專利名稱：免疫原性蛋白和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于治療和阻止無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) (B群鏈球菌；GBS)的蛋白和組合物。
背景技術(shù)：
革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)乳鏈球菌(或“B群鏈球菌”，簡(jiǎn)稱“GBS”)會(huì)在免疫受損個(gè)體和新生兒中引起嚴(yán)重的疾病，菌血癥和腦膜炎。有兩種新生兒感染。第一種(早發(fā)，通常在出生5天內(nèi))表現(xiàn)為菌血癥和肺炎。嬰兒穿過(guò)產(chǎn)道發(fā)生垂直收縮。GBS在約25%年輕女性的陰道中繁殖，通過(guò)有該菌繁殖的母親陰道分娩嬰兒中約I %會(huì)受到感染。致死率50-70%。第二種是腦膜炎，出生后10-60天發(fā)生。若懷孕女性用III型莢膜接種，則嬰兒會(huì)被動(dòng)免疫，遲發(fā)性腦膜炎發(fā)病率會(huì)降低但不是完全消除。 “GBS”中的“B”表不蘭氏分類法(Lancefield classification),其基于稀酸中可溶性糖(稱為C糖)的抗原性。蘭氏分類鑒定到13種C糖，稱為A-0，其可在血清學(xué)上區(qū)分。最常感染人類的生物體在A、B、D和G群中。B群中株系基于其多糖莢膜的結(jié)構(gòu)被分為10個(gè)血清型(la、lb、II、III、IV、V、VI、VII、VII 和 XI)已經(jīng)進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)基于蛋白和基于多糖的針對(duì)GBS的疫苗，但目前沒(méi)有市售可得的GBS疫苗。因此需要針對(duì)無(wú)乳鏈球菌(S. agalactiae)感染的有效疫苗。本發(fā)明目的是提供能用于開(kāi)發(fā)所述疫苗的蛋白和免疫原性組合物。

發(fā)明內(nèi)容
GBS的菌毛結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是感興趣的疫苗候選物。GBS具有三種菌毛變體，各由不同毒力島(pathogenicity island) PI-1、PI_2a 和 PI_2b 編碼[1，2]。各毒力島由 5 種基因組成，它們編碼菌毛主干蛋白(BP) ;2種輔助蛋白(API和AP2);和2種涉及菌毛組裝的分選酶蛋白。所有GBS株系載有這3種毒力島中至少一種且這些毒力島編碼的菌毛結(jié)構(gòu)蛋白(BP、AP1和AP2)的序列通常非常保守。毒力島2a(APl-2a)編碼的輔助蛋白I (API)序列(本文也稱為GBS67)在GBS株系中不同。至少存在2個(gè)GBS67蛋白家族。原始’ GBS67’ (SAG1408)序列在參考文獻(xiàn)147中注釋為細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白(參見(jiàn)GI :22534437)。2603菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS67的氨基酸序列在本文中列為SEQ IDNO: I。GBS株系CJB11U515和NEM316表達(dá)GBS67序列，其與2603株系的GBS67序列屬于同一家族。CJB111、515和NEM316株系中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS67的氨基酸序列在本文中列為SEQID N0:9、13 和 17。H36B株系中存在GBS67(SAI1512)變體。該’ GBS67’ (SAG1408)序列變體在參考文獻(xiàn)3中注釋為細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白(參見(jiàn)GI: 77405751)。H36B菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS67的氨基酸序列在本文中列為SEQ ID N0:5。GBS株系DK21和CJBllO表達(dá)GBS67序列，其與H36B株系的GBS67序列屬于同一家族。DK21和CJBllO株系中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS67的氨基酸序列在本文中列為SEQ ID NO:21和25。如本文所述，針對(duì)2603株系和相關(guān)株系中所發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)GBS67的氨基酸序列產(chǎn)生的血清對(duì)表達(dá)H36B株系和相關(guān)株系中所發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)GBS67的氨基酸序列的GBS株系有活性，反之亦然。因此全長(zhǎng)GBS67提供針對(duì)表達(dá)兩種家族任一種中GBS67變體的GBS株系的交叉保護(hù)。本發(fā)明目前從GBS的2603株系和GBS的H36B株系中成功鑒定到含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的全長(zhǎng)GBS67序列片段。2603株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文作為SEQ IDNO:3給出。SEQ ID NO:3的氨基酸序列是位于2603株系中GBS67序列(SEQ ID NO: I)的氨基酸218-615的398個(gè)氨基酸片段。2603株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文作為SEQ IDN0:4給出。SEQ ID NO:4的氨基酸序列是位于2603株系中GBS67序列(SEQ ID NO: I)的 氨基酸616-866的251個(gè)氨基酸片段。H36B株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:7給出。SEQ ID NO:7的氨基酸序列是位于H36B株系中GBS67序列(SEQ ID N0:5)的氨基酸218-610的393個(gè)氨基酸片段。H36B株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:8給出。SEQ ID N0:8的氨基酸序列是位于H36B株系中GBS67序列(SEQ ID N0:5)的氨基酸611-861的251個(gè)氨基酸片段。還在表達(dá)與GBS株系2603的GBS67為同一家族的GBS67的GBS株系即GBS株系CJB11U515和NEM316中和表達(dá)與GBS株系H36B為同一家族的GBS67的GBS株系即DK21和CJBllO中鑒定到相應(yīng)片段。CJBlll株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:11給出。SEQ ID NO: 11的氨基酸序列是位于CJBlll株系中GBS67序列(SEQ IDNO:9)的氨基酸218-615的398個(gè)氨基酸片段。CJBlll株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文作為SEQID NO: 12給出。SEQ ID NO: 12的氨基酸序列是位于CJBlll株系中GBS67序列(SEQ IDNO:9)的氨基酸616-866的251個(gè)氨基酸片段。515株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQ IDNO: 15給出。SEQ ID NO: 15的氨基酸序列是位于515株系中GBS67序列(SEQ ID NO: 13)的氨基酸218-615的398個(gè)氨基酸片段。515株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQ IDNO: 16給出。SEQ ID NO: 16的氨基酸序列是位于515株系中GBS67序列(SEQ ID NO: 13)的氨基酸616-866的251個(gè)氨基酸片段。NEM316株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:19給出。SEQ ID NO: 19的氨基酸序列是位于NEM316株系中GBS67序列(SEQ IDNO: 17)的氨基酸218-615的398個(gè)氨基酸片段。NEM316株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:20給出。SEQ ID N0:20的氨基酸序列是位于NEM316株系中GBS67序列(SEQ IDNO: 17)的氨基酸616-866的251個(gè)氨基酸片段。DK21株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:23給出。SEQ ID N0:23的氨基酸序列是位于DK21株系中GBS67序列(SEQ ID N0:21)的氨基酸218-610的393個(gè)氨基酸片段。DK21株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:24給出。SEQ ID N0:24的氨基酸序列是位于DK21株系中GBS67序列(SEQ ID N0:21)的氨基酸611-861的251個(gè)氨基酸片段。CJBllO株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:27給出。SEQ ID N0:27的氨基酸序列是位于CJBllO株系中GBS67序列(SEQ IDNO:25)的氨基酸218-610的393個(gè)氨基酸片段。CJBllO株系中發(fā)現(xiàn)的含有負(fù)責(zé)交叉保護(hù)表位的GBS67序列片段在本文中作為SEQID N0:28給出。SEQ ID N0:28的氨基酸序列是位于CJBllO株系中GBS67序列(SEQ ID NO:25)的氨基酸611-861的251個(gè)氨基酸片段。GBS67 多肽GBS67的片段和這些片段的表位可用于替代免疫原性組合物中的全長(zhǎng)GBS67以治療或阻止GBS。GBS672603因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供包括或由下述組成的多肽i)SEQ ID NO: I的至少t個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:3和/或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的表位；ii)具有與SEQ ID NO: I至少a%相同性的氨基酸序列中至少t個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4氨基酸序列的表位具有至少b%相同性的表位；本發(fā)明該方面的多肽可包括或由下述組成i)SEQ ID NO: I的至少t個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:3和/或SEQ ID NO:4的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO: I有a%相同性的氨基酸序列中至少t個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:3和/或SEQ ID N0:4有至少b%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明該方面的多肽可包括或由以下組成SEQ ID NO: I的至少t個(gè)連續(xù)氨基酸片段，所述片段包括SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。GBS67 H36B根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包括或由下述組成的多肽i)SEQ ID NO:5的至少u個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:7和/或SEQ ID NO:8的氨基酸序列的表位；ii)具有與SEQ ID N0:5至少c%相同性的氨基酸序列中至少u個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8氨基酸序列的表位具有至少d%相同性的表位；本發(fā)明該方面的多肽可包括或由下述組成i)SEQ ID NO:5的至少u個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:7和/或SEQ ID NO :8的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO: 5有c%相同性的氨基酸序列中至少u個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:7和/或SEQ ID N0:8具有至少d%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明該方面的多肽可包括或由以下組成SEQ ID NO:5的至少u個(gè)連續(xù)氨基酸片段，所述片段包括SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。GBS67 CJBlll根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包括或由下述組成的多肽i)SEQ ID NO: 9的至少V個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:11和/ 或SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的表位；ii)具有與SEQ ID NO:9至少e%相同性的氨基酸序列中至少v個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12氨基酸序列的表位具有至少
相同性的表位；本發(fā)明該方面的多肽可包括或由下述組成i)SEQ ID NO: 9的至少V個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:11和/或SEQ ID NO: 12的氨基酸序列；ii)與SEQ ID勵(lì):9有e%相同性的氨基酸序列中至少V個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12具有至少€%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明該方面的多肽可包括或由以下組成SEQ ID NO:9的至少V個(gè)連續(xù)氨基酸片段，所述片段包括SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。GBS67 515根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包括或由下述組成的多肽i)SEQ ID NO: 13的至少w個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:15和/或SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的表位；ii)具有與SEQ ID NO: 13至少g%相同性的氨基酸序列中至少w個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID NO: 15和/或SEQ ID NO: 16氨基酸序列的表位具有至少h%相同性的表位；本發(fā)明該方面的多肽可包括或由下述組成i)SEQ ID NO: 13的至少w個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:15和/或SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO: 13有§%相同性的氨基酸序列中至少w個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID NO: 15和/或SEQ ID NO: 16具有至少h%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明該方面的多肽可包括或由以下組成SEQ ID NO: 13的至少w個(gè)連續(xù)氨基酸片段，所述片段包括SEQ ID NO: 15和/或SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。GBS67 NEM316根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包括或由下述組成的多肽i)SEQ ID NO: 17的至少x個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDNO: 19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的表位；ii)具有與SEQ ID NO: 17至少i %相同性的氨基酸序列中至少x個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID NO: 19和/或SEQ ID NO:20氨基酸序列的表位具有至少j%相同性的表位；本發(fā)明該方面的多肽可包括或由下述組成i)SEQ ID NO: 17的至少x個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDNO: 19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO: 17有相同性的氨基酸序列中至少X個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:19和/或SEQ ID N0:20具有至少_]_%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明該方面的多肽可包括或由以下組成SEQ ID NO: 17的至少x個(gè)連續(xù)氨基酸片段，所述片段包括SEQ ID NO: 19和/或SEQ ID N0:20的氨基酸序列。GBS67 DK21根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包括或由下述組成的多肽 i)SEQ ID NO: 21的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:23和/或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的表位；ii)具有與SEQ ID NO: 21至少k%相同性的氨基酸序列中至少y個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:23和/或SEQ ID NO:24氨基酸序列的表位具有至少1%相同性的表位；本發(fā)明該方面的多肽可包括或由下述組成i)SEQ ID NO: 21的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDN0:23和/或SEQ ID NO:24的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO: 21有1^/。相同性的氨基酸序列中至少y個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:23和/或SEQ ID NO:24具有至少1%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明該方面的多肽可包括或由以下組成SEQ ID NO: 21的至少y個(gè)連續(xù)氨基酸片段，所述片段包括SEQ ID N0:23和/或SEQ ID N0:24的氨基酸序列。