專利名稱：用于疫苗的重組蛋白質、針對所述蛋白質的抗體及包括所述蛋白質和抗體的診斷和治療方法
用于疫苗的重組蛋白質、針對所述蛋白質的抗體及包括所述蛋白質和抗體的診斷和治療方法本發(fā)明涉及蛋白質和/或其片段和衍生物及它們作為疫苗和在生物技術方法中的應用。所述疫苗特別包括從牛蹄炎(digital dermatitis)分離出的密螺旋體(Treponemaspp.)的免疫原性蛋白。本發(fā)明進一步涉及針對所述蛋白質或其片段產生的抗體，和所述蛋白質在診斷方法中的應用，其中檢測抗體作為牛蹄炎的標志。
背景技術：
蹄炎(DD)是一種引起牛跛行的傳染性蹄病，其在集約化奶牛場生產中最為常見。該疾病最初于1974年在意大利公開。最近在瑞典公開了患有蹄炎的第一個畜群Hinstr0m和Bergsten，2005)，而以前只有零星的、非典型病例報告(Manske等，2002)。濕/臟的蹄環(huán)境和DD的發(fā)生率之間有強的聯系(Rodriguez-Lainz等，1996)，例如在隔間系統(tǒng)中小巷內的糞便和尿液的堆積是一個典型的衛(wèi)生問題。除了動物健康問題外，由于牛奶產量的減少和體重減輕導致的經濟損失也與DD相關(Losinger，2006)。對DD病變抗生素治療的快速反應強烈的地支持細菌為病因。已經從DD病變中分離出來許多不同屬的細菌，如密螺旋體屬(Treponema),梭桿菌屬(Fusobacterium),Dichelobacter,普氏菌屬(Prevotella)和Prophyromonas已經從DD病變中分離出來，經常討論多種微生物的病因。但是，有強有力的旁證證明密螺旋體是DD疾病的主要病因。早在1964年從牛的表現為“腳腐爛”表現的不同變種的涂片中觀察到螺旋體(Gupta等，1964)。另一個螺旋體的早期觀察是在1988年，當時DD在英國第一次被公開時(Blowey和Sharp，1988)。最早的來源于DD的第一個螺旋體培養(yǎng)物在1995年被報道(Walker等，1995)。在DD病變組織的組織學制備物中，發(fā)現密螺旋體侵入較深層表皮(Moter等，1998)。已經被證實在感染的牛中產生額外的針對密螺旋體的體液免疫反應(Walker等，1997 ；TiOtt等，2003)。在1966年公開了通過DD病變的新鮮刮擦接種使疾病成功實驗性傳播(Read和Walker，1996)。也通過組織病理學證實在接種后1_2周螺旋體侵入組織(Read等，1998)。密螺旋體的幾個種系型可以存在于相同的病變中。已經從相同的動物中分離出了不同的種系型(Walker等，1995 ;Evans等，2008)和通過16S rRNA基因的克隆和測序，在來源于四頭母牛的混合樣品中，確定了五種不同的種系型(Choi等，1997)。通過DD病變活檢的熒光原位雜交也已經證明了不同種系型之間在真皮層中分布的不同(Moter等，1998)。潰蝕齒樣密螺旋體(Treponema phagedenis-like)種系型主要分布在角質層和棘層。一些種系型也還沒有培養(yǎng)的報道。近來在一些研究中，潰蝕齒樣密螺旋體種系型已經被確定是DD 發(fā)病機制的關鍵因素(Klitgaard 等· 2008，Nordhoff 等· 2008，Yano 等· 2009)。在DD廣泛傳播的國家中，經常使用含有抗生素的足浴。這些足浴迅速被糞便和污物污染，因此起到抗生素耐藥性細菌的高選擇性培養(yǎng)的作用。在瑞典使用四環(huán)素，但是僅用于個體動物的局部治療，因此推薦含硫酸銅的畜牧水平足浴。至今還沒有用于DD的商業(yè)疫苗或血清學檢測。針對密螺旋體的體液應答已經被證實存在于患有DD的牛中，并在研究中用于全細胞裂解物ELISA調查(Demirkan等.1999，Trott等· 2003，Vink等· 2009，Walker等· 1997)。在21世紀早期的若干年，諾華公司生產了用于美國市場的全細胞裂解物DD疫苗(Tr印Shield) (Berry等.2004，Keil等.2002)。疫苗開發(fā)的技術和策略描述于i. a. Vaccine Design Innovative Approachand Novel Strategies(Caister Academic Press,2011)和 Vaccines :From Concept toClinic A Guide to the development and Clinical Testing of Vaccines for HumanUse (Informa Healthcare, 1998)。在1997年Erdile等描述了重組蛋白作為疫苗的應用。