專利名稱：受體酪氨酸激酶(rtk)的抑制劑及其使用方法
受體酪氨酸激酶(RTK)的抑制劑及其使用方法相關申請的交叉引用本申請涉及并要求2010年I月14日提交的美國臨時申請序列號61/335，950的優(yōu)先權，其全部內容通過引用特此引入本文。關于政府贊助研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明是利用由國家衛(wèi)生研究院以合同號ROl-AR 051448、ROl-AR 051886、P50AR054086資助的政府支持而完成的。政府可以擁有本發(fā)明的某些權利。
背景技術：
配體誘導的酪氨酸自磷酸化在控制受體酪氨酸激酶(RTK)的激活和細胞信號 傳導方面發(fā)揮重要作用(Schlessinger(1988)Trends Biochem. Sci. ,3(11) :443-447;Schlessinger (2000)Cell，103 (2) :211-225 ；Schlessinger 和 Lemmon(2003)Sci.STKE,191 RE12 ；Schlessinger 和 Ullrich(1992)Neuron,9 (3) :383-391 ;Lemmon和 Schlessinger (1994)Trends Biochem. Sci.,19(11) :459-463;及 Lemmon 和Schlessinger (1998)Methods Mol. Biol. ,84 :49-71)。結構和生化研究表明，受體酪氨酸激酶(如成纖維細胞生長因子受體I (FGFRl))的自磷酸化是由可以分為三個階段的順序和精確排序的分子間反應介導的(Furdui等人(2006)Mol. Cell.，21 (5) :711-717和Lew等人(2009) Sci. Signal，2 (58) ra6)，且 FGFR2 (Chen 等人(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，105(50) :19660-19665)。例如，第一階段包括位于催化核心的活化環(huán)中的酪氨酸(FGFR1中的Y653)的反式自磷酸化，從而導致激酶活性的50-100倍刺激(Furdui等人，2006)。在第二階段中，作為信號蛋白停泊位點的酪氨酸殘基被磷酸化，包括FGFRl的酪氨酸激酶插入?yún)^(qū)中的酪氨酸(Y583、Y585)、近膜區(qū)中的酪氨酸(Y463)和C末端尾中的酪氨酸(Y766)。在最后的第三階段中，位于活化環(huán)中的第二個酪氨酸Y654被磷酸化，導致FGFRl激酶活性再增加10倍(Furdui等人，2006)。有趣的是，彼此鄰近的酪氨酸(例如，Y653，Y654和Y583，Y585)沒有被順序磷酸化，從而表明序列和結構特異性支配受體酪氨酸激酶的磷酸化順序。雖然酪氨酸磷酸化在細胞信號傳導中起著重要作用，但是尚不清楚受體酪氨酸激酶的反式自磷酸化的結構基礎是什么。換句話說，二聚化的受體內的一個激酶(酶)如何特異性地和順序地催化另一激酶(底物)的酪氨酸磷酸化的分子機制尚不了解。因此，有必要更好地表征RTK的結構、磷酸化和信號傳導。這種表征將會導致有意地鑒別可以被藥物、藥品或其他生物藥劑靶向的區(qū)域。發(fā)明概述受體酪氨酸激酶(RTK)的酪氨酸自磷酸化在調控激酶活性及募集和活化細胞內信號傳導通路中起著關鍵作用。自磷酸化是由順序的和精確排序的分子間(反式)反應介導的。本發(fā)明表明，活化的RTK激酶結構域之間不對稱二聚體的形成對于刺激的細胞中RTK的反式自磷酸化是必需的。例如，在FGFRl受體酪氨酸激酶中，反式自磷酸化是由作為活性酶發(fā)揮作用的一個激酶分子的N-葉(lobe)和作為底物發(fā)揮作用的第二個激酶分子的C-葉上的特定停泊位點之間的特異性不對稱接觸介導的。受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面中的病理性功能缺失突變或致癌激活突變可能會分別阻礙或促進不對稱二聚體的形成和反式自磷酸化。這些數(shù)據(jù)提供了控制受體酪氨酸激酶(包括成纖維細胞生長因子受體)的反式自磷酸化的分子基礎。因此，本發(fā)明提供了一種通過抑制不對稱酪氨酸激酶二聚體的形成(對于RTK自磷酸化、酶激活和細胞信號傳導必需的步驟)來藥理抑制病理性激活的RTK(如FGF受體)的新途徑。一個方面，本發(fā)明提供了結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面的成分，其中該成分抑制RTK的配體誘導的反式自磷酸化。在一個實施方案中，該成分抑制RTK的配體誘導的反式自磷酸化及RTK的激活。在另一實施方案中，該成分不結合到RTK的催化結構域的核苷酸結合位點。而在另一實施方案中，該成分結合RTK的一個單體的N-葉上的不對稱接觸界面或RTK的一個單體的C-葉上的不對稱接觸界面。在一個實施方案中，該成分不會導致內在激酶活性的損失。換句話說，該成分不阻斷核苷酸或底物結合，而是直接抑制激酶活性。在另一個實施方案中，該成分不會導致RTK激酶結構域的構象變化。在另一個實施方案中，該成分增加RTK的單體之間的空間位阻。
在一個實施方案中，該成分不阻止RTK的二聚化。在另一個實施方案中，該成分阻止RTK的二聚化。在一個具體實施方案中，該成分阻止RTK的胞質結構域的二聚化。在一個實施方案中，RTK是成纖維細胞生長因子受體(FGFR)，例如，成纖維細胞生長因子受體I (FGFRl)、成纖維細胞生長因子受體2 (FGFR2)、成纖維細胞生長因子受體3 (FGFR3基因)或成纖維細胞生長因子受體4 (FGFR4)。在一個實施方案中，該成分結合FGFRl的氨基酸殘基Arg577。在另一個實施方案中，該成分結合FGFR2的氨基酸殘基Arg579。而在另一個實施方案中，該成分結合FGFR2的氨基酸殘基Arg580。在另一個實施方案中，該成分結合FGFR3或FGFR4中的等同殘基。在另一個實施方案中，該成分結合FGFRl的氨基酸殘基Asp519。在另一個實施方案中，該成分結合FGFR2、FGFR3或FGFR4的等同氨基酸殘基。在進一步的實施方案中，該成分結合選自于FGFRl的C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 和 P705 的氨基酸殘基。在一個實施方案中，該成分結合選自于FGFR2的(491、？492、1 577、？582、1590、？705、6706和P708的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該成分結合選自于FGFR2的C491、F492、N662、G663、R664、L665、P666、V667、K668、W669、R577、R579、R580、P581、P582、E585、Y589、S587、Y588、D589、I590、P705、G706、P708、F713、K724、A726、N727、C728、T729、N730 和 E731 的氨基酸殘基。在一個實施方案中，該成分結合選自于FGFR2、FGFR3或FGFR4的等同的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該成分結合至少兩個、三個、四個、五個或更多個選自于FGFRl的 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W69UT695、P702、G703和P705的氨基酸殘基。而在另一個實施方案中，該成分結合至少兩個、三個、四個、五個或更多個選自于 FGFR2 的 C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706 和 P708的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該成分結合至少兩個、三個、四個、五個或更多個選自于 FGFR2 的 C491、F492、N662、G663、R664、L665、P666、V667、K668、W669、R577、R579、R580、P581、P582、E585、Y589、S587、Y588、D589、I590、P705、G706、P708、F713、K724、A726、N727、C728、T729、N730和E731的氨基酸殘基。而在另一個實施方案中，該成分結合至少兩個、三個、四個、五個或更多個FGFR2、FGFR3或FGFR4中的等同氨基酸殘基。
在另一個實施方案中，該成分結合選自于RTK的單體的P 1-0 2環(huán)、RTK的單體的3 3- a C環(huán)、RTK的單體的P 4-B5環(huán)、RTK的單體的a D- a E環(huán)、RTK的單體的a F螺旋和RTK的單體的a F- a G環(huán)的RTK區(qū)域。在一個實施方案中，該成分結合RTK的構象表位。構象表位可以由RTK的不對稱接觸界面中的兩個或更多個殘基組成的。在另一個實施方案中，構象表位包含選自于R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703和P705的氨基酸殘基。而在另一個實施方案中，構象表位包含選自于FGFR2的C491、 492、1 577、？582、1590、？705、6706和？708的氨基酸殘基。在進一步的實施方案中，構象表位包含選自于 FGFR2 的 C491、F492、N662、G663、R664、L665、P666、V667、K668、W669、R577、R579、R580、P581、P582、E585、Y589、S587、Y588、D589、I590、P705、G706、P708、F713、K724、八726、町27、0728、了729、町30和￡731的氨基酸殘基。而在另一個實施方案中，構象表位包含作為FGFR2、FGFR3或FGFR4中的等同氨基酸殘基的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該成分結合RTK上的連續(xù)表位。在一個實施方案中，連續(xù)表 位是由RTK的不對稱接觸界面中的兩個或更多個殘基組成的。在一個實施方案中，該成分是小分子。而在另一個實施方案中，該小分子結合至少一個選自于 FGFRl 的氨基酸殘基 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 和 P705 的氨基酸殘基。