GBS67 CJBllO根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包括或由下述組成的多肽i)SEQ ID NO:25的至少z個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDNO:27和/或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的表位；ii)具有與SEQ ID NO: 25至少m%相同性的氨基酸序列中至少z個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:27和/或SEQ ID NO:28氨基酸序列的表位具有至少n%相同性的表位；本發(fā)明該方面的多肽可包括或由下述組成i)SEQ ID NO:25的至少z個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDNO:27和/或SEQ ID NO:28的氨基酸序列；ii)與SEQ ID勵(lì):25有111%相同性的氨基酸序列中至少z個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:27和/或SEQ ID NO:28具有至少n%相同性的氨基酸序列。本發(fā)明該方面的多肽可包括或由以下組成SEQ ID NO: 25的至少z個(gè)連續(xù)氨基酸片段，所述片段包括SEQ ID N0:27和/或SEQ ID N0:28的氨基酸序列?！氨砦弧北硎颈幻庖呙庖呦到y(tǒng)識(shí)別并引發(fā)免疫應(yīng)答的多肽部分。本發(fā)明的多肽能誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)GBS67肽變體的GBS株系的交叉保護(hù)。因此，本發(fā)明的多肽在給予對(duì)象時(shí)，能引起包含抗體的抗體應(yīng)答，該抗體與具有氨基酸序列SEQID NO: I的野生型GBS蛋白(株系2603)和具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的野生型GBS蛋白(株系H36B)結(jié)合。因此本發(fā)明的多肽能與SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合針對(duì)SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 5所產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的多肽在給予對(duì)象時(shí)，通常還能引起包含抗體的抗體應(yīng)答，該抗體與具有氨基酸序列SEQ ID NO: 9的野生型GBS蛋白(株系CJBl 11)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的野生型GBS蛋白(株系515)、具有氨基酸序列SEQ IDN0:17的野生型GBS蛋白(株系NEM316)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 21的野生型GBS蛋白(株系DK21)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 25的野生型GBS蛋白(株系CJB110)結(jié)合。因此本發(fā)明的多肽還能與這些具有SEQ ID N0:9、13、17、21或25的野生型GBS蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合針對(duì)這些蛋白所產(chǎn)生的抗體。針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體可用標(biāo)準(zhǔn)免疫方法容易地生成且這些抗體結(jié)合SEQ IDN0:l、5、9、13、17、21或25的野生型GBS蛋白的能力可用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)如ELISA實(shí)驗(yàn)評(píng)估。相似地，多肽競(jìng)爭(zhēng)針對(duì)野生型GBS蛋白所產(chǎn)生抗體的能力可用本領(lǐng)域已知的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)技術(shù)容易地測(cè)定，所述技術(shù)包括平衡方法如ELISA、動(dòng)力學(xué)方法如BIACORE 和流式 細(xì)胞分析方法。與SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21或25的野生型GBS蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合針對(duì)這些野生型GBS蛋白之一的抗體的多肽相較該多肽不存在時(shí)會(huì)使觀察到的野生型GBS蛋白和抗體的總結(jié)合下降。通常，與具有SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21或25的GBS蛋白所觀察到的抗體結(jié)合相比，存在本發(fā)明多肽時(shí)，結(jié)合降低10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多、60%或更多，例如結(jié)合降低70%或更多。本發(fā)明多肽誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)GBS67蛋白變體的GBS株系的交叉保護(hù)還可在動(dòng)物模型中確認(rèn)，例如實(shí)施例中所述的母體免疫模型，其中雌性小鼠用多肽免疫，其幼仔用表達(dá)GBS67蛋白變體的GBS株系攻擊。a 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。b 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。c 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。d 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。e 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。f 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。g 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。h值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。i值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。j 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。k值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。I值是至少75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。m 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。n 值是至少 75，例如 80、85、90、92、94、95、96、97、98、99 或更大。通常，a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、I、m 和 n 為至少 90,例如至少 95。t 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400。如SEQ ID NO: I所示的2603菌株的全長(zhǎng)GBS67序列是901個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。因此 t 值還小于 901，例如小于 850、800、750、700、650、600、550、500、450。t 值可為 50-600、100-400、150-300、225-275，例如 120-150。u 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400。如SEQ ID NO: 5所示的H36B菌株的全長(zhǎng)GBS67序列是896個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。因此 u 值還小于 896，例如小于 860、850、800、750、700、650、600、550、500、450。u 值可為50-600、100-400、150-300、225-275，例如 120-150。V 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400。如SEQ ID N0:9所示的CJBlll菌株的全長(zhǎng)GBS67序列是901個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。因此 V 值還小于 901，例如小于 860、850、800、750、700、650、600、550、500、450。v 值可為 50-600、100-400、150-300、225-275，例如 120-150。w 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、 380、390、400。如SEQ ID NO: 13所示的515菌株的全長(zhǎng)GBS67序列是901個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。因此 w 值還小于 901，例如小于 860、850、800、750、700、650、600、550、500、450。w 值可為50-600、100-400、150-300、225-275，例如 120-150。X 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400。如SEQ ID NO: 17所示的NEM316菌株的全長(zhǎng)GBS67序列是901個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。因此 X 值還小于 901，例如小于 860、850、800、750、700、650、600、550、500、450。w 值可為 50-600、100-400、150-300、225-275，例如 120-150。y 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400。如SEQ ID NO: 21所示的DK21菌株的全長(zhǎng)GBS67序列是896個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。因此 y 值還小于 896，例如小于 860、850、800、750、700、650、600、550、500、450。y 值可為50-600、100-400、150-300、225-275，例如 120-150。z 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400。如SEQ ID NO:25所示的CJBllO菌株的全長(zhǎng)GBS67序列是896個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。因此 z 值還小于 896，例如小于 860、850、800、750、700、650、600、550、500、450。z 值可為 50-600、100-400、150-300、225-275，例如 120-150。與SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21和25相比，本發(fā)明的多肽可包括一個(gè)或多個(gè)(例如1、2、5、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸置換，即用另一個(gè)具有相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸置換一個(gè)氨基酸。這些保守氨基酸置換可位于SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21和25的區(qū)域內(nèi)，分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:3和4、7和8、11和12、15和16、19和20,23和24、或27和28。遺傳編碼的氨基酸通常分為四類(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性，即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)極性不帶電，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時(shí)將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起分類為芳族氨基酸。通常，這些家族中單個(gè)氨基酸的替換不會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生重要影響。相對(duì)于SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21和25的片段，本發(fā)明多肽可含有一個(gè)或多個(gè)(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 等)單一氨基酸缺失。相對(duì)于 SEQ ID NO: 1、5、9、13、17、21 和25的片段，該多肽也可包含一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)等)插入(如各1、2、3、4或5個(gè)氨基酸)。這些缺失和插入可位于SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21和25的區(qū)域內(nèi)，分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:3 和 4、7 和 8、11 和 12、15 和 16、19 和 20,23 和 24、或 27 和 28。本發(fā)明的多肽可包括以下氨基酸序列(a)與SEQ ID NO: USEQ ID NO:5,SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 13,SEQID NO: 17,SEQ ID N0:21或SEQ ID N0:25的片段相同(即100%相同性)；(b)與SEQ ID N0:USEQ ID NO:5,SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 13,SEQID NO: 17,SEQID NO:21或SEQ ID NO:25的片段共有序列相同性;(c)與(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)(或更多個(gè))單氨基酸改變(缺失、插入、取代)的序列，這些改變可以位于不同位置或連續(xù)出現(xiàn)；和(d)用成對(duì)比對(duì)算法比對(duì)SEQ ID N0:USEQ ID NO:5,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 25的片段時(shí)，從N末端到C末端的各x個(gè)氨基酸的移動(dòng)窗口(從而對(duì)于延伸到P個(gè)氨基酸的比對(duì)來(lái)說(shuō)，P>x時(shí)，存在p-x+1個(gè)該窗口)具有至少X y個(gè)相同的比對(duì)氨基酸，其中x選自20，25，30, 35，40, 45，50, 60, 70, 80, 90, 100，150，200; y 選自 0. 50，0. 60，0. 70，0. 75，0. 80，0. 85，0. 90，0. 91, 0. 92，0. 93，0. 94，0. 95，0.96，0. 97，0. 98，0. 99;且若x y不是整數(shù)則將其四舍五入為最接近整數(shù)。優(yōu)選的逐對(duì)比對(duì)算法是Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法[4],使用默認(rèn)參數(shù)(如缺口開(kāi)放罰分=10. 0,缺口延伸罰分=0. 5，使用EBL0SUM62積分矩陣)。用EMBOSS軟件包中的needle工具能方便地實(shí)施這種算法[5]。本發(fā)明的多肽可以雜交多肽的形式提供。所述雜交多肽可包括其他GBS或非GBS多肽序列。本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明多肽或雜交多肽的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的多肽、雜交多肽或核酸的免疫原性組合物。此類免疫原性組合物可用在治療或阻止有關(guān)GBS的疾病或病癥的方法中。本發(fā)明還提供表達(dá)本發(fā)明多肽或雜交多肽的的細(xì)胞(通常為細(xì)菌)。雜交多肽本發(fā)明的多肽可與其他多肽作為單一多肽鏈組合表達(dá)(‘雜交’多肽或‘嵌合體’)。雜交多肽提供以下兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)首先，本身不穩(wěn)定或者表達(dá)較差的多肽可以通過(guò)加入能夠克服該問(wèn)題的合適雜交伴侶得到改善；其次，商業(yè)生產(chǎn)得以簡(jiǎn)化，因?yàn)橹恍枥靡淮伪磉_(dá)和純化以生產(chǎn)可作抗原應(yīng)用的兩種多肽。雜交多肽可包括來(lái)自其他GBS抗原和/或其他非GBS抗原的序列。通常，所述雜交多肽包括來(lái)自其他GBS序列的序列，如其他菌毛亞基。這些其他GBS序列可為GBS67多肽的N末端或C末端。不同的雜交多肽可以在單一制劑中混合在一起。雜交多肽可以式NH2-A-{-X-L-}n-B-C00H 表示。
