專利名稱：蛋白酶針對(duì)谷蛋白不耐受的用途的制作方法
蛋白酶針對(duì)谷蛋白不耐受的用途相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2010年2月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/300，726的優(yōu)先權(quán)和來(lái)自其中的權(quán)益，所述文獻(xiàn)因而通過(guò)引用的方式完整并入。
背景技術(shù)：
谷蛋白是ー種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其存在于某些禾草相關(guān)的穎果中，包括小麥、大麥和黒麥。谷蛋白是包含麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的蛋白質(zhì)的混合物。已經(jīng)將ー種在人類消化系統(tǒng)中不消化的源自α-2麥醇溶蛋白的33聚肽(殘基57-89)鑒定為例如乳糜瀉病中針對(duì)谷蛋白的炎癥反應(yīng)的引發(fā)物。這種33聚源自α-2麥醇溶蛋白特別富含脯氨酸殘基和谷氨酰胺殘基。它在易感受試者中刺激T-細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致?lián)p傷腸壁的炎癥。這轉(zhuǎn)而損害腸吸收養(yǎng)分的能力，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良和多種其他癥狀。 谷蛋白不耐受或谷蛋白敏感是包括全部類型的谷蛋白敏感的統(tǒng)稱。小比例的谷蛋白不耐受人群將檢驗(yàn)呈乳糜瀉病陽(yáng)性。乳糜瀉病的標(biāo)準(zhǔn)診斷是十二指腸活組織檢查樣品中檢測(cè)到的絨毛萎縮。此外，針對(duì)組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)和麥醇溶蛋白的抗體出現(xiàn)在幾乎100%的活動(dòng)性乳糜瀉病患者中，并且此類抗體(尤其IgA類)的存在已經(jīng)用于本病的診斷中。大部分乳糜瀉患者表達(dá)HLA-DQ2[DQA1*0501、DQB1*02]和/或DQ8[DQA1*0301、DQB1*0302]分子。乳糜瀉病的臨床癥狀包括，例如，乏力、慢性腹瀉、養(yǎng)分吸收不良、體重減輕、腹脹、貧血以及大幅度増加的發(fā)生骨質(zhì)疏松癥和腸道惡性腫瘤(淋巴瘤和癌瘤)的風(fēng)險(xiǎn)。然而，大部分谷蛋白不耐受或谷蛋白敏感的人群檢驗(yàn)呈乳糜瀉病陰性(或不確定)。至多到大約15%的群體(或7個(gè)人中有I個(gè))是非乳糜瀉谷蛋白敏感的或非乳糜瀉谷蛋白不耐受的。這些受試者是非乳糜瀉谷蛋白敏感的或非乳糜瀉谷蛋白不耐受的，在于他們?cè)庥雠c不符合乳糜瀉病診斷標(biāo)準(zhǔn)的乳糜瀉疾病患者相似的癥狀和疾病。因而，非乳糜瀉谷蛋白敏感(“NCGS”)、非乳糜瀉谷蛋白不耐受(“NCGI”)或谷蛋白相關(guān)疾病(“GRD”)指ー種病狀或病癥，其中個(gè)體遭遇與乳糜瀉病人十分相似的癥狀，但是鑒定和診斷乳糜瀉病的診斷檢驗(yàn)(包括血液檢驗(yàn))是陰性或不確定的。因而，多達(dá)15%的美國(guó)人(或7個(gè)人中有I個(gè))可能患有NCGS。另外，在美國(guó)15-30百萬(wàn)人購(gòu)買無(wú)谷蛋白產(chǎn)品，出于多種原因意圖減少谷蛋白暴露。美國(guó)專利號(hào)7，320，788 ( “Shan”)已經(jīng)提出給藥叫做“谷蛋白酶”的某些酶至乳糜 與或抱疫樣皮炎患者。根據(jù)Shan,谷蛋白酶包括小麥、大麥和黑麥中存在的內(nèi)切蛋白酶，如來(lái)自大麥(Hordeum vulgare)的內(nèi)切蛋白酶；脯氨酰內(nèi)肽酶(“PEP”)和尤其來(lái)自腦膜炎胺毒性黃桿菌(Flavobacterium meningoscepticum) (Genbank ID#D10980)和黃色粘球菌(Myxococcus xanthus) (Genbank ID#AF127082)的 PEP ;和催化ニ妝移除的刷狀緣酶，包括ニ肽基肽酶IV和ニ肽基羧肽酶。Shan還提到來(lái)自米曲霉(Aspergillusoryzae) (GenBank ID#BD191984)的 X-Pro ニ妝酶和來(lái)自佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)(GenBank ID#D25288)的羧肽酶可以在乳糜瀉腸中改善谷蛋白消化。Shan教導(dǎo)了寡肽如GIy-Prο-ρΝΑ,Z-GIy-Pro-pNA和Hip-His-Leu可以用來(lái)確定候選酶是否將消化有毒的谷蛋白寡肽。實(shí)際上，Shan教導(dǎo)了 PEP酶的劑量由水解I微摩爾Z-Gly-Ρ -ρΝΑ所要求的這種酶的量決定。美國(guó)專利號(hào)7，534，426 ( “Piper”)涉及通過(guò)檢測(cè)候選酶消化一種或多種所選擇寡肽的能力而確定候選谷蛋白酶的治療性效能的方法。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2008/0213245( “Hausch”)涉及食品原料的酶處理并且也提到使用有毒寡肽鑒定活性谷蛋白酶的篩選方法。如同Shan，Piper和Hausch均提到用于治療乳糜灣Sprue和/或皰疫樣皮炎的PEP并且教導(dǎo)了寡肽Z-Gly-Pro-pNA可以用來(lái)確定候選酶是否將消化有毒的谷蛋白寡肽。美國(guó)專利號(hào)7，462，688 ( “Khosla”)涉及了用于通過(guò)檢測(cè)有毒谷蛋白寡肽或?qū)ζ溆蟹磻?yīng)的T細(xì)胞和/或抗體診斷乳糜瀉病和/或皰疹樣皮炎的方法。Kholsa提出通過(guò)給藥干擾有毒谷蛋白寡肽與T細(xì)胞和/或人類白細(xì)胞抗原(HLA)分子結(jié)合的肽而治療此類患者。國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 2005/027953( “Edens”)涉及用于肽或多肽的蛋白酶水解的方法，并且提到使用脯氨酸特異性內(nèi)肽酶，如來(lái)自曲霉屬(Aspergillus)物種的PEP，以產(chǎn)生缺少乳糜瀉相關(guān)表位的食品。同樣，美國(guó)專利號(hào)7，563，864( “Marti”)提到ー種使用 胃蛋白酶、胰蛋白酶/木瓜凝乳蛋白酶、弾性蛋白酶、羧肽酶A、PEP，和大鼠刷狀緣膜酶類脫毒谷蛋白的體外蛋白酶水解操作方案。Rizello等人(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(Appliedand Environmental Microbiology), 2007 年 7 月，第 4499-4507 頁(yè))使用乳桿菌和米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶的組合(由伯樂(lè)(BIO-CAT)供應(yīng))以在食品加工期間降低谷蛋白濃度。Doumas等人(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(Applied and EnvironmentalMicrobiology)，1998年12月，第4809-4815頁(yè))提供了米曲霉脯氨酰ニ肽基肽酶(DPPIV)的序列并且提出這種DPPIV酶可以在小麥谷蛋白底物的エ業(yè)水解方面是重要的。Ehren等人(PLoS ONE 4(7) e6313)討論了具有適度谷蛋白脫毒特性的食品級(jí)酶制備物。Ehren等人指出來(lái)自黑曲霉的曲霉胃蛋白酶明顯增強(qiáng)谷蛋白消化作用。Ehren等人使用來(lái)自含有外肽酶DPPIV的米曲霉中的肽酶P以增進(jìn)ASP水解谷蛋白的程度。Ehren等人教導(dǎo)了単獨(dú)的DPPIV不能使谷蛋白寡肽(包括來(lái)自α2-麥醇溶蛋白的合成性33聚物或來(lái)自Y5-麥醇溶蛋白的26聚物)脫毒，并且DPPIV在低pH是無(wú)效的，并且因此在體內(nèi)在抗酸輔助劑不存在時(shí)將不是有效的?！肮鹊鞍撞荒褪苤械磨矸竟系鞍酌浮?“Messer等人”)指出用ロ服木瓜蛋白酶治療認(rèn)為患有乳糜瀉疾病的患者導(dǎo)致所述患者能夠消費(fèi)含谷蛋白膳食，而無(wú)乳糜瀉疾病的其他癥狀。澳大利亞專利申請(qǐng)?zhí)?008100719 (“Cornell和Stelmasiak”)提到用于預(yù)防或治療乳糜瀉病的組合物和方法。Cornell等人提到了包含番木瓜樹(shù)脂提取物或其功能性類似物的組合物和方法?！澳軌蚴果湸既艿鞍酌摱镜姆竟夏z乳酶”(“Cornell等人”)提到番木瓜的活性主要?dú)w因于木瓜蛋白酶Ω (caricain)并且較次要程度地歸因于木瓜凝乳蛋白酶和谷氨酰胺環(huán)化轉(zhuǎn)移酶。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明技術(shù)的某些實(shí)施方案提供ー種酶混合物，其包含谷蛋白降解酶制備物和木瓜蛋白酶。本發(fā)明技術(shù)的酶混合物能夠切割谷蛋白寡肽，如α-麥醇溶蛋白的33聚肽片段。這種酶混合物可以包含激活的木瓜蛋白酶。例如，木瓜蛋白酶可以由還原劑激活?？梢詫⑦@種酶混合物配制用于ロ服遞送和/或包含于含有腸衣的制劑中?？梢詫⑦@種酶混合物包含于包含藥學(xué)上可接受載體如固體、膠囊或液體的制劑中。本發(fā)明技術(shù)的某些實(shí)施方案提供ー種酶混合物，其包含谷蛋白降解酶制備物和具有與奧森(Aorsin)或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酸性絲氨酸蛋白酶多肽。本發(fā)明技術(shù)的酶混合物能夠切割谷蛋白寡肽，如α-麥醇溶蛋白的33聚肽片段。所述酶混合物還可以包含木瓜蛋白酶(包括激活的木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和/或純化的木瓜蛋白酶)、羧肽酶Y(“CPY”)和/或具有與CPY或其片段同源至少約90%的氨基酸序列的酶。CPY 可以是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CPY、黑曲霉(Aspergillus niger) CPY>粟酒裂通酵母(Schizosaccharomyces pombe)CPY、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)CPY。所述酶混合物可以在藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制?？梢詫⑦@種酶混合物配制用于ロ服遞送和/或包含于含有腸衣的制劑中?？梢詫⑦@種酶混合物包含于包含藥學(xué)上可接受載體如固體、膠囊或液體的制劑中。本發(fā)明技術(shù)的某些實(shí)施方案提供了一種用于減少谷蛋白暴露或治療谷蛋白不耐受的制劑，所述制劑包含能夠?qū)⒚庖咴怨鹊鞍坠央脑隗w外切割成無(wú)毒片段的酶組合物。這種酶組合物可以包含谷蛋白降解酶制備物；木瓜蛋白酶(包括激活的木瓜蛋白酶、木瓜 凝乳蛋白酶和/或純化的木瓜蛋白酶)；奧森(Aorsin);具有與Aorsin或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酸性絲氨酸蛋白酶多肽；CPY ;具有與CPY至少約80%的氨基酸序列的酶；來(lái)自蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶；和/或來(lái)自桔青霉的制備物。該制劑可以是能夠在體外將至少約70%、至少約80%或至少約90%的免疫原性谷蛋白寡肽切割成無(wú)毒片段。該制劑可以包含藥學(xué)上可接受載體，如固體、膠囊或液體。本發(fā)明技術(shù)的某些實(shí)施方案提供一種用于減少谷蛋白暴露或治療谷蛋白不耐受的制劑。該制劑能夠在體外胃腸模型中消化谷蛋白寡肽并且含至少兩種酶組合物。這些酶組合物可以是谷蛋白降解酶制備物；木瓜蛋白酶(包括激活的木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和/或純化的木瓜蛋白酶)；Aorsin ;具有與Aorsin或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酸性絲氨酸蛋白酶多肽；羧肽酶Y(CPY);具有與CPY至少約80%的氨基酸序列的酶；來(lái)自蜂蜜曲霉的蛋白酶；和/或來(lái)自桔青霉的制備物。體外胃腸模型可以包括將所述酶組合物與谷蛋白寡肽在模擬的胃液中在約37°C孵育持續(xù)一段代表體內(nèi)與胃液接觸的時(shí)間和/或?qū)⑺雒附M合物與谷蛋白寡肽在模擬的腸液中在約37°C孵育持續(xù)一段代表體內(nèi)與腸液接觸的時(shí)間。模擬的胃液可以包含胃粘膜粘蛋白、胃蛋白酶、明膠酶、淀粉酶和/或脂肪酶。模擬的腸液可以包含一種或多種胰酶和ー種膽鹽。胰酶可以是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和/或脂肪酶。所述谷蛋白寡肽可以是α-麥醇溶蛋白的33聚肽片段，如具有氨基酸序列 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO 1)的肽。