專利名稱：一種PA-MSHA菌株IgY及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘露糖敏感性綠膿桿菌，更具體地說，涉及一種甘露糖敏感性綠膿桿菌(PA-MSHA)菌株IgY及其制備方法、相關(guān)保健品和生物制品以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
I、腫瘤臨床治療中的局限性目前每年全球癌癥死亡人數(shù)約為700萬人，特別值得注意的是其中24%發(fā)生在中國，而缺乏積極有效的藥物對惡性腫瘤進行針對性治療是其主要原因。惡性腫瘤患者一般中晚期在體內(nèi)會釋放遠高于正常水平的免疫抑制因子，抑制細胞活性并且直接抑制各種淋巴細胞因子的分泌，從而降低機體的細胞免疫和體液免疫作用。目前對惡性腫瘤的治療依然是以手術(shù)和化療為主。手術(shù)除了能有效地切除部分的腫瘤組織以外，另一方面也會對機 體產(chǎn)生新的傷口并再次對機體的免疫環(huán)境造成破壞。而臨床上廣為使用的化療藥物，在殺死癌細胞的同時，會部分殺死患者體內(nèi)的正常細胞，包括數(shù)量已經(jīng)有所減弱的免疫細胞，因此本已低下的免疫功能會再次遭到損害，從而導(dǎo)致一方面未殺死的癌細胞更易得以增殖，另一方面病人虛弱的免疫系統(tǒng)會極大加劇其他病毒或病菌感染的概率。因此，很大程度上來說對于手術(shù)或化療后的患者而言，其體內(nèi)因缺失足量有效的免疫抗體是其病情進一步惡化，同時引起各種病菌的機會性感染的根本原因。2、PA-MSHA菌苗的廣譜抗菌特性以及對腫瘤的輔助治療特性PA-MSHA菌株是牟希亞教授于1984年分離培育得到的一種特異性綠膿桿菌，保藏號為CGMCC0190，其專利號為CN 1090602A。該菌株的滅活菌苗已作為一種生物制品在1996年獲得國家二級新藥的認證。在臨床上，該滅活菌苗作為一種廣譜抗菌和腫瘤的輔助治療產(chǎn)品已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。3、產(chǎn)蛋禽類IgY被動免疫是直接應(yīng)用特異抗體中和致病微生物及其產(chǎn)生的毒素，其來源主要包括人類免疫球蛋白、牛初乳、產(chǎn)蛋禽類卵黃免疫球蛋白(IgY)和單克隆抗體。相比較而言，產(chǎn)蛋禽類例如雞卵黃免疫球蛋白具有制備簡單、成本低廉以及無毒性的顯著特點。在自然界狀態(tài)下，IgY從母雞血液轉(zhuǎn)運到蛋黃中以保護未來的小雞免受各種感染性疾病。用抗原來人工免疫后的蛋雞是大規(guī)模生產(chǎn)多克隆抗體的主要來源。雞IgY在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳動物IgG相似，目前國內(nèi)外已有不少利用雞IgY來預(yù)防和治療各種感染性疾病以及腫瘤的研究報道和專利申請，如小兒輪狀病毒腹瀉、消化道感染、呼吸道感染、胃癌、肝癌等。利用菌苗來免疫蛋雞從而收獲得到雞IgY的專利已有申請，但能達到廣譜性抗菌作用以及在腫瘤中能起到廣譜免疫輔助治療作用的雞IgY尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對現(xiàn)有產(chǎn)蛋禽類IgY未具有廣譜性抗菌作用以及抗腫瘤輔助作用的缺陷，提供一種PA-MSHA菌株IgY及其制備方法和應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種PA-MSHA菌株IgY的制備方法，其中包括以下步驟(SI)制備PA-MSHA菌株的抗原；(S2)利用所述PA-MSHA抗原，對產(chǎn)蛋禽類進行多點皮下注射免疫，檢取免疫禽類所廣的免疫蛋；(S3)取所述免疫蛋的蛋黃，提取PA-MSHA菌株IgY。在本發(fā)明所述的PA-MSHA菌株IgY的制備方法中，所述步驟(SI)包括將制備的保藏號為CGMCC0190的甘露糖敏感性綠膿桿菌進行活化后在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 20h，培養(yǎng)溫度均為37°C，然后接種于大豆酶解液培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液后即制備得到所述PA-MSHA菌株的抗原。 在本發(fā)明所述的PA-MSHA菌株IgY的制備方法中，所述步驟(S3)包括a)取免疫蛋去殼取黃，除去粘附于蛋黃膜上的蛋白組分，浙干后刺破蛋黃膜，收集蛋黃;b)將上述收集的蛋黃充分攪拌均勻后，加入蛋黃勻漿5倍體積O. lmol/LPH7. 2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，制成稀釋蛋黃液，在該稀釋蛋黃液中海藻糖的重量百分比為25% ；c)將上述稀釋蛋黃液置于-20°C冰凍3小時，然后取出于溫室復(fù)融并以SOOr/min低速離心后浙出收集上清液，然后再向沉淀物中加入3倍體積的O. lmol/L PH7. 