X是本發(fā)明上述的GBS67多肽。如果野生型形式中-X-部分具有前導(dǎo)肽序列，那么在雜交蛋白中可以包含或者略去該序列。在一些實(shí)施方式中，前導(dǎo)肽可缺失，除了位于雜合蛋白N-末端的-X-部分，即保留X1的前導(dǎo)肽，但略去X^Xn的前導(dǎo)肽。這相當(dāng)于刪除所有前導(dǎo)肽并使用X1的前導(dǎo)肽作為-A-部分。在{-X-L-}的各個(gè)n值的情況下，接頭氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，當(dāng) n=2 時(shí)，雜交體可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOl NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH,NH2-X1-X2-L2-COOH等。接頭氨基酸序列-L- 一般較短(如20個(gè)或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接頭(即包含Glyn，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，組氨酸標(biāo)簽(即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然了解其它合適的接頭氨基酸序列。有用的接頭是 GSGS(SEQ ID NO :29)、GSGGGG(SEQID NO:30)或 GSGSGGGG(SEQID NO:31)，Gly-Ser 二肽由BamHI限制位點(diǎn)形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接頭。其他合適接頭，尤其用作最后一個(gè)Ln的接頭是Leu-Glu 二肽或Gly-Ser。接頭通常含至少一種甘氨酸殘基以促進(jìn)結(jié)構(gòu)柔性，如-L-部分可含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多甘氨酸殘基。所述甘氨酸可排列為在Gly-Gly 二肽或更長(zhǎng)的寡Gly序列(即Glyn，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)中包括至少2個(gè)連續(xù)甘氨酸。-A-是任選的N末端氨基酸序列。其一般較短(如40個(gè)或更少的氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè))。例子包括指導(dǎo)蛋白運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)序列，或有利于克隆或純化的短肽序列(如組氨酸標(biāo)簽，即Hisn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。其它合適的N末端氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。如果X1缺少其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-優(yōu)選是提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸)，如Met-Ala-Ser或單個(gè)Met殘基。在新生多肽中，_A_部分可提供多肽的N末端甲硫氨酸(細(xì)菌中為甲酰甲硫氨酸，fMet)?？蓮男律?A-部分的N末端切割一種或多種氨基酸，然而本發(fā)明的成熟多肽中所述-A-部分不必需包括N末端甲硫氨酸。-B-是任選的C末端氨基酸序列。其一般較短(如40個(gè)或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè))。例子包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)男蛄校欣诳寺』蚣兓亩屉男蛄?如包含組氨酸標(biāo)簽，即Hisn，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，或能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列。其他合適的C末端氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、金黃色葡萄球菌(S. aureus)蛋白A的14kDa片段、生物素化肽、麥芽糖結(jié)合蛋白、腸激酶標(biāo)簽等。-A-,-B-和-L-序列優(yōu)選不包括與人多肽序列共有10或更多連續(xù)氨基酸的序列。在一些實(shí)施方式中，-L-部分包含非GBS67抗原。在一些實(shí)施方式中，_A_部分包含非GBS67抗原，且在一些實(shí)施方式中，-B-部分包含非GBS67抗原。多肽可以多種方式制備本發(fā)明所用多肽，例如化學(xué)合成(全部或部分)，用蛋白酶消化較長(zhǎng)多肽，由RNA翻譯，由細(xì)胞培養(yǎng)物純化(如通過(guò)重組表達(dá))，由生物體本身制備(如細(xì)菌培養(yǎng)后，或直接從患者制備)等。產(chǎn)生長(zhǎng)度〈40個(gè)氨基酸的肽的優(yōu)選方法包括體外化學(xué)合成[6，7]。尤其優(yōu)選固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc [8]化學(xué)的方法。也可部分或完全利用酶促合成[9]。作為化學(xué)合成的替代方式，可利用生物合成，例如可通過(guò)翻譯產(chǎn)生多肽。這一過(guò)程可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。生物學(xué)方法通常僅限于產(chǎn)生基于L-氨基酸的多肽，但可通過(guò)操作翻譯機(jī)制(如氨基酰基tRNA分子的翻譯機(jī)制)引入D-氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、疊氮基高丙氨酸等)[10]。然而，包含D-氨基酸時(shí)，優(yōu)選使用化學(xué)合成。多肽的C末端和/或N末端上可能有共價(jià)修飾。多肽可采取各種形式(如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蘧?；嚯?、非肉豆蘧?；嚯?、單體、多聚體、顆粒、變性多肽等)。 多肽優(yōu)選以純化或基本純化的形式提供，即基本不含其它多肽(如不含天然產(chǎn)生的多肽)、特別是不含其它肺炎球菌或宿主細(xì)胞多肽，多肽的純度通常為至少約50重量％，通常至少約90%，即組合物中少于約50%，更優(yōu)選少于約10%(如5%或以下)由其它表達(dá)多肽構(gòu)成。多肽可與固體支持物結(jié)合。多肽可包含可檢測(cè)標(biāo)記(如放射性或熒光標(biāo)記，或生物素標(biāo)記)。術(shù)語(yǔ)“多肽”指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是線性或支鏈聚合物，可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，可以為非氨基酸中斷。該術(shù)語(yǔ)也包括天然修飾或通過(guò)人工介入修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?，如與標(biāo)記組分偶聯(lián)。該定義也包括，例如，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知其它修飾的多肽。多肽可以以單鏈或結(jié)合鏈的形式產(chǎn)生。多肽可以是天然或非天然糖基化的(即該多肽的糖基化模式不同于相應(yīng)天然產(chǎn)生多肽的糖基化模式)。本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，該方法包括在誘導(dǎo)多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞。雖然可以在鏈球菌(Streptococcus)中表達(dá)多肽，但本發(fā)明通常使用異源宿主進(jìn)行表達(dá)。異源宿主可以是原核(例如細(xì)菌)或真核生物。所述宿主通?？梢允谴竽c桿菌(E. coli),其他合適的宿主包括枯草桿菌(Bacillus subtilis)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium) >乳酸胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝桿菌(Mycobacteria)(例如結(jié)核分支桿菌(M. tuberculosis))、酵母等。本發(fā)明還提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其中所述多肽部分或完全用化學(xué)方式合成。本發(fā)明還提供含有兩種或多種本發(fā)明多肽的組合物。核酸本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明多肽或雜交多肽的核苷酸序列的核酸。例如，本發(fā)明提供含編碼多肽的核苷酸的核酸，所述多肽包含選自下組的氨基酸序列或由其組成SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:7、SEQ IDNO:8, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27 或 SEQID NO:28。本發(fā)明也提供所含核苷酸序列與這些核苷酸序列有序列相同性的核酸。這類核酸包括使用替代密碼子編碼相同氨基酸的核酸。具體地，核酸可包括為了在特定微生物如大腸桿菌(E. coli)中表達(dá)而優(yōu)化的替代密碼子。本發(fā)明也提供可與這些核酸雜交的核酸。可以在不同“嚴(yán)謹(jǐn)性”的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。增加雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性的條件在本領(lǐng)域眾所周知且已發(fā)表。相關(guān)條件的例子包括(按嚴(yán)謹(jǐn)性提高的順序)孵育溫度25° C、37。C、50。C、55。C和68° C ;緩沖液濃度IOxSSC、6x SSCUx SSC,0. Ix SSC (其中SSC是0. 15M NaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)和使用其它緩沖液體系的等同條件；甲酰胺濃度0%、25%、50%和75% ; 孵育時(shí)間5分鐘至24小時(shí)；1個(gè)、2個(gè)或更多洗滌步驟；洗滌孵育時(shí)間1、2或15分鐘；以及洗滌溶液6x SSCUx SSC、0. Ix SSC或去離子水。雜交技術(shù)和其優(yōu)化方法為本領(lǐng)域熟知(例如，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)11和222等)。本發(fā)明包括含有這些序列的互補(bǔ)序列的核酸(例如，用于反義或檢測(cè)，或用作引物)。本發(fā)明所述核酸可采取各種形式(如單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標(biāo)記等)。本發(fā)明核酸可以是環(huán)狀或分枝狀核酸，但通常是線性核酸。除非另有說(shuō)明或要求，利用核酸的本發(fā)明任何實(shí)施方式可采用雙鏈形式和構(gòu)成該雙鏈形式的兩條互補(bǔ)單鏈形式中的每條鏈。引物、探針以及反義核酸通常是單鏈。本發(fā)明核酸優(yōu)選以純化或基本純化的形式提供，即基本不含其它核酸(如不含天然產(chǎn)生的核酸)，特別是不含其它GBS或宿主細(xì)胞核酸，通常其純度至少為約50重量％，通常至少為約90%。本發(fā)明核酸優(yōu)選為GBS核酸?？梢远喾N方式制備本發(fā)明的核酸，例如，通過(guò)完全或部分化學(xué)合成(例如DNA的亞磷酰胺合成)、通過(guò)用核酸酶(例如限制性酶)消化較長(zhǎng)核酸、通過(guò)連接較短核酸或核苷酸(例如使用連接酶或聚合酶)、由基因組或cDNA文庫(kù)制備等。本發(fā)明核酸可連接于固體支持物(如珠、平板、濾器、膜、玻片、微陣列支持物、樹(shù)脂等)?？捎美绶派湫曰驘晒鈽?biāo)記、或生物素標(biāo)記來(lái)標(biāo)記本發(fā)明核酸。這在將核酸用于檢測(cè)技術(shù)時(shí)，例如核酸是引物或探針時(shí)特別有用。術(shù)語(yǔ)“核酸”通常包括任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交體。它也包括DNA或RNA類似物，如含有經(jīng)修飾主鏈(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或經(jīng)修飾堿基的類似物。因此，本發(fā)明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA, cDNA、重組核酸、分枝核酸、質(zhì)粒、載體、探針、引物等。本發(fā)明核酸采取RNA形式時(shí)，它可能具有或不具有5’帽。本發(fā)明核酸可以是載體的一部分，即設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染一種或多種細(xì)胞類型的核酸構(gòu)建物的一部分。載體可以是，例如，設(shè)計(jì)用于分離、增殖和復(fù)制所插入核苷酸的“克隆載體”，設(shè)計(jì)用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核苷酸序列的“表達(dá)載體”，設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生重組病毒或病毒樣顆粒的“病毒載體”，或具有一種以上載體類型的屬性的“穿梭載體”。優(yōu)選的載體是質(zhì)粒。“宿主細(xì)胞”包括單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，它可能是或已經(jīng)是外源核酸的受體。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，由于天然、偶然或有意的突變和/或改變，這些后代與原始親本細(xì)胞不必需完全相同(形態(tài)或總DNA互補(bǔ)方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明核酸體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。
應(yīng)理解核酸是DNA時(shí)，RNA序列中的“U”被DNA中的“ T ”所替代。相似地，應(yīng)理解核酸是RNA時(shí)，DNA中的“ T ”被RNA序列中的“U”所替代。涉及核酸的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)的”指沃森克里克堿基配對(duì)。因此，C的互補(bǔ)物是G，G的互補(bǔ)物是C，A的互補(bǔ)物是T (或U)，T (或U)的互補(bǔ)物是A。也能使用諸如I (嘌呤肌苷)等堿基，例如與嘧啶(C或T)互補(bǔ)。本發(fā)明的核酸可用于例如體外或體內(nèi)產(chǎn)生多肽；作為檢測(cè)生物樣品中核酸的雜交探針；產(chǎn)生核酸的額外拷貝；產(chǎn)生核酶或反義寡核苷酸；作為單鏈DNA引物或探針；或作為形成三鏈的寡核苷酸。本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明核酸的方法，其中所述核酸部分或完全用化學(xué)方式合成。本發(fā)明提供包含本發(fā)明核苷酸序列的載體(如克隆或表達(dá)載體)和用這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。免疫原性組合物 本發(fā)明的多肽和雜交多肽可用作免疫原性組合物的活化組分。該免疫原性組合物可用作疫苗。這些疫苗可以是預(yù)防性(即預(yù)防感染)或治療性(即治療感染)疫苗，但一般是預(yù)防性疫苗。因此，組合物可以是藥學(xué)上可接受的。它們通常還包含抗原以外的組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對(duì)這類組分的充分討論參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[217]。組合物通常以水性形式給予哺乳動(dòng)物。然而在給藥前，該組合物可以是非水性形式。例如，雖然一些疫苗制備成水性形式然后以水性形式填裝、分銷和給藥，但其他疫苗在制備過(guò)程中凍干，并在使用時(shí)重建成水性形式。因此，本發(fā)明組合物可被干燥，例如凍干制劑。該組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(即小于g/ml)含汞物質(zhì)，如不含硫柳汞。更優(yōu)選無(wú)汞的疫苗。特別優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。為了控制張度，優(yōu)選包含生理鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，它的濃度可以是l-20mg/ml，例如約10±2mg/ml NaCl?？梢源嬖诘钠渌}包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、無(wú)水磷
酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg-400m0sm/kg,優(yōu)選為240-360m0sm/kg,更優(yōu)選為 290-310m0sm/kg。組合物可含有一種或多種緩沖劑。常用緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(具體是有氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸鹽緩沖劑。包含的緩沖劑一般是5-20mM。組合物的pH通常為5. 0-8. 1，更常為6. 0-8. 0，例如6. 5-7. 5，或者7. 0-7. 8。該組合物優(yōu)選無(wú)菌。該組合物優(yōu)選無(wú)熱原，如每劑量含有<1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量〈O. IEU0該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。所述組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即‘多劑量’藥盒)。多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。作為多劑量組合物中包含防腐劑的替代方案(或補(bǔ)充方案)，所述組合物可包含在裝有無(wú)菌接頭以取出物質(zhì)的容器中。人疫苗的給藥劑量體積一般為約0. 5ml，但可將一半劑量(即約0. 25ml)給予兒
-W-
Mo
本發(fā)明免疫原性組合物也可包含一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑包括一種或多種佐劑。佐劑可包括THl佐劑和/或TH2佐劑，詳述見(jiàn)下?？捎糜诒景l(fā)明組合物的佐劑包括但不限于A.含有礦物質(zhì)的組合物適用作本發(fā)明佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦物鹽,例如氫氧化物(如羥基氧化物)、磷酸鹽(如羥磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)12的第8和9章]，或不同無(wú)機(jī)化合物的混合物，這些化合物可采取任何合適的形式(如凝膠、晶體、無(wú)定形等)，優(yōu)選具有吸附性。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒。
稱為〃氫氧化鋁〃的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)?？刹捎眉t外(IR)光譜將式AlO (OH)代表的羥基氧化鋁與其它鋁化合物，如氫氧化鋁Al (OH)3區(qū)別開(kāi)，具體區(qū)別是1070CI!!—1處存在吸收條帶和3090-3100( ^處存在強(qiáng)肩[參考文獻(xiàn)12的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶程度，結(jié)晶不佳的顆粒因晶體尺寸較小而顯示更強(qiáng)的譜線增寬。表面積隨WHH的增加而增加，WHH值較大的佐劑顯示吸附抗原的能力較強(qiáng)。氫氧化鋁佐劑通常呈纖維形態(tài)(例如，如透射電子顯微圖中所見(jiàn))。氫氧化鋁佐劑的Pl通常約11，即在生理pH下佐劑本身具有表面正電荷。據(jù)報(bào)道，pH 7. 4時(shí)氫氧化鋁佐劑的吸附容量為I. 8-2. 6毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)?？赏ㄟ^(guò)沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽的PO4Al摩爾比通常為0.3-1. 2。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴(yán)格的A1P04。例如，3164CHT1的IR光譜帶(例如，當(dāng)加熱至200°C時(shí))表明存在結(jié)構(gòu)性羥基[參考文獻(xiàn)12的第9章]。磷酸鋁佐劑的PO4Al3+摩爾比通常為0. 3-1.2，優(yōu)選為0. 8-1.2，更優(yōu)選為0.95±0.1。磷酸鋁通常是無(wú)定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A1摩爾比為0.84-0. 92的無(wú)定形羥基磷酸鋁，包含0.6mg Al3Vml0磷酸鋁通常是顆粒(如在透射電子顯微圖上觀察到的板狀形態(tài))?？乖胶箢w粒直徑一般是0. 5-20 y m(如約5-10 y m)。據(jù)報(bào)道，pH 7. 4時(shí)磷酸鋁佐劑的吸附容量為0. 7-1. 5毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。磷酸鋁的零電點(diǎn)(PZC)與磷酸根取代羥基的程度逆相關(guān)，且這種取代程度可根據(jù)用于通過(guò)沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度而變化。也通過(guò)改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=更酸性PZC)或加入緩沖劑如組氨酸緩沖劑(使PZC堿性更強(qiáng))來(lái)改變PZC。本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC通常為4. 0-7. 0，更優(yōu)選為5. 0-6. 5，例如約為5. 7。用于制備本發(fā)明組合物的鋁鹽懸浮液可以但不必定含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)。該懸浮液優(yōu)選無(wú)菌且無(wú)熱原。懸浮液可含有游離的水性磷酸根離子，如存在濃度為I. 0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約10mM。該懸浮液也可含有氯化鈉。在一個(gè)實(shí)施方式中，佐劑組分包括氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。在這種情況下，磷酸鋁多于氫氧化鋁，例如重量比為至少2:1，例如，彡5: I、彡6: I、彡7: I、彡8: I、彡9:1等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優(yōu)選小于10mg/ml,例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml 等。優(yōu)選范圍是 0. 3-lmg/ml。優(yōu)選最大值是〈O. 85mg/劑。B.油乳劑