本發(fā)明技術(shù)的某些實(shí)施方案提供了在人類受試者中治療谷蛋白不耐受的方法，該方法包括向受試者提供治療有效量的能夠在酸性條件切割谷蛋白寡肽的酶混合物。這種酶混合物可以包含谷蛋白降解酶制備物；木瓜蛋白酶(包括激活的木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和/或純化的木瓜蛋白酶);Aorsin ;具有與Aorsin或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酸性絲氨酸蛋白酶多肽；CPY ;具有與CPY至少約80%的氨基酸序列的酶；來(lái)自蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶；和/或來(lái)自桔青霉的制備物。所述酶混合物可以包含源自米曲霉的組合物。所述酶混合物可以在藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制?？梢詫⑦@種酶混合物配制用于ロ服遞送和/或包含于含有腸衣的制劑中?？梢詫⑦@種酶混合物包含于包含藥學(xué)上可接受載體如固體、膠囊或液體的制劑中。本發(fā)明技術(shù)的某些實(shí)施方案提供了在人類受試者中減少谷蛋白暴露的方法，該方法包括向受試者提供能夠在酸性條件切割谷蛋白寡肽的酶混合物。這種酶混合物可以包含谷蛋白降解酶制備物；木瓜蛋白酶(包括激活的木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和/或純化的木瓜蛋白酶);Aorsin ;具有與Aorsin或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酸性絲氨酸蛋白酶多肽；CPY ;具有與CPY至少約80%的氨基酸序列的酶；來(lái)自蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶；和/或來(lái)自桔青霉(Penicillium citrinum)的制備物。所述酶混合物可以包含源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的組合物。所述酶混合物可以在藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制?？梢詫⑦@種酶混合物配制用于ロ服遞送和/或包含于含有腸衣的制劑中。可以將這種酶混合物包含于包含藥學(xué)上可接受載體如固體、膠囊或液體的制劑中。本發(fā)明技術(shù)的某些實(shí)施方案提供了評(píng)估酶組合物的效能的方法，所述方法包括步驟(i)將包含候選酶組合物和谷蛋白寡肽的混合物在模擬的胃液中在約37°C孵育持續(xù)ー 段代表體內(nèi)與胃液接觸的時(shí)間；(ii)添加酸中和物質(zhì)至所述混合物；(iii)將所述混合物在模擬的腸液中在約37°C孵育持續(xù)一段代表體內(nèi)與腸液接觸的時(shí)間；并且確定完整谷蛋白寡肽在混合物中的量。代表體內(nèi)與胃液接觸的時(shí)間可以是約120分鐘。代表體內(nèi)與腸液接觸的時(shí)間可以是約60分鐘。模擬的胃液可以包含胃粘膜粘蛋白、胃蛋白酶、明膠酶、淀粉酶和脂肪酶。模擬的腸液包含一種或多種胰酶和ー種膽鹽。胰酶可以是胰蛋白酶、膜凝乳蛋白酶、淀粉酶和/或脂肪酶。所述谷蛋白寡肽可以是α-麥醇溶蛋白的33聚肽片段，如具有氨基酸序列 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:I)的肽。


圖I顯示由⑶EP-LGG在多個(gè)劑量和時(shí)間對(duì)33聚肽的降解(如通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)。圖2顯示由谷蛋白降解酶制備物及其單個(gè)組分酶水稻素NP I和NP II對(duì)33聚肽的降解(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)。圖3顯示由谷蛋白降解酶制備物及其單個(gè)組分酶水稻素NP I和NP II以及其多種組合對(duì)33聚肽的降解(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)。圖4顯示在用胃蛋白酶(圖4Α)、蛋白酶K(圖4Β)和⑶EP-LGG(圖4C)處理后，33聚肽的采用280nm和210nm(小圖(panel) I和2)的HPLC分析和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖5顯示在用谷蛋白降解酶制備物(圖5A)和其他曲霉蛋白酶GDEP_2A(圖5B)、⑶EP-LNA (圖5C)、⑶EP-M (圖5D)和蛋白酶P (圖5E)處理后，33聚肽的采用280nm和2IOnm (小圖I和2)的HPLC分析和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖6顯示用⑶EP-M在范圍從3. O至6. O的pH(圖6A-6D，6H)和用⑶EP-LGG在范圍從4. O至6. O的pH(圖6E-6G)處理后，33聚肽的采用280nm和210nm(小圖I和2)的HPLC分析和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖7顯示用⑶EP-LGG單獨(dú)處理(圖7A)和用⑶EP-LGG在PMSF(圖7B)、胃蛋白酶抑制劑(圖7C)和EDTA(圖7D)存在下處理后，33聚肽的采用280nm和210nm(小圖I和2)的HPLC分析和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖7還顯示用⑶EP-M單獨(dú)處理(圖7E)和用GDEP-LGG在苯甲基磺酰氟化物(PMSF)(圖7F)、胃蛋白酶抑制劑(圖7G)和こニ胺四こ酸(EDTA)(圖7H)存在下處理后，33聚肽的高效液相色譜(HPLC)分析(小圖I和2)和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖8顯示在用多個(gè)量的Aorsin A(圖8A-8D)和Aorsin B(圖8E-8H)處理后，33聚肽的采用280nm和210nm(小圖I和2)的HPLC分析和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖9顯示由Aorsin對(duì)33聚肽的降解(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)。圖10顯示用羧肽酶Y(“CPY”)在范圍從4. O至7. O的pH(圖IOA-1OD)和用黃色粘球菌脯氨酰內(nèi)肽酶(“MX-PEP”)在范圍從4. O至7. O的pH(圖10E-10H)處理后，33聚肽的采用280nm和210nm(小圖I和2)的HPLC分析和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖11顯示在用多個(gè)量的CPY (圖11A-11D)、MX-PEP (圖11E-11H)和黑曲霉脯氨酰 內(nèi)肽酶(“ΑΝ-PEP”)(圖11I-11L)處理后，33聚肽的HPLC分析(小圖I和2)和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖11還顯示在用CPY (圖11M-11P)、MX_PEP (圖11Q-11T)和AN-PEP (圖IIU-IIV)處理后，33聚肽的HPLC分析(小圖I和2)和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖12顯示由CPY和脯氨酰內(nèi)肽酶MX-PEP和AN-PEP對(duì)33聚肽的降解(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)(圖12A)。圖12還顯示由⑶EP-LGG和CPY對(duì)33聚肽的降解(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)(圖12B)。圖12還顯示由AN-PEP對(duì)33聚肽的降解(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)(圖12C)。圖13顯示在體外胃腸模型中由⑶EP-LGG對(duì)小麥麥醇溶蛋白和33聚肽的降解(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)。圖14顯示在體外胃腸模型中用單獨(dú)的消化酶⑶EP-M(圖14A)、CPY(圖14B)、⑶EP-M(圖14C)和CPY與⑶EP-M組合(圖14D)處理后，33聚肽的HPLC分析(小圖I和2)和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖15顯示在體外胃腸模型中由CPY和⑶EP-M對(duì)小麥麥醇溶蛋白和33聚肽的降解(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)。圖16顯示在體外胃腸模型中用⑶EP-LGG (圖16A)、CPY (圖16B)和⑶EP-LGG與CPY組合(圖16C)處理后，33聚肽的HPLC分析(小圖I和2)和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖17顯示分級(jí)的⑶EP-LGG的蛋白質(zhì)濃度(A280)、33聚肽降解活性、脯氨酰內(nèi)肽酶活性和蛋白酶活性。圖18顯示在通過(guò)ELISA分析采用酶量變動(dòng)的CPY和AN-PEP (圖18A)、⑶EP-M和GDEP-LGG (圖 18B)、Aorsin A 和 AorsinB (圖 18C)、GDEP-M 與ー些肽酶組合(圖 18D)和⑶EP-LGG與⑶EP-M組合(圖18E)消化谷蛋白后的殘余率比較結(jié)果。圖19顯示了以多個(gè)劑量(50mg、100mg、200mg和400mg)的⑶EP-LGG降解來(lái)自33聚肽商業(yè)制備物(圖19A)、意大利餃(圖19B)、乳酪通心粉(圖19C)、白面包(圖19D)和面包卷(圖19E)中的33聚肽(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)。圖20顯示了以多個(gè)劑量(50mg、lOOmg、200mg和400mg)的⑶EP-LGG和⑶EP-M降解來(lái)自意大利餃(圖20A)、通心粉(圖20B)、白面包(圖20C)、面包卷(圖20D)、烤寬面條(圖20E)和意大利面條(圖20F)中的33聚肽(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)。圖21顯示了由三個(gè)批次⑶EP-LGG和三種現(xiàn)存產(chǎn)品(“谷蛋白蓋斯特(GlutenGest)”、“谷蛋白酶(Gluten-zyme) ”和“谷蛋白易(GlutenEase^)降解33聚肽(如通過(guò)ELISA測(cè)量完整33聚肽的水平所評(píng)估)的殘余率的比較，以及在整個(gè)反應(yīng)期間的多個(gè)時(shí)間由HPLC-MS分析現(xiàn)存產(chǎn)品(“Gluten Gest”、“光譜酶(Spectrumzyme) ”、“谷蛋白酶正型(Gluten-zyme Plus) ”、“Gluten-zyme”和“GlutenEase”)、胃蛋白酶、33 聚對(duì)照和谷蛋白降解酶制備物后的色譜圖。圖22顯示在用木瓜蛋白酶處理后，33聚肽的HPLC分析(小圖I和2)和質(zhì)譜分析(小圖3)的色譜圖。圖23顯示用源自陽(yáng)離子交換層析的木瓜蛋白酶級(jí)分處理后，陽(yáng)離子交換分析木瓜蛋白酶和質(zhì)譜分析33聚肽的色譜圖。 圖24顯示通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分級(jí)后，木瓜蛋白酶的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠。圖25顯示通過(guò)陽(yáng)離子交換層析純化后，HPLC分析來(lái)自木瓜蛋白酶的峰2級(jí)分(圖25A)和峰3(圖25B)級(jí)分的色譜圖。圖26顯示通過(guò)陽(yáng)離子交換層析，接著進(jìn)ー步疏水相互作用層析(圖26A)和熒光共振能量轉(zhuǎn)換(FRETS)分析(圖26B)后，木瓜蛋白酶純化的E9級(jí)分的HPLC分析色譜圖。圖27顯示用所得到的級(jí)分處理后的33聚肽的FRETS分析和質(zhì)譜分析色譜圖。圖28顯示反相色譜的峰3-1 (圖28A)、峰3_2 (圖28B)和峰3 (圖28C)的HPLC分析色譜圖。圖29顯示在通過(guò)ELISA分析后木瓜蛋白酶和其他酶的殘余率比較。圖30顯示采用還原劑(谷胱甘肽、ニ硫蘇糖醇、L-半胱氨酸或N-こ酰-L-半胱氨酸)時(shí)木瓜蛋白酶和GDEP-LGG的蛋白酶活性和水解活性。圖31顯示以多個(gè)濃度包含DEP-LGG和木瓜蛋白酶的酶混合物的相對(duì)活性(圖31A)和每個(gè)濃度的HPLC分析色譜圖(圖31B-31G)。圖32顯示使用一組六聚物針對(duì)多種組合物的FRETS分析篩選法的結(jié)果。