專利名稱：生物學(xué)制品人源化激動(dòng)性抗-pd-1抗體的制作方法
生物學(xué)制品人源化激動(dòng)性抗-PD-1抗體本發(fā)明涉及對(duì)人ro-i的抗原決定簇具有特異性的抗體分子和包含所述抗體分子的組合物。本發(fā)明還涉及抗體分子、組合物的治療性用途和用于產(chǎn)生所述抗體分子的方法。程序化死亡I (PD-I)，也稱為⑶279 ;基因名稱H)⑶I ;登錄號(hào)NP_005009為在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的刺激性與抑制性信號(hào)之間的平衡和維持外周耐受性中具有至關(guān)重要的作用的細(xì)胞表面受體(Ishida, Y 等人 1992EMB0 J 113887 ；Kier, Mary E 等人 2008Annu RevTmmunol 26677-704 ;0kazaki, Taku 等人 2007International Immunology 19813-824)。其為與CD28具有同源性的免疫球蛋白超家族的抑制性成員。ro-i的結(jié)構(gòu)為單體I型跨膜蛋白，其由一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)樣細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以及含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。ro-i的表達(dá)在T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞和單核細(xì)胞上是可誘導(dǎo)的,例如在通過T細(xì)胞受體(TCR)或B細(xì)胞受體(BCR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化淋巴細(xì)胞后(Kier，MaryE 等人 2008Annu Rev Immunol 26677-704;Agata, Y 等人 1996IntImmunol 8765-72)。PD-1 具有兩個(gè)已知的配體，PD-L1 (B7-H1, CD274)和TO-L2 (B7-DC, CD273)，它們?yōu)锽7家族的細(xì)胞表面表達(dá)的成員(Freeman, Gordon等人 2000J Exp Med 1921027 ;Latchman, Y 等人 2001 Nat Immunol 2261)。當(dāng)銜接配體時(shí)，PD-I將磷酸酶例如SHP-I和SHP-2招募至其細(xì)胞內(nèi)酪氨酸基序，所述基序隨后使被TCR或BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的效應(yīng)分子脫去磷酸(Chemnitz，J等人2004J Immunol 173 945-954 ；Riley, James L 2009Immunological Reviews 229114-125)。由此，僅當(dāng)其同時(shí)與 TCR 或BCR銜接時(shí)，PD-I才可將抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細(xì)胞和B細(xì)胞。已證明F1D-I通過細(xì)胞內(nèi)在(cell-intrinsic)和細(xì)胞外在(cell-extrinsic)功能機(jī)制下調(diào)效應(yīng)τ細(xì)胞應(yīng)答。經(jīng)由ro-i的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)τ細(xì)胞的無反應(yīng)或無應(yīng)答性狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞不能克隆性擴(kuò)增或產(chǎn)生最佳水平的效應(yīng)細(xì)胞因子。ro-i還可通過其抑制來自共刺激的存活信號(hào)的能力(這導(dǎo)致關(guān)鍵抗細(xì)胞凋亡分子例如Bcl-a的減少的表達(dá))來誘導(dǎo)T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(Kier，Mary E等人2008AnnuRev Tmmunol 26677-704)。除了這些直接作用外，最近的公開案已顯示，PD-I通過促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tkk)的誘導(dǎo)和維持來參與效應(yīng)細(xì)胞的抑制。例如，已顯示在樹突細(xì)胞上表達(dá)的ro-Ll與TGF-β協(xié)同作用來促進(jìn)具有增強(qiáng)的抑制功能的⑶4+FoxP 3+TKE(；的誘導(dǎo)(Francisco, LoiseM等人2009J Exp Med2063015-3029)。PD-I在外周耐受性和炎性疾病中的重要性的第一指標(biāo)來自觀察結(jié)果ro-i敲除(Pdcdr7O小鼠產(chǎn)生自發(fā)的自身免疫性。50%的C57BL/6背景的Pdcdl+小鼠到14月齡時(shí)產(chǎn)生狼瘡樣腎小球腎炎和關(guān)節(jié)炎并且BALB/c-Pdcdl+小鼠從第5周開始產(chǎn)生致命性擴(kuò)張型心肌病和產(chǎn)生抗心肌肌I丐蛋白I的自身抗體(Nishimura, H等人1999Immunity11141-151 ;Nishimura，H 等人 2001Science 291319-322)。