適用作本發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包含鯊烯-水乳劑，如MF59 [參考文獻(xiàn)12的第10章；也參見(jiàn)參考文獻(xiàn)13] (5%鯊烯、0. 5%吐溫80和0. 5%司盤85，用微流化床配制成亞微米顆粒)。也可以使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。已知各種合適的水包油乳劑，它們通常包括至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容的。乳劑中的油滴直徑通常小于5 U m，乳液宜包含具有亞微米直徑的油滴，通過(guò)微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳劑。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因?yàn)槠淇蛇M(jìn)行過(guò)濾滅菌。本發(fā)明可使用的油諸如來(lái)自動(dòng)物(如魚(yú))或植物的油。植物油的來(lái)源包括堅(jiān)果、種籽和谷物。最常見(jiàn)的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的示例。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見(jiàn)的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫(huà)眉草、黑小麥等?？蓮膱?jiān)果和種籽油開(kāi)始，通過(guò)水解、分離和酯化合適物質(zhì)制備甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是種籽油中天然產(chǎn)生。來(lái)自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實(shí)施本發(fā)明。獲得動(dòng)物來(lái)源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法 的過(guò)程為本領(lǐng)域熟知。大多數(shù)魚(yú)類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚(yú)肝油、鯊魚(yú)肝油和諸如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚(yú)油的示例。通過(guò)生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊魚(yú)肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，即2，6，10, 15，19，23-六甲基-2，6，10, 14，18，22-二十四碳六烯。其它優(yōu)選油是生育酚(見(jiàn)下)。包含鯊烯的水包油乳液是特別優(yōu)選的。可以使用油的混合物。表面活性劑可以按其‘HLB’ (親水/親脂平衡)分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16?？梢耘c本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX 出售的環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈EP/P0嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);以及去水山梨糖醇酯(總稱為司盤)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酯。乳液中包含的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85(脫水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。如上所述，諸如吐溫80等去污劑可提供下文實(shí)施例所見(jiàn)的熱穩(wěn)定性。可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的組合也適合。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優(yōu)選的表面活性劑的含量(重量％)為聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫80)0. 01-1%，特別是約0. 1% ;辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通XlOO或曲通系列的其它去污劑)0. 001-0. 1%，特別是0. 005-0. 02% ;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9) 0. 1_20%，優(yōu)選0. 1_10%，特別是 0. 1-1% 或約 0. 5%O
本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于 藍(lán)烯、吐溫80 (Tween 80)和司盤(Span) 85的亞微米乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約O. 5%聚山梨酯80和約O. 5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例為4. 3%鯊烯、O. 5%聚山梨酯80和O. 48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59’ [14-16]，參考文獻(xiàn)17的第10章和參考文獻(xiàn)18的第12章更詳細(xì)地描述了該佐劑。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 包含鯊烯、α生育酚和聚山梨酯80的乳液。這些乳液可含有2_10%鯊烯、2_10%生育酚和O. 3-3%吐溫80，鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選彡I (例如O. 90)，因?yàn)檫@能使乳液更穩(wěn)定。鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2，或者重量比約為11:5?？赏ㄟ^(guò)將吐溫80溶解于PBS產(chǎn)生2%溶液，然后將90ml該溶液與5gDL_ α -生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，隨后使該混合物微流體化來(lái)制備一種這類乳液。得到的乳液可含有如平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。 鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含3d_MPL (見(jiàn) 下)。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖液?！ず芯凵嚼骢?如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸鹽)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75:11:10(如7501^/1111聚山梨酯80、1101^/1111曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α-生育酚)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。所述乳液還可包含鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL(見(jiàn)下)。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。 鯊?fù)椤⒕凵嚼骢?0和泊洛沙姆401 ( “普流羅尼克 L121”(〃PlUr0niCTMLI21〃))的乳液。所述乳液可用PH 7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水配制。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，且已與含蘇氨?；?MDP的“SAF-1”佐劑[19] (O. 05_l%Thr_MDP、5%鯊烯、2. 5%普流羅尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80) —起使用。也可不與Thr-MDP—起使用，例如用“AF”佐劑[20] (5%鯊烯、I. 25%普流羅尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80)。優(yōu)選微流體化。·含有鯊烯、水溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯
(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳液優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[21]。該乳液也可含有以下一種或多種物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。這類乳液可凍干。 含有O. 5-50%油、O. 1-10%磷脂和O. 05-5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)22所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸?！げ豢纱x油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液。可包含添加劑，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂偶聯(lián)物(如通過(guò)葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫酰基皂苷上而產(chǎn)生的GPI-0100，如參考文獻(xiàn)23所述)、二甲基雙十八烷基溴化銨和/或N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺?！ぐV物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[24]。
·包含礦物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[24]。 皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[25]。通常在傳遞給病人時(shí)混合組合物中的抗原和佐劑?？梢栽谏a(chǎn)時(shí)或在遞送時(shí)將該乳液與抗原臨時(shí)混合。因此，在包裝或出售的疫苗中該佐劑和抗原可分開(kāi)保存，使用時(shí)配制成最終制劑。所述抗原通常是水性形式，從而最終通過(guò)混合兩種液體制備疫苗。所述兩種液體的混合體積比可變(例如5:1-1:5)，但通常約為1:1。C.皂苷制劑[參考文獻(xiàn)12的第22章]皂苷制劑也可以用作本發(fā)明的佐劑。皂苷是在許多植物物種的樹(shù)皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的留醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。已廣泛研究了作為佐劑的得自皂皮樹(shù)(Quillaia saponaria Molina)樹(shù)皮的阜苷。阜苷也可市售獲自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥阜草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21，以及脂質(zhì)制劑如ISCOM。QS21以商標(biāo)Stimulon 出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術(shù)純化的特定組分，包括037、0317、0318、0321、0!^、0!1-8和職-(。所述皂苷優(yōu)選QS21。制備QS21的方法公開(kāi)于參考文獻(xiàn)26。皂苷制劑也可包含留醇，如膽固醇[27]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)12第23章]。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻(xiàn)27-29中進(jìn)一步描述了 ISC0M。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[30]。 開(kāi)發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)31和32。D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP )也可以用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常包含一種或多種任選與磷脂組合或一起配制的病毒蛋白質(zhì)。其通常無(wú)病原性，不能復(fù)制，且通常不含任何天然病毒基因組。所述病毒蛋白可重組生成或分離自全病毒。這些適用于病毒體或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾沃克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、QP -噬菌體(如外殼蛋白)、GA-噬菌體、噬菌體、AP205噬菌體和Ty (如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pi)的蛋白。VLP在參考文獻(xiàn)33_38中有進(jìn)一步描述。病毒體在(例如)參考文獻(xiàn)39中有進(jìn)一步描述。E.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，如腸細(xì)菌脂多糖(LPS)的無(wú)毒衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的無(wú)毒衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A (MPL)和3_0_脫酰基MPL (3dMPL)。3dMPL是3脫-O-酰基單磷酰脂質(zhì)A與4、5或6條?；湹幕旌衔?。3脫-O-酰基單磷酰脂質(zhì)A的優(yōu)選“小顆?！毙问焦_(kāi)于參考文獻(xiàn)40。3dMPL的這種“小顆?！毙〉阶阋酝ㄟ^(guò)O. 22um膜過(guò)濾除菌[40]。其它無(wú)毒LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，例如RC 529 [41，42]。
脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物，如0M-174。例如參考文獻(xiàn)43和44中描述了 0M-174。適用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過(guò)磷酸鍵與鳥(niǎo)苷連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文結(jié)構(gòu)或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可以包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，且可以是雙鏈或單鏈。參考文獻(xiàn)45、46和47公開(kāi)了可能的類似取代，例如用2’-脫氧-7-脫氮鳥(niǎo)苷取代鳥(niǎo)苷。參考文獻(xiàn)48-53中進(jìn)一步討論了 CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可針對(duì)TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT [54]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，如CpG-A 0DN，或更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，如CpG-B ODN0參考文獻(xiàn)55-57中討論了 CpG-A 和 CpG-B ODN。優(yōu)選 CpG 為 CpG-A ODN。