圖33顯示了選自FRETS分析篩選法的組合物的水解活性的HPLC分析色譜圖(圖32)。發(fā)明詳述本發(fā)明技術(shù)總體上涉及酶組合物。這種酶組合物可以用來(lái)治療谷蛋白不耐受的和/或谷蛋白敏感受試者，包括患有非乳糜 與谷蛋白敏感(“NCGS”)和/或非乳糜 與谷蛋白不耐受(“NCGI”)的受試者。所述酶組合物也可以用來(lái)減少某些個(gè)體中的谷蛋白暴露。例如，該酶組合物也可以用作預(yù)防藥以減少或阻止對(duì)谷蛋白寡肽(如源自α-2麥醇溶蛋白的33聚肽)的暴露，以限制、減少、阻止或控制谷蛋白不耐受和/或谷蛋白不敏感的發(fā)展。α -麥醇溶蛋白的 33 聚肽片段 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO 1 通過(guò)胃酶和胰酶消化天然地形成并且抵抗消化酶的進(jìn)一歩降解。多種食品和飲料包括谷蛋白寡肽，如源自α-2麥醇溶蛋白的33聚肽。對(duì)谷蛋白肽(包括源自α _2麥醇溶蛋白的33聚肽)的消化提供生理益處，如減少暴露于谷蛋白和谷蛋白相關(guān)肽。這可能特別有益于未能有效或高效水解谷蛋白的群體或特定個(gè)體(包括人或動(dòng)物主體)(例如，其消化系統(tǒng)缺少為有效或高效水解谷蛋白和/或谷蛋白相關(guān)肽所需要的酶活性)和有益于需要減少暴露于谷蛋白和谷蛋白相關(guān)肽的個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物是營(yíng)養(yǎng)藥。術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)藥”已經(jīng)用來(lái)指意在或合理預(yù)期為被攝取并且可以提供醫(yī)學(xué)或健康益處的任何食品或物質(zhì)，所述益處包括預(yù)防和/或治療NCGS和/或NCGI和/或相關(guān)的癥狀，包括，但不限于腹痛、胃脹、腸不適、腹瀉、腸胃脹氣和養(yǎng)分吸收不良。屬于標(biāo)簽“營(yíng)養(yǎng)藥”下的組合物可以范圍從分離的養(yǎng)分、膳食補(bǔ)充劑和酶組合物至基因修飾設(shè)計(jì)食品、草藥產(chǎn)品和加工食品如谷類食品、湯和飲料。在更為技術(shù)的意義上，術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)藥”指通常以醫(yī)學(xué)形式出售并且經(jīng)證實(shí)具有生理益處(例如是改善、治療、防止、減低急性或慢性疾病、病癥或其他癥狀的發(fā)病率或提供針對(duì)性保護(hù)作用)的可攝取食品。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的ー種或多種酶組合物可以用來(lái)治療適合通過(guò)預(yù)防和/或減少谷蛋白暴露而治療的任何疾病，包括，例如乳糜瀉病、甲狀腺病，如甲狀腺功 能減退癥和神經(jīng)學(xué)疾病，如孤獨(dú)癥、小腦性共濟(jì)失調(diào)、周圍神經(jīng)病和精神分裂癥。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以包含任何酶或酶的混合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物的酶是減少蛋白質(zhì)的酶，包括，例如，蛋白酶和肽酶如外切蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶和酸穩(wěn)定性蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，酶組合物可以包括蛋白酶。通常，蛋白酶是斷開(kāi)蛋白質(zhì)的氨基酸之間肽鍵的酶。合適的酶亞類包括源自米曲霉的酶。例如，酶組合物可以包含谷蛋白降解酶制備物、木瓜蛋白酶、純化的木瓜蛋白酶、激活的木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶或其組合。酶組合物也可以包括羧肽酶，如羧肽酶Y(“CPY”)。酶組合物也可以包括半堿性蛋白酶。制備物也可以包括來(lái)自桔青霉的制備物。本發(fā)明技術(shù)的酶組合物是有用的，例如，用于谷蛋白不耐受的治療中，和用于減少暴露于谷蛋白寡肽，包括源自α-2麥醇溶蛋白的33聚。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“谷蛋白降解酶制備物”(“GDEP”)用來(lái)指含有至少水稻素(Oryzin)、中性蛋白酶I ( “ΝΡΙ”)和中性蛋白酶II ( “ΝΡΙΙ”)的酶制備物。由亮氨酰-甘氨酰-甘氨酸(“LGG” )方法確定在中性pH具有不少于約70單位/g肽酶活性的GDEP在本文中稱作“ GDEP-LGG”。由亮氨酰萘酰胺(“LNA”)方法確定在中性PH具有不少于約1，400u/g肽酶活性的GDEP在本文中稱作“GDEP-LNA”。在酸性pH具有不少于約5，500單位/g蛋白酶活性的GDEP在本文中稱作“GDEP-Μ”。在中性pH具有不少于約20，000單位/g蛋白酶活性的⑶EP在本文中稱作“⑶EP-2A”。在中性pH具有不少于約10，000單位/g蛋白酶活性的⑶EP在本文中稱作“⑶EP-AH”。在一個(gè)實(shí)施方案中，⑶EP-LGG是源自酒曲霉(Koji mold)(米曲霉)的肽酶制備物。通過(guò)使米曲霉經(jīng)歷誘變過(guò)程(包括UV誘變)衍生出谷蛋白降解酶制備物生產(chǎn)菌株。例如，含有米曲霉的黃酒曲霉經(jīng)歷UV誘變以產(chǎn)生“A菌株”，所述A菌株經(jīng)歷UV誘變以產(chǎn)生90-76，其具有約500-600u/g的蛋白酶水解活性。90-76菌株進(jìn)一步經(jīng)歷UV誘變以產(chǎn)生具有約800-1000u/g的蛋白酶水解活性的90-51菌株。在UV誘變后，進(jìn)行單孢子分離(M. S. I.)以在培養(yǎng)基平板上獲得單菌落。這個(gè)過(guò)程產(chǎn)生谷蛋白降解酶制備物生產(chǎn)菌株。谷蛋白降解酶制備物生產(chǎn)菌株的蛋白酶水解活性約兩倍于親本菌株。示例性⑶EP-LGG組合物在pH約7. O具有不少于約70u/g肽酶活性。⑶EP-LGG可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從米曲霉獲得，并且在使用之前稀釋或濃縮。GDEP-LGG的制備物可以通過(guò)噴霧干燥獲得以避免肽酶的失活。生產(chǎn)エ藝包括，例如，固態(tài)發(fā)酵，隨后水提取、過(guò)濾、超濾并且最后噴霧干燥。在本發(fā)明技術(shù)的至少一些實(shí)施方案中，⑶EP-LGG在Gin、Ser> Thr、Met、Arg、Ala、Lys, Phe和Leu.的羧基側(cè)切割。如通過(guò)評(píng)估針對(duì)底物Z-Gly-Pro-pNA的活性所確定，⑶EP-LGG沒(méi)有脯氨酰-內(nèi)肽酶活性。然而，⑶EP-LGG部分地水解33聚肽并且甚至在酸性PH仍有效。使用33聚肽作為底物，谷蛋白降解酶制備物消化大約90%的33聚物。在體外胃腸模型中，與不添加酶時(shí)存在的33聚物水平(對(duì)照)相比，200mg谷蛋白降解酶制備物消化大約80%來(lái)自IOg小麥谷蛋白的33聚物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶的常見(jiàn)商業(yè)制備物是作為木瓜蛋白酶W-40散裝物可商業(yè)獲得的。這種商業(yè)制備物可以按給定的濃度使用，或可以將這種商業(yè)制備物稀釋或濃縮使用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含純化的木瓜蛋白酶。純化方法包 括陽(yáng)離子交換層析和疏水相互作用層析。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含木瓜凝乳蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物含木瓜蛋白酶。例如，木瓜蛋白酶可以由還原劑激活。用于本發(fā)明技術(shù)中的合適還原劑包括，但不限于谷胱甘肽、ニ硫蘇糖醇(“DTT”)、L-半胱氨酸和N-こ酰-L-半胱氨酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物是酶或酶組合物的混合物。在某些實(shí)施方案中，該混合物的組分具有添加物。在某些其他實(shí)施方案中，混合物的各個(gè)組分具有協(xié)同效應(yīng)，例如，包含谷蛋白降解酶制備物和木瓜蛋白酶的混合物的酶組合物對(duì)于33聚肽降解作用具有出乎意料的協(xié)同效應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含⑶EP-M。⑶EP-M可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從米曲霉獲得，并且在使用之前稀釋或濃縮。GDEP-LGG的制備物可以通過(guò)噴霧干燥或通過(guò)こ醇沉淀獲得。與こ醇沉淀的蛋白酶活性相比，噴霧干燥產(chǎn)生更多的肽酶活性。在某些實(shí)施方案中，所用的⑶EP-M在pH約3. O具有不少于約5，500u/g的蛋白酶活性。這種制備物可以按給定的濃度使用，或可以將這種制備物稀釋或濃縮使用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含⑶EP-2A。⑶EP-2A可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從米曲霉獲得，并且在使用之前稀釋或濃縮。GDEP-2A的制備物可以通過(guò)噴霧干燥或通過(guò)こ醇沉淀獲得。與こ醇沉淀的蛋白酶活性相比，噴霧干燥產(chǎn)生更多的肽酶活性。在某些實(shí)施方案中，所用的⑶EP-2A在pH約7. O具有不少于約20，000u/g的蛋白酶活性。這種制備物可以按給定的濃度使用，或可以將這種制備物稀釋或濃縮使用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含⑶EP-AH。⑶EP-AH可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從米曲霉獲得，并且在使用之前稀釋或濃縮。GDEP-AH的制備物可以通過(guò)噴霧干燥獲得。在某些實(shí)施方案中，所用的⑶EP-AH在pH約7. O具有不少于約10，000u/g的蛋白酶活性。這種制備物可以按給定的濃度使用，或可以將這種制備物稀釋或濃縮使用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含⑶EP-LNA。⑶EP—LNA可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從米曲霉獲得，并且在使用之前稀釋或濃縮。GDEP-LNA的制備物可以通過(guò)噴霧干燥獲得。在某些實(shí)施方案中，GDEP-LNA具有亮氨酰萘酰胺(“LNA”)方法確定的在pH約7. O不少于約1，400u/g肽酶活性。這種制備物可以按給定的濃度使用，或可以將這種制備物稀釋或濃縮使用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含⑶EP-M的特定蛋白酶組分。例如，奧森(Aorsin)是從GDEP-M純化的在酸性pH具有胰蛋白酶樣特異性的絲氨酸蛋白酶。Aorsin A和Aorsin B在日本專利號(hào)JP4401555和JP2009-232835A中表征，所述專利的每一份通過(guò)引用方式完整并入。Aorsin在酸性pH高效地水解33聚肽。Aorsin的核苷酸和氨基酸序列在Lee等人,Biochem. J. 371 (PT 2), 541-548 (2003)公布。Aorsin A的核苷酸序列具有GenBank登錄號(hào)AB084899. 1，并且相應(yīng)的氨基酸序列具有GenBank登錄號(hào)BAB97387。Aorsin B的核苷酸序列具有GenBank登錄號(hào)XM 001820783. 1，并且相應(yīng)的氨基酸序列具有基因庫(kù) GenBank 登錄號(hào) ΧΡ_001820835· I。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含ー種酶,所述酶具有Aorsin的氨基酸序列或與Aorsin的氨基酸序列具有至少約70%同一性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述氨基酸可以與Aorsin的氨基酸序列具有至少約80%、至少約81 %、至少約82%、 至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87 %、至少約88 %、至少約89%、至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%同一性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含ー種酶，所述酶具有與Aorsin基本上同源的氨基酸序列。