而在另一個實施方案中，該小分子結合至少一個選自于FGFR2的C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706和P708的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該小分子結合至少一個選自于FGFR2的C491、F492、N662、G663、R664、L665、P666、V667、K668、W669、R577、R579、R580、P581、P582、E585、Y589、S587、Y588、D589、1590、P705、G706、P708、F713、K724、A726、N727、C728、T729、N730和E731的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該小分子結合選自于RTK的單體的0 1-3 2環(huán)、RTK的單體的P 3- a C環(huán)、RTK的單體的P 4-B5環(huán)、RTK的單體的a D- a E環(huán)、RTK的單體的a F螺旋和RTK的單體的a F- a G環(huán)的區(qū)域。在一個實施方案中，小分子基于成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的不對稱接觸界面設計。在另一個實施方案中，該成分是肽類分子，例如，基于成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的不對稱接觸界面設計的肽類分子。而在另一個實施方案中，該肽類分子結合至少一個選自于 FGFRl 的 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、 587、？579、胃691、了695、？702、6703和？705的氨基酸殘基。在進一步的實施方案中，該肽類分子結合至少一個選自于 FGFR2 的 C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706 和 P708 的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該肽類分子結合至少一個選自于FGFR2的C491、F492、N662、G663、R664、L665、P666、V667、K668、W669、R577、R579、R580、P581、P582、E585、Y589、S587、Y588、D589、I590、P705、G706、P708、F713、K724、A726、N727、C728、T729、N730 和 E731的氨基酸殘基。在一個實施方案中，該肽類分子結合選自于RTK的單體的￠1-0 2環(huán)、RTK的單體的旦3- a C環(huán)、RTK的單體的3 4-B5環(huán)、RTK的單體的a D- a E環(huán)、RTK的單體的a F螺旋和RTK的單體的a F- a G環(huán)的區(qū)域。在另一個實施方案中，該肽類分子包含與FGFRl的氨基酸殘基576-594至少80 %相同的結構。在另一個實施方案中，該肽類分子是包含F(xiàn)GFR2的氨基酸殘基579-597至少80%相同的結構。在一個實施方案中，該成分是分離的抗體，或其抗原結合部分，如細胞內抗體(intrabody)。在另一個實施方案中，該抗體或其抗原結合部分選自于人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和嵌合抗體。在另一個實施方案中，該抗體或其抗原結合部分包含選自于1§61、1§62、1§63、1§64、1§11、1§4和IgE恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。在再另一個實施方案中，抗體重鏈恒定區(qū)是IgGl。在進一步的實施方案中，抗體或其抗原結合部分是單鏈Fv片段、SMIP、親和體(affibody)、親和性多聚體(avimer)、納米抗體(nanobody)以及單域抗體。在另一個實施方案中，抗體或其抗原結合部分以選自于包括1x10_7M或更小、更優(yōu)選地5x10_8M或更小、更優(yōu)選地1x10_8M或更小、更優(yōu)選地5x10_9M或更小的KD結合受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面。在另一個方面，本發(fā)明提供了產生本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分的雜交瘤。在另一個方面，本發(fā)明提供了結合成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的不對稱接觸界面上的構象表位的成分，其中該成分抑制配體誘導的FGFR的反式自磷酸化。而在另一個方面，本發(fā)明提供了結合選自于FGFRl的R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W69U T695、P702、G703 和 P705 的
氨基酸殘基，或所述殘基1-5人內的氨基酸殘基的成分，從而抑制配體誘導的FGFRl的反式自磷酸化。在另一個方面，本發(fā)明提供了結合選自于FGFR2的C491、F492、R577、P582、I590、P705、G706和P708的氨基酸殘基，或所述殘基I人內的氨基酸殘基的成分，從而抑制配體誘導的FGFR2的反式自磷酸化。在另一個方面，本發(fā)明提供了結合選自于FGFR2的C491、F492、N662、G663、R664、L665、P666、V667、K668、W669、R577、R579、R580、P581、P582、E585、Y589、S587、Y588、D589、I590、P705、G706、P708、F713、K724、A726、N727、C728、T729、
N730和E731的氨基酸殘基，或所述殘基I_；5人內的氨基酸殘基的成分，從而抑制配體誘導的FGFR2的反式自磷酸化。在另一個方面，本發(fā)明提供了結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面的成分，其中該成分破壞作為酶發(fā)揮作用的RTK單體的N-葉和作為底物發(fā)揮作用的RTK單體的C-葉之間的界面。在再另一個方面，本發(fā)明提供了結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面的成分，其中該成分抑制RTK的反向去磷酸化。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的成分和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在再另一個方面，本發(fā)明提供了一種治療或預防受試者中的RTK相關疾病的方法，該方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的成分，從而治療或預防受試者的該疾病。在一個實施方案中，RTK相關疾病選自于癌癥和嚴重骨骼障礙。在一個實施方案中，嚴重骨骼障礙選自于軟骨發(fā)育不全、Crouzon綜合征和Saethre-Chotzen綜合征。在另一個實施方案中，RTK相關疾病是LADD綜合征。而在另一實施方案中，癌癥選自于膠質母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種鑒定結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面和抑制RTK的配體誘導的反式自磷酸化的成分的方法。該方法包括使RTK與候選成分接觸；同時或順序地使RTK與RTK的配體接觸；確定該成分是否影響作為酶發(fā)揮功能的RTK單體的N-葉和作為底物發(fā)揮功能的RTK單體的C-葉之間的定位、定向和/或距離，從而鑒定結合RTK的不對稱接觸界面和抑制RTK的配體誘導的反式自磷酸化的成分。在一個實施方案中，該成分抑制RTK的配體誘導的反式自磷酸化。在另一個實施方案中，該成分不引起內在RTK激酶活性的損失。在另一個方面，本發(fā)明提供結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面的小分子，其中該小分子抑制RTK的反式自磷酸化。在一個實施方案中，該小分子結合選自于FGFRl 的 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、
W69U T695、P702、G703和P705的氨基酸殘基，或在所述殘基的U人內的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該小分子結合選自于FGFR2的C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706和P708的氨基酸殘基，或在所述殘基的I_5人內的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，該小分子結合選自于 FGFR2 的 C491、F492、N662、G663、R664、L665、P666、V667、K668、W669、R577、R579、R580、P581、P582、E585、Y589、S587、Y588、D589、1590、P705、G706、P708、F713.K724, A726.N727, C728, T729.N730和E73I的氨基酸殘基，或所述殘基I_5人內的氨 基酸殘基。在另一個實施方案中，該小分子結合選自于RTK單體的P I-￠2環(huán)、RTK單體的3 3- a C環(huán)、RTK單體的3 4-B5環(huán)、RTK單體的a D- a E環(huán)、RTK單體的a F螺旋和RTK單體的a F-a G環(huán)的區(qū)域。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢由下面的詳細描繪和權利要求而變得清楚。附圖簡要說明該專利或申請案包含至少一個以彩色完成的附圖。帶有彩色附圖的本專利或專利申請公開文本將根據(jù)要求和繳納必要費用后由專利局提供。圖I描繪了不對稱的激活FGFRl激酶二聚體的整體結構和受體間接觸的詳細視圖。圖IA描繪了活性的磷酸化FGFRl的不對稱二聚體的帶狀柵圖。不對稱二聚體的分子E 和S被分別標為藍綠色和綠色。圖IB描繪了不對稱二聚體中激酶之間形成的界面的詳細視圖。ATP類似物(AMP-PCP)和相互作用殘基以棍示意圖顯示和鎂離子以藍色球顯示。分子S的殘基用符號“’”(prime)標記。該圖中應用的配色方案應用于所有附圖。二級結構標記為藍色。圖IC描繪了分子E的表面示意圖和帶狀柵圖，表面示意圖被描繪為藍綠色，分子S的相互作用殘基以棒表示。分子S的代表性殘基被標記。圖ID描繪了分子S的表面示意圖和帶狀柵圖，表面示意圖被描繪為綠色，分子E(淺藍綠色)的相互作用殘基以棒表不(www. pymol. org)。圖2描繪了不對稱的FGFRl激酶二聚體界面的殘基的表面分布。圖IA描繪了不對稱激酶二聚體的整體結構，其以帶狀形式顯示。圖IB描繪的分子E(酶)的表面示意圖為藍綠色。近端的底物結合區(qū)域顯示為紅色和遠端的底物結合區(qū)域顯示為黃色?