CpG寡核苷酸優(yōu)選構(gòu)建成5’末端可被受體識(shí)別。任選將兩個(gè)CpG寡核苷酸序列的3’端相連接形成“免疫聚體”。參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)54和58-60?；诿庖叽碳ば怨押塑账岬奶貏e有用的佐劑被稱為IC_31 [61]。因此，本發(fā)明使用的佐劑可以包含⑴和(ii)的混合物(i)含有至少一個(gè)(優(yōu)選多個(gè))CpI基序(即胞嘧啶與肌苷相連形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40個(gè)核苷酸)，和(ii)聚陽(yáng)離子聚合物，如含有至少一個(gè)(優(yōu)選多個(gè))Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20個(gè)氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚體序列5’-(IC) 13-3’ (SEQ ID NO: 32)的脫氧核苷酸。聚陽(yáng)離子聚合物可以是含有11-聚體氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO: 33)的肽。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選所述蛋白衍生自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。參考文獻(xiàn)62中描述了脫毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的應(yīng)用，參考文63中描述了其作為胃腸外佐劑的應(yīng)用。所述毒素或類毒素優(yōu)選全毒素形式，包含A和B亞基。A亞基優(yōu)選含有脫毒突變亞基優(yōu)選不突變。所述佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作為佐劑的應(yīng)用可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)64-71。一種有用的CT突變體是CT-E29H[72]。優(yōu)選根據(jù)參考文獻(xiàn)73中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基排列對(duì)氨基酸取代基編號(hào)，該參考文獻(xiàn)特定通過(guò)引用全文納入本文。F.人免疫調(diào)節(jié)劑適用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL_12[74]等)[75]、干擾素(例如干擾素-Y )、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是IL-12。G.生物粘著劑和粘膜粘著劑生物粘著劑和粘膜粘著劑也可以用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質(zhì)酸微球[76]或粘膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯(lián)衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[77]。H.微粒微粒也可以用作本發(fā)明的佐劑。微粒(即直徑為 IOOnm至 150 μ m，更優(yōu)選直徑^200nm-^30 μ tm,最優(yōu)選直徑 500nm_ 10 μ m的顆粒)由生物可降解的無(wú)毒材料(例如,聚(α -羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己內(nèi)酯等)形成，優(yōu)選聚丙交酯乙交酯共聚物，并任選經(jīng)處理而具有帶負(fù)電表面(例如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽(yáng)離子去污劑如CTAB處理)。I.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)12的第13和14章)適用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見(jiàn)參考文獻(xiàn)78-80所述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[81]。這種制劑還包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑和辛苯糖醇[82]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[83]的組合。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)84和85。L.胞壁酰肽適用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(去甲-MDP )和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2- (Γ -2’ - 二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)_乙胺MTP-PE )。M.咪唑并喹諾酮(Imidazoquinolone)化合物適用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，〃瑞喹莫德3M")，其進(jìn)一步描述于參考文獻(xiàn)86和87。本發(fā)明也可包含以上鑒定的一種或多種佐劑各方面的組合。例如，可將以下佐劑組合物用于本發(fā)明(1)皂苷和水包油乳劑[88] ；(2)皂苷(如QS21) +無(wú)毒LPS衍生物(如3dMPL) [89] ; (3)皂苷(如QS21) +無(wú)毒LPS衍生物(如3dMPL) +膽固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任選+固醇)[90] ； (5) 3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合[91] ； (6) SAF，含有10%鯊烯、O. 4%吐溫80 、5%普朗尼克-嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP,或微流體化成為亞微米乳液或渦旋振蕩產(chǎn)生粒度較大的乳液。(7) Ribi 佐劑系統(tǒng)(RAS) (RI公司(Ribilmmunochem))，含有2%鯊烯、O. 2%吐溫80和一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，所述組分選自單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(Detox );和(8) —種或多種礦物鹽(如鋁鹽)+LPS的無(wú)毒衍生物(如3dMPL)。用作免疫刺激劑的其它物質(zhì)公開(kāi)于參考文獻(xiàn)12的第7章。特定在兒童中，使用氫氧化鋁和/或磷酸鋁佐劑有效，且抗原通常吸附于這些鹽。也優(yōu)選水包鯊烯乳液，特定在老年人中。有用的佐劑組合包括Thl和Th2佐劑的組合，如CpG和明礬或雷西莫特和明礬?？梢允褂昧姿徜X和3dMPL的組合。本發(fā)明組合物可引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及體液免疫應(yīng)答。通常認(rèn)為兩種T細(xì)胞類型CD4和CD8細(xì)胞是啟動(dòng)和/或增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)免疫和體液免疫所必需的。⑶8T細(xì)胞可表達(dá)⑶8共受體，通常稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。⑶8T細(xì)胞能夠識(shí)別MHC I型分子上展示的抗原或與之相互作用。⑶4T細(xì)胞可表達(dá)⑶4共受體，通常稱為T輔助細(xì)胞。⑶4T細(xì)胞能夠識(shí)別結(jié)合MHCII型分子的抗原性肽。與MHC II型分子相互作用后，CD4細(xì)胞可分泌諸如細(xì)胞因子等因子。這些分泌的細(xì)胞因子可激活B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和參與免疫應(yīng)答的其它細(xì)胞。輔助T細(xì)胞或CD4+細(xì)胞可進(jìn)一步分為兩個(gè)功能不同的亞組即細(xì)胞因子和效應(yīng)功能不同的THl表型和TH2表型。活化的THl細(xì)胞能增強(qiáng)細(xì)胞免疫(包括抗原特異性CTL生成增加)，因而對(duì)響應(yīng)胞內(nèi)感染具有特定價(jià)值?；罨腡Hl細(xì)胞可分泌IL-2、IFN-Y和TNF-β中的一種或多種。THl免疫應(yīng)答可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞、NK (自然殺傷)細(xì)胞和CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)。通過(guò)用IL-12刺激B和T細(xì)胞的生長(zhǎng)，THl免疫應(yīng)答也可用于放大免疫應(yīng)答。THl刺激的B細(xì)胞可分泌IgG2a。
活化的TH2細(xì)胞提高抗體生成，因此對(duì)響應(yīng)胞外感染具有價(jià)值?；罨腡H2細(xì)胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和ILlO中的一種或多種。TH2免疫應(yīng)答可引起產(chǎn)生IgGU IgE, IgA和用于未來(lái)保護(hù)的記憶B細(xì)胞。增強(qiáng)的免疫應(yīng)答可包括增強(qiáng)的THl免疫應(yīng)答和TH2免疫應(yīng)答中的一種或多種。THl免疫應(yīng)答可包括以下一種或多種CTL增加，與THl免疫應(yīng)答相關(guān)的一種或多種細(xì)胞因子(如IL-2、IFNy和TNF-β )增加，活化巨噬細(xì)胞增加，NK活性增加，或者IgG2a生成增加。增強(qiáng)的THl免疫應(yīng)答優(yōu)選包括IgG2a生成增加?？墒褂肨Hl佐劑引發(fā)THl免疫應(yīng)答。相對(duì)于不用佐劑的抗原免疫，THl佐劑通常引起IgG2a生成水平增加。適用于本發(fā)明的THl佐劑可包括例如，皂苷制劑、病毒體和病毒樣顆粒、腸細(xì)菌脂多糖(LPS)的無(wú)毒衍生物、免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸是本發(fā)明所用的優(yōu)選THl佐劑。TH2免疫應(yīng)答可包括以下一種或多種 與TH2免疫應(yīng)答相關(guān)的一種或多種細(xì)胞因子(如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)增加，或者IgGl、IgE、IgA和記憶B細(xì)胞生成增加。增強(qiáng)的TH2免疫應(yīng)答優(yōu)選包括IgGl生成增加。可使用TH2佐劑引發(fā)TH2免疫應(yīng)答。相對(duì)于不用佐劑的抗原免疫，TH2佐劑通常引起IgGl生成水平增加。適用于本發(fā)明的TH2佐劑包括例如，含礦物質(zhì)組合物、油乳劑和ADP-核糖基化毒素和其脫毒衍生物。含礦物質(zhì)組合物如鋁鹽是本發(fā)明使用的優(yōu)選TH2佐劑。組合物可包括THl佐劑和TH2佐劑的組合。這種組合物優(yōu)選引起增強(qiáng)的THl和增強(qiáng)的TH2應(yīng)答，即IgGl和IgG2a的生成相對(duì)于不用佐劑的免疫均有增加。更優(yōu)選地，相對(duì)于用單一佐劑的免疫(即，相對(duì)于只用THl佐劑的免疫或只用TH2佐劑的免疫)，包含THl和TH2佐劑組合的組合物引起THl增加和/或TH2免疫應(yīng)答增強(qiáng)。所述免疫應(yīng)答可以是THl免疫應(yīng)答和TH2免疫應(yīng)答之一或兩種。免疫應(yīng)答優(yōu)選提供增強(qiáng)的THl應(yīng)答和增強(qiáng)的TH2應(yīng)答之一或兩種。增強(qiáng)的免疫應(yīng)答可以是全身免疫應(yīng)答和粘膜免疫應(yīng)答之一或兩種。該免疫應(yīng)答優(yōu)選提供增強(qiáng)的全身免疫應(yīng)答和增強(qiáng)的粘膜免疫應(yīng)答之一或兩種。優(yōu)選粘膜免疫應(yīng)答為TH2免疫應(yīng)答。粘膜免疫應(yīng)答優(yōu)選包括IgA生成增加。鏈球菌(Streptococcal)感染可影響機(jī)體的各個(gè)部分，因此可將本發(fā)明組合物制備成各種形式。例如，可將所述組合物制備為液體溶液或懸浮液形式的注射劑。也可制備適合在注射前溶解或懸浮于液體載劑的固體形式(如凍干組合物或噴霧凍干組合物)。可制備所述組合物用于局部給藥，例如作為油膏、乳膏或粉劑。該組合物可制備用于口服給藥，如作為片劑或膠囊，噴霧劑，或糖漿劑(任選調(diào)味)?？蓪⑺鼋M合物制備為采用細(xì)粉或噴霧的肺部給藥制劑，例如吸入劑。可將所述組合物制備為栓劑或陰道栓。所述組合物可以制成鼻部、耳部或眼部給藥制劑，例如滴劑。組合物可以是藥盒形式，設(shè)計(jì)成在臨給予患者之前重建的合并組合物。這種藥盒可包含一種或多種液體形式的抗原以及一種或多種凍干抗原。組合物在使用前臨時(shí)制備(例如，以凍干形式提供組分)和以藥盒形式提供時(shí)，該藥盒可包括兩個(gè)藥瓶，或者可包括一個(gè)已填充的注射器和一個(gè)藥瓶，所述注射器內(nèi)容物用于在注射前再次激活藥瓶?jī)?nèi)容物。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它組分?！懊庖哂行Я俊敝冈谝淮蝿┝炕蛞幌盗袆┝康囊徊糠种薪o予個(gè)體的對(duì)治療或預(yù)防有效的量。該量根據(jù)待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、待治療個(gè)體的分類群(例如，非人靈長(zhǎng)類、靈長(zhǎng)類等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)情況的評(píng)估和其它相關(guān)因素而變化。預(yù)計(jì)所述量將落入可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的相對(duì)較寬范圍內(nèi)。核酸免疫上述免疫原性組合物包括來(lái)自GBS的多肽抗原。然而，在所有情況下，可用編碼這些多肽的核酸(通常是DNA)替換多肽(和雜交多肽)抗原，以得到基于核酸免疫的組合物、方法和用途[92-99]。編碼免疫原的核酸在遞送給病人后體內(nèi)表達(dá)，然后所表達(dá)的免疫原刺激免疫系統(tǒng)?；钚猿煞滞ǔ２捎煤怂彷d體形式，其包含(i)啟動(dòng)子；(ii)可操作連接于啟動(dòng)子的免疫原編碼序列；以及任選(iii)選擇標(biāo)記物。優(yōu)選的載體還可包含(iv)復(fù)制起點(diǎn)；以及(V) 位于(ii)下游并與其可操作連接的轉(zhuǎn)錄終止子。通常，(i)和(V)為真核的，(iii)和(iv)為原核的。優(yōu)選的啟動(dòng)子是病毒啟動(dòng)子,如來(lái)自巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子。除了啟動(dòng)子，載體還可以包含與啟動(dòng)子功能性相互作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(如增強(qiáng)子)。優(yōu)選的載體包含立即早期CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，更優(yōu)選的載體還包含CMV內(nèi)含子A。將該啟動(dòng)子可操作連接于編碼免疫原的下游序列，從而使免疫原編碼序列的表達(dá)在該啟動(dòng)子的控制之下。當(dāng)使用標(biāo)記物時(shí)，優(yōu)選其在微生物宿主中(如原核生物、細(xì)菌、酵母中)具有功能。標(biāo)記物優(yōu)選原核選擇標(biāo)記物(如在原核啟動(dòng)子控制之下轉(zhuǎn)錄)。方便起見(jiàn)，典型的標(biāo)記物為抗生素抗性基因。所述載體優(yōu)選自主復(fù)制附加體或染色體外載體，如質(zhì)粒。所述載體優(yōu)選包括復(fù)制起點(diǎn)。該復(fù)制起點(diǎn)優(yōu)選在原核生物中有活性而在真核生物中無(wú)活性。因此優(yōu)選的載體包含用于選擇載體的原核標(biāo)記物、原核復(fù)制起點(diǎn)以及驅(qū)動(dòng)免疫原編碼序列轉(zhuǎn)錄的真核啟動(dòng)子。因此載體(a)在原核宿主中擴(kuò)增并選擇，但不進(jìn)行多肽表達(dá)，而(b)在真核宿主中表達(dá)，但不進(jìn)行擴(kuò)增。這種配置對(duì)于核酸免疫載體來(lái)說(shuō)是理想的。所述載體可以在編碼序列下游包含真核轉(zhuǎn)錄終止序列。這能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)編碼序列本身不包含聚腺苷酸化序列時(shí)，所述載體優(yōu)選包含聚腺苷酸化序列。優(yōu)選的聚腺苷酸化序列來(lái)自于牛生長(zhǎng)激素。所述載體可包括多克隆位點(diǎn)。除免疫原和標(biāo)記物的編碼序列外，載體可以包含第二個(gè)真核編碼序列。載體還可在所述第二序列上游包含IRES，以從與該免疫原相同的轉(zhuǎn)錄物中翻譯第二條真核多肽?；蛘撸庖咴幋a序列可以在IRES的下游。 所述載體可以包含非甲基化CpG基序，如非甲基化DNA序列，它們都在鳥(niǎo)苷之前有一個(gè)胞嘧啶，側(cè)接有兩個(gè)5’嘌呤和兩個(gè)3’嘧唆。在其非甲基化形式中，已證明這些DNA基序是多種類型免疫細(xì)胞的強(qiáng)效刺激因子。載體可以靶向方式進(jìn)行遞送。例如，參考文獻(xiàn)100-105中描述了受體介導(dǎo)的DNA遞送技術(shù)。在基因治療方案中，以約100ng-200mg DNA的范圍局部給予包含核酸的治療性組合物。在基因治療方案中也能使用濃度范圍約500ng-50mg，約I μ g-2mg,約5 μ g-500 μ g以及約20 μ g-100 μ g的DNA。諸如作用方法(如提高或抑制編碼基因產(chǎn)物的水平)以及轉(zhuǎn) 化和表達(dá)效率等因素是影響最終功效所需劑量的考慮因素。當(dāng)需要在更大面積組織上更強(qiáng)表達(dá)時(shí)，可能需要更大量的載體或在連續(xù)給藥方案中重復(fù)給予相同量，或?qū)Σ煌噜徎蚓o密組織部分多次給藥，以達(dá)到陽(yáng)性治療效果。在所有情況下，使用臨床試驗(yàn)中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法確定最優(yōu)治療效果的特定范圍?？捎没蜻f送運(yùn)載體來(lái)遞送載體?；蜻f送運(yùn)載體可以是病毒或非病毒來(lái)源(通常參見(jiàn)參考文獻(xiàn)106-109)。本領(lǐng)域熟知用于遞送所需核酸并在所需細(xì)胞中表達(dá)的基于病毒的載體。示例性基于病毒的載體包括但不限于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如參考文獻(xiàn)110-120)，基于α病毒的載體(如辛德畢斯病毒載體、西門利克森林病毒(ATCC VR-67 ；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(ATCC VR-373 ；ATCC VR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923 ；ATCC VR-1250 ；ATCCVR 1249 ；ATCC VR-532);還可以使用這些病毒的雜交體或嵌合體)、痘病毒載體(如牛痘、鳥(niǎo)痘、金絲雀痘、改性的安卡拉牛痘等)、腺病毒載體和腺伴隨病毒(AAV)載體(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)121-126)。還能給予連接已滅活腺病毒的DNA[127]。還能使用非病毒遞送運(yùn)載體和方法，包括但不限于連接或不連接單獨(dú)滅活腺病毒的聚陽(yáng)離子濃縮DNA[如127]，配體連接的DNA[128]，真核細(xì)胞遞送運(yùn)載體細(xì)胞[如參考文獻(xiàn)129-133]和核電荷中和或與細(xì)胞膜融合。還能使用裸露DNA。參考文獻(xiàn)134和135中描述了引入裸露DNA的示例性方法。參考文獻(xiàn)136-140中描述了可作為基因遞送運(yùn)載體的脂質(zhì)體(如免疫脂質(zhì)體)。參考文獻(xiàn)141和142中描述了其它方法。其它適用的非病毒遞送包括機(jī)械遞送系統(tǒng)，如參考文獻(xiàn)142所述方法。而且，可通過(guò)光聚合水凝膠材料沉積或使用電離輻射來(lái)遞送此編碼序列和其表達(dá)產(chǎn)物[如參考文獻(xiàn)143和144]。其它可用于遞送編碼序列的常規(guī)基因遞送方法包括例如，使用手持式基因傳遞顆粒槍[145]或使用離子輻射激活轉(zhuǎn)移的基因[143和144]。使用PLG (聚丙交酯乙交酯共聚物)微粒遞送DNA是一個(gè)尤其優(yōu)選的方法，如吸附于微粒上，微粒任選經(jīng)處理成表面帶負(fù)電(如用SDS處理)或帶正電(如用陽(yáng)離子去垢劑如CTAB處理)。治療方法和所述疫苗給予本發(fā)明還提供了使哺乳動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括給予有效量的上述多肽、雜交多肽、核酸或免疫原性組合物的步驟。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選為保護(hù)性，并優(yōu)選涉及抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)免疫。該方法可以引起增強(qiáng)的應(yīng)答。本發(fā)明還提供上述多肽、雜交多肽、核酸或免疫原性組合物用作藥物，如在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供上述多肽、雜交多肽、核酸或免疫原性組合物在生產(chǎn)引起哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物中的用途。