)境污染重的技術問題；全膜法雖廢水量少，但膜只能去除大量的無機鹽離子及大分子的雜蛋白，發(fā)酵液中存在的大量與L-纈氨酸相近的氨基酸無法去除，所制得的成品雜酸偏高。綜合考慮各種因素，離子交換法略優(yōu)于沉淀法和全膜法，也是氨基酸提取工藝常用的方法。離子交換法是將除去菌體后的發(fā)酵液下調PH值為酸性，用強酸性陽離子交換樹脂分離L-纈氨酸和雜質氨基酸，最后通過氨水洗脫分離出L-纈氨酸。但是，仍然有一部分陰離子和陽離子雜質存在其中，且以丙氨酸為主的雜質氨基酸(主要是丙氨酸)與L-纈氨酸性質相近，無法有效分離，致使L-纈氨酸純度較低。如果想提高L-纈氨酸的純度，就要采用多級離子交換柱串柱提取，這就導致了生產過程產生大量廢水，并且消耗過多的離子交換樹脂，增加成本。此外，利用離子交換法提取L-纈氨酸的提取率也較低，且廢棄的截留液和母液易造成環(huán)境污染。以上種種因素，使得L-纈氨酸的制備工藝無法進一步提高。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種從L-纈氨酸發(fā)酵液中提取L-纈氨酸的方法，使得該方法能夠提高L-纈氨酸的提取率和純度。為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術方案—種從L-纈氨酸發(fā)酵液中提取L-纈氨酸的方法，包括步驟1、將L-纈氨酸發(fā)酵液微濾得到微濾濾清液和微濾截留液，調節(jié)微濾濾清液 PH值為6-8，然后用強酸性陽離子交換樹脂吸附，接著再用弱堿性陰離子交換樹脂吸附得到離子交換液；步驟2、將離子交換液于50_70°C下濃縮結晶至濃縮后體積為濃縮前體積的 1/8-1/6，離心獲得L-纈氨酸粗結晶和第一母液；步驟3、將L-纈氨酸粗結晶用蒸餾水溶解，用分子量為800-1000D的納濾膜納濾， 獲得納濾濾清液和納濾截留液；
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步驟4、調節(jié)納濾截留液PH值為6-8，然后用強酸性陽離子交換樹脂吸附，接著再用弱堿性陰離子交換樹脂吸附得到離子交換液，離子交換液重復步驟2 ；納濾濾清液脫色后于50-70°C下濃縮結晶至濃縮后體積為濃縮前體積的 1/8-1/6，離心獲得L-纈氨酸成品和第二母液；步驟5、第二母液用分子量為SOO-IOOODa的納濾膜納濾，獲得納濾濾清液和納濾截留液，重復步驟4。具體流程圖參見圖1。其中，L-纈氨酸發(fā)酵液是由工業(yè)上常用L-纈氨酸生產菌株與原料發(fā)酵后獲得，步驟2和步驟4所述濃縮后體積均優(yōu)選為濃縮前體積的1/7，所述脫色為加入占納濾濾清液體積0. 5-0. 8%的藥用粉狀活性碳于50-70°C下攪拌40min。L-纈氨酸發(fā)酵液經生產菌株發(fā)酵完之后一般含有較多的金屬陽離子、陰離子、丙氨酸和少量的其他雜質氨基酸。傳統(tǒng)的離子交換法將發(fā)酵液PH值下調至低于L-纈氨酸等電點，使發(fā)酵液呈酸性環(huán)境，讓L-纈氨酸帶正電荷，利用強酸性陽離子交換樹脂吸附L-纈氨酸，達到與其他氨基酸以及雜質分離的目的，然后通過洗脫液洗脫。雖然大部分氨基酸與L-纈氨酸性質差別較大，能夠分離，但丙氨酸與L-纈氨酸性質相近，與樹脂吸附能力同 L-纈氨酸相似，無法輕易分離，且一些陽離子雜質也易混入其中。本發(fā)明根據L-纈氨酸等電點為5. 