此外，將 PD-1 缺陷引入非肥胖糖尿病(NOD)小鼠品系顯著地加速了糖尿病的發(fā)作和發(fā)病率，導(dǎo)致所有NOD-Pdcdl+小鼠在 10 周齡時(shí)發(fā)生糖尿病(Wang, J 等人 2005Proc Natl Acad Sci USA 10211823)。此外，通過使用自身免疫的誘導(dǎo)型鼠模型例如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)或移植/移植物抗宿主(GVHD)模型，幾個(gè)研究小組已顯示阻斷I3D-I-PD-L相互作用可惡化疾病，這進(jìn)一步確認(rèn)了 ro-i在炎性疾病中的至關(guān)重要的作用。重要地，有證據(jù)表明，ro-i在人中與在小鼠中具有相當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)功能，因?yàn)槿藃ocDi的多態(tài)性與許多自身免疫疾病包括全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化(MS)、I型糖尿病(TID)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和格雷斯夫病相關(guān)(Okazaki, Taku 等人 2007International Immunology 19813-824 ；Prokunina, L 等人 2002NatGenet 32666-669 ;Kroner, A 等人 2005Ann Neurol 5850-57 ;Prokunina, L 等人2004Arthritis Rheum 501770)。通過使用自身免疫的鼠模型，已報(bào)導(dǎo)了幾個(gè)增強(qiáng)ro-i信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎性疾病的治療方法。一個(gè)這樣的方法是產(chǎn)生過表達(dá)ro-Ll的人工樹突細(xì)胞。在通過免疫接種MOG肽誘導(dǎo)EAE之前或之后，用載有抗原的ro-Ll-樹突細(xì)胞注射小鼠減輕了脊髓的炎癥以及疾病的臨床嚴(yán)重度(Hirata，S等人2005J Immunol 1741888-1897)。另一個(gè)方法是，嘗試通過使用表達(dá)小鼠ro-Ll的重組腺病毒遞送ro-i信號(hào)來治愈BXSB小鼠的狼瘡樣綜合征。該病毒的注射部分阻止了腎炎的發(fā)展，如通過更低頻率的蛋白尿、減少的血清抗-dsDNA Ig以及更好的腎臟病理所顯示的(Ding, H等人2006Clin Immunol 118258)。這些結(jié)果表明， 增強(qiáng)ro-i信號(hào)可在人自身免疫疾病中具有治療益處。更適合用作人藥物治療的可選擇的治療方法可以為使用抗人ro-ι的激動(dòng)性單克隆抗體。理想地，該激動(dòng)性抗體的結(jié)合可通過PD-I獨(dú)立地轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號(hào)，并且還可與從天然ro-1-PDl-L相互作用發(fā)出的正在進(jìn)行的內(nèi)源信號(hào)協(xié)同作用。預(yù)期激動(dòng)性抗-PD-ImAb調(diào)節(jié)參與炎性疾病的許多免疫細(xì)胞類型，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞，從而在治療多種人自身免疫或炎性障礙中具有效用。盡管已描述了許多拮抗性抗-PD-I抗體，但迄今為止，就本發(fā)明人所知，文獻(xiàn)中描述的唯一的ro-i激動(dòng)性抗體仍然也阻斷ro-i-PDiL和roi-PD2L相互作用。參見例如，W02004/056875。因此，本領(lǐng)域仍然需要適用于治療患者的改進(jìn)的激動(dòng)性抗-PD-I抗體，特別是不阻斷PDl-PDLl或PD1-PDL2相互作用的抗體。我們現(xiàn)已鑒定了適用于治療或預(yù)防免疫障礙(例如通過減弱T細(xì)胞應(yīng)答)的高親和力激動(dòng)性抗-PD-I抗體?？赏ㄟ^給受試者施用ro-i特異性抗體來治療的免疫障礙的非限定性實(shí)例包括但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎性腸病、克羅恩病、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、過度增生性免疫障礙、癌癥和感染性疾病。附圖概述圖I顯示與根據(jù)本公開內(nèi)容的抗體949相關(guān)的氨基酸序列。圖2-12顯示與根據(jù)本公開內(nèi)容的抗體相關(guān)的某些氨基酸或DNA序列。

圖13顯示抗體949對(duì)人⑶4+T細(xì)胞增殖的抑制。圖14顯示利用抗體949和人源化形式的配體阻斷測(cè)定。圖15顯示抗體949對(duì)來自人ro_l/CD28/ ζ報(bào)道細(xì)胞系的SEAP的刺激。圖16顯示949嵌合和人源化移植物(graft)與H)_l的物種交叉反應(yīng)性。圖17顯示鼠的輕鏈、接納體構(gòu)架和人源化輕鏈的比對(duì)。圖18顯示鼠的重鏈、接納體構(gòu)架和人源化重鏈的比對(duì)。圖19顯示以huIgG4形式存在的抗體949的重鏈的氨基酸序列。圖20顯示以huIgG4形式存在的抗體949的重鏈的核酸序列。圖21顯示以huIgG4形式存在的抗體949的重鏈包括信號(hào)序列的氨基酸序列。