借助這些應(yīng)用和方法在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，能保護(hù)該哺乳動(dòng)物抵御GBS引起的疾病和/或感染，例如抵御腦膜炎。本發(fā)明還提供了一種預(yù)填充本發(fā)明免疫原性組合物的遞送裝置。所述哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。所述人可為青少年或成人。 檢測(cè)治療性處理功效的一種方式包括在給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測(cè)GBS感染。一種檢查預(yù)防性處理功效的方法包括用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來(lái)測(cè)試免疫后血清；例如，可在調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)(OPKA)中測(cè)試血清，其調(diào)理細(xì)菌的能力指示了保護(hù)效力。另一種檢查預(yù)防性處理功效的方法涉及在GBS感染的動(dòng)物模型，例如豚鼠或小鼠中的免疫后攻擊。參考文獻(xiàn)146中描述了一種此類模型。另一評(píng)價(jià)本發(fā)明組合物免疫原性的途徑是重組表達(dá)多肽，通過(guò)免疫印跡和/或微陣列篩查患者血清或粘膜分泌物。多肽和患者樣品間的陽(yáng)性反應(yīng)表明患者已經(jīng)產(chǎn)生對(duì)受試多肽的免疫應(yīng)答。該方法也可用于鑒定免疫顯性抗原和/或抗原中的表位。本發(fā)明的組合物通常直接給予患者?？赏ㄟ^(guò)胃腸外注射(如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或組織間隙)，或通過(guò)粘膜，如經(jīng)直腸、口腔(如片劑、噴霧)、陰道、局部、透皮或經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼、耳、肺或其它粘膜途徑給藥來(lái)完成直接遞送。本發(fā)明可用于引起全身和/或粘膜免疫，優(yōu)選引起增強(qiáng)的全身和/或粘膜免疫。增強(qiáng)的全身和/或粘膜免疫優(yōu)先表現(xiàn)為提高的THl和/或TH2免疫應(yīng)答。增強(qiáng)的免疫應(yīng)答優(yōu)選包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA生成增加?？梢酝ㄟ^(guò)單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行給藥。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過(guò)相同或不同途徑給予各劑量，例如采用胃腸外初次免疫和粘膜加強(qiáng)免疫、粘膜初次免疫和胃腸外加強(qiáng)免疫等。一般以至少I周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)的間隔給予多個(gè)劑量?？捎冒凑毡景l(fā)明制備的疫苗治療兒童和成年人。因此，人患者可以小于I歲、小于5歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受疫苗的優(yōu)選患者是青少年(如13-20歲)、孕婦和老年人(如> 50歲、> 60歲和優(yōu)選> 65歲)。然而所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的群體。可將本發(fā)明產(chǎn)生的疫苗與其它疫苗基本上同時(shí)(在健康護(hù)理專業(yè)人員或疫苗接種中心的同一用藥咨詢或就診期間)給予患者，例如與風(fēng)疹疫苗、水痘疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如四價(jià)A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗、流感病毒疫苗(包括流行性流感病毒疫苗)等基本上同時(shí)給藥。還可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，具體是對(duì)流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(shí)給予患者(如在健康護(hù)理專業(yè)人員的同一用藥咨詢或就診期間)。這些抗病毒化合物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如(3R，4R, 5S) -4-乙?；被?5-氨基-3 (I-乙基丙氧基)-I-環(huán)己烯-I-羧酸或5-(乙?；被?-4-[(氨基亞氨基甲基)-氨基]-2，6-脫水-3，4，5-三脫氧-D-甘油-D-半乳糖壬_2_烯酮酸，包括它們的酯(如乙酯)和鹽(如磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(3R，4R, 5S)-4-乙?；被?5-氨基-3 (I-乙基丙氧基)-I-環(huán)己烯-I-羧酸，乙酯和磷酸鹽(1:1)，也稱為磷酸奧塞米韋(達(dá)菲(TAMIFLU) )。組合除了 GBS67多肽片段以外，組合物可包括(i)針對(duì)GBS蛋白，特別是針對(duì)GBS67以外的GBS蛋白引發(fā)抗體應(yīng)答的一種或多種其他多肽；(ii)GBS的莢膜糖；和/或(iii)引發(fā)識(shí)別非GBS生物體上表位的抗體應(yīng)答的一種或多種其他免疫原。與其他多肽抗原的組合上述GBS67多肽片段可與選自下組的一種或多種(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或所 有 10)多肽抗原組合(I) (GBS80)抗原;(2)GBS59 抗原;(3)GBS1523 抗原;(4) GBS 104 抗原;(5)GBS1524 抗原;(6)GBS3 抗原;(7)SAN1485 抗原;(8)GBS147 抗原;(9)GBS328 抗原;和/或(10)GBS84抗原。這些其他抗原可作為單獨(dú)多肽加入。作為替代，其可作為雜交物加入，如GBS80-GBS1523雜交物。作為另一種替代，其可融合GBS67多肽片段以提供雜交多肽。任意這些組合也可包括一種或多種GBS莢膜糖，其通常偶聯(lián)載體蛋白。下面提供所述糖和偶聯(lián)的進(jìn)一步信息。GBS80原始’GBS67’ (SAG0645)序列注釋于參考文獻(xiàn)147，為細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白(參見(jiàn)GI: 22533660)。出于參比目的，2603菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS80的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID NO: 34。本發(fā)明所用的優(yōu)選GBS80多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO : 34 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高);和 / 或(b)包含 SEQ ID NO 34 的至少 ’ η’ 個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中，η，是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 GBS80 蛋白包括 SEQ ID NO :34 的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID NO :34的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ IDN0:34C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或SEQ IDNO: 34N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))，而保留SEQ ID N0:34的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。野生型GBS 80在SEQ ID NO: 34的氨基酸1_37包含N-末端前導(dǎo)或信號(hào)序列區(qū)域。GBS 80前導(dǎo)或信號(hào)序列區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被移除，如SEQ ID N0:35。野生型序列還在SEQ ID NO: 34的氨基酸526-543包含C-末端跨膜區(qū)域?？缒^(qū)域和/或胞質(zhì)區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被移除，如SEQ IDNO:36ο野生型GBS80在SEQ ID Ν0:34的氨基酸521-525包含指示細(xì)胞壁錨定的氨基酸基序。在一些重組宿主細(xì)胞系統(tǒng)中，移除該基序有助于重組GBS80多肽從所述宿主細(xì)胞中分泌。因此所述跨膜和/或胞質(zhì)區(qū)域和細(xì)胞壁錨定基序可從GBS80中移除，如SEQ ID Ν0:37。或者，在一些重組宿主細(xì)胞系統(tǒng)中，用所述細(xì)胞壁錨定基序?qū)⒅亟M表達(dá)多肽錨定在細(xì)胞壁上是有用的。表達(dá)多肽的胞外結(jié)構(gòu)域在純化中可被切割，或所述重組多肽可結(jié)合滅活的宿主細(xì)胞或最終組合物中的細(xì)胞膜，如SEQ ID Ν0:38。野生型GBS80的特定免疫原性片段位于所述多肽的N末端方向，為SEQ ID N0:39。GBS59GBS59是毒力島2a(BP_2a)編碼的菌毛主干蛋白。出于參比目的，2603菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS59的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID N0:40。本發(fā)明所用的GBS59多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO 40具有60%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高);和 / 或(b)包含SEQID N0:40的至少’η’個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中’ η’是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 GBS59蛋白包括SEQ ID Ν0:40的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID NO :40的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID NO: 40C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多 個(gè))，而保留SEQ ID N0:40的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。GBS59變體存在于株系H36B、515、C JB111、DK21和C JB110中。出于參比目的，H36B、515、CJB111、CJBllO和DK21菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS59的氨基酸序列在本文中作為SEQ IDNO: 41、42、43、44和45。本發(fā)明所用的優(yōu)選GBS59多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :41、42、43、44 或 45 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高);和/或(b)包含 SEQ ID NO:41、42、43、44或45的至少’η’個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中’ η’是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。(b)的優(yōu)選片段包含來(lái)自SEQ ID N0:41、42、43、44或45的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID NO:41,42,43,44或45C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))，而保留SEQID N0:41、42、43、44或45的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。GBS1523原始’ GBS 1523’ (SAN1518; SpbI)序列注釋于參考文獻(xiàn)3，為細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白(參見(jiàn)GI: 77408651)。出于參比目的，COHl菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS1523的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID N0:46。本發(fā)明所用的優(yōu)選GBS1523多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與 SEQ ID NO 46 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高);和/或(b)包含 SEQID NO 46 的至少’η’個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中’η’是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 GBS1523 蛋白包括 SEQ ID NO :46 的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID N0:46的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID N0:46C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))，而保留SEQ ID NO:46的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。野生型GBS1523在SEQ ID NO:46的氨基酸1_29包含N-末端前導(dǎo)或信號(hào)序列區(qū)域，其可從片段中移除，如SEQ ID NO:47。野生型序列在SEQ IDNO:46的氨基酸468-472包含指示細(xì)胞壁錨定的氨基酸基序(LPSTG)。在一些重組宿主細(xì)胞系統(tǒng)中，優(yōu)選移除該基序以有助于重組多肽從所述細(xì)胞中分泌?；蛘邇?yōu)選使用所述細(xì)胞壁錨定基序?qū)⒅亟M表達(dá)多肽錨定在細(xì)胞壁上。表達(dá)多肽的胞外結(jié)構(gòu)域可在純化中進(jìn)行切割，或所述重組多肽可結(jié)合滅活的宿主細(xì)胞或最終組合物中的細(xì)胞膜。還在SEQ ID NO:46的氨基酸419-429鑒定到含保守谷氨酸殘基的E盒，在殘基423處具有保守的谷氨酸。所述E盒基序可能對(duì)寡聚菌毛樣結(jié)構(gòu)的形成很重要，且因此GBS1523的有用片段可包括該保守谷氨酸殘基。鑒定到GBS1523的突變，其中SEQ ID N0:46位置41處的谷氨酰胺(Q)替換為賴氨酸(K)，這是由于編碼核酸序列中的密碼子從CAA突變?yōu)锳AA。該替代可存在于GBS1523序列和GBS1523片段中(如SEQ IDNO:48)。所述組合物包括GBS80和GBS 1523時(shí)，可使用雜交多肽。GBS80-GBS 1523雜交物的示例見(jiàn)參考文獻(xiàn)148且包括SEQ ID NOS:49-52的多肽。GBS104原始’ GBS104’ (SAG0649)序列在參考文獻(xiàn)147中注釋為‘細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白’(參見(jiàn)GI :22533664)。出于參比目的，2603菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS104的氨基酸序列在 本文中作為SEQ ID N0:53。本發(fā)明所用的GBS104多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與 SEQ ID NO :53 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高);和/或(b)包含 SEQ ID N0:53 的至少’η’個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中，η，是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 GBS104 蛋白包括 SEQ ID NO :53 的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ IDN0:40的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID N0:53C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))，而保留SEQ ID N0:53的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。GBS1524出于參比目的，COHl菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS1524(SAN1519)的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID N0:54。本發(fā)明所用的優(yōu)選GBS1524多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與 SEQ ID NO :54 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高);和/或(b)包含 SEQ ID N0:54 的至少’η’個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中’η’是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 GBS1524 蛋白包括 SEQ ID NO :54 的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID N0:54的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID N0:54C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))，而保留SEQID N0:54的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。GBS3原始’GBS3’ (SAG2603;BibA)序列在參考文獻(xiàn)147中標(biāo)注為’毒力蛋白’(參見(jiàn)GI:22535109)。出于參比目的，2603菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS3的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID NO: 55。本發(fā)明所用的優(yōu)選GBS3多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與SEQ IDNO 55 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高);和 / 或(b)包含 SEQ ID NO 55 的至少 ’ η’ 個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中 ’η’ 是 7 或更高(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。這些GBS3蛋白包括SEQ ID NO :55的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID N0:35的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID NO: 55C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多個(gè))，而保留 SEQ ID N0:55 的至少一個(gè)表