96，將準備進行離子交換吸附的發(fā)酵液pH值調整到6-8，優(yōu)選為7，使發(fā)酵液呈偏中性環(huán)境，在這一環(huán)境下強酸性陽離子樹脂以及弱堿性陰離子樹脂對L-纈氨酸吸附能力較弱，但對其他的無機鹽和少量雜質氨基酸的吸附卻較明顯，能夠除去除丙氨酸之外的絕大部分雜質。由于丙氨酸的溶解度是L-纈氨酸的2倍，且 L-纈氨酸溶解度隨溫度變化不明顯，故在較高溫度下通過濃縮結晶使丙氨酸和未除盡的其他氨基酸溶于溶液中，達到分離的目的。為了保證更高的純度，本發(fā)明在利用納濾技術后再次濃縮結晶進一步除去雜質。其中，步驟2和步驟4所述濃縮結晶的溫度均優(yōu)選為65°C，步驟1和步驟4所述pH值均優(yōu)選調節(jié)為7。本領域技術人員公知濃縮結晶一般均在真空下進行，此外，本發(fā)明將發(fā)酵液先通過陽離子樹脂吸附，而后再通過陰離子樹脂吸附，是由于發(fā)酵液通過陽離子樹脂吸附后PH 值下降呈酸性，有助于陰離子的吸附效果，更好的除去陰離子雜質。在進行吸附時，上液流速為每小時0.8-1.0倍陽離子樹脂體積，陽離子樹脂與陰離子樹脂的體積比為5 8-10。其中，作為優(yōu)選，所述強酸性陽離子交換樹脂為在苯乙烯-二乙烯苯共聚體上帶有磺酸基的陽離子交換樹脂，如ClOO型強酸性陽離子交換樹脂或732型強酸性陽離子交換樹脂，其他如WA-2型強酸性陽離子樹脂也可用于吸附；所述弱堿性陰離子交換樹脂為聚丙烯酸系弱堿性樹脂，如A830弱堿性陰離子交換樹脂。針對傳統(tǒng)工藝L-纈氨酸提取率較低的問題，本發(fā)明將納濾截留液繼續(xù)回送至離子交換吸附工序循環(huán)，將第二母液繼續(xù)回送至納濾工序循環(huán)，極大地減少了發(fā)酵液原料的損失，有利于提高L-纈氨酸的提取率。通過對比本發(fā)明技術方案和傳統(tǒng)技術方案可知，傳統(tǒng)技術方案是利用樹脂吸附 L-纈氨酸，而本發(fā)明是利用樹脂吸附雜質，而發(fā)酵液中L-纈氨酸占絕大部分，故可以推知在獲得同樣多的L-纈氨酸晶體的情況下，傳統(tǒng)工藝必然需要使用較多的樹脂，而本發(fā)明所述方法由于吸附的是占少數的雜質，樹脂使用量較少。樹脂使用量越多，需要還原樹脂的清
4水就多，產生的廢水就越多，因此，與傳統(tǒng)工藝相比本發(fā)明所述方法能夠減少廢水排放量。除此之外，離子交換法對環(huán)境污染較大的還有微濾后的截留液和母液，其COD(化學耗氧量)較高。傳統(tǒng)工藝往往不加處理即排放，即使處理也無法收到較好的效果。而本發(fā)明為了有效解決此問題，作為優(yōu)選技術方案，還包括將步驟1獲得的微濾截留液與步驟2 獲得的第一母液混合、干燥，制成L-纈氨酸飼料。微濾截留液以及第一母液中含有豐富的菌體蛋白、無機鹽和多種氨基酸，對于動物有良好的促生長作用，同時解決了微濾截留液和母液的污染問題，實現零排放的目的。在本發(fā)明所述方法與傳統(tǒng)離子交換法的對比試驗中，采用相同來源、體積的L-纈氨酸發(fā)酵液進行提取，結果顯示本發(fā)明所述方法L-纈氨酸的提取率在65%左右，純度經 HPLC檢測高于98%，而傳統(tǒng)離子交換法的L-纈氨酸提取率在60%左右，純度經HPLC檢測為95%左右。由以上技術方案可知，本發(fā)明改變傳統(tǒng)離子交換吸附工藝直接吸附L-纈氨酸的方式，改為吸附雜質，繼而通過二次濃縮結晶的方法提取L-纈氨酸，能夠極大地提高L-纈氨酸產品的純度和收率，減少廢水量并可將所產生的廢棄物用于制備飼料，避免環(huán)境污染。