圖22顯示以huIgG4形式存在的抗體949的重鏈包括信號(hào)序列的核酸序列。圖23顯示以huIgGl形式存在的抗體949的重鏈的氨基酸序列。圖24顯示以huIgGl形式存在的抗體949的重鏈的核酸序列。圖25顯示以huIgGl形式存在的抗體949的重鏈包括信號(hào)序列的氨基酸序列。圖26顯示以huIgGl形式存在的抗體949的重鏈包括信號(hào)序列的核酸序列。圖27至30顯示其中已將⑶R 3修正以除去酰胺化位點(diǎn)的可變區(qū)的多種氨基酸或核苷酸序列。人源化抗體所源自的親代鼠抗體雜交瘤在本文中稱為克隆19。來源于克隆19的 克隆的重組抗體在本文中稱為抗體CA051_00949，在本文中也稱為949。抗體可變結(jié)構(gòu)域中的殘基可按照由Kabat等人設(shè)計(jì)的系統(tǒng)方便地進(jìn)行編號(hào)。該系統(tǒng)不于 Kabat 等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interes t, USDepartment of Heal th and HumanServices, NIH, USA (此后簡(jiǎn)寫為“Kabat 等人(同上)，，)中。除非另外指明，本說明書中使用該編號(hào)系統(tǒng)。Kabat殘基命名并非總是直接相應(yīng)于氨基酸殘基的線性編號(hào)。實(shí)際的線性氨基酸序列可包含比嚴(yán)格Kabat編號(hào)更少或更多的氨基酸，對(duì)應(yīng)于基本可變結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)組件(無論是構(gòu)架還是互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))的縮短或至所述結(jié)構(gòu)組件中的插入?？赏ㄟ^將抗體序列中同源的殘基與“標(biāo)準(zhǔn)” Kabat編號(hào)的序列比對(duì)來確定給定的抗體的殘基的正確Kabat編號(hào)。按照Kabat編號(hào)系統(tǒng)，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R位于殘基31-35 (⑶R-H1)、殘基50-65 (CDR-H2)和殘基 95-102 (CDR-H 3)上。然而，根據(jù) Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol.，196，901-917 (1987))，等同于CDR-Hl的環(huán)從殘基26延伸至殘基32。因此，除非另外指明，否則本文中使用的‘⑶R-ΗΓ意欲指殘基26至35，如通過Kabat編號(hào)系統(tǒng)與Chothia’ s拓?fù)洵h(huán)定義的組合所描述的。根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R位于殘基24_34(⑶R-L1)、殘基50-56 (CDR-L2)和殘基 89-97 (CDR-L3)。如本文中使用的，術(shù)語“激動(dòng)性抗體”描述了能夠刺激ro-i的生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，導(dǎo)致磷酸酶至其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的招募，從而使T或B細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及與激活相關(guān)的表型特征失活的抗體?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法獲得本發(fā)明中使用的抗體。PD-I多肽/蛋白質(zhì)(包括融合蛋白，例如ro-i-Fc融合蛋白)或(重組或天然地)表達(dá)所述多肽的細(xì)胞(例如活化的τ細(xì)胞)可用于產(chǎn)生特異性識(shí)別ro-i的抗體。ro-i多肽可以是‘成熟’多肽或其生物學(xué)活性片段或衍生物。適當(dāng)?shù)?，PD-I多肽為成熟人多肽或其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或片段。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域通常包含PD-I蛋白的氨基酸21-170 (SWISS PROT登錄號(hào)Q15116)。PD-I多肽可通過本領(lǐng)域公知的方法從遺傳工程宿主細(xì)胞(其包含表達(dá)系統(tǒng))制備，或它們可從天然生物學(xué)來源回收而來。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“多肽”包括肽、多肽和蛋白質(zhì)。除非另外明確指出，否則這些術(shù)語可互換使用。ro-i多肽在一些情況下可以為更大的蛋白質(zhì)例如融合蛋白(例如與親和標(biāo)簽融合的融合蛋白)的一部分?？