位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)域。野生型GBS3在SEQ ID NO: 55的氨基酸1_36包含N-末端前導(dǎo)或信號(hào)序列區(qū)域，其可從片段中移除，如SEQ ID N0563OGBS3還包括指示細(xì)胞壁錨定的氨基酸基序(LPXTG)、跨膜區(qū)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)149)。前導(dǎo)或信號(hào)序列區(qū)域、跨膜區(qū)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、和細(xì)胞壁錨定基序都可從GBS3中移除，留下如下所示的包括卷曲螺旋和富含脯氨酸的區(qū)段(SEQ ID N0:57)。GBS3的替代區(qū)段可包括信號(hào)序列區(qū)域和卷曲螺旋區(qū)段(SEQ IDNO:58);卷曲螺旋區(qū)段(SEQ ID NO:59);或信號(hào)序列區(qū)域、卷曲螺旋區(qū)段和富含脯氨酸的區(qū)段(SEQ ID NO:60)。GBS3 變體存在于 515 株系(SAL2118)、CJBlll 株系(SAM1974)和 COHl 株系(SAN2207)中。515株系、CJBlll株系和COHl株系中全長(zhǎng)GBS3的參比氨基酸序列在本文中分別作為SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:62和SEQID N0:63。因此，本發(fā)明所用的GBS3多肽還可包含某一氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :61、SEQ ID NO 62或SEQ ID NO 63 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高)；和 / 或(b)包含 SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62 或 SEQID N0:63的至少’η’個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中’ η’是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 GBS3 蛋白包括 SEQ IDNO:61,SEQID Ν0:62 或 SEQ ID Ν0:63 的變體。(b)的優(yōu)選片段包含來(lái)自 SEQ ID N0:61、SEQID NO: 62 或 SEQ ID NO: 63 的表位。其他優(yōu)選片段缺少 SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62 或 SEQID NO:63C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))，而保留SEQ IDNO:61,SEQ ID N0:62或SEQ ID N0:63的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明包括使用與以上詳述中討論的2603株系中GBS3片段類似的515、cjblll和cohl株系中GBS3片段，如缺少N-末端前導(dǎo)或信號(hào)序列區(qū)域；包括卷曲螺旋和富含脯氨酸的區(qū)段；包括信號(hào)序列區(qū)域和卷曲螺旋的區(qū)段；或包括信號(hào)序列區(qū)域、卷曲螺旋和富含脯氨酸的區(qū)段。SAN1485原始’ SAN1485’序列在參考文獻(xiàn)3中注釋為‘細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白’(參見(jiàn)GI :77408233)。出于參比目的，COHl菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)SAN1485的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID N0:64。本發(fā)明所用的優(yōu)選SAN1485多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :64 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高);和 / 或(b)包含 SEQ ID NO 64 的至少 ’ η’ 個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中’η’是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 SAN1485 蛋白包括 SEQ ID NO :64 的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID N0:64的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID N0:64C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多個(gè))，而保留 SEQ ID N0:64 的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域。GBS147原始’GBS147’ (SAG0416)序列在參考文獻(xiàn)147中標(biāo)注為’推定蛋白酶’(參見(jiàn)GI: 22533435) 0出于參比目的，2603菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS147的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID N0:65。本發(fā)明所用的優(yōu)選GBS147多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與SEQ IDNO :65 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或更高);和 / 或(b)包含 SEQ ID NO 65 的至少 ’ η’ 個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中 ’η’ 是 7 或更高(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 GBS147 蛋白包括 SEQ ID NO :65 的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID N0:65的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID NO:65C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨 基酸(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多個(gè))，而保留 SEQ ID N0:65 的至少一個(gè)表位。GBS328原始’ GBS328’ (SAG1333)序列在參考文獻(xiàn)147中標(biāo)注為’ 5’ -核苷酸酶家族蛋白’(參見(jiàn)GI: 22534359)。出于參比目的，2603菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS328的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID N0:66。本發(fā)明所用的優(yōu)選GBS328多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與 SEQ ID NO :66 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高);和 / 或(b)包含 SEQ ID NO 66 的至少，η，個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中’η’是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高)。這些 GBS328 蛋白包括 SEQ ID NO :66 的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID N0:66的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID N0:66C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))，而保留SEQ ID NO:66的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域。GBS84原始’ GBS84’(SAG0907)序列在參考文獻(xiàn)147中標(biāo)注為’推定脂蛋白’(參見(jiàn)GI: 22533929)。出于參比目的，2603菌株中發(fā)現(xiàn)的全長(zhǎng)GBS84的氨基酸序列在本文中作為SEQ ID N0:67。本發(fā)明所用的優(yōu)選GBS84多肽包含某一氨基酸序列，該序列(a)與SEQ IDNO 67 具有 60% 或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高);和 / 或(b)包含 SEQ ID NO 67 的至少 ’ η’ 個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中 ’η’ 是 7 或更高(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。這些GBS84蛋白包括SEQ ID NO :67的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID N0:67的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID NO:67C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè))和/或N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25 或更多個(gè))，而保留 SEQ ID NO: 67 的至少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域。
與GBS糖的組合GBS67多肽片段可與通常偶聯(lián)載體蛋白的一種或多種GBS莢膜糖組合。因此，本發(fā)明提供一種包含以下組合的免疫原性組合物(I)上述討論的GBS67多肽片段；和(2) —種或多種GBS莢膜糖。該組合的組分(2)所用的糖理想上作為含有糖部分和載體蛋白部分的偶聯(lián)物存在。偶聯(lián)物中的載體部分可為單一 GBS67多肽片段、雜交GBS67多肽、非GBS67GBS多肽或非GBS多肽。所述糖來(lái)自GBS的莢膜糖。糖可以是多糖，其大小是在從細(xì)菌純化該糖期間形成，或者可以是這種多糖片段化產(chǎn)生的寡糖。
組合物可包含來(lái)自以下一種或多種鏈球菌血清型的莢膜糖Ia、Ib、Ia/C、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。組合物可包括多種血清型如2、3、4、5、6、7或8種血清型。包括來(lái)自一種或多種血清型la、lb、II、III和V的糖有用。這5種血清型的莢膜糖各包括(a)末端N-乙?；?神經(jīng)氨酸(NeuNAc)殘基(一般稱為唾液酸)，在所有情況下2 — 3連接至半乳糖殘基；和(b)三糖核心內(nèi)的N-乙?；?葡糖胺殘基(GlcNAc)。本發(fā)明所用糖可為天然形式，或也可被修飾。例如，糖可以比天然莢膜糖短，或可被化學(xué)修飾。例如，所述糖可去-O-乙?；?部分或全部)、去-N-乙?；?部分或全部)、N-丙?；?部分或全部)等?？稍谂悸?lián)之前、期間或之后進(jìn)行去乙?；珒?yōu)選在偶聯(lián)前進(jìn)行。根據(jù)具體的糖，去乙?；捎绊懟虿挥绊懨庖咴浴⒖嘉墨I(xiàn)150討論了各種血清型中GBS糖上O-乙?；年P(guān)聯(lián)，且在一些實(shí)施方式中，位置7、8和/或9的唾液酸殘基的
O-乙?；谂悸?lián)前、中和后都保留，例如通過(guò)保護(hù)/去保護(hù)、通過(guò)再乙?；?。然而，本發(fā)明所用的GBS糖通常基本不發(fā)生位置7、8和/或9的唾液酸殘基的O-乙?；??？赏ㄟ^(guò)常規(guī)試驗(yàn)評(píng)價(jià)去乙酰化等的效果。另一可能修飾是從糖中移除唾液酸殘基如側(cè)鏈末端的唾液酸[151]。具體地,血清型V莢膜糖用于本發(fā)明時(shí)，其可如參考文獻(xiàn)[151]所述通過(guò)去唾液酸苷化修飾。脫唾液酸化的GBS血清型V莢膜糖可通過(guò)以下方式制備在溫和酸性條件下(例如O. IM硫酸，80°C持續(xù)60分鐘)處理純化的GBS血清型V莢膜糖或者用神經(jīng)氨酸酶處理，如參考文獻(xiàn)151所述。在另一實(shí)例中，可解聚全長(zhǎng)多糖以提供用于本發(fā)明的較短片段，例如，通過(guò)在溫和酸中水解、通過(guò)加熱、通過(guò)尺寸選擇色譜等。已報(bào)道鏈長(zhǎng)影響GBS糖在兔子中的免疫原性[152]。具體地，血清型II和/或III莢膜糖用于本發(fā)明時(shí)，其可如參考文獻(xiàn)153所述解聚。該文獻(xiàn)描述了通過(guò)溫和去氨基切割為含末端還原的2，5-脫水-D-甘露糖殘基的抗原片段來(lái)部分解聚II型和III型莢膜糖?？赏ㄟ^(guò)已知技術(shù)純化莢膜糖，如本文引用的參考文獻(xiàn)所述，如參考文獻(xiàn)154。典型的方法包括堿提取、離心、過(guò)濾、RNA酶/DNA酶處理、蛋白酶處理、濃縮、尺寸排阻色譜、超濾、陰離子交換色譜和進(jìn)一步超濾。作為替代，可使用參考文獻(xiàn)155所述的純化過(guò)程。該過(guò)程涉及堿提取、乙醇/CaCl2處理、CTAB沉淀和再溶。本發(fā)明不限于純化自天然來(lái)源的糖，然而，可通過(guò)其它方法如全合成或部分合成獲得所述糖。糖通?？膳c載體蛋白偶聯(lián)。通常，與載體的共價(jià)偶聯(lián)增強(qiáng)糖的免疫原性，因?yàn)榕悸?lián)可以將糖由T-非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門-依賴性抗原，由此能夠引發(fā)免疫記憶。
已廣泛報(bào)道GBS糖的偶聯(lián)，例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)156-163。GBS糖偶聯(lián)的典型現(xiàn)有技術(shù)方法涉及將純化的糖還原性胺化到載體蛋白，例如破傷風(fēng)類毒素(TT)或CRM197上[157]。還原胺化涉及載體氨基酸側(cè)鏈上的胺基與糖上的醛基。由于GBS莢膜糖在其天然形式中不包括醛基，通常是在偶聯(lián)之前通過(guò)糖唾液酸殘基的一部分發(fā)生氧化(如高碘酸鹽氧化)產(chǎn)生醛基[157，164]。已顯示此方法制備的偶聯(lián)疫苗就各GBS血清型la、lb、II、III和V而言在人體中安全且具有免疫原性[165]。優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素，如白喉或破傷風(fēng)毒素、或其類毒素或突變體。這些常用于偶聯(lián)疫苗。偶聯(lián)物中的載體蛋白可以是或不是(I)中GBS59抗原之一。若不是GBS59抗原，其可為不同的GBS抗原。在一些實(shí)施方式中，盡管載體不是GBS抗原，其可以是例如細(xì)菌毒素或類毒素。常用載體蛋白是白喉或破傷風(fēng)類毒素，或其突變物。還可使用毒素或類毒素的片段，例如破傷風(fēng)類毒素的片段C[166]。白喉毒素的CRM197突變體[167-169]對(duì)本發(fā)明特別有用。其他合適的載體蛋白包括，腦膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)外膜蛋白復(fù)合物 [170]、合成肽[171、172]、熱激蛋白[173，174]、百日咳蛋白[175，176]、細(xì)胞因子[177]、淋巴因子[187]、激素[187]、生長(zhǎng)因子、含有各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細(xì)胞表位的人造蛋白[178]如N19[179]、流感嗜血桿菌(H. influenzae)的D蛋白[180-182]、鐵攝取蛋白[183]、艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B[184]、重組金黃色葡萄球菌(P. aeruginosa)胞外蛋白 A(rEPA) [185]等等。當(dāng)組合物包含一種以上偶聯(lián)物時(shí)，每種偶聯(lián)物可使用相同的載體蛋白或不同的載體蛋白。在一些實(shí)施方式中，一種偶聯(lián)物可攜帶來(lái)自多種血清型的糖[186]。然而，每種偶聯(lián)物通常包含來(lái)自一種血清型的糖。偶聯(lián)物可包含過(guò)量載體(w/w)或過(guò)量糖(w/w)。在一些實(shí)施方式中，偶聯(lián)物可包含相同重量的載體和糖。例如，可使用糖蛋白比(w/w)為1:5-5:1的偶聯(lián)物,特定是1:5-2:1的比例。載體分子可直接與載體共價(jià)偶聯(lián)，或通過(guò)接頭偶聯(lián)?？赏ㄟ^(guò)(例如)糖和載體之間的還原性胺化(如參考文獻(xiàn)187和188所述)，實(shí)現(xiàn)與蛋白質(zhì)的直接連接。首先需要通過(guò)，例如氧化來(lái)激活糖?？捎萌魏我阎椒?，如參考文獻(xiàn)189和190所述的過(guò)程通過(guò)接頭基團(tuán)進(jìn)行連接。優(yōu)選的連接類型是己二酸接頭，這種連接可通過(guò)以下方式形成將游離-NH2基團(tuán)與己二酸偶聯(lián)(如通過(guò)胺化引入葡聚糖中)(例如，利用二酰亞胺活化)，然后將蛋白質(zhì)偶聯(lián)于所得的糖-己二酸中間體[191，192]。另一種優(yōu)選連接類型是羰基接頭，這種連接可通過(guò)以下方式形成使糖CDI的游離羥基發(fā)生反應(yīng)[193，194]，然后與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成氨基甲酸酯連接。其它接頭包括丙酰胺基[195]、硝基苯基-乙基胺[196]、鹵代酰基鹵化物、糖苷鍵[198]、6_氨基己酸[199]、ADH[200]、C4-C12部分[201]等。也采用碳二亞胺縮合反應(yīng)[202]。與非GBS抗原組合GBS67片段可與非GBS抗原聯(lián)用。因此，本發(fā)明提供一種包含以下組合的免疫原性組合物(I)上述討論的GBS67多肽片段；和