當(dāng)兩個(gè)氨基酸序列中至少約80 %、至少約81 %、至少約82 %、至少約83 %、至少約84 %、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%、或至少約99%的氨基酸是相同的；或至少約80%、至少約81%、至少約82 %、至少約83 %、至少約84 %、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%的氨基酸是相似的以至于它們?cè)诠δ苌舷嗤瑫r(shí)，則這兩個(gè)氨基酸序列是“基本上同源的”?？梢允褂美鏕CG(遺傳計(jì)算機(jī)組(Genetics Computer Group), GCG軟件包程序手冊(cè)·, 7版,麥迪遜(Madison),威斯康辛(Wisconsin))堆疊(pileup)程序或序列比較算法如BLAST或FASTA中的任一者,通過(guò)比對(duì)而鑒定同源序列。本發(fā)明技術(shù)還包括酶組合物顯示與⑶EP-M相似的酶活性譜。例如，在某些實(shí)施方案中，酶組合物顯示約4，000至約8，000u/g的蛋白酶活性。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，這種組合物具有包含蛋白酶活性約6，500u/g的酶活性譜。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含CPY，，也稱作蛋白酶C或yscY。CPY是ー種廣特異性液泡外肽酶，其從蛋白質(zhì)和肽的羧基端移除氨基酸。它屬于絲氨酸羧肽酶家族，這些絲氨酸羧肽酶是以其活性部位周圍高度保守且催化必需的絲氨酸和組氨酸殘基為特征的泛在蛋白裂解酶。在本發(fā)明技術(shù)中有用的CPY可以是來(lái)自例如酵母或真菌如酵母、裂殖酵母、曲霉、假絲酵母和畢赤酵母的CPY。例如，本發(fā)明技術(shù)中所用的CPY在氨基酸水平與以下CPY之一具有至少約20%序列同一性，備選地至少約40%序列同一性、備選地至少約50%序列同一』丨生、備選地至少約60%序列同一』丨生、備選地至少約70%序列同一'注、備選地至少約80%序列同一性、備選地至少約90%序列同一』注釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CPY、黑曲霉(Aspergillus niger)CPY、粟酒裂通酵母CPY、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)CPY0在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含ー種酶，所述酶具有CPY的氨基酸序列或與CPY的氨基酸序列具有至少約70%同一性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述氨基酸可以與CPY的氨基酸序列具有至少約80%、至少約81 %、至少約82%、至少約83 %、至少約84%、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%或 至少約99%同一性。在某些實(shí)施方案中，這種酶組合物包含ー種酶，所述酶具有與CPY基本上同源的氨基酸序列。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，谷蛋白降解活性已經(jīng)令人驚訝多存在于來(lái)自桔青霉的酶制備物。具體而言，來(lái)自桔青霉的酶制備物具有其中將實(shí)施例24中鑒定的10種6聚底物中至少4種消化> 1000u/g的谷蛋白消化活性，其中I單位等于I μ mo I消化的FRET底物。具有這種活性的制備物也可以從其他真菌如黑曲霉和某些放線菌屬(Actinomyces)如金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)獲得。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物包含來(lái)自桔青霉的制備物，所述制備物具有谷蛋白降解活性以及5'-磷酸ニ酯酶(“5' -PDE")活性。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，谷蛋白降解活性已經(jīng)令人驚訝多存在于包含了含有半堿性蛋白酶的制備物的酶制備物中。如本文所用，半堿性蛋白酶指ー種酶，其衍生自真菌來(lái)源并且能夠通過(guò)水解作用分解蛋白質(zhì)和它們的降解產(chǎn)物(多肽和肽)，并且在范圍從PH 6. O至pH 11的環(huán)境中有活性。半堿性蛋白酶的來(lái)源包括某些真菌，如蜂蜜曲霉。半堿性蛋白酶也可以從某些植物細(xì)菌如大麥細(xì)菌或高粱細(xì)菌獲得。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以由眾多方法的任ー種產(chǎn)生。例如，各種酶可以組合以實(shí)現(xiàn)具有所需要的酶活性譜的所需酶組合物。額外或備選地，酶組合物可以從天然產(chǎn)生酶的微生物或使用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行基因修飾以產(chǎn)生ー種或多種酶的微生物而獲得。例如，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以包括至少兩種以下酶⑶EP、⑶EP-LGG、⑶EP-LNA、⑶EP-M、⑶EP-2A、⑶EP-AH、水稻素、NPI、NPII、Aorsin A、Aorsin B、CPY、木瓜蛋白酶、激活的木瓜蛋白酶、純化的木瓜蛋白酶或木瓜凝乳蛋白酶。本發(fā)明技術(shù)的酶組合物還可以包括來(lái)自桔青霉的制備物和/或一種半堿性蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，酶組合物可以包含⑶EP-LGG和木瓜蛋白酶。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，酶組合物可以包含⑶EP-LGG、木瓜蛋白酶和來(lái)自桔青霉的制備物。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，酶組合物可以包含GDEP-LGG、木瓜蛋白酶、來(lái)自桔青霉的制備物和半堿性蛋白酶。在其他實(shí)施方案中，酶組合物可以包含GDEP-LGG和激活的木瓜蛋白酶.在另ー個(gè)實(shí)施方案中，酶組合物可以包含⑶EP-LGG、激活的木瓜蛋白酶和來(lái)自桔青霉的制備物。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，酶組合物可以包含GDEP-LGG、激活的木瓜蛋白酶、來(lái)自桔青霉的制備物和半堿性蛋白酶。在其他實(shí)施方案中，酶組合物可以包含GDEP-LGG和木瓜凝乳蛋白酶。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，酶組合物可以包含GDEP-LGG、木瓜凝乳蛋白酶和來(lái)自桔青霉的制備物。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，酶組合物可以包含GDEP-LGG、木瓜凝乳蛋白酶、來(lái)自桔青霉的制備物和半堿性蛋白酶。如上文指出，本發(fā)明技術(shù)的酶和酶組合物也可以從通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞獲得。例如，可以將編碼所需酶的核酸序列插入表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體可以用來(lái)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染用于產(chǎn)生這種酶的宿主細(xì)胞。隨后可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法從這種宿主細(xì)胞獲得酶或酶組合物。組合物中給定的酶或酶活性的量可以根據(jù)組合物的所需效果變動(dòng)，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法確定或測(cè)量。組合物中存在的酶量可以按摩爾數(shù)量或摩爾比(例如，納摩爾或微摩爾酶)、重量數(shù)量或重量比(微克或納克酶)或活性數(shù)量或活性比(例如，“單位”酶或酶活性或摩爾酶)描述。在特定實(shí)施方案中，組合物可以包含蛋白酶和肽酶活性。在本發(fā)明技術(shù)的某些實(shí)施方案中，評(píng)估多種蛋白酶組合物的效能。因而，本發(fā)明技術(shù)包括ー個(gè)評(píng)估這些蛋白酶組合物的體外模型。體外模型可以包括，例如，胃模型、腸模型或胃腸模型。體外胃模型。體外胃模型可以包含例如，模擬的胃液(“SGF”)。SGF可以含有血清白蛋白、胃粘膜粘蛋白和/或緩沖液。這種緩沖液可以是こ酸鹽緩沖液。SGF可以包含生理鹽溶液，所述生理鹽溶液包含例如，氯化鈉(NaCl)和氯化鈣(CaCl2)。SGF可以在適宜pH 維持以模擬胃狀況，如酸性PH，包括范圍從約I. O至約7. O的pH并包括約2. O、約2. I、約
2.2、約 2. 3、約 2. 4、約 2. 5、約 2. 6、約 2. 7、約 2. 8、約 2. 9、約 3. O、約 3. I、約 3. 2、約 3. 3、約
3.4、約 3. 5、約 3. 6、約 3. 7、約 3. 8、約 3. 9、約 4. O、約 4. I、約 4. 2、約 4. 3、約 4. 4、約 4. 5、約
4.6、約 4. 7、約 4. 8、約 4. 9、約 5. O、約 5. I、約 5. 2、約 5. 3、約 5. 4、約 5. 5、約 5. 6、約 5. 7、約
5.8、約 5. 9、約 6. O、約 6. I、約 6. 2、約 6. 3、約 6. 4、約 6. 5、約 6. 6、約 6. 7、約 6. 8 或約 6. 9?？梢詫⑺崛鐨渎人嵩诜跤A段期間以周期間隔添加至SGF以維持SGF的酸度。SGF也可以包含一種或多種胃酶，如胃蛋白酶、明膠酶、淀粉酶和脂肪酶，以及其他酶如乳糖酶和α-半乳糖苷酶以進(jìn)ー步模擬胃狀況。市售的消化酶產(chǎn)品如EZ-GEST (Shaklee)可以使用以補(bǔ)充模擬的胃混合物。為評(píng)估候選酶組合物的效能，可以將一定量的酶組合物和含肽物質(zhì)添加至SGF。含肽物質(zhì)可以是同源肽制備物，如含有天然或合成谷蛋白寡肽的制備物或包含例如意圖或合理地預(yù)期由動(dòng)物攝取的任何物質(zhì)(包括食品原料)的異源制備物。示例性谷蛋白寡肽包括33 聚肽LQLQPEPQPQLPYPQPQLPYQPQLPYPQPQPF 和 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO 1)以及在例如美國(guó)專利號(hào)7，563，864中鑒定的肽。包含SGF、酶組合物和含肽物質(zhì)的混合物可以在約37°C孵育一段代表體內(nèi)與胃液接觸的時(shí)間，例如，約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘、約60分鐘、約65分鐘、約70分鐘、約80分鐘、約85分鐘、約90分鐘、約95分鐘、約100分鐘、約105分鐘、約110分鐘、約115分鐘或約120分鐘。包含SGF、酶組合物和含肽物質(zhì)的混合物可以規(guī)律間隔取樣以評(píng)估消化效率。消化效率可以通過(guò)例如測(cè)量混合物中存在的33聚物的量或測(cè)量由福林(Folin)法產(chǎn)生的游離酪氨酸的量進(jìn)行評(píng)估。體外腸模型。體外腸模型可以包含例如，模擬的腸液(stimulated intestinalfluid，“SIF”)。SIF可以在適宜pH維持以模擬胃狀況，如略微酸性、中性或堿性pH，包括范圍從約6. O至約14. O的pH并且包括約7. O、約7. O、約7. I、約7. 2、約7. 3、約7. 4、約7. 5、約 7. 6、約 7. 7、約 7. 8、約 7. 9、約 8. O、約 8. I、約 8. 2、約 8. 3、約 8. 4、約 8. 5、約 8. 6、約 8. 7、約 8. 8、約 8. 9、約 9. O、約 9. I、約 9. 2、約 9. 3、約 9. 4、約 9. 5、約 9. 6、約 9. 7、約 9. 8、約 9. 9、約 10. O、約 10. I、約 10. 2、約 10. 3、約 10. 4、約 10. 5、約 10. 6、約 10. 7、約 10. 8、約 10. 9、約 11. O、約 11. I、約 11. 2、約 11. 3、約 11. 4、約 11. 5、約 11. 6、約 11. 7、約 11. 8、約 11. 9、約 12. O、約 12. I、約 12. 2、約 12. 3、約 12. 4、約 12. 5、約 12. 6、約 12. 7、約 12. 8、約 12. 9、約13. O、約 13. I、約 13. 2、約 13. 3、約 13. 4、約 13. 5、約 13. 6、約 13. 7、約 13. 8 或約 13. 9。SIF