；罨h(huán)(A-環(huán))和核苷酸結合環(huán)(N-環(huán))被指明。圖IC描繪了為綠色的分子S(底物)的表面示意圖，分子S的激酶插入?yún)^(qū)域中的酪氨酸自磷酸化位點(Y583)被標明。分子S的底物位點標為紅色和遠端底物位點標為黃色。圖3顯示了在體外和體內的FGFRl的自磷酸化。在室溫下隨著時間變化的wt-FGFRl (圖3A)和FGFRl-RE (圖3B)的分離的激酶結構域的體外磷酸化反應的特征。圖3C表明FGFRl-RE在體外的激酶活性得到保持。用抗-FGFRl的抗體對表達wt-FGFRl或FGFRl-RE突變體的L6細胞的裂解液進行免疫沉淀。然后免疫沉淀物在存在或不存在FGFRl底物(結果中所描述的PLC Y片段)條件下在室溫下孵育30分鐘，然后進行SDS-PAGE和用抗PTyr或抗FGFRl抗體進行免疫印跡。圖3D表明FGFRl-RE在體內的自磷酸化受到強烈影響。用漸增濃度的FGF (如所標明的)在37°C刺激表達wt-FGFRl或其RE突變體的L6細胞10分鐘。用抗-FGFRl抗體對未刺激的或FGF刺激的細胞的裂解液進行免疫沉淀，然后進行SDS-PAGE并用抗-pTyr或抗FGFRl抗體進行免疫印跡。圖3E顯示用100ng/ml的FGF刺激表達wt-FGFRl或FGFRl-RE的L6細胞不同的時間(如所標明的)。對未刺激或FGF刺激的細胞的裂解液進行SDS-PAGE，然后用抗-pTyr或抗FGFRl抗體進行免疫印跡。圖4以簡化卡通圖(上)和帶狀柵圖(下)描繪了 wt-FGFRl (PDBID 3KY2)(圖4A)、FGFRl-RE 突變體(PDB ID 3KXX)(圖 4B)和激活的 FGFRl (FGFR1-3P) (PDB ID 3GQI)(圖4C)的激酶結構域的結構。在卡通圖中催化環(huán)顯示為黃色，活化環(huán)顯示為綠色，螺旋a C被描繪成圓柱形。在卡通圖中的磷酸酪氨酸標為紅色和在帶狀柵圖中顯示為棍型示意圖。圖4D描繪了分別顯示為綠色、藍綠色和藍色的FGFRl、FGFR1-RE和FGFR1-3P的激酶插入環(huán)的帶狀柵圖。棍型示意圖中顯示了 R576、R577和R577E的側鏈。圖4E描繪了 FGFRl (綠色)、FGFRl-RE (藍綠色)和FGFR1-3P (藍色)的激酶插入?yún)^(qū)域的疊加，揭示了這三種結構 中激酶插入?yún)^(qū)域的多種構象。圖5描繪了順序排列的FGFRl的酪氨酸自磷酸化位點之間的距離。在帶狀柵圖中顯示了 FGFRl模型(包括尚未在FGFRl的結構中觀察到的殘基Y766)和六個磷酸化位點以棍型示意圖顯示并標為紅色。FGFRl的六個自磷酸化位點的自磷酸化順序用數(shù)字標記并顯示自磷酸化位點之間的大致距離。兩個磷酸化位點之間的距離是未磷酸化和磷酸化的FGFRl結構之間的平均距離，并總結于表中。圖6描繪了活性FGFR1-3P的R577和FGFRl-RE的R577E周圍的電子密度。圖6A描繪了活性FGFR1-3P(3GQI)在激酶插入?yún)^(qū)域周圍的電子密度。兩個激酶結構域顯示于藍綠色和綠色帶狀柵圖中。分子E的D519及分子S的R577’和Y583E’以棍型示意圖顯示。AMP-PCP以棍型示意圖顯示和鎂離子顯示為藍色球。2FoFc電子密度圖以灰色顯示并且以1.0 a描繪輪廓(contored)。圖6B描繪了以帶狀柵圖顯示的具有兩個激酶結構域的FGFRl-RE的示例性2FoFc電子密度圖和R576和R577E的側鏈以棍型示意圖顯示并且以I-Oa描繪輪廓。圖7描繪了 FGFRl-RE的所有四個分子的疊加。晶格中的FGFRl-RE的四個分子疊加并以綠色到淺綠色的梯度著色。圖8描繪了不對稱FGFRl和FGFR2激酶二聚體的整體結構，其以帶狀柵圖(圖8A和SB)或卡通圖(圖SC和8D)顯示。近端和遠端底物界面分別以黃色或紅色的球標記。不對稱的FGFRl或FGFR2的激酶二聚體的說明示意圖。顯示了兩種結構的磷酸化區(qū)域和活化環(huán)。螺旋a C顯示為圓柱體。用黃色圓圈標記兩種結構的近端底物界面，并用紅色圓圈標記遠端底物界面。圖9描繪了人類FGFRl和FGFR2激酶的基于結構的序列比對和螺旋a G附近功能缺失突變的位置。圖9A顯示了在FGFRl和FGFR2序列底部的四個FGF受體的具有空白(最低)、一個點、兩個點或星形(最高)的殘基保守程度。FGFRl的整體結構以灰色帶表示，并且序列結構中的相應區(qū)域用箭頭標明。綠色標記的殘基來自于分子E(酶)和著色的殘基來自于分子S (底物)。圖9B描繪了用藍色方框中FGFRl和FGFR2的螺旋a G附近的環(huán)中功能缺失突變的位置。來自于分子E的氨基酸用綠色表示，來自于分子S的氨基酸用紅色表示。a G螺旋用序列上方標簽的黑色方框標記。

圖10顯示wt-FGFRl和R577E突變體(FGFRl-RE)的數(shù)據(jù)收集和結構優(yōu)化統(tǒng)計。圖11描繪了涉及FGFRl的不對稱接觸界面的潛在區(qū)域和氨基酸殘基。
圖12描繪了成纖維細胞生長因子受體序列(FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4)的序列比對。加框的序列表示負責介導不對稱接觸界面的序列，標為藍色和紅色的氨基酸分別位于酶和底物分子中。在一個方面，本發(fā)明提供了結合FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4的任何加框的氨基酸殘基的成分。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了結合人受體酪氨酸激酶，例如FGFR受體(如人FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4)的不對稱接觸界面的成分，例如小分子、肽類分子、適體、抗體或其抗原結合部分和Adnectin。本發(fā)明的成分結合受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面并抑制RTK的反式自磷酸化。在某些情況中，該成分不引起RTK激酶結構域中內在激酶活性的損失。換句話說，該成分可以允許RTK的二聚化，但影響兩個不對稱二聚體的定位或者改變或阻止RTK受體中的構象變化，從而抑制配體誘導的RTK的反式自磷酸化。本發(fā)明至少部分地基于人FGFRl的反式自磷酸化所需的不對稱接觸界面的晶體結構的破譯。這種界面的破譯使得能夠鑒別本發(fā)明的成分可以靶向的殘基及位點和表位，例如構象表位和連續(xù)表位。在被其配體激活后，受體酪氨酸激酶的兩個單體相互作用形成不對稱二聚體，其特征在于具有不對稱的接觸界面，并隨后進行反式自磷酸化。如本文中所使用，術語“不對稱接觸界面”意圖包括與第二個受體酪氨酸激酶單體不對稱地相互作用并且是受體酪氨酸激酶的酪氨酸殘基自磷酸化(酪氨酸激酶激活和細胞信號傳導所需的步驟)必需的一個受體酪氨酸激酶單體的區(qū)域。不對稱二聚體界面的兩個區(qū)域是互補的，且不對稱接觸界面的形成對于受體酪氨酸激酶的激活是必需的。RTK上發(fā)生反式自磷酸化的各酪氨酸與明顯的不對稱接觸界面相關。在一個實施方案中，受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面包含作為活性酶的一個受體酪氨酸激酶分子(如FGFR1)的N-葉。在另一個實施方案中，受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面包含作為底物的受體酪氨酸激酶分子(如FGFR1)的C-葉。在一個實施方案中，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面包含如圖2所示的FGFRl的黃色區(qū)域。在另一個實施方案中，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面不包含如圖2所示的FGFRl的紅色區(qū)域。在另一個實施方案中，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面包含F(xiàn)GFRl的氨基酸殘基Arg577。在另一個實施方案中，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面包含F(xiàn)GFRl的氨基酸殘基Asp519。而在另一個實施方案中，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面包含用作酶的RTK的0 1-82環(huán)、@3-0(環(huán)或￠4-3 5環(huán)。在另一個實施方案中，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面包含用作底物的RTK的a D- a E環(huán)(激酶插入)、a F螺旋或a F- a G環(huán)。在另一個實施方案中，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面包含作酶的RTK的殘基C488、F489、S518、D519、T521、E522、D554、G555或P556。在另一個實施方案中，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面包含用作底物的 RTK 的殘基 Q574、R577、P587、P579、W691、T695、P702、G703 或 P705。在具體的實施方案中，本文所述的兩個單體的不對稱接觸界面的相互作用對于FGFRl的Y583的反式自磷酸化是必需的。在另一個實施方案中，本文所述的兩個單體的不對稱接觸界面的相互作用對于FGFRl的Y653、Y463、Y766、Y585或Y654的反式自磷酸化是必需的。圖9和圖12呈現(xiàn)的基于結構的序列比對表明，參與形成不對稱接觸的殘基在FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4中是保守的。在一個實施方案中，不對稱接觸界面在不對稱FGFRl 二聚體中用作酶的FGFRl的激活片段、核苷酸結合環(huán)的尖端、03-aC環(huán)、￠4-05環(huán)和N-葉中aC螺旋的N-末端區(qū)域之間形成。該區(qū)域與螺旋a F和a G的氨基酸和與位于第二個FGFRl分子(其在不對稱FGFRl 二聚體中用作底物)的C-葉中的激酶插入?yún)^(qū)域的N-末端殘基相互作用(參見圖I、2、8和11)。如本文所使用的，術語“N-葉”指的是包含核苷酸結合位點和/或用作酶的RTK單體的不對稱接觸界面的RTK的部分。如本文所使用的，術語“C-葉”指的是包含催化結構域和/或用作底物的RTK單體的不對稱接觸界面的RTK部分。如本文所使用，術語“磷酸化”指的是通過激酶將磷酸基團添加到蛋白質上。如本文所使用，術語“自磷酸化”或“順式磷酸化”指的是通過激酶蛋白自身進行的激酶的磷酸化。