(2) 一種或多種選自下組的抗原白喉類毒素；破傷風(fēng)類毒素；一種或多種百日咳抗原；乙型肝炎病毒表面抗原；滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原；C群腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)莢膜糖抗原的偶聯(lián)物；Y群腦膜炎奈瑟球菌莢膜糖抗原的偶聯(lián)物；W135群腦膜炎奈瑟球菌莢膜糖抗原的偶聯(lián)物；A群腦膜炎奈瑟球菌莢膜糖抗原的偶聯(lián)物；一種或多種流感抗原；和一種或多種人乳頭狀瘤病毒抗原?？赏ㄟ^(guò)處理(例如用甲醒)來(lái)自白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)的白喉毒素獲得白喉類毒素。例如，參考文獻(xiàn)203的第13章更詳細(xì)地公開(kāi)了白喉類毒素。可通過(guò)處理(例如用甲醒)來(lái)自破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)的破傷風(fēng)毒素獲得破傷風(fēng)類毒素。參考文獻(xiàn)203的第27章更詳細(xì)地公開(kāi)了破傷風(fēng)類毒素。疫苗中的百日咳抗原是細(xì)胞(全細(xì)胞，Pw)或無(wú)細(xì)胞(Pa)。本發(fā)明可用于分選百日咳抗原。已經(jīng)詳盡記載了細(xì)胞百日咳抗原的制備(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)203的第21章)，例如，可通過(guò)加熱滅活百日咳博德特菌(B. pertussis)的I期培養(yǎng)物獲得該抗原。非細(xì)胞 百日咳抗原包含特定的純化百日咳博德特菌(B. pertussis)抗原,它們或是由天然細(xì)菌純化，或是在重組宿主中表達(dá)后純化。通常使用一種以上非細(xì)胞抗原，因此組合物可包含以下熟知和已良好鑒定的百日咳博德特菌抗原中的一種、兩種或三種(1)脫毒的百日咳毒素(百日咳類毒素或“PT”)；(2)絲狀血細(xì)胞凝集素(“FHA”)；(3)百日咳桿菌粘附素(也稱為“69千道爾頓外膜蛋白”)。在根據(jù)本發(fā)明使用之前，可用甲醛處理FHA和百日咳桿菌粘附素。可通過(guò)甲醛和/或戊二醛處理對(duì)PT脫毒，但是，作為此種化學(xué)脫毒方法的替代方案，它可以是酶活性經(jīng)誘變降低的突變PT[204]?？梢允褂玫钠渌羌?xì)胞百日咳抗原包括菌毛(如凝集原2和3)。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒衣殼的主要組分?？赏ㄟ^(guò)在酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中重組表達(dá),方便地產(chǎn)生這種抗原。滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒(IPV)抗原由細(xì)胞培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的病毒制備并隨后滅活(例如用甲醛)。因?yàn)榧顾杌屹|(zhì)炎可由三類脊髓灰質(zhì)炎病毒之一引起(如參考文獻(xiàn)203的第24章所述)，所以組合物可包含以下三類脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原I型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如Mahoney毒株)、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如MEF-I毒株)和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如Saukett 毒株)。組合物的組分(2)中包含白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素或非細(xì)胞百日咳抗原之一時(shí)，它通常包含所有這三種抗原，即組分(2)包含D-T-Pa組合。組合物的組分(2)中包含白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素或細(xì)胞百日咳抗原之一時(shí)，它通常包含所有這三種抗原，即組分(2)包含D-T-Pw組合。人乳頭瘤病毒抗原包括LI衣殼蛋白，其可裝配形成稱作病毒樣顆粒(VLP)的結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)在酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))或昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如夜蛾(Spodoptera)細(xì)胞,如草地貪夜蛾(S. frugiperda),或果蜆(Drosophila)細(xì)胞)中重組表達(dá)LI產(chǎn)生VLP。在酵母細(xì)胞中，質(zhì)粒載體可攜帶LI基因；在昆蟲(chóng)細(xì)胞中，桿狀病毒載體可攜帶LI基因。更優(yōu)選地，該組合物包含來(lái)自HPV-16和HPV-18毒株的LI VLP。已證明這種二價(jià)組合非常有效[205]。除了 HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含來(lái)自HPV-6和HPV-Il毒株的LI VLP，產(chǎn)生四價(jià)組合。流感抗原可為當(dāng)前流感病毒疫苗的形式。目前可以獲得各種形式的流感病毒疫苗(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[203]的第17和18章)。疫苗通?；诨畈《尽缁畈《?、重組血細(xì)胞凝集素或病毒體。滅活疫苗可基于全病毒顆粒、裂解病毒顆?；蚧诩兓谋砻婵乖?。本發(fā)明疫苗中的抗原可以采取活病毒的形式，或者更優(yōu)選地，采取滅活病毒的形式。疫苗可為例如，三價(jià)疫苗(如包括來(lái)自A/H1N1菌株、A/H3N2菌株和B菌株的血細(xì)胞凝集素)。在其他實(shí)施方式中，所述疫苗是單價(jià)疫苗(如包括來(lái)自A/H1N1菌株或A/H5N1菌株的血細(xì)胞凝集素)。所述疫苗可為含佐劑(如水包油乳液)或不含佐劑。人乳頭瘤抗原為從重組HPV外殼蛋白組裝的中空病毒樣顆粒(VLP)，通常來(lái)自HPV16型和18型，且任選地還來(lái)自HPV 6型和11型。抗體GBS抗原的抗體可用于被動(dòng)免疫[206]。因此本發(fā)明提供同時(shí)、分別或依次給予的抗體組合，其中所述組合包括以下至少兩種(a)識(shí)別上述定義的第一氨基酸序列的抗體；(b)識(shí)別上述定義的第二氨基酸序列的抗體；和/或(C)識(shí)別上述定義的第三氨基酸序列的抗體； 本發(fā)明還提供此類抗體組合在治療中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供此類抗體組合在藥物制造中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種治療哺乳動(dòng)物的方法，其包括給予哺乳動(dòng)物有效量的該組合。如上就免疫原性組合物所述，這些方法和應(yīng)用能夠保護(hù)哺乳動(dòng)物抵御GBS感染。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的免疫球蛋白分子及其能結(jié)合抗原的片段。這些包括雜交(嵌合)抗體分子[207,208] ;F(ab' )2和F(ab)片段和Fv分子；非共價(jià)異源二聚體[209,210];單鏈Fv分子(sFv) [211] ;二聚和三聚抗體片段構(gòu)建物；小抗體[212,213];人源化抗體分子[214-216];和任何獲自此類分子的功能性片段，以及通過(guò)非常規(guī)方法如噬菌體展示獲得的抗體。優(yōu)選所述抗體為單克隆抗體。獲取單克隆抗體的方法為本領(lǐng)域熟知。優(yōu)選人源化或完全人抗體。概述除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將采用化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法，這些方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分描述。參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)217-224等。上文使用“GI”編號(hào)。GI編號(hào)，或者“基因信息識(shí)別號(hào)”(Genlnfo Identifier)是NCBI將序列加入其數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，連續(xù)對(duì)每一序列記錄指定的一串?dāng)?shù)字。GI編號(hào)與序列記錄登錄號(hào)沒(méi)有相似之處。序列更新(如糾正或加入更多注釋或信息)后，將接受新GI編號(hào)。因此與給定GI編號(hào)相關(guān)的序列是不變的。當(dāng)本發(fā)明涉及“表位”時(shí)，該表位可以是B細(xì)胞表位和/或T細(xì)胞表位.可憑經(jīng)驗(yàn)鑒定此類表位(如使用PEPSCAN[225，226]或相似方法)，或可對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)(如使用詹姆森-沃爾夫抗原性指數(shù)(Jameson-Wolf antigenic index) [227]、基于矩陣的方法[228]、ΜΑΡΙΤ0ΡΕ[229], ΤΕΡΙΤ0ΡΕ [230, 231],神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[232]、OptiMer 和 EpiMer [233，234]、ADEPT [235]、T位點(diǎn)[236]、親水性[237]、抗原性指數(shù)[238]或參考文獻(xiàn)239-243中公開(kāi)的方法等)。表位是由抗體或T細(xì)胞受體的抗原結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別并結(jié)合的抗原的某部分，它們也稱作“抗原決定簇”。術(shù)語(yǔ)“包含”涵蓋“包括”以及“由……組成”，例如，“包含”Χ的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質(zhì)，例如Χ+Υ。
術(shù)語(yǔ)“基本”不排除“完全”，如“基本不含” Y的組合物可能完全不含Y。必要時(shí)，可以從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語(yǔ)“基本”。與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”是可選的并表示例如x± 10%。除非另有說(shuō)明，包括混合兩種或多種組分的步驟的過(guò)程不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何順序混合。有三種組分時(shí)，可將兩種組分相互合并，然后可將合并物再與第三種組分混合等?？贵w通常對(duì)于其靶標(biāo)是特異性的。因此，其對(duì)靶標(biāo)的親和性高于無(wú)關(guān)對(duì)照 蛋白，例如牛血清白蛋白。
兩個(gè)氨基酸序列間的序列相同性百分?jǐn)?shù)表示進(jìn)行比對(duì)時(shí)所比較的兩條序列中相同氨基酸的百分?jǐn)?shù)。利用本領(lǐng)域已知軟件程序，例如參考文獻(xiàn)224的7. 7. 18部分所描述的軟件程序，可進(jìn)行比對(duì)并確定同源性百分?jǐn)?shù)或序列相同性百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的比對(duì)通過(guò)史密斯-沃特曼(Smith-ffaterman )同源性搜索算法使用仿射缺口搜索確定，其中缺口開(kāi)放罰12分，缺口延伸罰2分，BLOSUM矩陣計(jì)62分。參考文獻(xiàn)245中公開(kāi)了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1:2603(SAG1408)和 H37B (SAI1512)的 GBS67 比對(duì)，顯示片段 I (Frl)、片段2 (Fr2)和片段3(Fr3)的位置。圖2:2603(圖 2A)和 H36B (圖 2B)的片段 I (Frl)、片段 2 (Fr2)和片段 3 (Fr3)的純化。圖3:針對(duì)GBS672603(圖3A)和GBS67H36B(圖3B)產(chǎn)生的多克隆抗體在Western印跡分析中識(shí)別兩種變體的片段3 (Fr 3)，但不是片段2 (Fr 2)或片段I (Fr I)。圖4 ffestern印跡分析中，針對(duì)2603中片段I的抗體僅識(shí)別2603變體的重組片段 I (I 2603)和 2603 變體的全長(zhǎng) GBS67 (FL 2603)。H36B 的全長(zhǎng) GBS67 (FL H36B)、H36B的片段1、2和3以及2603的片段2和3沒(méi)有被識(shí)別。圖5A =Western印跡分析中，針對(duì)2603中片段2的抗體識(shí)別2603變體的重組片段
2(2 2603)和H36B變體的重組片段2 (2 2603)，以及2603變體的全長(zhǎng)GBS67 (FL 2603)。圖5B =Western印跡分析中，針對(duì)2603中片段3的抗體識(shí)別2603變體的重組片段
3(32603)和H36B變體的重組片段3 (32603)，以及2603變體的全長(zhǎng)GBS67 (FL 2603)和H36B 的全長(zhǎng) GBS67 (FL H36B)。
具體實(shí)施例方式GBS67變體為交叉保護(hù)已鑒定GBS67(APl_2a)的兩種等位基因變體，一種在GBS株系2603中且一種在GBS株系H36B中。GBS株系2603中鑒定的GBS67株系具有優(yōu)勢(shì)，是存在于87%的GBS株系中的變體。這兩種GBS67變體中任一種都能賦予針對(duì)表達(dá)另一 GBS67變體的GBS株系的交叉保護(hù)。例如，如下表I所述，用2603株系的GBS67(APl-2a)免疫的雌鼠幼仔得到保護(hù)免受表達(dá)GBS67 2603或H36B變體的GBS株系的攻擊。表I:在GBS小鼠母體免疫/幼仔攻擊模型中GBS67賦予交叉保護(hù)
權(quán)利要求
1.一種多肽，所述多肽包括 i)SEQID NO: I的至少7個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDNO:4的氨基酸序列的表位； ii)具有與SEQID NO: I至少90%相同性的氨基酸序列中至少7個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:4氨基酸序列的表位具有至少90%相同性的表位； iii)SEQID NO:5的至少7個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括SEQ IDNO:8的氨基酸序列的表位； iv)具有與SEQID NO: 5至少90%相同性的氨基酸序列中至少7個(gè)連續(xù)氨基酸片段，其中所述片段包括與SEQ ID N0:8氨基酸序列的表位具有至少90%相同性的表位。
2.如權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，所述多肽由以下片段組成 i)SEQID NO: I的片段，其中所述片段含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列； ii)與SEQID NO: I具有90%相同性的氨基酸序列的片段，其中所述片段包括與SEQ IDN0:4具有至少90%相同性的氨基酸序列； iii)SEQID NO:5的片段，其中所述片段含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列； iv)與SEQID N0:5具有90%相同性的氨基酸序列的片段，其中所述片段包括與SEQ IDN0:8具有至少90%相同性的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求I或2所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括或由以下片段組成i)SEQID NO: I的片段，所述片段包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列；*ii)SEQ ID N0:5的片段，所述片段包括SEQ ID N0:8的氨基酸序列。
4.一種多肽，所述多肽包含氨基酸序列A-{-X-L} n_B 其中各X是權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)定義的多肽；L是任選的接頭氨基酸序列；A是任選的N末端氨基酸序列；B是任選的C末端氨基酸序列；n是I或更大的整數(shù)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽引起包含抗體的抗體應(yīng)答，所述抗體結(jié)合具有SEQ ID NO: I氨基酸序列的野生型GBS蛋白和具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的野生型GBS蛋白的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽引起包含抗體的抗體應(yīng)答，該抗體與具有氨基酸序列SEQ ID N0:9的野生型GBS蛋白(株系CJB111)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的野生型GBS蛋白(株系515)、具有氨基酸序列SEQ ID NO: 17的野生型GBS蛋白(株系NEM316)、具有氨基酸序列SEQ ID NO:21的野生型GBS蛋白(株系DK21)、具有氨基酸序列SEQ IDNO:25的野生型GBS蛋白(株系CJB110)結(jié)合。
7.一種包括糖部分和載體蛋白部分的偶聯(lián)物，所述載體蛋白部分包括如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽。
8.—種編碼權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽的核酸。
9.一種包括權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求7所述的偶聯(lián)物或權(quán)利要求8所述的核酸的免疫原性組合物。
10.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求7所述的偶聯(lián)物、權(quán)利要求8所述的核酸或權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物在治療中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求7所述的偶聯(lián)物、權(quán)利要求8所述的核酸或權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物在治療或預(yù)防GBS引起的疾病和/或感染，包括在治療或預(yù)防腦膜炎中的應(yīng)用。
12.—種在哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防GBS引起的疾病和/或感染，優(yōu)選腦膜炎的方法，所述方法包括給予有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求7所述的偶聯(lián)物、權(quán)利要求8所述的核酸或權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物。
13.—種表達(dá)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽的細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療和阻止無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B群鏈球菌;GBS)的蛋白和組合物。
文檔編號(hào)C07K14/315GK102770444SQ201180011318
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者C·D·日努多, D·邁文 申請(qǐng)人:諾華有限公司