2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3次，合并收集各次得到的上清液備用；d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉淀劑中的任一種或其復(fù)合物，離心收集其沉淀物，該沉淀物中即含有IgY ；e)將上述沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后透析或超濾濃縮或凝膠層析，進一步純化得IgY。在本發(fā)明所述的PA-MSHA菌株IgY的制備方法中，所述產(chǎn)蛋禽類為母雞。本發(fā)明還提供了一種PA-MSHA菌株IgY，采用如上所述的方法制備。本發(fā)明還提供了一種PA-MSHA菌株IgY保健品和生物制品，由如上所述的PA-MSHA菌株IgY組成。本發(fā)明還提供了一種PA-MSHA菌株I gY保健品和生物制品，包含如上所述的PA-MSHA 菌株 IgY。本發(fā)明還提供了一種如上所述的PA-MSHA菌株的應(yīng)用，用于制備防治大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎球菌、變形球菌、幽門螺旋桿菌所引起的原發(fā)病的保健品或生物制品。本發(fā)明還提供了一種如上所述的PA-MSHA菌株IgY保健品和生物制品的應(yīng)用，用于制備在乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌、膀胱癌、白血病治療時提高機體免疫功能的輔助治療的保健品或生物制品。實施本發(fā)明的PA-MSHA菌株IgY及其制備方法，具有以下有益效果本發(fā)明將甘露糖敏感性綠膿桿菌免疫產(chǎn)卵家禽，再從禽卵中提取提純后可得到該PA-MSHA菌株IgY，可進一步制成保健品和生物制品，一方面可用于防治廣譜的機會感染菌群，如大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎球菌、變形球菌、幽門螺旋桿菌等，另一方面還可以對多種癌癥起到良好的輔助治療效果，如乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌、膀胱癌、白血病等。本產(chǎn)品具有良好的活性和特異性，適用于廣譜抗菌以及抗癌，尤其適用于腫瘤的主、被動免疫治療。
具體實施例方式本發(fā)明的目的在于以甘露糖敏感性綠膿桿菌(PA-MSHA)作為抗原免疫產(chǎn)蛋禽類例如母雞后，在免疫蛋中提取純化得到IgY產(chǎn)品，并應(yīng)用該產(chǎn)品配制保健品和生物制品，用于廣譜抗菌以及腫瘤治療中的輔助治療。本發(fā)明采用的甘露糖敏感性綠膿桿菌(PA-MSHA)菌株為牟希亞于1984年分離培育得到的一種特異性綠膿桿菌，保藏號為CGMCC0190，其專利號為CN 1090602A。本發(fā)明提供的PA-MSHA菌株IgY為具有廣譜抗菌及抗癌的卵黃免疫球蛋白的產(chǎn)品，具體而言。是一種抗大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎球菌、變形球菌、幽門螺旋桿菌以及在乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌、膀胱癌、白血病等疾病治療中起輔助作用的卵黃免疫球蛋白，可用于制備保健品和生物制品。該產(chǎn)品可通過以下步驟獲得用保存的上述PA-MSHA菌株接種LB半固體培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)，從而得到活化的PA-MSHA菌株。在LB固體培養(yǎng)基斜面接種活化的PA-MSHA菌株，37°C培養(yǎng)18 20h，然后接種于大豆酶解液培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液后即制備得到 PA-MSHA菌株的抗原。將培養(yǎng)液注射給產(chǎn)蛋禽類，尤其是母雞，使其產(chǎn)生大量抗體并被輸送到蛋黃中儲存。其中注射部位包括肌肉、皮下、皮內(nèi)、血管和生殖腔囊。待5 20天后的免疫母雞所產(chǎn)生的雞蛋中即含有相應(yīng)的IgY。下面結(jié)合實施例更為具體地描述本發(fā)明的詳細內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于此。實施例I :具有廣譜抗菌及抗癌的卵黃免疫球蛋白的產(chǎn)品的獲得方法通過上述過程獲得了 PA-MSHA菌株的抗原，注射后得到免疫蛋，例如雞蛋。下面對免疫蛋中提取出具有廣譜抗菌以及抗癌的卵黃免疫球蛋白的制備過程進行描述。該卵黃免疫球蛋白的提取純化方法是采用水稀釋法、反復(fù)凍融法或硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉淀或浸提、萃取、濃縮、膜過濾的方法從雞蛋黃中提取該抗體，然后將該純化的抗體添加相應(yīng)輔料包括海藻糖而制備成藥劑學(xué)上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。其具體步驟包括a)取雞蛋去殼取黃，除去粘附于蛋黃膜上的蛋白組分，然后將蛋黃置于滅菌蒸餾水中，反復(fù)洗滌三次，進一步除去蛋黃膜上的蛋白組分，浙干后刺破蛋黃膜，收集蛋黃。b)將上述收集蛋黃充分攪拌均勻后，加入蛋黃勻漿5倍體積O. lmol/LPH7. 