如本文所使用，術語“反式自磷酸化”指的是二聚化受體中作為底物發(fā)揮作用的激酶蛋白的一個單體通過作為酶發(fā)揮作用的激酶蛋白的另一個單體進行的磷酸化。配體誘導的反 式自磷酸化在控制RTK的激活和細胞信號傳導中起著重要的作用。如本文所使用，術語“配體誘導的反式自磷酸化”指的是當RTK與其配體結合時體酪氨酸激酶的反式自磷酸化的激活。如本文中所使用，術語“成分”意圖包括任何結合受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面的成分，其中該成分抑制RTK的反式自磷酸化。所述成分可以是小分子；肽類分子(例如基于受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面的結構設計的肽類分子)；分離的抗體或其抗原結合部分；適體或adnectin。在一些實施方案中，所述成分將結合人受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面中的特定序列。在具體的實施方案中，所述成分結合FGFR受體的不對稱接觸界面中的特定序列，例如，F(xiàn)GFRl 的 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 或 P705。RTK—個單體的 P I-P 2 環(huán)、RTK—個單體的 ^ 3-a C環(huán)、RTK —個單體的P 4-B5環(huán)、RTK —個單體的a D- a E環(huán)、RTK —個單體的a F螺旋和RTK一個單體的a F-a G環(huán)中的這些殘基構成了人FGFRl的不對稱接觸界面結構域并在本文顯示為對于受體的反式自磷酸化是重要的。本領域技術人員將理解，在一些實施方案中，本發(fā)明的成分很容易靶向于其它RTK中的相應殘基，例如那些形成不對稱接觸界面的相似口袋或空腔的那些殘基或通過結構比對或序列比對處于相同的位置的那些殘基。本領域技術人員將理解，特異性結合不對稱接觸界面中的上述殘基(或與那些殘基在某一距離范圍內，例如1、2、3、4或5人內)的成分可以通過例如阻止RTK的反式自磷酸化而拮抗受體的活性。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的成分可以結合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基，并起到阻止RTK的不對稱接觸界面以使RTK能夠反式自磷酸化的距離和定向進行定位所需的運動的分子楔的作用。在特定實施方案中，本發(fā)明的成分結合RTK上的構象表位或非連續(xù)表位。如本文所使用，術語“表位”意圖包括本發(fā)明的小分子、抗體或其抗原結合部分或肽類分子可以結合的RTK的殘基、基序、位點或結構域。構象表位或非連續(xù)表位可以由RTK (例如人FGFRl、FGFR2、FGFR3或FGFR4)的不對稱接觸界面的兩個或更多個殘基組成。在特定的實施方案中，本發(fā)明的成分結合由2個或更多個選自于下列的氨基酸組成的構象表位FGFR1的R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703和P705。在另一實施方案中，本發(fā)明的成分結合由3個或更多個選自于下列的氨基酸組成的構象表位FGFR1 的 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 和 P705。在另一實施方案中，本發(fā)明的成分結合由4個或更多個選自于下列的氨基酸組成的構象表位=FGFRl的R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 和 P705。在另一實施方案中，本發(fā)明的成分結合由5個或更多個選自于下列的氨基酸組成的構象表位=FGFRl 的 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W69U T695、P702、G703和P705。如以上所示的，本發(fā)明的成分可以結合形成不對稱接觸界面的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結合形成不對稱接觸界面的殘基的亞群。應當理解，在特定實施方案中，當提到本發(fā)明的成分結合表位例如構象表位時，意圖是所述成分僅結合那些構成該表位的那些特定殘基，而不結合該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在另一實施方案中，本發(fā)明的成分結合RTK上的連續(xù)表位。在一個實施方案中，連續(xù)表位由FGFR的不對稱接觸界面中的兩個或更多個殘基組成。在另一實施方案中，連續(xù)表位是選自于RTK單體的3 I- 3 2環(huán)、RTK單體的3 3- a C環(huán)、RTK單體的3 4-B5環(huán)、RTK單體的a D- a E環(huán)、RTK單體的a F螺旋和RTK單體的a F- a G環(huán)的表位?！け景l(fā)明的成分可以通過阻止RTK的不對稱接觸界面之間的關鍵同型相互作用(例如鹽橋)而發(fā)揮其對受體活化的抑制作用，所述相互作用對于RTK單體以酪氨酸激酶活化至關重要的距離和定向進行定位是不可或缺的。因此，本發(fā)明的成分可以允許RTK的二聚化而阻止反式自磷酸化。本領域技術人員也會理解，本發(fā)明的成分可以結合可以出現(xiàn)在RTK的糖基化形式上的糖殘基。本發(fā)明的成分也可以結合由氨基酸殘基和糖殘基兩者組成的表位。術語“受體酪氨酸激酶”和“RTK”在本文中可互換地使用以表示公知的使酪氨酸殘基磷酸化的膜受體的家族。很多受體酪氨酸激酶在發(fā)育或者細胞分裂中起到重要作用。受體酪氨酸激酶具有細胞外配體結合結構域、跨膜結構域和胞內催化結構域。胞外結構域結合細胞因子、生長因子或其它配體，并通常由一個或多個可識別的結構基序組成，包括富半胱氨酸區(qū)、纖連蛋白III樣結構域、免疫球蛋白樣結構域、EGF樣結構域、鈣粘著蛋白樣結構域、kringle樣結構域、因子VIII樣結構域、富甘氨酸區(qū)、富亮氨酸區(qū)、酸性區(qū)和盤狀(discoidin)結構域。胞內激酶結構域的活化通過配體結合細胞外結構域實現(xiàn)，這引起受體二聚化。以這種方式活化的受體能夠自磷酸化催化結構域外的酪氨酸殘基，從而促進活性受體構象的穩(wěn)定。磷酸化殘基也作為隨后在細胞內傳導信號的蛋白質的結合位點。RTK的實例包括但不限于Kit受體(亦稱干細胞因子受體或SCF受體)、成纖維細胞生長因子(FGF)受體、肝細胞生長因子(HGF)受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)受體、神經生長因子(NGF)受體、血管內皮生長因子(VEGF)受體、PDGF受體-a、H)GF受體-3、CSF-I受體(亦稱M-CSF受體或Fms)和Flt3_受體(亦稱Flk2)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，RTK是IV型RTK。在本發(fā)明另一實施方案中，RTK是V型RTK，即VEGF受體家族的成員，或是III型RTK，即TOGF受體家族的成員。 如本文中所使用，術語“ IV型受體酪氨酸激酶家族”或“ IV型RTK”意于包括通常包含三個免疫球蛋白樣結構域(或Ig樣結構域)、單一跨膜螺旋結構域和具有酪氨酸激酶活性的胞內結構域的受體酪氨酸激酶。IV型RTK家族結合成纖維細胞生長因子。IV型RTK的實例包括但不限于FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4。如本文中所使用，術語“受體酪氨酸激酶的III型家族”或“III型RTK”意于包括一般地在其胞外域中包含五個免疫球蛋白樣結構域或Ig樣結構域的受體酪氨酸激酶。III型RTK的實例包括但不限于I3DGF受體、M-CSF受體、FGF受體、Flt3受體(亦稱Flk2)和Kit受體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，III型RTK是Kit (在本領域也稱為SCF受體)。KU，與其它III型RTK相似，由通過單一跨膜(TM)結構域連接于胞質區(qū)糖基化的細胞外配體結合結構域(胞外域)構成(綜述于 Schlessinger (2000)Cell 103:211-225)。III型 RTK，例如 Kit 或TOGFR，的另一標志是帶有大的激酶插入?yún)^(qū)的胞質蛋白酪氨酸激酶(PTK)結構域。已知存在至少兩種Kit受體的剪接同種型，較短的利用框內的剪接位點。本發(fā)明包括Kit以及其它上述RTK的所有同種型。本文中所用的受體酪氨酸激酶(RTK)的“Ig樣結構域”意于包括本領域公知的存在于RTK胞外域中的結構域。在IV型受體酪氨酸激酶家族的胞外域中，有三個這樣的結構域。在III型受體酪氨酸激酶家族(III型RTK)，例如KU，的胞外域中，存在5個這樣的結構域，已知為D1、D2、D3、D4和D5。III型RTK的Dl、D2和D3結構域負責結合RTK的配體(綜述于 Ullrich 和 Schlessinger (1990) Cell 61 :203-212 中)。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，術語“Ig樣結構域”不意于包括負責配體結合的RTK的結構域。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，Ig樣結構域是III型RTK的D4和/或D5結構域。在VEGF受體家族的胞外域中，存在7個Ig樣結構域，已知為D1、D2、D3、D4、D5、D6和D7。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，Ig樣結構域是VEGF受體家族的D7結構域。如本文所使用，術語“催化結構域”意圖包括酶分子的發(fā)生底物催化的區(qū)域。例如，RTK的催化結構域包括作為酶發(fā)揮作用的RTK單體中參與作為底物發(fā)揮作用的RTK單體的結合和反式自磷酸化的殘基。在本發(fā)明的具體實施方案中，催化結構域包括如圖2所示的FGFRl的紅色區(qū)域。在一個實施方案中，催化結構域包括如圖4所示的FGFRl的黃色區(qū)域。如本文所使用，短語“作為底物發(fā)揮作用”或“底物分子”意圖包括作為二聚化的RTK的一部分并且被另一個受體酪氨酸激酶單體(其為二聚化的RTK的一部分并作為酶發(fā)揮作用)磷酸化的受體酪氨酸激酶單體。如本文所使用，短語“作為酶發(fā)揮作用”或“酶分子”意圖包括作為二聚化的受體酪氨酸激酶的一部分并且起到對另一作為底物發(fā)揮作用的RTK單體進行酶促磷酸化的作用的RTK單體。類似地，如本文所使用的術語“單體”指的是不與第二個相同或不同類型的RTK多肽締合的作為單多肽鏈的RTK分子。如本文所使用的術語“二聚體”指的是包含兩個RTK單體的分子。如本文所使用的術語“二聚化”指的是包含兩個RTK單體的二聚體分子的形成。本文中所用的術語“單體狀態(tài)”指的是其中RTK分子由單多肽鏈組成的RTK的狀態(tài)，該單多肽鏈不與相同或不同類型的第二 RTK多肽締合。RTK 二聚化導致反式自磷酸化和受體活化。因此，單體狀態(tài)的RTK是非活性狀態(tài)。單體狀態(tài)也是其中單一 RTK的不對稱接觸界面不與第二 RTK的不對稱接觸界面分別結合的狀態(tài)。術語受體酪氨酸激酶(RTK)的“胞外域”是本領域公知的，并且指RTK的細胞外部分，即在質膜外的RTK的部分。