赏ㄟ^使用公知和常規(guī)的方案，給動(dòng)物，優(yōu)選非人動(dòng)物施用多肽來獲得針對(duì)ro-i多肽產(chǎn)生的抗體，其中動(dòng)物的免疫接種是必需的，參見例如Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir(ed.),第 4卷，Blackwell ScientificPublishers, Oxford, England, 1986)?？梢悦庖咴S多溫血?jiǎng)游锢缤米?、小鼠、大鼠、綿羊、牛、駱駝或豬。然而，小鼠、兔子、豬和大鼠通常是最適合的。可利用本領(lǐng)域已知的任何方法例如雜交瘤技術(shù)(Kohler &Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、三源雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，1983，ImmunologyToday, 4:72)和 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc. , 1985)來制備單克隆抗體。還可使用單淋巴細(xì)胞抗體法，通過克隆和表達(dá)免疫球蛋白可變區(qū)cDNA來產(chǎn)生本發(fā)明中使用的抗體，所述cDNA通過例如由Babcook, J.等人,1996, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 93(15) :7843-78481 ；W092/02551 ;W02004/051268 和國際專利申請(qǐng)?zhí)?W02004/106377描述的方法從就特異性抗體的產(chǎn)生而選擇的單個(gè)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。可使用測(cè)量對(duì)人ro-i的結(jié)合的測(cè)定和/或測(cè)量激發(fā)PDl活性的能力的測(cè)定進(jìn)行抗體的篩選。結(jié)合測(cè)定的實(shí)例為ELISA，特別是這樣的ELISA，其使用人ro-Ι與人Fe的融合蛋白，所述融合蛋白被固定在板上，并使用綴合的二抗檢測(cè)結(jié)合融合蛋白的抗-PD-I抗體。 適當(dāng)?shù)募?dòng)和配體阻斷測(cè)定的實(shí)例描述于本文的實(shí)例中。人源化抗體(其包括⑶R-移植抗體)為具有來自非人物種的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)的抗體分子(參見，例如，US5, 585, 089 ；W091/09967)。應(yīng)理解，可能僅需轉(zhuǎn)移⑶R的特異性決定殘基而非整個(gè)⑶R(參見例如，Kashmiri等人，2005, Methods, 36，25-34)。人源化抗體可任選地還包括來源于CDR所源自的非人物種的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基。本發(fā)明提供了具有對(duì)于人ro-i的特異性的激動(dòng)性人源化抗體。激動(dòng)性鼠抗-PD-I抗體(克隆19)描述于PCT/IB2009/06940 (未公布)中并且該抗體的可變區(qū)和⑶R的序列提供于圖I中。特別地，該抗體的⑶R提供于圖I (c)，SEQ IDNO I-6 中。來源于克隆19的CDRL3 (SEQ ID NO: 6)的改進(jìn)形式提供于圖2 (a) (SEQ ID NO: 7)中，其中已對(duì)潛在的脫酰胺位點(diǎn)進(jìn)行了修飾。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合人ro-Ι的包含重鏈和輕鏈的人源化激動(dòng)性抗體，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: I中給出的⑶R-Hl的序列、SEQ ID NO:2中給出的⑶R-H2的序列和SEQ ID NO:3中給出的⑶R-H3的序列，并且輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:4中給出的⑶R-Ll的序列、SEQ IDNO:5中給出的CDR-L2的序列和SEQID NO:7中給出的CDR-L3的序列。如本文中使用的，術(shù)語‘人源化抗體分子’是指這樣的抗體分子，其中重鏈和/或輕鏈包含移植入接納體抗體(例如人抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)構(gòu)架的來自供體抗體(例如鼠單克隆抗體)的一個(gè)或多個(gè)CDR(必要時(shí)包括一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的CDR)。關(guān)于綜述，參見 Vaughan 等人，Nature Biotechnology, 16，535-539，1998。在一個(gè)實(shí)施方案中，并非轉(zhuǎn)移完整的CDR，而是僅將上文描述的任一 CDR的一個(gè)或多個(gè)特異性決定殘基轉(zhuǎn)移至人抗體構(gòu)架(參見例如，Kashmiri等人，2005, Method s, 36, 25-34)。在一個(gè)實(shí)施方案中，僅將上文描述的一個(gè)或多個(gè)CDR的特異性決定殘基轉(zhuǎn)移至人抗體構(gòu)架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，僅將上文描述的每一個(gè)CDR的特異性決定殘基轉(zhuǎn)移至人抗體構(gòu)架。