圖1所示為本發(fā)明所述從L-纈氨酸發(fā)酵液中提取L-纈氨酸的方法流程圖。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種從L-纈氨酸發(fā)酵液中提取L-纈氨酸的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例1 本發(fā)明所述方法提取L-纈氨酸1、提取方法取經L-纈氨酸發(fā)酵菌株發(fā)酵后的發(fā)酵液經0. 05-0. 1 μ m孔徑陶瓷膜處理后得到8L微濾濾清液和微濾截留液(微濾截留液備用)，微濾濾清液調節(jié)pH值為6-7，然后以 13. 3ml/min的流速先過IL ClOO強酸性陽離子樹脂，再過1. 6L A830弱堿性陰離子樹脂。將經陰、陽離子樹脂處理后的離子交換液于65°C下真空濃縮結晶，至濃縮后體積為濃縮前體積的1/7，降至常溫后離心分離，得到L-纈氨酸粗結晶和第一母液(第一母液備用)，L-纈氨酸粗結晶折合成純度為100%的纈氨酸為420g。取8. 4L蒸餾水于65°C時將上述粗結晶溶解，完全溶解后過分子量為IOOODa的納濾膜，得到納濾濾清液和納濾截留液，納濾截留液調節(jié)PH值為6-7后回送至離子交換吸附工序循環(huán)，納濾濾清液取占其體積的0. 8%的藥用粉狀活性炭于65°C時攪拌40min脫色，抽濾，得到透光為99%的脫色液。將上述脫色液于65°C時真空濃縮結晶，至濃縮后體積為濃縮前體積的1/7，將所得的濃縮液于40-50°C下離心分離，得到L-纈氨酸成品和第二母液，第二母液回送至納濾工序循環(huán)。將L-纈氨酸成品于60°C時烘干，所得成品質量為350g，檢測結果符合USPM標準，產品收率為65 %，純度經HPLC檢測為99 %。2、產品收率與純度的對比試驗利用傳統(tǒng)工藝提取取與1中相同來源和體積的L-纈氨酸發(fā)酵液，下調發(fā)酵液PH 值為酸性，經ClOO強酸性陽離子樹脂吸附后，用氨水洗脫，洗脫液脫色后兩次濃縮結晶，最后產品收率為59%，純度經HPLC檢測為95%。與本發(fā)明的產品收率和純度相比，傳統(tǒng)工藝提取的L-纈氨酸均不高，且色澤不如本發(fā)明所述方法提取L-纈氨酸潔白透亮，這是由于其中含有雜氨基酸所導致。3、L-纈氨酸飼料的制備將1中備用的微濾截留液和第一母液混合，噴霧干燥，得L-纈氨酸飼料產品，L-纈氨酸含量為40%左右。實施例2 本發(fā)明所述方法提取L-纈氨酸1、提取方法取經L-纈氨酸發(fā)酵菌株發(fā)酵后的發(fā)酵液經0. 05-0. 1 μ m孔徑陶瓷膜處理后得到 60m3微濾濾清液和微濾截留液(微濾截留液備用)，微濾濾清液調節(jié)pH值為7-8，然后以 6ml/min的流速先過7. 5m3 732型強酸性陽離子樹脂，再過13. 5m3 A830弱堿性陰離子樹脂。將經陰、陽離子樹脂處理后的離子交換液于50°C下真空濃縮結晶，至濃縮后體積為濃縮前體積的1/6，降至常溫后離心分離，得到L-纈氨酸粗結晶和第一母液(第一母液備用)， L-纈氨酸粗結晶折合成純度為100%的纈氨酸為31^kg。取64m3蒸餾水于50°C時將上述粗結晶溶解，完全溶解后過分子量為SOODa的納濾膜，得到納濾濾清液和納濾截留液，納濾截留液調節(jié)PH值為6-7后回送至離子交換吸附工序循環(huán)，納濾濾清液取占其體積的0. 5%的藥用粉狀活性炭于65°C時攪拌40min脫色，抽濾，得到透光為99%的脫色液。將上述脫色液于50°C時真空濃縮結晶，至濃縮后體積為濃縮前體積的1/6，將所得的濃縮液于40-50°C下離心分離，得到L-纈氨酸成品和第二母液，第二母液回送至納濾工序循環(huán)。