也可以包括中和酸的物質(zhì)如碳酸氫鈉(NaHCO3)或磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)15SIF可以包含ー種或多種胰酶如胰蛋白酶、膜凝乳蛋白酶和淀粉酶以及腸酶如蔗糖酶、麥芽糖酶、異麥芽糖酶和乳糖酶。例如，SIF也可以含有胰酶。胰酶含有胰酶類胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。胰酶是作為Creon (蘇威(Solvay))、Nutrizym 10 (默克(Merck))、Pancrease (楊森奧托(Janssen-Ortho))和 Pancrex (§)(佩因和伯恩(Paines&Byrne))可商業(yè)獲得的。SIF也可以包括ー種或多種膽鹽，如膽酸鹽，包括牛磺脫氧膽酸鹽(“TDCA”)和脫氧膽酸鹽(“DCA”)或膽汁酸，如膽酸、甘氨石膽酸、?；悄懰?、脫氧膽酸或石膽酸。 為評(píng)估候選酶組合物的效能，可以將一定量的酶組合物和含肽物質(zhì)添加至SIF。含肽物質(zhì)可以是同源肽制備物，如含有天然或合成谷蛋白寡肽的制備物或包含例如意圖或合理地預(yù)期由人或動(dòng)物攝取的任何物質(zhì)(包括食品原料)的異源制備物。示例性谷蛋白寡肽包括 33 聚肽LQLQPEPQPQLPYPQPQLPYQPQLPYPQPQPF 和 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO 1)以及在例如美國(guó)專利號(hào)7，563，864中鑒定的肽。包含SIF、酶組合物和含肽物質(zhì)的混合物可以在約37°C孵育一段代表體內(nèi)與腸液接觸的時(shí)間，例如約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約80、約 85、約 90、約 95、約 100、約 105、約 110、約 115、約 120、約 125、約 130、約 135、約 140、約 145、約 150、約 155、約 160、約 165、約 170、約 175、約 180、約 185、約 190、約 195、約 200、約205、約210、約215、約220、約225、約230、約235或約240分鐘。包含SIF、酶組合物和含肽物質(zhì)的混合物可以規(guī)律間隔取樣以評(píng)估消化效率。消化效率可以通過(guò)例如測(cè)量混合物中存在的33聚物的量或測(cè)量由福林(Folin)法產(chǎn)生的游離酪氨酸的量進(jìn)行評(píng)估。體外胃腸模型。體外胃腸模型可以包括在上述胃模型和腸模型中依次處理。例如，候選酶組合物和含肽物質(zhì)可以在SGF中在約37°C孵育一段代表體內(nèi)與胃液接觸的時(shí)間，例如，例如約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約80、約85、約90、約95、約100、約105、約110、約115或約120分鐘?？梢詫⒅泻退岬奈镔|(zhì)如碳酸氫鈉(NaHCO3)或磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)添加至混合物。該混合物可以隨后在SIF中孵育在約37°C孵育一段代表體內(nèi)與腸液接觸的時(shí)間，例如約20、約25、約30、約35、約40、約45、約 50、約 55、約 60、約 65、約 70、約 80、約 85、約 90、約 95、約 100、約 105、約 110、約 115、約120、約 125、約 130、約 135、約 140、約 145、約 150、約 155、約 160、約 165、約 170、約 175、約180、約 185、約 190、約 195、約 200、約 205、約 210、約 215、約 220、約 225、約 230、約 235 或約240分鐘。優(yōu)選地，候選酶組合物和含肽物質(zhì)可以在SGF中孵育約60分鐘并在SIF中孵育約60分鐘。備選地，候選酶組合物和含肽物質(zhì)可以在SGF中孵育約120分鐘并在SIF中孵育約60分鐘。可以使用來(lái)自合適動(dòng)物模型的胃腸液和/或模擬的液體如模擬的胃液和腸液USP?！八幬锝M合物”指本文所述的ー種或多種酶或本發(fā)明技術(shù)的酶組合物連同其他化學(xué)組分如生理可接受的載體和如下文描述的賦形劑一起的混合物。藥物組合物的目的是促進(jìn)酶或酶組合物給藥至有機(jī)體。盡管酶或酶組合物可以按其基本上純的形式給藥，可以想要的是在給藥之前將所述酶配制至藥物組合物中以增加例如，酶可ロ性、受試者對(duì)治療方案的依從性和/或給藥的一般容易性。因而，在某些實(shí)施方案中，除ー種或多種具有針對(duì)谷蛋白寡肽的活性的酶之夕卜，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物還包含其他組分，如一種或多種藥學(xué)上可接受的涂料、粘合剤、潤(rùn)滑劑、助懸劑、甜味劑、矯味劑、防腐剤、緩沖液、潤(rùn)濕劑、崩解劑、泡騰劑和其他賦形劑。此類賦形劑是本領(lǐng)域已知的并且可以由技術(shù)人員輕易地選擇。除一種或多種酶之外存在的額外組分的量可以變動(dòng)，范圍從約O. Iwt. %至約99wt. %、優(yōu)選地從約5wt. %至約80wt. %>更優(yōu)選地從約IOwt. %至約70wt%的總組成。例如，除一種或多種酶之外存在的額外組分的量可以是約 15wt. %、約 20wt. %、約 25wt. %、約 30wt. %、約 35wt. %、約 40wt. %、約45wt. %、約 50wt. %、約 55wt. %、約 60wt. %、或約 65 重量％ (wt. % )。根據(jù)本發(fā)明技術(shù)的ー些實(shí)施方案，藥物組合物可以包含藥學(xué)上可接受載體。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受載體”涉及適于給藥至例如人類受試者的一個(gè)或多個(gè)相容性固體或液體填料、稀釋劑或膠囊物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“載體”涉及將有效成分組合以促進(jìn)使用的本質(zhì)上天然或合成 的有機(jī)或無(wú)機(jī)成分。藥物組合物的成分通常具有這樣的性質(zhì)，從而不出現(xiàn)大幅度損害所需藥物效能的相互作用。在某些實(shí)施方案中，用于此類組合物內(nèi)的載體是生物相容性和/或生物可降解的。在某些實(shí)施方案中，載體可以是包含至少ー種能夠形成水凝膠的粘膜黏附聚合物的組合物，如US 2008/0020036中描述的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶組合物與至少ー個(gè)種藥學(xué)上可接受賦形劑摻合，由賦形劑稀釋或封閉于載體內(nèi)部，所述載體可以膠囊、小袋、片劑、口腔含化劑(buccal)、錠劑、口腔用薄膜、紙或其他容器的形式。當(dāng)賦形劑充當(dāng)稀釋劑時(shí)，它可以是作為溶媒、載體或平衡組合物的介質(zhì)發(fā)揮作用的固體、半固體、懸液、漿液或液體材料。因而，組合物可以是配制成片劑、丸剤、軟錠劑(pastille)、散劑、酏劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、膠囊劑(如，例如柔質(zhì)和硬質(zhì)明膠膠囊劑)、栓劑、錠劑、頰劑型、無(wú)菌注射液和無(wú)菌包裝的散剤。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可以包含鹽、緩沖物質(zhì)、防腐劑、載體和若適宜，其他治療性有效成分。對(duì)于在藥物中使用，鹽應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)上可接受的。然而，其他鹽可以用來(lái)制備藥學(xué)上可接受鹽并且被包括作為本發(fā)明技術(shù)的部分。此類藥理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽包括，例如，從以下酸中制備的那些鹽氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、馬來(lái)酸、磷酸、こ醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對(duì)甲苯磺酸、酒石酸、こ酸、檸檬酸、甲酸、苯甲酸、丙ニ酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。也可以將藥學(xué)上可接受鹽制備為堿金屬鹽或堿土金屬鹽如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可以包含緩沖物質(zhì)如處于鹽狀態(tài)的こ酸、處于鹽狀態(tài)的こ酸、處于鹽狀態(tài)的檸檬酸、處于鹽狀態(tài)的硼酸和處于鹽狀態(tài)的磷酸。若適宜的，藥物組合物也可以包含合適的防腐剤，如尼泊金酷，包括聚尼泊金酯(polyparaben)和尼泊金甲酯、山梨酸鉀、苯甲酸及其鹽、對(duì)輕基苯甲酸的其他酯如尼泊金丁酷、醇如こ醇或芐醇、酚類化合物如苯酚或季銨類化合物如苯扎氯銨、氯丁醇和硫柳汞。藥物組合物通常以標(biāo)準(zhǔn)劑量形式供應(yīng)并且可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式產(chǎn)生。藥物組合物可以例如是膠囊劑、片劑、軟錠劑(pastiIIe)、混懸劑、膏劑、糖漿劑、酏劑或乳劑形式。
粘合劑的實(shí)例包括多種纖維素和交聯(lián)的聚こ烯吡咯烷酮、微晶纖維素(如AvicelPH)、硅化微晶纖維素(SMCC)和甘露醇。合適的潤(rùn)滑劑(包括作用于待壓縮粉末形式的流動(dòng)性上的試劑)包括膠態(tài)ニ氧化硅(如Aerosil 200)、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣和ニ氧化硅凝膠。甜味劑的實(shí)例包括天然或人工甜味劑，如蔗糖、木糖醇、乳糖、糖精、環(huán)己烷氨基磺酸鹽、阿司帕坦和こ酰舒泛及其鹽。矯味劑的實(shí)例是麥カ甜(Magnasweet ) (MAFCO)、阿拉伯膠、小豆蓮、葛縷子、香草、糖精、葡萄糖、丙三醇、甘草、泡泡糖香料(bubble gumflavor)、薄荷、冬青油和果實(shí)香料,如樓桃味或橙味矯味劑。合適的稀釋劑包括藥學(xué)上可接受惰性填料，如膠態(tài)ニ氧化硅、微晶纖維素(如Avicel PH);磷酸氫I丐(dibasic calcium phosphate);糖,包括甘露醇、山梨醇、乳糖、鹿糖，和葡萄糖；和/或前述填料中任意者的混合物。
合適的崩解劑包括輕度交聯(lián)的聚こ烯基吡咯烷酮、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉和改性淀粉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、淀粉羥こ酸鈉及其混合物。泡騰劑的實(shí)例包括泡騰對(duì)偶物(effervescent couple),如有機(jī)酸和碳酸鹽或碳酸氫鹽。合適的有機(jī)酸包括，例如，檸檬酸、酒石酸，蘋(píng)果酸、延胡索酸、己ニ酸，琥珀酸的和海藻酸以及酐及酸鹽。合適的碳酸鹽和碳酸氫鹽包括，例如，碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鎂鹽、甘氨酸碳酸鈉、L-賴氨酸碳酸鹽和精氨酸碳酸鹽。備選地，僅泡騰對(duì)偶物的酸性組分可以存在。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的藥物組合物是速釋組合物。在其他實(shí)施方案中，藥物組合物是控釋組合物。這種藥物組合物可以提供ー種活性組分的相對(duì)恒定水平的釋放。然而，在其他實(shí)施方案中，給藥時(shí)旋即釋放的更快速率可以是合乎需要。在其他實(shí)施方案中，活性化合物的釋放可以是事件觸發(fā)的。觸發(fā)活性組分釋放的事件可以是暴露于水分、較低的pH或溫度閾值。此類組合物的配制完全在使用已知技術(shù)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。在這個(gè)方面有用的示例性載體包括聚(丙交酷-共-こ交酷)、聚丙烯酸酷、膠乳、淀粉、纖維素、葡聚糖等的微粒子。其他示例性延遲釋放載體包括超分子生物載體，這類載體包含非液態(tài)親水的核芯(例如，交聯(lián)的多糖或寡糖)和任選地，包含兩性化合物(如磷脂)的外層。在一個(gè)實(shí)施方案中，持續(xù)釋放制劑中所含有的活性化合物的量取決于給藥部位、釋放的速率和預(yù)期持續(xù)時(shí)間和待治療病狀的性質(zhì)。多種其他材料可以作為涂料存在或否則存在以修飾劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可以用紫膠、糖或這二者包衣。在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明技術(shù)的酶組合物成型為適于ロ服給藥的劑量單位，其中活性化合物可以隨賦形劑一起摻入并且以可攝取的片劑、錠劑、頰部片劑、藥錠劑(troche)、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖楽;劑、糯米紙囊劑(wafer)、等的形式使用。例如，酶組合物可以與固體、粉狀載體如,例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維素衍生物或明膠酶、以及與潤(rùn)滑劑例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鈣和聚こニ醇蠟混合。這種混合物隨后可以是壓制成片劑。如果需要包衣片劑是，可以將上文制備的片劑包衣，如用濃縮的糖溶液包衣，所述糖溶液可以含有阿拉伯樹(shù)膠、明膠酶、滑石、ニ氧化鈦，或用溶解于揮發(fā)性有機(jī)溶劑或溶劑混合物中的清漆包衣?？梢韵蜻@種包衣劑添加多種染料以在酶不同或存在的酶的量的片劑之間區(qū)分。