當(dāng)移植CDR或特異性確定殘基時(shí)，考慮到CDR所源自的供體抗體的種類/類型，可使用任何適當(dāng)?shù)慕蛹{體可變區(qū)構(gòu)架序列，包括小鼠、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人構(gòu)架區(qū)。適當(dāng)?shù)兀鶕?jù)本發(fā)明的人源化抗體具有可變結(jié)構(gòu)域，其包含人接納體構(gòu)架區(qū)以及一個(gè)或多個(gè)圖1(c)或圖2(a)中提供的CDR。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中提供了結(jié)合人I3D-I的激動(dòng)性人源化抗體，其中可變結(jié)構(gòu)域包含人接納體構(gòu)架區(qū)和非人供體CDR。可用于本發(fā)明的人構(gòu)架的實(shí)例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL和NEWM可用于重鏈，REI可用于輕鏈，和EU，LAY和POM可用于重鏈和輕鏈?；蛘?，可使用人種系序列:此類序列可在http: //vbase. mrc-cpe. cam, ac. uk/上獲得。在本發(fā)明的人源化抗體中，接納體重鏈和輕鏈不必一定來源于相同抗體，并且必要時(shí)，可包含具有來源于不同鏈的構(gòu)架區(qū)的復(fù)合鏈(composite chain)。本發(fā)明的人源化抗體的重鏈的一個(gè)這樣的適當(dāng)?shù)臉?gòu)架區(qū)來源于與JH4 —起的人亞組VHl序列1-31-46 (SEQ ID N0:52)。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了包含SEQ ID N0:1中給 出的CDR-Hl的序列、SEQ IDN0:2中給出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO: 3中給出的CDRH3的序列的激動(dòng)性人源化抗體，其中重鏈構(gòu)架區(qū)來源于與JH4 —起的人亞組VHl序列1-31-46。人 JH4 的序列如下(YFDY)WGQGTLVTVS(Seq ID No:56)。YFDY 基序?yàn)?CDR-H3 的一部分，而不是構(gòu)架 4 的一部分(Ravetch, JV.等人，1981，Cell，27，583-591)。本發(fā)明的人源化抗體的重鏈的另一個(gè)合適的構(gòu)架區(qū)來源于與JH4 —起的人亞組VHl序列l(wèi)-21-e(SEQ ID N0:54)。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了包含SEQ ID N0:1中給出的CDR-Hl的序列、SEQ ID NO:2中給出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO:3中給出的CDRH 3的序列的激動(dòng)性人源化抗體，其中重鏈構(gòu)架區(qū)來源于與JH4—起的人亞組VHl序列l(wèi)-21-e，參見例如 SEQ ID NO:46)。人 JH4 的序列如下(YFDY)WGQGTLVTVS(Seq ID No:56)。YFDY基序?yàn)?CDR-H3 的一部分，而不是構(gòu)架 4 的一部分(Ravetch, JV.等人，1981，Cell, 27, 583-591)。在一個(gè)實(shí)例中，抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID N0:46中給出的序列。本發(fā)明的人源化抗體的輕鏈的適當(dāng)?shù)臉?gòu)架區(qū)來源于與JK4 一起的人種系亞組VKl序列2-1-(1) L23 (SEQ ID NO: 48)。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了包含SEQ ID NO: 4中給出的CDR-Ll的序列、SEQ ID NO: 5中給出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 7中給出的CDRL3的序列的激動(dòng)性人源化抗體，其中輕鏈構(gòu)架區(qū)來源于與JK4 一起的人亞組序列 2-l-(l)L23。JK4 序列如下(LT)FGGGTKVEIK(Seq ID No:57)。LT 基序?yàn)?CDR-L3 的一部分，而不是構(gòu)架 4 的一部分(Hieter, PA.，等人，1982，J. Biol. Chem.，257，1516-1522)。本發(fā)明的人源化抗體的輕鏈的另一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?gòu)架區(qū)來源于與JK4 一起的人種系亞組VK3序列6-l-(l)A27(SEQ ID NO: 50)。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了包含SEQ ID N0:4中給出的CDR-Ll的序列、SEQ IDN0:5中給出的CDR-L2的序列和SEQ ID N0:6或SEQ ID NO: 7中給出的CDRL 3的序列的激動(dòng)性人源化抗體，其中輕鏈構(gòu)架區(qū)來源于與JK4 一起的人亞組序列 VK36-1-(1)A27。JK4 序列如下(LT) FGGGTKVEIK (Seq ID No: 57)。