發(fā)明簡述本發(fā)明的目的在于提供有效的用于動物皮炎，特別是反芻動物中的蹄炎的診斷和免疫保護方法，以及用于所述目的的產品。本發(fā)明圍繞從牛蹄炎中分離的密螺旋體的免疫原性蛋白，更具體的是重組蛋白。在第一個方面，本發(fā)明涉及分離的潰蝕齒樣密螺旋體蛋白，TmpA、Ttm和PrrA,分別具有根據SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列，涉及能夠誘導對密螺旋體的免疫應答的片段和衍生物，和涉及能夠結合由對象在針對所述蛋白的免疫應答中所產生的抗體的片段和衍生物，其如下進一步定義。在本發(fā)明的一個實施方式中，密螺旋體蛋白和其片段和衍生物是重組產生的。在一個方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的蛋白質、片段和衍生物的核酸分子。本發(fā)明還涉及所述蛋白質、其片段和衍生物在獸藥中的應用，特別是作為用于預防蹄炎的疫苗。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于預防蹄炎的獸用疫苗，其包含一或多種所述重組蛋白和/或其活性片段，和常規(guī)的和適宜的佐劑。為了得到更廣的免疫應答，該疫苗可能進一步包括或不包括其它的密螺旋體免疫原或不同的密螺旋體的全細胞裂解物。根據另一個方面，本發(fā)明還涉及一種在動物中預防蹄炎的方法，包括給有需要的動物施用所述疫苗的步驟。根據仍然另一方面，提供一種用于檢測樣品中針對密螺旋體的抗體的存在的方法，其中所述重組蛋白和/或活性片段用于檢測樣品中針對密螺旋體的抗體的存在。根據仍然另一方面，提供一種用于診斷動物中蹄炎的方法，其中所述重組蛋白和/或活性片段被用于檢測動物中針對密螺旋體的抗體的存在。在所述檢測方法或診斷方法的實施方式中，所述重組蛋白和/或活性片段用于ELISA(酶聯免疫吸附測定)方法中。在一個方面，本發(fā)明涉及針對所述免疫原性蛋白或其免疫原性衍生物或片段的抗體。這種抗體在通過被動免疫方式治療由密螺旋體所引起的疾病中是有用的，和在例如密螺旋體的免疫磁性分離的多種實驗室方法中也是有用的。附圖
簡述圖I :重組潰蝕齒樣密螺旋體菌株Vl免疫原性蛋白TmpA、Ttm和PrrA作為抗原的酶聯免疫吸附測定。用來自患有急性蹄炎(黑條)的8只奶牛、蹄炎病史未知的2只奶牛和6-7個月大的5只小牛(灰色)的血清進行該測定。綴合辣根過氧化物酶(HRP)的兔抗牛 IgG 抗體(Sigma) (A)或單克隆 22 : 26 抗牛 IgG-HRP 抗體(Svanova Biotech AB) (B)用作二抗。在450nm下測得校正的光密度值。
定義“免疫原性劑”或“免疫原”能夠在給對象施用時誘導針對自身的免疫應答，任選地與佐劑組合。如在本說明書中使用的“活性片段”或“活性衍生物”是天然免疫原性劑的片段或衍生物，其能在給對象施用時誘導針對所述天然免疫原性劑的免疫應答，任選地與佐劑組合?；钚云位蜓苌锇ɑ蚰M至少一種“表位”或“抗原決定簇”。在本說明書中使用的“結合片段”或“結合衍生物”是天然免疫原性劑的片段或衍生物，其能免疫特異性結合由對象在針對所述天然免疫原性劑的免疫應答中產生的抗體。結合片段或衍生物包括或模擬至少一種“表位”或“抗原決定簇”。蛋白質的“衍生物”可以是顯示與原始蛋白具有大量序列同源性的蛋白質。序列同源性可以是氨基酸序列中的50%或更多的相同性，如65%、80%、85%、90%、95%或99%的相同性。取代的氨基酸優(yōu)選是保守取代。取代的氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上的B和/或T細胞應答的位點。B細胞表位可以是由連續(xù)的氨基酸或由蛋白質三級折疊而并置的非連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于變性溶劑時被保留，然而由三級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時丟失。在獨特的空間構象中，一個表位通常包括至少3個氨基酸，通常更多個，至少5個或8-10個氨基酸。測定表位空間構象的方法包括，例如，X-射線晶體學和二維核磁共振。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)?？梢栽陲@示一種抗體阻斷另一種抗體與靶免疫原或其片段或衍生物的結合能力的簡單的免疫分析中鑒定識別相同表位的抗體。術語“抗體”是指完整的抗體，或其結合片段?？贵w可能包括完整的抗體分子(包括多克隆、單克隆或嵌合)或包括其抗原結合片段?？贵w片段包括F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fe和Fd片段,和可以被并入單域抗體、單鏈抗體、大抗體、微抗體、內抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、V-NAR 和雙-scFv (參見例如，Hollinger and Hudson, 2005, Naturebiotechnology,23，9，1126-1136)。序列表