如本文使用的術語“成纖維細胞生長因子受體”、“FGFR”、“FGF受體”或“FGFR家族”(也稱為IV型RTK)包括結合成纖維細胞生長因子的受體。如上所述，這些RTK其胞外域中具有三個Ig樣結構域。FGFR家族受體的實例有FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4。如本文使用的術語“血管內皮生長因子受體”、“VEGF受體”或“VEGF受體家族”，亦稱V型RTK，包括血管內皮生長因子的RTK受體。如上所述，這些RTK在其胞外域中具有7個Ig樣結構域。VEGF家族受體的實例為VEGFRl (亦稱Flt_l)、VEGFR2 (亦稱KDR或Flk-I)和 VEGFR3 (亦稱 Flt-4)。術語受體酪氨酸激酶的胞外域的“近膜區(qū)”指的是接近質膜的RTK的細胞外部分，并優(yōu)選地不直接負責配體與RTK的結合。近膜區(qū)的實例包括但不限于III型受體酪氨酸激酶的D4結構域、III型受體酪氨酸激酶的D5結構域、III型受體酪氨酸激酶的D3-D4鉸鏈區(qū)、III型受體酪氨酸激酶的D4-D5鉸鏈區(qū)和V型受體酪氨酸激酶的D7結構域。本文中所用的術語“同型相互作用”指的是來自兩個單體受體相同區(qū)域之間的相 互作用。本文中所用的術語“異型相互作用”指的是來自兩個單體受體的兩個不同區(qū)域之間的相互作用。異型相互作用可以是兩個不同類型的單體受體二聚化的結果，或者同種單體受體的野生型和突變體形式二聚化的結果。例如，本領域公知癌癥患者可以攜帶某一受體的野生型等位基因和突變體等位基因。本文所使用的，“原體”是寡聚蛋白如RTK的結構單元。原體是可以以確定的化學計量組裝以形成低聚物的蛋白質亞基。受體酪氨酸激酶的VEGFR家族是共價連接的同型二聚體，并且各個VEGFR原體是以名為“半胱氨酸結生長因子”的結構由按反向平行方式排列的四鏈￠-折疊片組成的。短語“抑制配體誘導的反式自磷酸化”指的是本發(fā)明的成分抑制受體酪氨酸激酶的活性的能力。換言之，該短語包括本發(fā)明的成分將平衡轉向形成非活性或未磷酸化的受體構型的能力。例如，與不存在本發(fā)明的成分時的受體活性相比，本發(fā)明的成分可以抑制受體酪氨酸激酶的反式自磷酸化至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在一些實施方案中，本發(fā)明的成分可以抑制RTK的所有酪氨酸殘基的反式自磷酸化。例如，該成分可以抑制FGFRl的Y653、Y583、Y463、Y766、Y585和Y654的反式自磷酸化。在另一個實施方案中，本發(fā)明的成分可以抑制位于RTK的催化核心的活化環(huán)中的所有酪氨酸殘基的反式自磷酸化。例如，該成分可以抑制FGFRl的催化核心的活化環(huán)中的殘基Y653的反式自磷酸化。在其他實施方案中，本發(fā)明的成分可以抑制位于激酶插入?yún)^(qū)域中的所有酪氨酸殘基的反式自磷酸化。例如，該成分可以抑制FGFRl的激酶插入?yún)^(qū)域中的殘基Y583和Y585的反式自磷酸化?；蛘?，該成分可以抑制FGFRl的激酶插入?yún)^(qū)域中的殘基Y583的反式自磷酸化，或該成分可以抑制FGFRl的激酶插入?yún)^(qū)域中的殘基Y585的反式自磷酸化。在其他實施方案中，本發(fā)明的成分可以抑制位于RTK的近膜區(qū)中的所有酪氨酸殘基的反式自磷酸化。例如，該成分可以抑制FGFRl的近膜區(qū)中的殘基Y463的反式自磷酸化。在其他實施方案中，本發(fā)明的成分可以抑制位于RTK的C末端尾中的所有酪氨酸殘基的反式自磷酸化。例如，該成分可以抑制FGFRl的C末端尾中的殘基Y766的反式自磷酸化。在其他實施方案中，本發(fā)明的成分可以抑制位于RTK活化環(huán)中的所有的酪氨酸殘基的反式自磷酸化。例如，該成分可以抑制FGFRl的活化環(huán)中的殘基Y654的反式自磷酸化。所有酪氨酸自磷酸化位點的反式自磷酸化是RTK完全激活所必需的并且酪氨酸殘基的反式自磷酸化是以特定的順序發(fā)生的。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的成分可以抑制一個酪氨酸殘基及將后續(xù)反式自磷酸化的任何酪氨酸殘基的反式自磷酸化。例如，在一個實施方案中，該成分可以抑制殘基Y583、Y463、Y766、Y585和Y654的反式自磷酸化。在另一個實施方案中，該成分可以抑制殘基Y463、Y766、Y585和Y654的反式自磷酸化。在另一個實施方案中，該成分可以抑制殘基Y766、Y585和Y654的反式自磷酸化。在另一個實施方案中，該成分可以抑制殘基Y585和Y654的反式自磷酸化。而在另一個實施方案中，該成分可以抑制殘基Y654的反式自磷酸化。本文中所用的術語“非活性狀態(tài)”指的是其中RTK分子不能激活下游的信號傳導的RTK的狀態(tài)。非活性狀態(tài)可以是這樣的狀態(tài)，其中受體酪氨酸激酶被允許二聚化，但是兩個單體的不對稱接觸界面(例如IV型受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面)之間的定位、定向、構象和/或距離發(fā)生改變從而抑制了受體酪氨酸激酶的活性(例如受體的酪氨酸自 磷酸化受到抑制和/或受體激活下游信號傳導途徑的能力受到抑制)。非活性狀態(tài)也包括如上所述的單體狀態(tài)。實施例進一步詳述了實驗，其表明存在對于RTK配體誘導的反式自磷酸化至關重要的但是對于受體二聚化不是必不可少的特定的保守氨基酸殘基。術語“非活性狀態(tài)”包括其中與沒有本發(fā)明的成分時受體的反式自磷酸化相比，本發(fā)明的成分可以降低或抑制受體酪氨酸激酶的配體誘導的反式自磷酸化至少5%、10 %、15 %、20 %、25 %、30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的狀態(tài)。本文中描繪的任何功能分析試驗可用于確定本發(fā)明的成分抑制受體酪氨酸激酶的反式自磷酸化的能力。在一些實施方案中，本發(fā)明的成分可以表現(xiàn)出寬的效應，例如當受試者中的大部分或全部靶RTK滅活時。在其他的實施方案中，本發(fā)明的成分可以表現(xiàn)出較窄的效應，例如當受試者中的部分靶RTK滅活時。在這樣的實施方案中，與不存在所述成分時的受體相比，至少5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 的受體被鎖定在非活性狀態(tài)中。本文中所使用的術語“構象表位”或“非線性表位”或“不連續(xù)表位”可互換地使用以指由至少兩個不是單蛋白質鏈中的連續(xù)氨基酸的氨基酸組成的表位。例如，構象表位可以是由一段(strech)插入氨基酸分開，但是足夠靠近以被本發(fā)明的成分作為單一表位識別的兩個或更多個氨基酸組成。作為進一步的實例，在單蛋白質鏈上由插入氨基酸分開的氨基酸或者存在于獨立的蛋白質鏈上的氨基酸可以由于蛋白質結構或復合體的構象形狀而拉近，以成為可以被本發(fā)明的成分結合的構象表位。特定的不連續(xù)表位和構象表位在本文中進行描述。本領域技術人員將理解，通常本發(fā)明的成分結合的線性表位可以依賴于或不依賴于RTK的二級、三級或四級結構。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的成分可以結合一組氨基酸而無論它們是否以天然的三維蛋白質結構進行折疊。在其他的實施方案中，本發(fā)明的成分可能不識別組成該表位的單個氨基酸殘基，而是可能需要特別的構象(彎曲、盤旋、轉角或折疊)以識別和結合表位。如本文使用的，“鄰近表位”或“連續(xù)表位”可互換使用，指的是由單肽鏈中的連續(xù)氨基酸的至少兩個氨基酸組成的表位。本文中描繪了特定的連續(xù)表位。在一個實施方案中，本發(fā)明的成分結合RTK上的連續(xù)表位。在另一個實施方案中，連續(xù)表位由RTK的不對稱的接觸界面中的兩個或更多個殘基組成。本文所用的短語“疏水氨基酸”是指包含疏水性能的氨基酸，如丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸、絲氨酸、脯氨酸和本文列出的其他氨基酸。本發(fā)明的各個方面將在以下小節(jié)中進一步詳細描繪I.結合人受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面的小分子在本發(fā)明的一個方面，結合人受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面的成分是小分