LT 基序?yàn)?CDR-L3 的一部分，而不是構(gòu)架 4 的一部分(Hieter, PA.,等人，1982, J. Biol. Chem. , 257, 1516-1522)。同樣地，在本發(fā)明的人源化抗體中，構(gòu)架區(qū)不必具有與接納體抗體的構(gòu)架區(qū)完全相同的序列。例如，可將罕見殘基改變成對(duì)于該接納體鏈種類或類型而言更常存在的殘基?；蛘撸筛淖兘蛹{體構(gòu)架區(qū)中的選擇的殘基以便它們相應(yīng)于供體抗體中相同位置上發(fā)現(xiàn)的殘基(參見Reichmann等人，1998，Nature, 332，323-324)。應(yīng)當(dāng)將此類改變保持至恢復(fù)供體抗體的親和力所需的最低限度。用于選擇接納體構(gòu)架區(qū)中可能需要改變的殘基的方案示于 TO91/09967 中。適當(dāng)?shù)?，在本發(fā)明的人源化抗體分子中，如果接納體重鏈具有與JH4 —起的人VHl序列1-31-46，則除3個(gè)供體⑶R(SEQ ID NO: 1、2和3)外，重鏈的接納體構(gòu)架區(qū)還在位置25、37、41、48、71、73和76(按照Kabat等人，(同上))中的至少一個(gè)上包含供體殘基。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了人源化抗體，其中至少重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置25、37、41、48、71、73和76的每一個(gè)位置上的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID NO:30中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了人源化抗體，其中至少重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置25、37、41和48的每一個(gè)位置上的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID N0:38中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了人源化抗體，其中至少重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置25上的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID NO:40中給出的序列。適當(dāng)?shù)?，在本發(fā)明的人源化抗體分子中，如果接納體重鏈具有與JH4 —起的人VHl序列1-2 Ι-e，則除3個(gè)供體CDR(SEQ ID NO: 1、2和3)外，重鏈的接納體構(gòu)架區(qū)還可在位置
25、37、41、48、71、76和78(按照Kaba t等人，(同上))中的至少一個(gè)上包含供體殘基。因 此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了人源化抗體，其中至少重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置25、37、41、48、71、76和78的每一個(gè)上的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID NO:42中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了人源化抗體，其中至少重鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置25、37、41和48的每一個(gè)上的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID N0:44中給出的序列。適當(dāng)?shù)?，在本發(fā)明的人源化抗體分子中，如果接納體輕鏈具有與JK4 一起的人亞組VKl序列2-l-(l)L23，則除3個(gè)供體CDR(SEQ IDNO:4,5和6或7)外，輕鏈的接納體構(gòu)架區(qū)還可在位置1、2、3、4、47、60和70的至少一個(gè)上包含供體殘基。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了人源化抗體，其中至少輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的位置1、2、3、4、47、60和70的每一個(gè)上的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID N0:10o在一個(gè)實(shí)例中，提供了人源化抗體，其中至少輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的位置1、2、3和4的每一個(gè)上的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID NO: 18或SEQ ID N0:20o在一個(gè)實(shí)例中，提供了人源化抗體，其中至少輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的位置1、2和3的每一個(gè)上的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24。