在某些實(shí)施方案中，劑量單位形式是膠囊劑。膠囊劑可以含有液體載體。例如，劑量単位形式可以是適于ロ服給藥的軟膠囊劑，如含有一種或多種酶與植物油或非水的水溶混性材料(例如聚こニ醇等)的混合物的膠囊劑。備選地，所述酶可以在硬膠囊劑中提供，所述硬膠囊劑可以含有與固體、粉狀載體例如山梨醇、甘露醇、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、支鏈淀粉、纖維素衍生物，或明膠組合的酶組合物的顆粒。本發(fā)明技術(shù)的其他實(shí)施方案包括本文所述的酶組合物的顆粒形式。顆粒形式用于制備ロ服片劑，并且一般按以下方式制備，不過(guò)可以使用本領(lǐng)域熟知的其他技術(shù)。將固體物質(zhì)(包括一種或多種酶)溫和地研磨或篩分至所需的粒度，并且將所得到的物質(zhì)溫和地壓縮穿過(guò)具有所需尺寸的不銹鋼篩?；旌衔锏母鱾€(gè)層隨后在受控干燥裝置中干燥持續(xù)確定的時(shí)間長(zhǎng)度以實(shí)現(xiàn)所需的粒度和一致性。將干燥的混合物顆粒溫和地過(guò)篩以除去任何粉末?？梢韵蜻@種混合物添加任選的崩解劑、抗摩擦劑和/或抗黏附劑。最后，使用具有適宜沖頭(punch)和陰模(die)以獲得所需片劑尺寸的機(jī)器，將這種混合物壓制成片劑。這種機(jī)器的運(yùn)行參數(shù)可以由技術(shù)人員選擇。
本發(fā)明技術(shù)的其他實(shí)施方案包括用于吸入的散劑。本發(fā)明技術(shù)的ー種或多種酶或酶組合物還可以配制于在延長(zhǎng)的時(shí)間段范圍例如約2小時(shí)至約16小時(shí)之間釋放酶或酶組合物的組合物內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，酶或酶組合物在約3至約12小時(shí)之間的時(shí)間范圍內(nèi)釋放。例如，酶或酶組合物可以在約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10或約11小時(shí)范圍內(nèi)釋放。在其他實(shí)施方案中，酶或酶組合物在約4至約8小時(shí)之間的時(shí)間范圍內(nèi)釋放。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備此類持續(xù)釋放制劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物經(jīng)穩(wěn)定化以抵抗酸性胃條件下的消化。在某些實(shí)施方案中，酶組合物可以被包含于允許遞送活性物質(zhì)至腸的腸衣中。在某些實(shí)施方案中，酶組合物可以在ー個(gè)或多個(gè)層包圍的核芯中存在，所述層包括例如具有或沒(méi)有如普通技術(shù)人員就藥物制劑而言已知的保護(hù)性次級(jí)涂層(sub-coating)的腸衣層。如果不使用次級(jí)涂層，則可以選擇腸衣，從而它不降解核芯中的有效成分。腸溶層(enteric layer) 一般包含具有腸溶特性的聚合物。示例性腸溶聚合物包括，但不限于甲基丙烯酸共聚物、羥丙基甲基纖維素酞酸酯(hydroxypiOpylmethylcellulose phtalate)和輕丙基甲基纖維素こ酸酯琥拍酸酷?？梢允鞘褂貌煌愋偷募谆┧峁簿畚?，例如，A型甲基丙烯酸共聚物(優(yōu)奇特(Eudragit )L-100)、B型甲基丙烯酸共聚物(Eudragit S 100)、C型甲基丙烯酸共聚物(Eudragit L 100-55),甲基丙烯酸共聚物分散體(Eudragit L 30D-55)、甲基丙烯酸甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物(Eudragit FS)及其混合物,例如，Eudragit L 100-55和Eudragit S100以重量比約3 I至約2 I的混合物，或Eudragit L 30D-55和Eudragit FS以重量比約3 : I至約5 : I的混合物。腸溶層還可以包含其他物質(zhì)如纖維こ酸酯酞酸酷、聚こ酸こ烯酞酸酷、纖維素こ酸酯檸檬酸三こ酷、紫膠和/或玉米醇溶蛋白。任選地，腸溶層還包含抗粘著劑如滑石或單硬脂酸甘油酯；增塑劑如檸檬酸三こ酯或聚こニ醇；和/或顏料如ニ氧化鈦或氧化鐵。腸溶層可以還包含ー種或多種增塑劑，包括，但不限于こ酰檸檬酸三こ酷、こ酰檸檬酸三丁酷、こ酰化こ?；瘑胃视涂帷⒈?、三こ酸甘油酷、丙ニ醇、酞酸酯(例如，酞酸ニこ酷、酞酸二丁酯)、蓖麻油、山梨醇和二丁基琥拍酸酯(dibutyl seccate)。某些實(shí)施方案提供腸溶制劑，其中腸溶層包含羥丙基甲基纖維素酞酸酯、三乙酸甘油酯、二氧化硅和硬脂酸。還構(gòu)思了用于直腸給藥的劑量單位。這些可以按含有所述酶和中性脂肪堿的栓劑形式制備。備選地，它們可以按明膠-直腸膠囊劑形式制備，所述明膠-直腸膠囊劑含有在具有植物油或石蠟油的混合物中的酶。適于腸胃外給藥的組合物通常包含有效成分的水質(zhì)或非水質(zhì)無(wú)菌制備物，所述制備物優(yōu)選地與接受者的血液等滲。合適的載體和溶劑是例如林格氏(Ringer)溶液和等滲氯化鈉溶液。通常，無(wú)菌的固定油額外地用作溶解或助懸介質(zhì)。本文提供了用于給藥一種或多種酶組合物至谷蛋白不耐受受試者或需要減少谷蛋白暴露的受試者的方法和組合物。在某些實(shí)施方案中，這些方法和組合物將允許受試者攝取含谷蛋白的食物，而無(wú)嚴(yán)重的健康后果，與未患有谷蛋白不耐受的個(gè)體完全相同。在某些實(shí)施方案中，未患有乳糜瀉病的受試者可以希望減少或限制他或她對(duì)谷蛋白的暴露，而 不必嚴(yán)格限于無(wú)谷蛋白膳食。作為其他實(shí)例，酶組合物也可以給藥受試者以治療適合通過(guò)減少谷蛋白暴露而治療的任何疾病，包括，例如甲狀腺病，如甲狀腺功能減退癥和神經(jīng)學(xué)疾病，如孤獨(dú)癥、小腦性共濟(jì)失調(diào)、周圍神經(jīng)病和精神分裂癥。在某些實(shí)施方案中，酶或酶組合物可以單獨(dú)或彼此組合地給藥或與其他活性或無(wú)活性物質(zhì)一起給藥。當(dāng)使用酶或酶組合物的組合時(shí)，構(gòu)思了至少兩種不同酶或酶組合物的同時(shí)或依次給藥。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)思了同時(shí)給藥酶或酶組合物的組合以適于口服給藥的劑量單位形式存在，其中活性化合物可以隨賦形劑一起摻入并且以可攝取的片劑、錠劑、頰部片齊Li、藥錠劑(troche)、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖楽；劑、糯米紙囊劑(wafer)等的形式使用。酶或酶組合物的組合可以包含以下酶的至少兩種⑶EP-LGG、⑶EP-LNA、⑶EP-M、⑶EP-2A、⑶EP-AH、水稻素、NPI、NPII、Aorsin A、Aorsin B、CPY、木瓜蛋白酶、激活的木瓜蛋白酶、純化的木瓜蛋白酶或木瓜凝乳蛋白酶。本發(fā)明技術(shù)的酶組合物還可以包括來(lái)自桔青霉的制備物。如本文所用，短語(yǔ)“治療有效量”指有效治療谷蛋白不耐受(包括NCGS或NCGI)的量。在某些實(shí)施方案中，短語(yǔ)“治療有效量”也可以用來(lái)指有效減少受試者暴露于谷蛋白寡肽(包括源自α-2麥醇溶蛋白的33聚物)或有效減少谷蛋白寡肽(包括源自α-2麥醇溶蛋白的33聚物)的抗原性的量。這個(gè)量可以按照不同受試者變動(dòng)，并且對(duì)于人類受試通?？梢允敲總€(gè)劑量約20mg至約lOOOmg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該量對(duì)于人類受試是每個(gè)劑量約IOOmg至約500mg。例如，該量可以對(duì)于人類受試是每個(gè)劑量約50mg、約lOOmg、約150mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg或約450mg。示例性劑量對(duì)于人類受試是約200mg。本發(fā)明技術(shù)的酶組合物的治療有效量可以每日給藥一次。備選地，治療有效量可以按分開(kāi)的量每日給藥多次。示例性給藥方案是每日兩次約200mg給定的酶組合物。當(dāng)攝取含谷蛋白食物時(shí)，另一個(gè)示例性給藥方案對(duì)于人類受試者是約200mg給定的酶組合物。替代性的合適給藥方案可以由技術(shù)人員決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到有效成分的治療有效量將取決于多種因素變動(dòng)，所述因素包括，例如，所用的具體復(fù)合物的活性；具體患者或患者群體的年齡、體重、總體健康、性別和膳食；給藥的時(shí)間、吸收速率和排泄速率；與單獨(dú)或組合服用的其他藥物的潛在相互作用；和需要治療效果的具體疾病、病狀或病癥的嚴(yán)重性。劑量的大小還將由可能伴隨給藥特定復(fù)合物的任何不良副作用的存在、性質(zhì)和程度決定。影響具體劑量的其他因素包括，例如，與特定受試者中施的特定復(fù)合物相關(guān)的生物利用度、代謝譜和藥效動(dòng)力學(xué)。例如，治療有效量可以包括酶組合物的數(shù)量或量，所述數(shù)量和量足以激發(fā)所要求或所需要的治療性反應(yīng)，例如，當(dāng)給藥至受試者時(shí)足以激發(fā)生物性或治療性反應(yīng)的量。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“給藥”指使受試者與本文提供的組合物接觸。例如，在某些實(shí)施方案中，本文提供的組合物適于口服給藥，因而使受試者與所述組合物接觸，包括攝取該組合物。在其他實(shí) 施方案中，給藥的方法可以包括將細(xì)胞(如腸細(xì)胞)進(jìn)行基因修飾以表達(dá)增加水平的特定酶或?qū)⒈磉_(dá)酶組合物的微生物導(dǎo)入受試者的腸道。在一些實(shí)施方案中，將此類細(xì)胞(包括并不源自患者但給藥至患者時(shí)不遭到免疫排異的細(xì)胞)和微生物在藥學(xué)上可接受賦形劑中配制或?qū)胧澄镏小Ｔ谄渌麑?shí)施方案中，食物可以進(jìn)行預(yù)處理或與酶組合物組合以減少或除去有毒的谷蛋白寡肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)輕易地認(rèn)識(shí)到使受試者與本文提供的組合物接觸的方法將取決于多個(gè)變量，如，而沒(méi)有任何意圖限于，給藥模式；年齡、預(yù)存狀況、給藥至受試者的其他藥物、癥狀的嚴(yán)重性、受試者重量或增重傾向性、抵抗其他藥物等。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，本文中提供了通過(guò)任何適宜途徑給藥本發(fā)明技術(shù)的化合物至受試者的方法的實(shí)施方案。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”指消除；預(yù)防；基本上抑制、延緩或逆轉(zhuǎn)疾病、病癥或病狀的進(jìn)展；基本上改善疾病、病癥或病狀的臨床和/或非臨床癥狀；或基本上預(yù)防或延遲疾病、病癥或病狀的臨床和/或非臨床癥狀的出現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“受試者”指哺乳動(dòng)物，包括因一種病狀或其后遺癥而需要治療或易受該病狀或其后遺癥影響的人。受試者可以包括犬、貓、豬、牛、羊、山羊、馬、大鼠以及小鼠和人。術(shù)語(yǔ)“受試者”不排除在全部方面均正常的個(gè)體。在前述段落中，單數(shù)的用途可以包括包括復(fù)數(shù)，除非另外特別地指明。如本文所用，詞“a (—個(gè))”、“an (—個(gè))”和“the (該)”意指“一個(gè)或多個(gè)”，除非另外說(shuō)明。此外，盡管本發(fā)明技術(shù)的方面參考一系列替代物加以描述，然而所述技術(shù)包括該系列替代物的任何單個(gè)成員或亞組以及其一個(gè)或多個(gè)的任何組合。全部專利、出版物的公開(kāi)內(nèi)容，包括公布的專利申請(qǐng)、保藏登錄號(hào)和數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)在此通過(guò)引用方式相同程度地并入，如同特別和分別地通過(guò)引用方式并入每份專利、出版物、保藏登錄號(hào)和數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明技術(shù)的范圍不限于上述的具體實(shí)施方案。本發(fā)明技術(shù)可以如具體所述之外那樣實(shí)施并且仍處于后附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。同樣，提出以下實(shí)施例以更充分地說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)的優(yōu)選實(shí)施方案。然而，它們無(wú)論如何不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本文中公開(kāi)的技術(shù)的寬廣范圍。