子。 本發(fā)明的小分子的特征在于特定功能特征或性質。例如，小分子結合RTK的不對稱接觸界面的特定殘基或區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，小分子抑制劑與不對稱接觸界面的結合阻止使得RTK單體能夠處于允許酪氨酸激酶結構域活化并隨后募集和激活下游信號傳導途徑的距離和定向(位置)的移動。在一些實施方案中，小分子結合可以允許受體酪氨酸激酶二聚化，但影響兩個單體的不對稱接觸界面(例如，IV型受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面)之間的定位、定向和/或距離，從而抑制受體酪氨酸激酶的配體誘導的反式自磷酸化和活性。術語“小分子化合物”、“小分子藥物”、“小分子”或“小分子抑制劑”在本文可互換使用以用來指能夠抑制RTK(例如，F(xiàn)GFR如FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4)的配體誘導的反式自磷酸化和活性的本發(fā)明的化合物。這些化合物可包括在PubChem數(shù)據(jù)庫(pubchem.ncbi. nlm. nih. gov/) > Molecular Libraries Screening Center Network(MLSCN)數(shù)據(jù)庫中的化合物、相關數(shù)據(jù)庫中的化合物、或者它們的衍生物和/或功能類似物。如本文所使用，“類似物”或“功能類似物”是指化合物或小分子抑制劑，其在結構上類似于母體化合物，但在組成上稍微不同(例如，一個或多個原子或功能團被添加、除去或改變)。相比于初始化合物，類似物可具有或不具有不同的化學或物理特性，并可具有或不具有改善的生物學和/或化學活性。例如，與母體化合物相比，類似物可以是更疏水性的或者它可具有改變的活性(增加、降低或與母體化合物相同)。所述類似物可以是初始化合物的天然或非天然發(fā)生(例如重組)的變體。其它類型的類似物包括化合物的異構體(對映異構體、非對映異構體等等)和其它類型的化合物手性變體，以及結構異構體。所述類似物可以是線性化合物的分支或環(huán)狀變體。例如，線性化合物可具有支化的或另外取代的以賦予某些期望的性質(例如改善的親水性或生物利用度)的類似物。如本文所使用，“衍生物”是指化合物或小分子抑制劑的化學上或生物學上的改良形式，其結構上類似于母體化合物并且(實際上或理論上)可衍生于該母體化合物?！把苌铩迸c“類似物”或“功能類似物”的區(qū)別在于母體化合物可以是產生“衍生物”的起始物質，而母體化合物不是必須被用作產生“類似物”或“功能類似物”的起始物質。衍生物可以具有或不具有與所述母體化合物不同的化學或物理特性。例如，與母體化合物相比，衍生物可以是更親水的或者它可具有改變的反應性。衍生化(即，通過化學或其它手段修飾)可包括分子內一個或多個部分的取代(例如，官能團的改變)。例如，氫可以用鹵素如氟或氯取代，或者羥基(一0H)可以用羧酸部分(一C00H)取代。術語“衍生物”也包括偶聯(lián)物和母體化合物的前藥(即化學修飾的衍生物，其在生理條件下可轉化為原始化合物)。例如，前藥可以是活性劑的無活性形式。在生理條件下，前藥可以轉化為所述化合物的活性形式。例如，可以通過用?；鶊F(?；八?或氨基甲酸酯基團(氨基甲酸酯前藥)置換氮原子上的一個或兩個氫原子以形成前藥。關于前藥的更多詳細信息可例如發(fā)現(xiàn)于Fleisher等，Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115 ；Design of Prodrugs, H. Bundgaard(編輯)，Elsevier, 1985 ;和 H. Bundgaard, Drugs of the Future 16 (1991) 443 中。術語“衍生物”也用于描述全部溶劑合物，例如水合物或加合物(例如與醇的加合物)、活性代謝物和母體化合物的鹽?？梢灾苽涞柠}的類型取決于化合物內的部分的性質。例如，酸性基團如羧酸基團可以形成堿金屬鹽或堿土金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽)和與生理上可耐受的季銨離子的鹽以及與氨和生理上可耐受的有機胺(如三乙胺、乙醇胺或三-(2-羥乙基)胺)的酸加成鹽。堿性基團可以例如與無機酸如鹽酸(“HC1”)、硫酸或磷酸形成酸加成鹽，或者與有機羧酸和磺酸如乙酸、檸檬酸、苯甲酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、甲磺酸或對甲苯磺酸形成酸加成鹽。除了堿性氮原子之外同時包含堿性基團和酸性基團(如羧基)的化合物可以作為兩性離子存在?？梢酝ㄟ^本領域普通技術人員已知的慣用方法獲得鹽，例如通過在溶劑或稀釋劑中將化合物與無機或有機酸或堿結合，或者通過陽離子交換或陰離 子交換從其它鹽獲得。小分子已知具有1200或以下、1000或以下、900或以下、800或以下、700或以下、600或以下、500或以下、400或以下、300或以下、200或以下、100或以下、50或以下、25或
以下或者10或以下的分子量。本發(fā)明的小分子抑制劑經選擇或設計以結合RTK(例如，IV型RUB FGFR)的不對稱接觸界面。在一些實施方案中，小分子抑制劑經選擇或設計以結合人FGFR1、人FGFR2、人FGFR3或人FGFR4的不對稱接觸界面，從而抑制受體的反式自磷酸化或成有活性的(例如，激活細胞內信號轉導途徑)的能力。在其他實施方案中，小分子抑制劑經選擇以結合與FGF受體的不對稱接觸界面具有共同的同源性的結構域。例如，本發(fā)明的小分子可指向與RTK的不對稱接觸界面(例如，F(xiàn)GFRl的不對稱接觸界面)至少50%相同，至少60%相同，至少70%相同，至少80%相同，至少90%相同，或至少95%或99%相同的，結構域。這樣的小分子能夠結合功能與例如FGFR的不對稱接觸界面相似的蛋白質結構域。本發(fā)明的小分子抑制劑也可結合來源于RTK (例如人FGFR或人IV型RTK)的不對稱接觸界面的特定基序或共有序列，這允許所述小分子抑制劑特異性地結合RTK家族的成員(例如人IV型RTK家族的成員)間共有的結構域。在其它實施方案中，小分子抑制劑結合代表蛋白質的三維結構的蛋白質基序或共有序列。這樣的基序或共有序列不表示氨基酸的連續(xù)鏈，而是代表由RTK的三維折疊產生的非線性的氨基酸排列(即“結構基序”)。這樣的基序的實例是基于FGF受體的不對稱接觸界面的線性區(qū)域設計的基序。這樣的基序和共有序列可以根據(jù)關于抗體的章節(jié)中論述的方法設計。重要的是，本發(fā)明的小分子抑制劑不結合成纖維細胞生長因子受體的催化結構域的核苷酸結合位點在另一個實施方案中，本發(fā)明的小分子抑制劑結合RTK上的連續(xù)表位。如本文所使用，術語“表位”意圖包括小分子可以結合的RTK的殘基、基序或結構域。在一個實施方案中，連續(xù)表位由RTK的不對稱接觸界面中的兩個或更多個殘基組成。在另一個實施方案中，連續(xù)表位是選自于RTK單體的3 I- 3 2環(huán)、RTK單體的3 3- a C環(huán)、RTK單體的3 4-B5環(huán)、RTK單體的a D- a E環(huán)、RTK單體的a F螺旋和RTK單體的a F- a G環(huán)的表位。在另外的實施方案中，本發(fā)明的小分子抑制劑經選擇或設計來特異性地結合RTK的突變不對稱接觸界面。在優(yōu)選實施方案中，突變體RTK是致瘤的或致癌的突變體。在一種具體實施方案中，小分子抑制劑經選擇或設計來結合致癌的FGFR突變體?？梢员槐景l(fā)明的小分子靶向的RTK突變體包括，但不限于，具有以下一個或多個氨基酸的突變的成纖維細胞生長因子受體FGFR1 的 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703或P705。本領域技術人員應理解，本發(fā)明的方法可以應用于FGFR中的其它突變或其它RTK中的突變。靶向于突變體RTK的一個優(yōu)點是治療性小分子可以僅結合包含該突變的細胞上的RTK，而使得健康細胞大部分或完全不受影響。因此，在突變是致瘤性突變的情況下，僅腫瘤細胞將被用作治療靶標，從而潛在地減少副作用和劑量要求。在一些實施方案中，小分子結合人FGFR的特定序列，例如FGFRl的殘基R577、 D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703或P705。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的小分子可以結合FGF受體中構成不對稱接觸界面的小空腔或口袋的一個或多個殘基。例如，本發(fā)明的小分子可以結合RTK—個單體的3 I-P 2環(huán)、RTK—個單體的P 3-a C環(huán)、RTK—個單體的P 4-B5環(huán)、RTK—個單體的a D-a E環(huán)、RTK—個單體的a F螺旋和RTK—個單體的a F-a G環(huán)中的以下殘基的一個或多個。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的小分子可以結合連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸殘基，并起到阻止使酪氨酸激酶能夠活化的RTK反式自磷酸化所需的運動的分子楔的作用。本發(fā)明的小分子也可以起到阻止同型RTK相互作用或使不對稱接觸界面去穩(wěn)定的作用。本領域技術人員將理解，在一些實施方案中，本發(fā)明的小分子可以容易地被靶向于其它IV型RTK中的相應殘基，例如形成相似的口袋或空腔的那些殘基或通過結構比對或序列比對處于相同的位置的那些殘基。在具體的實施方案中，本發(fā)明的小分子結合IV型RTK上的構象表位或非連續(xù)表位。構象表位或非連續(xù)表位可以由來自IV型RTK(例如人FGFR)的不對稱接觸界面的兩個或更多個殘基組成。例如，構象表位或非連續(xù)表位可以由FGFRl的殘基R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 和 P705組成。在特定的實施方案中，本發(fā)明的小分子結合由選自RTK—個單體的￠1-02環(huán)、RTK一個單體的P 3- a C環(huán)、RTK —個單體的P 4-B5環(huán)、RTK —個單體的a D- a E環(huán)、RTK —個單體的a F螺旋和RTK —個單體的a F- a G環(huán)的RTK區(qū)域中的2個或更多個氨基酸組成的構象表位。如以上所指出的，本發(fā)明的小分子可以結合形成在RTK的不對稱接觸界面中確定的口袋或空腔的所有氨基酸殘基，或者它們可以結合形成口袋或空腔的殘基的亞群。應理解，在某些實施方案中，當提及本發(fā)明的小分子結合表位(例如構象表位)時，本發(fā)明意圖是所述小分子僅結合那些構成該表位(例如不對稱接觸界面的口袋或空腔)的那些特定殘基，而不是在該受體的線性氨基酸序列中的其它殘基。在另一個實施方案中，本發(fā)明的小分子結合人FGFR2的氨基酸殘基Arg579或Arg580,或FGFR3或FGFR4中的相應殘基。人FGFR2的殘基Arg579或Arg580類似于FGFRl的殘基Arg576且是FGFR2的不對稱接觸界面的部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明的小分子結合選自于 FGFR2 的 C491、F492、N662、G663、R664、L665、P666、V667、K668、W669、R577、R579、R580、P581、P582、E585、Y589、S587、Y588、D589、I590、P705、G706、P708、F713、K724、A726、N727、C728、T729、N73(^PE731的氨基酸殘基。圖9和圖12呈現(xiàn)的基于結構的序列比對描繪了參與不對稱接觸形成的殘基；這些殘基在FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4中是保守的。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，小分子結合FGFR3或FGFR4中的等同殘基。