適當(dāng)?shù)?，在根?jù)本發(fā)明的人源化抗體分子中，如果接納體輕鏈具有與JK4 一起的人亞組VK 3序列6-1-(1)Α27，則除3個(gè)供體CDR(SEQID N0:4、5和6或7)外，輕鏈的接納體構(gòu)架區(qū)還可在位置2、47、58、70、71和85的至少一個(gè)上包含供體殘基。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了人化抗體，其中至少輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的位置2、47、58、70、71和85的每一個(gè)上的殘基為供體殘基，參見例如，SEQ ID N0:26或SEQ ID N0:28。供體殘基為來自供體抗體(即CDR最初所源自的抗體)的殘基。供體殘基可被來源于人接納體構(gòu)架的適當(dāng)殘基(接納體殘基)替代。替代各個(gè)構(gòu)架的供體殘基的適當(dāng)?shù)娜私蛹{體殘基列于下文中VKl 輕鏈 2-1(1) L2權(quán)利要求
1.結(jié)合人ro-i的包含重鏈和輕鏈的人源化激動(dòng)性抗體，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: I中給出的CDR-Hl的序列、SEQ ID NO: 2中給出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO: 3中給出的⑶R-H 3的序列，并且輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:4中給出的⑶R-Ll的序列、SEQ IDNO: 5中給出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO: 7中給出的CDR-L3的序列。
2.結(jié)合人ro-i的包含重鏈的人源化激動(dòng)性抗體,其中所述重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO: I中給出的⑶R-Hl的序列、SEQ ID NO:2中給出的CDR-H2的序列和SEQ ID N0:3中給出的CDR-H3的序列，并且重鏈構(gòu)架區(qū)來源于人亞組序列VH l-31-46+JH4(SEQ ID NO:52)。
3.權(quán)利要求2的人源化抗體，其中所述重鏈的可變結(jié)構(gòu)域的位置25、37、41、48、71、73和76中的至少一個(gè)上的殘基為供體殘基。
4.權(quán)利要求3的人源化抗體，其具有SEQID NO: 30,SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 40中給出的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
5.結(jié)合人ro-i的包含重鏈的人源化激動(dòng)性抗體,其中所述重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO: I中給出的CDR-Hl的序列、SEQ ID NO:2中給出的CDR-H2的序列和SEQ ID N0:3中給出的CDR-H3的序列，并且重鏈構(gòu)架區(qū)來源于人亞組序列VH 1-2 l_e+JH4(SEQ ID NO:54)。
6.權(quán)利要求5的人源化抗體，其具有SEQID N0:46中給出的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
7.權(quán)利要求5的人源化抗體，其中所述重鏈的可變結(jié)構(gòu)域的位置25、37、41、48、71、76和78中的至少一個(gè)上的殘基為供體殘基。
8.權(quán)利要求7的人源化抗體，其具有SEQID NO: 42或SEQ IDN0:44中給出的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
9.結(jié)合人ro-i的包含輕鏈的人源化激動(dòng)性抗體，其中所述輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO:4中給出的CDR-Ll的序列、SEQ ID NO:5中給出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中給出的⑶R-L3的序列，并且輕鏈構(gòu)架區(qū)來源于人亞組序列VKl 2-1 (I)L23+JK4(SEQID NO:48)。
10.權(quán)利要求9的人源化抗體，其中所述輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的位置1、2、3、4、47、60和70中的至少一個(gè)上的殘基為供體殘基。
11.權(quán)利要求10的人源化抗體，其具有SEQID NO: 10, SEQ IDNO:18, SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:22或SEQ ID NO:24中給出的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