權利要求
1.具有SEQID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白質，或其能夠誘導針對所述蛋白質的免疫應答的片段或衍生物，或其能夠結合由對象在針對所述蛋白質的免疫應答中產生的抗體的片段或衍生物。
2.權利要求I的蛋白質、片段或衍生物，其用于獸藥中。
3.權利要求I的蛋白質、片段或衍生物，其用于預防由密螺旋體(Treponemaspp.)引起的疾病，例如蹄炎。
4.用于治療或預防由密螺旋體引起的疾病的方法，包括給對象施用具有SEQID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白或其能夠誘導針對所述蛋白質的免疫應答的片段或衍生物。
5.權利要求4的方法，其中所述由密螺旋體引起的疾病是蹄炎。
6.藥物組合物，其包含具有SEQID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白質或其能夠誘導針對所述蛋白質的免疫應答的片段或衍生物，和任選存在的藥學上可接受的佐劑、載體和/或稀釋劑。
7.檢測樣品中針對來自密螺旋體的蛋白質的抗體存在的方法，包括以下步驟-使所述樣品接觸具有SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白質或其能夠結合由對象在針對所述蛋白質的免疫應答中產生的抗體的片段或衍生物；和-檢測結合所述蛋白質、片段或衍生物的抗體。
8.體外診斷由密螺旋體引起的疾病的方法，包括以下步驟-從對象獲取體液或組織樣品；-使所述樣品接觸具有SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白質或其能夠結合由對象在針對所述蛋白質的免疫應答中產生的抗體的片段或衍生物；和-檢測結合所述蛋白質、片段或衍生物的抗體；其中結合所述蛋白質、片段或衍生物的抗體的存在表示是由密螺旋體引起的疾病。
9.權利要求8的方法，其中所述疾病是蹄炎。
10.抗體或其結合片段，其特異性結合具有SEQID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分離的蛋白質。
11.治療或預防由密螺旋體引起的疾病的方法，其包括給對象施用權利要求10的抗體。
12.權利要求11的方法，其中所述由密螺旋體引起的疾病是蹄炎。
13.從樣品中分離密螺旋體屬細菌的方法，包括以下步驟-使所述樣品與結合至固相的權利要求10的抗體接觸；-使所述抗體結合所述密螺旋體屬細菌中的密螺旋體蛋白質；和-從所述樣品中分離所述固相，由此從所述樣品中分離所述密螺旋體屬細菌。
14.權利要求13的方法，其中所述分離是免疫磁性分離。
15.編碼權利要求I的蛋白質、片段或衍生物的核酸分子。
16.權利要求15的核酸分子，其具有SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5的核苷酸序列。
17.載體,其包含權利要求15或16的核酸分子以及任選存在的用于在宿主細胞中表達的調控序列。
18.轉基因宿主細胞，其包含權利要求17的載體。
19.用于產生權利要求I的蛋白質、片段或衍生物的方法，包括以下步驟-在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求18的宿主細胞；和-從所述培養(yǎng)基中分離所述蛋白質、片段或衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質和/或其片段和衍生物及它們在疫苗和生物技術方法中的應用。該疫苗特別包括從牛蹄炎分離出的密螺旋體的免疫原性蛋白質。本發(fā)明進一步涉及針對所述蛋白質或其片段的抗體，和所述蛋白質在診斷方法中的應用，其中檢測所述抗體作為牛蹄炎的標志。
文檔編號C07K14/20GK102918053SQ201180007747
公開日2013年2月6日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權日2010年1月28日
發(fā)明者A·羅桑德, M·普林格爾 申請人:A·羅桑德, M·普林格爾