本發(fā)明的小分子可以通過阻止反式自磷酸化必需的IV型RTK不對稱接觸界面之間的關鍵同型相互作用(例如鹽橋)發(fā)揮其對受體活化的抑制作用。本發(fā) 明的小分子可以允許RTK(例如FGFR)的二聚化，但同時阻止反式自磷酸化?；诮Y構的序列比對已經表明在激性FGFRl和FGFR2結構中都發(fā)現(xiàn)的參與形成不對稱接觸界面的殘基是保守的(圖9A)。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的小分子可以靶向于IV型RTK的不對稱接觸界面的保守區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的小分子以高親和性結合RTK(例如FGFR)的不對稱接觸界面，例如Kd為1x10_7M或更低、Kd為5x10_8M或更低、Kd為IxKT8M更低、Kd為5x1 O^9M更低、或者Kd為1x10_8M和IxKTkiM更低之間的親和性。本發(fā)明的小分子抑制劑可以通過本領域已知的幾種方法進行制備或選擇。篩選程序可用于從文庫鑒定結合期望的RTK的不對稱接觸界面的小分子。一種方法，Chemetics (Nuevolutions),利用文庫中各分子的DNA標簽來輔助選擇。Chemetics⑧系統(tǒng)允許篩選數(shù)百萬個化合物的靶結合。涉及小分子文庫和基于標簽的篩選的專利是美國專利申請 20070026397 ；20060292603 ；20060269920 ；20060246450 ；20060234231 ；20060099592 ；20040049008 ；20030143561號，這些文獻以其全文通過引用的方式并入本文。其它可以用于從文庫鑒定結合期望的RTKH^UnFGFR)的不對稱接觸界面的小分子的公知方法包括利用其中文庫成員以鑒定標記進行標記(即，文庫中存在的各個標記與文庫中存在的不同化合物結構相關聯(lián)，從而標記的鑒別指出了標記分子的結構)的文庫的方法。標記的文庫的一種方法利用寡核苷酸標簽，如在例如以下文獻中描述PCT公開 WO 2005/058479A2 (Direct Select 技術)和美國專利 5，573，905 ;5，708，153 ；5，723，598，6，060, 596 號；公開的 PCT 申請 W 93/06121 ；W0 93/20242 ；W0 94/13623 ；WO 00/23458 ；W0 02/074929 和 WO 02/103008，以及&'enner 和 Lerner (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89,5381-5383(1992) ;Nielsen 和 Janda(Methods :A Companion to Methods inEnzymology 6,361-371 (1994)；以及 Nielsen, Brenner 和 Janda(J. Am. Chem. Soc. 115,9812-9813(1993))，每一篇文獻的全部內容均通過引用的方式并入本文中。這樣的標簽可以使用例如聚合酶鏈式反應進行擴增，以產生很多標簽拷貝并通過測序鑒定所述標簽。然后標簽的序列鑒別結合分子的結構，所述結合分子可以純的形式進行合成和測試活性。組合化學文庫的預備和篩選是本領域技術人員公知的?？捎糜阼b定本發(fā)明的成分的這類組合化學文庫包括但不局限于肽文庫(參見，例如美國專利5，010，175號，F(xiàn)urka,Int. J. Pept. Prot. Res. 37 :487 493 (1991)和 Houghton 等，Nature 354 :8488 (1991))。用于產生化學多樣性文庫的其它化學物質是本領域公知的并且可以被使用。這樣的化學物質包括但不局限于類肽(例如PCT公開號WO 91/19735)，編碼肽(例如PCT公開號WO 93/20242)，隨機生物寡聚物(例如PCT公開號WO 92/00091)，苯并二氮草(例如美國專利5，288，514號)，diversomer如乙內酰脲、苯并二氮草和二肽(Hobbs等，Proc. Nat.Acad. Sci. USA 90 :6909 6913 (1993))，插烯多月太(vinylogous polypeptide) (Hagihara等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :6568 (1992))、具有葡萄糖骨架的非肽類肽模擬物(Hirschmann等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :92179218 (1992))，小化合物文庫的類似有機合成(Chen等，J. Amer. Chem. Soc. 116 :2661 (1994))、寡氨酉旨(oligocarbamate) (Cho 等，Science 261 1303(1993))和 / 或肽基膦酸酯(Campbell 等，J. Org. Chem. 59 :658 (1994))、核酸文庫(參見Ausubel，Berger和Russell & Sambrook，所有同上)、肽核酸文庫(參見例如美國專利5，539，083 號)、碳水化合物文庫(參見例如 Liang 等，Science，274 :1520 1522(1996)和美國專利5，593，853號)、小有機分子文庫(參見例如苯并二氮草，BaumC&EN，Jan 18，33頁
(1993);類異戊二烯，美國專利5，569，588號；噻唑烷酮和間噻嗪酮，美國專利5，549，974號；吡咯烷，美國專利5，525，735和5，519，134號；嗎啉代化合物，美國專利5，506, 337號；苯并二氮草,5，288，514等)。各前述出版物通過引用的方式并入本文。公眾數(shù)據(jù)庫也是可利用的，并常用于小分子篩選，例如 PubChem (pubchem. ncbi. nlm. nih. gov), Zinc (Irwin 和 Shoichet (2005) J. Chem. Inf. Model. 45(1) :177-82)和 ChemBank (Seiler 等(2008) NucleicAcids Res. 36(數(shù)據(jù)庫發(fā)行號):D351_D359)。用于制備組合文庫的裝置是市場上可買到的(見，例如357MPS，390MPS，AdvancedChem Tech, Louisville Ky. , Symphony,Rainin,Woburn,Mass. ,433A Applied Biosystems,Foster City, Calif. ,9050Plus, Millipore, Bedford, Mass.)。此外，許多組合文庫本身是市場上可買到的(見例如，ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis, Mo. , 3DPharmaceuticals, Exton, Pa. , Martek Biosciences, Columbia, Md.,等)。而且，因為篩選方法被非常好地建立，通常與專業(yè)公司簽訂合同以鑒定用于目標靶的特定化合物(例如BioFocus DPI (biofocus, com)和 Quantum Lead (q-lead. com))。本領域眾所周知的并且可應用于本發(fā)明的方法的其它選擇小分子的方法是Huang和 Stuart L. Schreiber(1997)Proc Natl Acad Sci USA. 94(25) :13396-13401 ;Hung 等(2005) Science 310 :670-674 ;Zhang 等(2007) Proc Natl Acad Sci 104 :4606-4611 ;或者在Gordon(2007)ACS Chem. Biol. 2 :9-16中綜述的任何一種方法，其全部都通過引用以其全部內容并入本文。除了實驗篩選法之外，本發(fā)明的小分子還可以使用虛擬篩選法加以選擇。虛擬篩選技術使用統(tǒng)計分析和蛋白質對接(docking)模擬來預測來自文庫的哪些小分子將結合蛋白質或其中的特定表位。最常見地，虛擬篩選方法比較蛋白質的三維結構和文庫中小分子的三維結構。使用了對蛋白質-分子相互作用進行建模的不同策略，盡管常用的是模擬在原子之間的結合能一包括氫鍵、靜電力和范德瓦耳斯相互作用一的算法。通常，虛擬篩選方法可以掃描具有超過一百萬個化合物的文庫并返回可能是強結合物的小分子的短的名單。對虛擬篩選的若干綜述可以獲得，其詳述了可用來鑒定本發(fā)明的小分子的技術(Engel 等(2008) J. Am. Chem. Soc. ,130(15),5115-5123 ；McInnes. (2007). Curr Opin ChemBiol. Oct ；11(5) :494-502 ;Reddy 等(2007)Curr Protein Pept Sci. Aug ；8(4) :329-51;Muegge 和 Oloff. 2006)Drug Discovery Today. 3(4) :405-411 ;Kitchen 等(2004)NatureReviews Drug Discovery 3,935-949)。小分子篩選的進一步的實例可以在美國專利申請2005/0124678號中找到，其通過引用并入本文。本發(fā)明的小分子可以包含在下表中描繪的骨架結構之一。在該表中引用的參考文獻均通過引用的方式以其全文并入本文中?；鶊FRl、R2、R3和R4的僅有限制在于它們不應干擾或顯著抑制所指出的反應，并且可以包括氫、烷基、取代烷基、雜烷基、取代雜烷基、環(huán)燒基、雜環(huán)燒基、取代環(huán)燒基、取代雜環(huán)燒基、芳基、取代芳基、芳燒基、雜芳燒基、取代芳烷基、取代雜芳烷基、雜芳基、取代雜芳基、齒素、烷氧基、芳氧基、氨基、取代氨基和本領域已知的其它基團。適宜的取代基包括但不局限于燒基、燒氧基、硫代燒氧基、硝基、輕基、疏基、芳氧基、芳基-S-、齒素、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、氰基、氰酸酯、腈、 異氰酸酯、硫氰酸酯、氨基甲?；腿〈被柞；?。
權利要求
1.結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面的成分，其中所述成分能抑制配體誘導的RTK的反式自磷酸化。
2.權利要求I的成分，其中所述成分不結合RTK的催化結構域的核苷酸結合位點。
3.權利要求I的成分，其中所述成分結合RTK的一個單體的N-葉上的不對稱接觸界面。
4.權利要求I的成分，其中所述成分結合RTK的一個單體的C-葉上的不對稱接觸界面。
5.權利要求I的成分，其中所述成分不引起內在激酶活性的損失。
6.權利要求I的成分，其中所述成分提高了RTK單體之間的空間位阻。