12.結(jié)合人ro-i的包含輕鏈的人源化激動(dòng)性抗體，其中所述輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 4中給出的CDR-Ll的序列、SEQ ID NO: 5中給出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO:7中給出的⑶R-L3的序列，并且輕鏈構(gòu)架區(qū)來源于人亞組序列VK 36-1-(1)A27+JK4(SEQ ID NO:50)。
13.權(quán)利要求12的人源化抗體，其中所述輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的位置2、47、58、70、71和85中的至少一個(gè)上的殘基為供體殘基。
14.權(quán)利要求13的人源化抗體，其具有SEQID NO: 26或SEQ IDNO: 28中給出的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
15.結(jié)合人ro-i的具有重鏈和輕鏈的人源化激動(dòng)性抗體，其中所述重鏈包含選自下列的序歹丨J SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44和SEQ IDN0:46，并且所述輕鏈包含選自下列的序列SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26 和 SEQ ID NO:28。
16.權(quán)利要求I至15的任一項(xiàng)的激動(dòng)性抗體分子，其中所述抗體分子選自具有全長(zhǎng)重鏈和輕鏈的完全抗體分子或其片段，例如Fab、經(jīng)修飾的Fab’、Fab’、F (ab’)2、Fv、VH、VL或s cFv片段。
17.結(jié)合人ro-i的人源化激動(dòng)性抗體，其中輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含與權(quán)利要求15的抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的同一性或相似性的序列，并且其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含與權(quán)利要求15的抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的同一性或相似性的序列。
18.人源化激動(dòng)性抗體，其具有小于5nM的對(duì)于分離的人I3D-I(例如人細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合親和力。
19.分離的DNA序列，其編碼權(quán)利要求I至18的任一項(xiàng)的抗體的重鏈和/或輕鏈。
20.克隆性或表達(dá)載體，其包含一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求19的DNA序列。
21.宿主細(xì)胞，其包含一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求20的克隆性或表達(dá)載體。
22.用于產(chǎn)生權(quán)利要求I至18的任一項(xiàng)的抗體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞和分離所述抗體。
23.一種藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體中的一種或多種組合的權(quán)利要求I至18的任一項(xiàng)的抗體。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其還包含其它活性成分。
25.權(quán)利要求I至18的任一項(xiàng)的抗體或權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的藥物組合物，用于治療或預(yù)防免疫障礙。
26.權(quán)利要求I至18的任一項(xiàng)的抗體在制造用于治療或預(yù)防免疫障礙的藥物中的用途。
全文摘要
PD-1抗體結(jié)合人PD-1的包含重鏈和輕鏈的人源化激動(dòng)性抗體，其中重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:1中給出的CDR-H1的序列、SEQ ID NO:2中給出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO:3中給出的CDR-H3的序列，并且輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:4中給出的CDR-L1的序列、SEQ IDNO:5中給出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO:7中給出的CDR-L3的序列。本發(fā)明還擴(kuò)展至抗體分子的治療性用途、組合物和用于產(chǎn)生所述抗體分子的方法。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102892785SQ201180019620
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
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