將L-纈氨酸成品于60°C時烘干，所得成品質量為2651kg，檢測結果符合USPM標準，產品收率為64%，純度經HPLC檢測為98%。2、產品收率與純度的對比試驗利用傳統(tǒng)工藝提取取與1中相同來源和體積的L-纈氨酸發(fā)酵液，下調發(fā)酵液PH 值為酸性，經732型強酸性陽離子樹脂吸附后，用氨水洗脫，洗脫液脫色后兩次濃縮結晶， 最后產品收率為60 %，純度經HPLC檢測為96 %。與本發(fā)明的產品收率和純度相比，傳統(tǒng)工藝提取的L-纈氨酸均不高，且色澤不如本發(fā)明所述方法提取L-纈氨酸潔白透亮，這是由于其中含有雜氨基酸所導致。3、L-纈氨酸飼料的制備將1中備用的微濾截留液和第一母液混合，噴霧干燥，得L-纈氨酸飼料產品，L-纈氨酸含量為40%左右。實施例3 本發(fā)明所述方法提取L-纈氨酸
1、提取方法取經L-纈氨酸發(fā)酵菌株發(fā)酵后的發(fā)酵液經0. 05-0. 1 μ m孔徑陶瓷膜處理后得到8L微濾濾清液和微濾截留液(微濾截留液備用)，微濾濾清液調節(jié)pH值為6-7，然后以 13. 3ml/min的流速先過IL WA-2型強酸性陽離子樹脂，再過1. 6L A830弱堿性陰離子樹脂。將經陰、陽離子樹脂處理后的離子交換液于70°C下真空濃縮結晶，至濃縮后體積為濃縮前體積的1/8，降至常溫后離心分離，得到L-纈氨酸粗結晶和第一母液(第一母液備用)， L-纈氨酸粗結晶折合成純度為100%的纈氨酸為413g。取8. 4L蒸餾水于65°C時將上述粗結晶溶解，完全溶解后過分子量為IOOODa的納濾膜，得到納濾濾清液和納濾截留液，納濾截留液調節(jié)PH值為6-7后回送至離子交換吸附工序循環(huán)，納濾濾清液取占其體積的0. 6%的藥用粉狀活性炭于65°C時攪拌40min脫色，抽濾，得到透光為99%的脫色液。將上述脫色液于70°C時真空濃縮結晶，至濃縮后體積為濃縮前體積的1/8，將所得的濃縮液于40-50°C下離心分離，得到L-纈氨酸成品和第二母液，第二母液回送至納濾工序循環(huán)。將L-纈氨酸成品于60°C時烘干，所得成品質量為342g，檢測結果符合USPM標準，產品收率為66 %，純度經HPLC檢測為99 %。2、產品收率與純度的對比試驗利用傳統(tǒng)工藝提取取與1中相同來源和體積的L-纈氨酸發(fā)酵液，下調發(fā)酵液PH 值為酸性，經WA-2型強酸性陽離子樹脂吸附后，用氨水洗脫，洗脫液脫色后兩次濃縮結晶， 最后產品收率為58%，純度經HPLC檢測為94%。與本發(fā)明的產品收率和純度相比，傳統(tǒng)工藝提取的L-纈氨酸均不高，且色澤不如本發(fā)明所述方法提取L-纈氨酸潔白透亮，這是由于其中含有雜氨基酸所導致。3、L-纈氨酸飼料的制備將1中備用的微濾截留液和第一母液混合，噴霧干燥，得L-纈氨酸飼料產品，L-纈氨酸含量為40%左右。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種從L-纈氨酸發(fā)酵液中提取L-纈氨酸的方法，其特征在于，包括步驟1、將L-纈氨酸發(fā)酵液微濾得到微濾濾清液和微濾截留液，調節(jié)微濾濾清液pH值為6-8，然后用強酸性陽離子交換樹脂吸附，接著再用弱堿性陰離子交換樹脂吸附得到離子交換液；步驟2、將離子交換液于50-70°C下濃縮結晶至濃縮后體積為濃縮前體積的1/8-1/6， 