2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，制成稀釋蛋黃液。在該稀釋蛋黃液中海藻糖的重量百分比是25%。c)將上述稀釋蛋黃液置于冰盒(_20°C )冰凍3小時，然后取出于溫室復(fù)融并低速離心(800r/min)后浙出收集上清液，然后再向沉淀物中加入3倍體積的O. lmol/L PH7. 2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3次，合并收集各次得到的上清液備用。d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉淀劑中的任一種或其復(fù)合物，離心收集其沉淀物，該沉淀物中即含有目標(biāo)產(chǎn)品中的卵黃免疫球蛋白。e)將上述沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后透析或超濾濃縮或凝膠層析，進一步純化。由此獲得PA-MSHA菌株IgY。
f)向上述純化的PA-MSHA菌株IgY抗體按比例添加相應(yīng)輔料，將其制備成藥劑學(xué)上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑，得到各種PA-MSHA菌株IgY保健品和生物制品。該PA-MSHA菌株IgY保健品和生物制品可用于用于防治大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎球菌、變形球菌、幽門螺旋桿菌所引起的原發(fā)病，以及用于乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌、膀胱癌、白血病治療時提高機體免疫功能的輔助治療。在此所述的輔料包括海藻糖。上述比例為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生產(chǎn)保健品和生物制品所采用的比例。實驗結(jié)果表明批量制備的每個雞蛋大約可提取52mg 148mg的蛋黃免疫球蛋白(IgY)，平均每個雞蛋可提取82mg。
實施例2 =ELISA法檢測蛋黃免疫球蛋白的效價用綠膿桿菌抗原以10 μ g/ml包被96孔板，4°C過夜，次日用ρΗ7· 4的PBS洗滌3遍，5%小牛血清封閉12h，洗滌后風(fēng)干。用無菌PBS倍比稀釋提純的卵黃免疫球蛋白(從
I 10開始，共8個濃度組)，每孔加100μ1，37 孵育Ih;洗滌風(fēng)干后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞免疫球蛋白(HRP-IgG，濃度為I : 105) 100 1，37°〇孵育111。鄰苯二胺371避光顯色15min，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取A450值。設(shè)置無菌PBS為空白對照。檢測結(jié)果證實提純得到的蛋黃免疫球蛋白效價為I : 105。實施例3 :蛋黃免疫球蛋白穩(wěn)定性試驗蛋黃免疫球蛋白經(jīng)過濾除菌，以10mg/ml分裝小試管中，分別于_20°C冰凍、4°C和室溫保存，定期進行其效價檢測。實驗結(jié)果表明蛋黃免疫球蛋白于-20°C冰凍保存，其穩(wěn)定性至少可保持12個月以上；于4°C保存，其穩(wěn)定性至少可以保持6個月以上；于室溫保存，其穩(wěn)定性至少可以保存2個月以上。實施例4 口服IgY對燒傷大鼠腸源性感染的影響采用燒傷大鼠綠膿桿菌腸源性感染動物模型，用給燒傷大鼠口服IgY的方法，考察其對嚴(yán)重?zé)齻笫竽c源性感染的影響。將健康SD大鼠隨機分為對照用的正常組，頭孢他啶治療組及IgY治療組。大鼠禁食8小時后用I %戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，胃管內(nèi)注入I. 5% NaHCO3Iml,待一分鐘后注入108CFU/ml的綠膿桿菌的菌懸液(lml/100g)，自由進食。菌懸液處理8小時后，1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，在麻醉的情況下進行背部10% Na2S脫毛處理。正常組不做任何處理。頭孢他啶治療組及IgY治療組用100°C不銹鋼塊接觸脫毛區(qū)20秒，造成25% TBSA三度燒傷。傷后立即腹腔注射生理鹽水(3mg/100g)抗休克。頭孢他啶治療組尾靜脈注射抗生素1ml。IgY治療組燒傷后立即管飼IgY 2ml (lmg/ml)，每12小時重復(fù)一次，24h后停止管飼IgY。動物單籠管理，自由飲水，24小時后自由進食。三組動物均于燒傷處理后24小時及48小時活殺，解剖，分別檢測腔靜脈血中的細菌數(shù)量、腔靜脈血內(nèi)毒素含量。結(jié)合表I和表2的結(jié)果說明IgY治療組和頭孢他啶治療組在抑菌的治療效果方面無顯著差異(P > O. 05)。表I腔靜脈血中的細菌數(shù)量(lg 10cfu/ml)
權(quán)利要求