實(shí)施例實(shí)施例I :33聚肽由⑶EP-LGG降解將33 聚肽(lmg/ml ；LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID NO :1))與多種濃度(Omg/ml ；0. lmg/ml>O. 5mg/ml和I. Omg/ml)的GDEP-LGG在來(lái)自美國(guó)藥典的模擬腸液(SIF ;pH ^ 6. 8)存在下孵育。30 μ L反應(yīng)體積包含IOyL 33聚肽、10 μ L酶溶液和10 μ L3xSIF緩沖液。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約15、30、60、120和240分鐘并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘以終止酶反應(yīng)。酶處理的33聚物的樣品由使用針對(duì)這種33聚肽所開(kāi)發(fā)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的多克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(“ELISA”)分析。在圖I中顯示33聚肽由⑶EP-LGG降解的時(shí)間-過(guò)程和劑量-反應(yīng)分析的結(jié)果。與⑶EP-LGG (在全部濃度)孵育約120分鐘減少33聚物的抗原性至少約70%。 實(shí)施例2 33聚肽由⑶EP-LGG的組分降解對(duì)⑶EP-LGG的各種組分(包括水稻素、NP I和NP II)是檢驗(yàn)針對(duì)33聚物的酶活性。將 33 聚肽(lmg/ml)與包含 GDEP-LGG 的 O. lmg/ml 酶溶液；3X GDEP-LGG(即，O. 3mg/ml);水稻素；NP I ；NP II ;或水稻素、NP I和NP II (以比率I : I : I和2 : I : 4)的組合在模擬腸液(SIF ；pH 6. 8)存在下孵育。30 μ L反應(yīng)體積包含10 μ L 33聚肽、10 μ L酶 溶液和10 μ L3xSIF緩沖液。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約20、60、120和240分鐘并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘以終止酶反應(yīng)。酶處理的33聚肽樣品如實(shí)施例I中那樣進(jìn)行分析。圖2中顯示33聚物由⑶EP-LGG及其各種組分酶降解。與GDEP-LGG (在檢驗(yàn)的兩個(gè)濃度)孵育約60分鐘導(dǎo)致約90%的33聚肽降解。水稻素單獨(dú)不降解33聚肽。NP I和NP II各自顯示有限的降解33聚肽的能力。使三種純化的酶(水稻素、NP I和NP II)重構(gòu)⑶EP-LGG在120分鐘和240分鐘導(dǎo)致約50%的33聚肽降解。對(duì)水稻素、NP I和/或NP II的其他組合檢驗(yàn)它們降解33聚肽的能力。將33聚肽(lmg/ml)與包含谷蛋白降解酶制備物；水稻素；NP I ;和/或NP II的多種濃度的酶溶液(O. lmg/ml, O. 2mg/ml, O. 4mg/ml 或 O. 8mg/ml)在模擬腸液(SIF ；pH ^ 6. 8)存在下孵育。30 μ L反應(yīng)體積包含10 μ L 33聚肽、10 μ L酶溶液和IOyLSxSIF緩沖液。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約60分鐘并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘以終止酶反應(yīng)。酶處理的33聚肽樣品如實(shí)施例I中那樣進(jìn)行分析。圖3中顯示33聚物由⑶EP-LGG及其各種組分酶和其多種組合降解。單獨(dú)的NP I降解約40%的33聚肽(圖3B)。單獨(dú)的NP II降解約20%至約30%的33聚肽(圖3B)。水稻素在最低濃度不降解33聚肽(圖3B)。然而,在較高的濃度(O. 4mg/ml和O. 8mg/ml),水稻素降解約10%至約20%的33聚肽(圖3B)。使三種純化的酶(水稻素、NP I和NP II)重構(gòu)⑶EP-LGG導(dǎo)致約30%至約50%的33聚肽降解。然而，這種組合沒(méi)有實(shí)現(xiàn)與⑶EP-LGG相同的33聚物降解百分比(圖3B)。因而，⑶EP-LGG中另一種蛋白酶或肽酶可能參與33聚物消化。水稻素和NP I的組合和NPI和NP II的組合均似乎不產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)(圖3C和3E)。然而，水稻素和NP II的組合可以實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)(圖3D)。實(shí)施例3 KDEP-LGG與其他消化性蛋白酶的比較將33聚肽(lmg/ml)與O. 25mg/ml酶溶液(含有胃蛋白酶、蛋白酶K或⑶EP-LGG)在模擬腸液(SIF ；pH 6. 8)或模擬胃液(SGF ；pH 2. O)存在下孵育。40 μ L反應(yīng)體積包含10 μ L33聚肽、10 μ L酶溶液和20 μ L2X SIF或SGF緩沖液。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約15小時(shí)并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘。酶33聚物的樣品由使用Agilent 11OOHPLC系統(tǒng)的反相高壓液相色譜(“HPLC”)分析。將樣品加載到 Eclipse SB-C18(ID2. Immxl50mm,3. 5um)柱上。由(A)含有 0.1% 甲酸的蒸餾水和⑶含有O. I %甲酸的乙腈組成的流動(dòng)相用來(lái)以梯度模式(O分鐘，2% B — 10分鐘，25% B — 40分鐘，40% B — 45分鐘，100% B — 50分鐘，100% B)洗脫靶。流速設(shè)定在O. 2mL/分鐘并且上樣體積是5μ L。檢測(cè)用二極管陣列檢測(cè)器(210，280)和質(zhì)譜儀進(jìn)行。質(zhì)譜儀以使用以下條件的電噴霧(API-ES)正模式運(yùn)行干燥氣體流量13. OL/分鐘；干燥氣體溫度280°C ;氣霧器壓力60磅/平方英寸(psig);并且毛細(xì)管電壓2000V。在胃條件(pH ^ 2. O)下，胃蛋白酶不水解大部分的33聚肽(圖4A)。類似地，，在腸條件(pH 6. 8)下，蛋白酶K不水解大部分的33聚肽(圖4B)。在腸條件下，⑶EP-LGG水解33聚肽，但是沒(méi)有消除全部肽片段(圖4C)。實(shí)施例4 :谷蛋白降解酶制備物和其他曲霉蛋白酶的比較 將33聚肽(lmg/ml)與谷蛋白⑶EP-LGG、⑶EP-2A、⑶EP-LNA、⑶EP-M或蛋白酶P在SIF (pH ^ 6. 8)存在下孵育。30 μ L反應(yīng)體積包含10 μ L33聚肽、10 μ L酶溶液(O. lmg/ml)和10 μ L3xSIF緩沖液。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約4小時(shí)并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘。HPLC-MS分析如實(shí)施例3中描述。蛋白酶P是一種半堿性蛋白酶和蛋白裂解性酶制備物。蛋白酶P由獨(dú)特的發(fā)酵工藝以選擇的曲霉菌株制造，其中所述曲霉菌株在小麥麩上培養(yǎng)。蛋白酶P酶用水提取并且通過(guò)乙醇分級(jí)純化。蛋白酶P具有高的蛋白酶水解活性。PZH(SD)是一種來(lái)自蜂蜜曲霉的半堿性蛋白酶。根據(jù)此酶的純化和應(yīng)用，這種酶還稱作蛋白酶P、蜂蜜曲霉蛋白酶(Seaprose)或蛋白酶DS。蛋白酶P是較少純化的；Seaprose (半堿性蛋白酶)已經(jīng)在日本用作肺部相關(guān)疾病的藥物；蛋白酶DS是由蜂蜜曲霉產(chǎn)生的酶制備物。在腸條件(pH 6. 8)與33聚肽孵育時(shí)4小時(shí)的時(shí)候，⑶EP-LGG水解33聚肽(圖5A)。然而，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間與15小時(shí)(見(jiàn)實(shí)施例3)相比縮減至4小時(shí)的時(shí)候，33聚由GDEP-LGG的水解是較不高效的。其他曲霉蛋白酶顯示與谷蛋白降解酶制備物相似的33聚肽水解作用(圖 5B-5E)。實(shí)施例5 KDEP-M和⑶EP-LGG在多個(gè)pH的33聚物水解活性將33聚肽(lmg/ml)與⑶EP-LGG或⑶EP-M在多個(gè)pH孵育。30 μ L反應(yīng)體積包含10 μ L 33聚肽、10 μ L酶溶液(O. lmg/ml)和10 μ L 50mM檸檬酸鹽緩沖液。用于⑶EP-M的緩沖液的PH是從3. O至6. O (圖6A-6D)。用于谷蛋白降解酶制備物的緩沖液的pH是從4. O至8. O (圖6E-6G)。還在pH 4. O對(duì)一半量的⑶EP-M測(cè)試(圖6H)。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約4小時(shí)并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘。HPLC-MS分析如實(shí)施例3中描述。⑶EP-LGG和⑶EP-M在個(gè)體各自以高效率在酸性pH水解33聚肽。⑶EP-M在酸性pH比⑶EP-LGG顯示出更高效的水解作用。實(shí)施例6 :蛋白酶抑制劑分析前述實(shí)施例顯示，⑶EP-M和⑶EP-LGG在酸性pH高效地水解33聚肽，如，源自α -2麥醇溶蛋白的那種。多種蛋白酶抑制劑用來(lái)評(píng)價(jià)有效降解33聚物的GDEP-M和GDEP-LGG的組分。將33 聚肽(lmg/ml)與 O. lmg/ml 酶溶液(O)EP-LGG 或 GDEP-M)孵育。30 μ L 反應(yīng)體積包含IOyL 33聚肽、IOyL酶溶液(O. lmg/ml)、10 μ L 50mM檸檬酸鹽緩沖液和3 μ L蛋白酶抑制劑-PMSF胃蛋白酶抑制劑或EDTA。緩沖液的pH是約4. O。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約4小時(shí)并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘。HPLC-MS分析如實(shí)施例3中描述。在酸性條件(pH ^ 4. O)與33聚肽孵育時(shí)4小時(shí)的時(shí)候，⑶EP-LGG水解33聚肽(圖7A)。然而，在苯甲基磺酰氟化物(PMSF)存在下，33聚由GDEP-LGG的水解是較不高效的(圖7B)。胃蛋白酶抑制劑和EDTA均不抑制33聚肽由GDEP-LGG水解(圖7C和7D)。在酸性條件(pH 4. O)與33聚肽孵育時(shí)4小時(shí)的時(shí)候，⑶EP-M水解33聚肽(圖7E)。然而，在PMSF存在下，33聚由⑶EP-M的水解是較不高效的(圖7F)。胃蛋白酶抑制劑和EDTA均不抑制33聚肽由GDEP-M水解(圖7G和7H)。胃蛋白酶抑制劑和EDTA均不抑制33聚肽由⑶EP-LGG或⑶EP-M水解。PMS抑制33聚肽由谷蛋白降解酶制備物或GDEP-M水解。因而，酸性絲氨酸蛋白酶是谷蛋白降解酶制備物或⑶EP-M水解33聚肽的主要組分。