7.權利要求I的成分，其中所述成分不阻止RTK的二聚化。
8.權利要求I的成分，其中所述成分阻止RTK的胞質結構域的二聚化。
9.權利要求I的成分，其中所述RTK是成纖維細胞生長因子受體(FGFR)。
10.權利要求9的成分，其中所述成纖維細胞生長因子受體是成纖維細胞生長因子受體 I (FGFRl)。
11.權利要求9的成分，其中所述成纖維細胞生長因子受體是成纖維細胞生長因子受體 2(FGFR2)。
12.權利要求9的成分，其中所述成纖維細胞生長因子受體是成纖維細胞生長因子受體 3(FGFR3)。
13.權利要求9的成分，其中所述成纖維細胞生長因子受體是成纖維細胞生長因子受體 4(FGFR4)。
14.權利要求I的成分，其中所述成分結合FGFRl的氨基酸殘基Arg577、FGFR2的氨基酸殘基Arg579或FGFR2的殘基氨基酸Arg580。
15.權利要求I的成分，其中所述成分結合FGFRl的氨基酸殘基Asp519。
16.權利要求I的成分，其中所述成分結合選自于FGFRl的C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 和 P705 的氨基酸殘基。
17.權利要求I的成分，其中所述成分結合選自于FGFRl的R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 和 P705 的至少兩個氨基酸殘基。
18.權利要求I的成分，其中所述成分結合選自于FGFR2的C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706和P708的氨基酸殘基。
19.權利要求I的成分，其中所述成分結合選自于FGFR2的C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706和P708的至少兩個氨基酸殘基。
20.權利要求I的成分，其中所述成分結合選自于RTK單體的@I- P 2環(huán)、RTK單體的3 3- a C環(huán)、RTK單體的3 4-B5環(huán)、RTK單體的a D- a E環(huán)、RTK單體的a F螺旋和RTK單體的a F-a G環(huán)的區(qū)域。
21.權利要求I的成分，其中所述成分結合RTK的構象表位。
22.權利要求21的成分，其中所述構象表位由RTK的不對稱接觸界面中的兩個或更多個殘基組成。
23.權利要求21的成分，其中所述構象表位包含選自于R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703 和 P705 的氨基酸殘基。
24.權利要求21的成分，其中所述構象表位包含選自于FGFR2的C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706 和 P708 的氨基酸殘基。
25.權利要求I的成分，其中所述成分結合RTK的連續(xù)表位。
26.權利要求25的成分，其中所述連續(xù)表位由RTK的不對稱接觸界面中的兩個或更多個殘基組成。
27.權利要求I的成分，其中所述成分是小分子。
28.權利要求27的成分，其中所述小分子結合至少一個選自于FGFRl的R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703和P705的氨基酸殘基。
29.權利要求27的成分，其中所述小分子結合選自于RTK單體的P1-02環(huán)、RTK單體的3 3- a C環(huán)、RTK單體的3 4-B5環(huán)、RTK單體的a D- a E環(huán)、RTK單體的a F螺旋和RTK單體的a F-a G環(huán)的區(qū)域。
30.權利要求27的成分，其中所述小分子基于成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的不對稱接觸界面設計。
31.權利要求I的成分，其中所述成分是肽分子。
32.權利要求31的成分，其中所述肽分子基于成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的不對稱接觸界面設計。
33.權利要求32的成分，其中所述肽分子結合至少一個選自于FGFRl的R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703和P705的氨基酸殘基。
34.權利要求32的成分，其中所述肽分子結合選自于RTK單體的PI- P 2環(huán)、RTK單體的3 3- a C環(huán)、RTK單體的3 4-B5環(huán)、RTK單體的a D- a E環(huán)、RTK單體的a F螺旋和RTK單體的a F-a G環(huán)的區(qū)域。
35.權利要求32的成分，其中所述肽分子包含與FGFRl的氨基酸殘基576-594具有至少80%同一性的結構。
36.權利要求32的成分，其中所述肽分子包含與FGFR2的氨基酸殘基579-597具有至少80%同一性的結構。
37.權利要求I的成分，其中所述成分是分離的抗體或其抗原結合部分。
38.權利要求37的成分，其中所述分離的抗體或其抗原結合部分是細胞內抗體。
39.權利要求37的成分，其中所述抗體或其抗原結合部分選自于人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和嵌合抗體。
40.權利要求39的成分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含選自于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。
41.權利要求40的成分，其中所述抗體重鏈恒定區(qū)是IgGl。
42.權利要求37的成分，其中所述抗體或其抗原結合部分是單鏈Fv片段、SMIP、親和體、親和性多聚體、納米抗體以及單域抗體。
43.權利要求37的成分，其中所述抗體或其抗原結合部分以選自于IxlQ-7M或更低、更優(yōu)選地5x10_8M或更低、更優(yōu)選地1x10_8M或更低、更優(yōu)選地5x10_9M或更低的KD結合受體酪氨酸激酶的不對稱接觸界面。
44.一種產生權利要求37至43中任一項的抗體或其抗原結合部分的雜交瘤。
45.一種結合成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的不對稱接觸界面上的構象表位的成分，其中所述成分抑制FGFR的配體誘導的反式自磷酸化。
46.一種結合選自于 FGFRl 的 R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574, P587、P579、W69U T695, P702, G703 和 P7O5 的氨基酸殘基，或所述殘基I_5 A內的氨基酸殘基的成分，從而抑制FGFRl的配體誘導的反式自磷酸化。
47.一種結合選自于 FGFR2 的 C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706 和 P708 的氨基酸殘基的成分。
48.一種結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面的成分，其中所述成分破壞用作酶的RTK單體的N-葉和用作底物的RTK單體的C-葉之間的界面。
49.一種結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面的成分，其中所述成分抑制RTK的反向去磷酸化。
50.一種包含權利要求I至43和權利要求45至49中任一項的成分和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
51.有效量的權利要求I至43和權利要求45至49中任一項的成分在制備用于治療或預防受試者中RTK相關疾病的藥物中的用途。
52.權利要求51的用途，其中所述RTK相關疾病選自于癌癥和嚴重骨疾病。
53.權利要求52的用途，其中所述嚴重骨疾病是選自于軟骨發(fā)育不全、Crouzon綜合征和Chotzen綜合征的障礙。
54.權利要求52的用途，其中所述癌癥選自于膠質母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌。
55.一種用于鑒定結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面和抑制RTK的配體誘導的反式自磷酸化的成分的方法，該方法包括 將RTK與候選成分接觸； 同時地或相繼地將所述RTK與RTK的配體接觸；和 測定所述成分是否影響作為酶發(fā)揮功能的RTK單體的N-葉和作為底物發(fā)揮功能的RTK單體的C-葉之間的定位、定向和/或距離， 從而鑒定結合RTK的不對稱接觸界面和抑制RTK的配體誘導的反式自磷酸化的成分。
56.權利要求55的方法，其中所述成分抑制RTK的配體誘導的反式自磷酸化。
57.權利要求55的方法，其中所述成分不引起內在RTK激酶活性的損失。
58.結合受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面的小分子，其中所述小分子抑制RTK的反式自磷酸化。
59.權利要求58的小分子，其中所述小分子結合選自于FGFRl的R577、D519、C488、F489、S518、T521、E522、D554、G555、P556、Q574、P587、P579、W691、T695、P702、G703和 P705的氨基酸殘基，或所述殘基I_5人內的氨基酸殘基。
60.權利要求58的小分子，其中所述小分子結合選自于FGFR2的C491、F492、R577、P582、1590、P705、G706 和 P708 的氨基酸殘基。
61.權利要求58的小分子，其中所述小分子結合選自于RTK單體的￠1-02環(huán)、RTK單體的P 3- a C環(huán)、RTK單體的P 4-B5環(huán)、RTK單體的a D- a E環(huán)、RTK單體的a F螺旋和RTK單體的a F-a G環(huán)的區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明提供了與受體酪氨酸激酶(RTK)的不對稱接觸界面結合的成分，其中該成分拮抗該RTK的配體誘導的反式自磷酸化。本發(fā)明還提供了治療或預防RTK相關疾病的方法和鑒別結合RTK的不對稱接觸界面的成分的方法。
文檔編號C07K16/00GK102762221SQ201180006181
公開日2012年10月31日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權日2010年1月14日
發(fā)明者I·萊克斯, J·H·貝, J·施萊斯英格 申請人:耶魯大學