1.一種PA-MSHA菌株IgY的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (51)制備PA-MSHA菌株的抗原； (52)利用所述PA-MSHA抗原，對產(chǎn)蛋禽類進行注射免疫，檢取免疫禽類所產(chǎn)的免疫蛋； (53)取所述免疫蛋的蛋黃，提取PA-MSHA菌株IgY。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PA-MSHA菌株IgY的制備方法，其特征在于，所述步驟(SI)包括將制備的保藏號為CGMCC0190的甘露糖敏感性綠膿桿菌進行活化后在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 20h，培養(yǎng)溫度均為37°C，然后接種于大豆酶解液培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液后即制備得到所述PA-MSHA菌株的抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的PA-MSHA菌株IgY的制備方法，其特征在于，所述步驟(S3)包括 a)取免疫蛋去殼取黃，除去粘附于蛋黃膜上的蛋白組分，浙干后刺破蛋黃膜，收集蛋黃； b)將上述收集的蛋黃充分攪拌均勻后，加入蛋黃勻漿5倍體積O.lmol/LPH7. 2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，制成稀釋蛋黃液，在該稀釋蛋黃液中海藻糖的重量百分比為25% ； c)將上述稀釋蛋黃液置于_20°C冰凍3小時，然后取出于溫室復(fù)融并以800r/min低速離心后浙出收集上清液，然后再向沉淀物中加入3倍體積的O. lmol/L PH7. 2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3次，合并收集各次得到的上清液備用； d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉淀劑中的任一種或其復(fù)合物，離心收集其沉淀物，該沉淀物中即含有IgY ; e)將上述沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后透析或超濾濃縮或凝膠層析，進一步純化得IgY。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的PA-MSHA菌株IgY的制備方法，其特征在于，所述產(chǎn)蛋禽類為母雞。
5.一種PA-MSHA菌株IgY，其特征在于，采用權(quán)利要求1_4中任意一項所述的方法制備。
6.一種PA-MSHA菌株IgY保健品和生物制品，其特征在于，由根據(jù)權(quán)利要求5所述的PA-MSHA菌株IgY組成。
7.—種PA-MSHA菌株IgY保健品和生物制品，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求5所述的PA-MSHA 菌株 IgY。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的PA-MSHA菌株IgY的應(yīng)用，其特征在于，用于制備防治大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎球菌、變形球菌、幽門螺旋桿菌所引起的原發(fā)病的保健品或生物制品O
9.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的PA-MSHA菌株IgY的應(yīng)用，其特征在于，用于制備在乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌、膀胱癌、白血病治療時提高機體免疫功能的輔助治療的保健品或生物制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甘露糖敏感性綠膿桿菌(PA-MSHA)菌株IgY及其制備方法和應(yīng)用，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟(S1)制備PA-MSHA菌株的抗原；(S2)利用所述PA-MSHA抗原，對產(chǎn)蛋禽類進行注射免疫，檢取免疫禽類所產(chǎn)的免疫蛋；(S3)取所述免疫蛋的蛋黃，提取PA-MSHA菌株IgY。本發(fā)明將甘露糖敏感性綠膿桿菌免疫產(chǎn)卵家禽，再從禽卵中提取PA-MSHA菌株IgY，可進一步制成保健品和生物制品，一方面可用于防治廣譜的機會感染菌群，如大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎球菌、變形球菌、幽門螺旋桿菌等，另一方面還可以對多種癌癥起到良好的輔助治療效果，如乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌、膀胱癌、白血病等，尤其適用于腫瘤的主、被動免疫治療。
文檔編號C07K16/12GK102770452SQ201180004304
公開日2012年11月7日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者盧超, 祁振強 申請人:深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司