實(shí)施例7 33聚肽由⑶EP-LGG的組分Aorsin降解以上提出的實(shí)驗(yàn)表明，酸性絲氨酸蛋白酶對(duì)GDEP-M針對(duì)33聚肽的水解活性有貢獻(xiàn)。Aorsin是一種存在于⑶EP-M中的酸性絲氨酸蛋白酶。對(duì)⑶EP-M的各種組分(包括AorsinA和Aorsin B)檢驗(yàn)針對(duì)33聚肽的酶活性。將33聚肽(lmg/ml)與包含Aorsin A或Aorsin B的I. Omg/ml酶溶液在朽1檬酸鹽緩沖液(PH&4.0)存在下孵育。30 μ L反應(yīng)體積包含IOyL 33聚肽、10 μ LAorsin溶液和10μ L50mM檸檬酸鹽緩沖液。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約15、30、60和240分鐘并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘以終止酶反應(yīng)。HPLC-MS分析如實(shí)施例3中描述。在酸性條件(pH ^ 4. O)與33聚肽孵育時(shí)4小時(shí)的時(shí)候，Aorsin A水解33聚肽(圖8A-8D)。類似地，在酸性條件(pH ^ 4. O)與33聚肽孵育時(shí)4小時(shí)的時(shí)候，Aorsin B水解33聚肽(圖8E-8H)。用Aorsin處理約240分鐘的33聚肽的樣品也如實(shí)施例I中那樣進(jìn)行分析。圖9中顯示33聚物由Aorsin降解。與Aorsin A或B孵育約240分鐘導(dǎo)致33聚肽徹底降解。實(shí)施例5 :羧肽酶Y和黃色粘球菌脯氨酰內(nèi)肽酶在多個(gè)pH的33聚物水解活性將33聚肽(lmg/ml)與源自釀酒酵母的CPY或黃色粘球菌脯氨酰內(nèi)肽酶(“MX-PEP”)在多個(gè)pH孵育。30 μ L反應(yīng)體積包含10 μ L 33聚肽、10 μ L酶溶液(O. Img/ml)和IOyL緩沖液。用于CPY的緩沖液的pH是從4. O至7. 0(圖10A-10D)并且用于MX-PEP的緩沖液的pH是從4. O至7. O (圖10E-10H)。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約4小時(shí)并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘。HPLC-MS分析如實(shí)施例3中描述。MX-PEP在酸性pH不水解33聚肽。CPY在酸性pH徹底水解33聚肽。這個(gè)結(jié)果是令人驚訝的，因?yàn)镃PY稱作具有中性最佳pH的外肽酶。然而，這里提出的數(shù)據(jù)顯示CPY具有針對(duì)33聚肽的酸性最佳pH。實(shí)施例9 :羧肽酶Y和脯氨酰內(nèi)肽酶的比較將33聚肽(lmg/ml)與酶溶液(含有CPY、MX-PEP或黑曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶(“ΑΝ-PEP”))孵育。AN-PEP 是可商業(yè)獲得的，例如，Brewers Clarex (DSM)。CPY 和 AN-PEP在酸性pH (pH ^ 5. O)孵育。MX-PEP在SIF (pH ^ 6. 8)存在下孵育。30 μ L反應(yīng)體積包含
10μ L 33聚肽、10 μ L酶溶液和10 μ L緩沖液。在4 個(gè)濃度0. lmg/ml、O. 05mg/ml ；0, 025mg/ml 和 0. 0125mg/ml 測(cè)試每種酶。反應(yīng)在約37°C實(shí)施約4小時(shí)并且隨后在90°C進(jìn)行5分鐘以終止酶反應(yīng)。在圖llA-llD(CPY)、IIE-IIH (MX-PEP)和 111-IIL (AN-PEP)中提出 CPY、MX-PEP 和 AN-PEP 的劑量反應(yīng)的結(jié)果。還在個(gè)時(shí)間點(diǎn)約15分鐘、30分鐘、60分鐘和240分鐘測(cè)試每種酶(濃度O. Img/ml)。HPLC分析如實(shí)施例3中描述那樣進(jìn)行并且在圖11M_1 IP (CPY)、IIQ-I IT (MX-PEP)和IIU-IIV (AN-PEP)中提出CPY、MX-PEP和AN-PEP的這種分析結(jié)果。ELISA分析還如實(shí)施例I中描述那樣進(jìn)行并且在圖12中提出這種分析的結(jié)果。CPY、MX-PEP和AN-PEP水解33聚肽。AN-PEP似乎具有針對(duì)33聚肽的最強(qiáng)活性，隨后是CPY并且隨后是MX-PEP。實(shí)施例10:體外胃腸模型體外胃腸模型用來(lái)評(píng)估多種酶(包括⑶EP-LGG、⑶EP-M和CPY)的消化效率。
為檢驗(yàn)GDEP-LGG對(duì)意在或合理預(yù)期由動(dòng)物攝取的小麥谷蛋白和市售食品原料的消化效率，使用以下模型。使用IOOml 2. 7%牛血清白蛋白；5ml 3 %胃粘膜粘蛋白；10ml NaCl13. 2g+CaCl22H20 O. 22g/100ml和20ml pH 4. 0乙酸鹽緩沖液，制備135ml溶液。這種溶液在37°C孵育約20分鐘。在這個(gè)預(yù)孵育后，將5ml O. 2%胃蛋白酶和IOmlI. 47% EZ-GEST (Shaklee)添加至該溶液。在t = O分鐘，將含肽物質(zhì)(例如，小麥谷蛋白或市售食物)添加至該溶液并且孵育約120分鐘。在孵育階段期間，將4ml O. 2N HCl添加至混合物以維持混合物的酸度(在t = 5分鐘、t = 20分鐘、t = 35分鐘、t = 50分鐘、t = 65分鐘)。在t = 120分鐘，將3. Og碳酸氫鈉(NaHCO3)、0· 31g TDCA和150mg胰酶添加至混合物以模擬腸條件?；旌衔镫S后在約37°C孵育約60分鐘(直至t = 180分鐘)?；旌衔锿ㄟ^(guò)在t = O分鐘、t = 30分鐘、t = 60分鐘、t = 90分鐘、t = 120分鐘、t = 130分鐘、t = 140分鐘、t = 150分鐘和t = 180分鐘取出Iml進(jìn)行采樣。在表I和2中提出使用多種市售食物作為33聚肽的來(lái)源時(shí)⑶EP-LGG針對(duì)33聚肽的消化效率。表I中的數(shù)據(jù)反映所示33聚物來(lái)源與200mgGDEP-LGG孵育180分鐘。表2中提出的數(shù)據(jù)反映所示33聚物來(lái)源與所示量的GDEP-LGG孵育180分鐘。表I :由200mg⑶EP-LGG消化的33聚肽的量
33聚肽的夾源(含物) 份量大小消化效車
小麥谷蛋白__IOj__68%_
烤寬面條252 g89%
Easy Mac58 g51%
Cheez-It 脆餅30 g81%
拉面43 g49%
芝麻雞_ 283 g49%
冷凍的墨西哥卷餅142 g64%表2 :由⑶EP-LGG消化的33聚肽的量
權(quán)利要求
1.一種酶混合物，其包含 一種組合物，其選自基本上由⑶EP ;ffl)EP-LGG ;( ΕΡ-Μ ;ffl)EP-LNA ;( ΕΡ-2Α ;( ΕΡ-ΑΗ ；木瓜蛋白酶;Aorsin ;具有與Aorsin或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酸性絲氨酸蛋白酶多肽；羧肽酶Y ;具有與羧肽酶Y或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酶；半堿性蛋白酶；和來(lái)自桔青霉(Penicillium citrinum)的制備物所組成的組中； 其中，所述酶混合物能夠切割谷蛋白寡肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶混合物，其中，所述酶混合物包含GDEP-LGG、木瓜蛋白酶、半堿性蛋白酶和來(lái)自桔青霉的制備物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶混合物，其中，所述半堿性蛋白酶是蛋白酶P。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶混合物，其中，所述木瓜蛋白酶已經(jīng)由還原劑激活。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶混合物，其中，所述谷蛋白寡肽是α-麥醇溶蛋白的33聚肽片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的酶混合物，其中，所述33聚肽片段具有氨基酸序列LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO 1)
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶混合物，其中，所述酶混合物是在酸性條件下穩(wěn)定的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶混合物，其中，所述酶混合物在藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制。
9.一種在人類受試者中治療谷蛋白不耐受或減少谷蛋白暴露的方法，其包括 向受試者提供治療有效量的酶混合物， 其中所述酶混合物能夠在酸性條件切割谷蛋白寡肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述酶混合物包含一種組合物，所述組合物選自基本上由⑶EP ;ffl)EP-LGG ;( ΕΡ-Μ ;ffl)EP-LNA ;( ΕΡ-2Α ;( ΕΡ-ΑΗ ;木瓜蛋白酶；Aorsin ；具有與Aorsin或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酸性絲氨酸蛋白酶多肽；羧肽酶Y ;具有與羧肽酶Y或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酶；半堿性蛋白酶；和來(lái)自桔青霉的制備物所組成的組中。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述酶混合物包含⑶EP-LGG和木瓜蛋白酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述酶混合物包含GDEP-LGG;木瓜蛋白酶；半堿性蛋白酶；和來(lái)自桔青霉的制備物。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述酶混合物在藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，配制所述酶混合物用于口服遞送。
15.一種用于治療谷蛋白不耐受或減少谷蛋白暴露的制劑，其包含 至少兩種酶組合物，其選自基本上由⑶EP ;OTEP-LGG ;OTEP_M ;OTEP_LNA ;OTEP_2A ；⑶EP-AH ;木瓜蛋白酶；Aorsin ;具有與Aorsin或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酸性絲氨酸蛋白酶多肽；羧肽酶Y ;具有與羧肽酶Y或其片段同源至少約80%的氨基酸序列的酶；半堿性蛋白酶；和來(lái)自桔青霉的制備物所組成的組中； 其中所述至少兩種酶組合物能夠在體外胃腸模型中消化谷蛋白寡肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制劑，其中，所述至少兩種酶組合物是GDEP-LGG和木瓜蛋白酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制劑，其中，所述模型包括將至少兩種酶組合物與谷蛋白寡肽在模擬的胃液中在約37°C下孵育約120分鐘。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制劑，其中，所述模擬的胃液包含胃粘膜粘蛋白、胃蛋白酶、明膠酶、淀粉酶和脂肪酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制劑，其中，所述模型包括將所述至少兩種酶組合物與谷蛋白寡肽在模擬的腸液中在約37°C下孵育約60分鐘。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的制劑，其中，所述模擬的腸液包含一種或多種胰酶和膽鹽。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的制劑，其中，所述一種或多種胰酶選自基本上由胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶所組成的組中。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制劑，其中，所述模型包括 將包含所述至少兩種酶組合物、所述谷蛋白寡肽、胃粘膜粘蛋白、胃蛋白酶、明膠酶、淀粉酶和脂肪酶的混合物在酸性條件在約37°C下孵育約60分鐘至約120分鐘； 添加酸中和物質(zhì)至所述混合物；并且 將所述混合物與胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶以及膽鹽在中性條件在約37°C下孵育約60分鐘。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制劑，其中，所述谷蛋白寡肽是α-麥醇溶蛋白的33聚肽片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的制劑，其中，所述33聚肽片段具有氨基酸序列LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO 1)
全文摘要
本發(fā)明的技術(shù)涉及酶組合物。所述酶組合物可以用來(lái)治療谷蛋白不耐受性受試者，包括患有非乳糜瀉谷蛋白不耐受和/或非乳糜瀉谷蛋白敏感的受試者。所述酶組合物也可以用來(lái)減少某些個(gè)體中的谷蛋白暴露。例如，該酶組合物也可以用作預(yù)防藥以減少對(duì)谷蛋白寡肽的暴露。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102858795SQ201180008536
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者詹姆斯·F·喬利, 井戶宏樹(shù), 松原寬敬, 高橋哲也, 西尾享一 申請(qǐng)人:天野酶制品美國(guó)有限公司, 天野酶制品株式會(huì)社