離心獲得L-纈氨酸粗結晶和第一母液；步驟3、將L-纈氨酸粗結晶用蒸餾水溶解，用分子量為800-1000D的納濾膜納濾，獲得納濾濾清液和納濾截留液；步驟4、調節(jié)納濾截留液pH值為6-8，然后用強酸性陽離子交換樹脂吸附，接著再用弱堿性陰離子交換樹脂吸附得到離子交換液，離子交換液重復步驟2 ；納濾濾清液脫色后于50-70°C下濃縮結晶至濃縮后體積為濃縮前體積的1/8-1/6，離心獲得L-纈氨酸成品和第二母液；步驟5、第二母液用分子量為SOO-IOOODa的納濾膜納濾，獲得納濾濾清液和納濾截留液，重復步驟4。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述強酸性陽離子交換樹脂為在苯乙烯-二乙烯苯共聚體上帶有磺酸基的陽離子交換樹脂。
3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述在苯乙烯-二乙烯苯共聚體上帶有磺酸基的陽離子交換樹脂為ClOO型強酸性陽離子交換樹脂或732型強酸性陽離子交換樹脂。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述弱堿性陰離子交換樹脂為聚丙烯酸系弱堿性樹脂。
5.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述聚丙烯酸系弱堿性樹脂為A830弱堿性陰離子交換樹脂。
6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2和步驟4所述濃縮結晶的溫度均為 65 "C。
7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1和步驟4所述pH值均調節(jié)為7。
8.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2和步驟4所述濃縮后體積均為濃縮前體積的1/7。
9.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述脫色為加入占納濾濾清液體積 0. 5-0. 8%的藥用粉狀活性碳于50-70°C下攪拌40min。
10.根據權利要求1-9任意一項所述方法，其特征在于，還包括將步驟1獲得的微濾截留液與步驟2獲得的第一母液混合、干燥，制成L-纈氨酸飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及氨基酸提取工藝領域，公開了一種從L-纈氨酸發(fā)酵液中提取L-纈氨酸的方法。該方法將L-纈氨酸發(fā)酵液微濾，調節(jié)微濾濾清液pH值為中性先后經過陽、陰離子樹脂吸附，一次濃縮結晶后納濾，納濾濾清液脫色后二次濃縮結晶即得。本發(fā)明還將工序中的納濾截留液和二次母液分別回送至離子交換吸附工序和納濾工序循環(huán)。本發(fā)明改變傳統(tǒng)離子交換吸附工藝直接吸附L-纈氨酸的方式，改為吸附雜質，繼而通過二次濃縮結晶的方法提取L-纈氨酸，能夠極大地提高L-纈氨酸產品的純度和收率，減少廢水量并可將所產生的廢棄物用于制備飼料，避免環(huán)境污染。
文檔編號C07C229/08GK102432479SQ20111045672
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權日2011年12月30日
發(fā)明者劉康樂, 孟祥杰, 彭芳菊, 梁是森, 王海雷, 鐘秀如, 龔華 申請人:梅花生物科技集團股份有限公司