專利名稱：用于提高生理活性物質(zhì)等的生物體內(nèi)穩(wěn)定性的肽和提高了生物體內(nèi)穩(wěn)定性的生理活性物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于提高生理活性物質(zhì)等的生物體內(nèi)穩(wěn)定性的肽以及該肽和生理活性物質(zhì)結(jié)合而成的肽復(fù)合體。
背景技術(shù)：
關(guān)于生物體內(nèi)的生理活性物質(zhì)等(蛋白質(zhì)或肽等)的迅速消失，在將它們用作藥品的情況下有時會限制其效能。例如，GLP-1 (glucagon like peptide-1,胰高血糖素樣肽-I)的生理作用被認(rèn)為作為糖尿病用藥品有用，但其血中消失半衰期為2分鐘 3分鐘，為了充分獲得有效性，需要持續(xù)注入或頻繁給藥。因此，作為解決方案之一，對經(jīng)脂肪酸修飾的GLP-I進(jìn)行了研究(非專利文獻(xiàn)I、專利文獻(xiàn)I)。即，通過對GLP-I進(jìn)行脂肪酸修飾， 賦予了與作為血液蛋白質(zhì)的白蛋白的親和性，其結(jié)果避免了酶分解和腎臟排泄，實現(xiàn)了血中消失半衰期的提高。但是，若使用脂肪酸、聚こニ醇(PEG)等疏水性長鏈分子或者聚醚進(jìn)行修飾，則會產(chǎn)生生產(chǎn)エ序繁雜化和生產(chǎn)收率降低之類的問題。然而，已知來自某種革蘭氏陽性菌的蛋白質(zhì)、例如蛋白G具有與白蛋白親和性高的區(qū)域，作為具有該能力的最小區(qū)域，已知被稱為GA模塊(GA module)或ABD(Albuminbinding domain,白蛋白結(jié)合域)等的氨基酸46殘基的肽(非專利文獻(xiàn)2)。已知的是,實際上附加了 GA模塊的某種抗體蛋白質(zhì)與未附件的抗體蛋白質(zhì)相比，生物體內(nèi)穩(wěn)定性提高(非專利文獻(xiàn)3)。另外，同樣地還已知通過將來自葡萄球菌蛋白A或鏈球菌性蛋白G且與血清白蛋白或免疫球蛋白G結(jié)合的肽片段結(jié)合到生理活性蛋白質(zhì)，能夠延長生物體內(nèi)半衰期(專利文獻(xiàn)3)。已知的是，由GA模塊序列構(gòu)成的肽在GA模塊的第2螺旋和第3螺旋部分可以觀察到白蛋白結(jié)合能力(專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)4)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :W01996/029342專利文獻(xiàn)2 :W02009/016043專利文獻(xiàn)3 :W091/001743非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I J Med Chem，2000，43 (9)，1664-1669非專利文獻(xiàn)2 =Biochemistry, 1992，31 (5)，1451-1457非專利文獻(xiàn)3 :Protein Eng Des Sel，2007，20 (11)，569-576非專利文獻(xiàn)4 :Protein Eng Des Sel, 2008, 21 (8), 515-52
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題如上所述，可以預(yù)測通過將GA模塊附加至生理活性物質(zhì)等，可以提高該生理活性物質(zhì)等的生物體內(nèi)穩(wěn)定性。但是，本發(fā)明人進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了下述新的問題若將GA模塊46殘基的肽附加至生理活性物質(zhì)等，則與未附加時相比，活性顯著降低。因此，本申請發(fā)明的課題在于提供ー種在保持生理活性物質(zhì)等的活性的同時還能夠提高生物體內(nèi)穩(wěn)定性的肽片段。用于解決問題的方案本發(fā)明人認(rèn)為，在將GA模塊46殘基的肽附加至生理活性物質(zhì)等時顯示出顯著的活性降低的原因在于附加氨基酸序列長度的不同，由此將GA模塊46殘基內(nèi)的第3螺旋部分作為中心，為了發(fā)現(xiàn)對于生理活性物質(zhì)等的生物體內(nèi)穩(wěn)定性的提高特別必須的部位進(jìn)行了深入研究。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了能夠顯著避免生理活性物質(zhì)的活性降低、并且提高生物體內(nèi)穩(wěn)定性的由GA模塊的部分序列構(gòu)成的肽(下文中,稱為GA模塊的部分肽)，由此完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明的主要構(gòu)成如下所述。(I) ー種GA模塊的部分肽，其包含氨基酸序列IIe-Asp-Glu-Ile-Leu，氨基酸數(shù)為5個 25個。(2)如(I)所述的GA模塊的部分肽，其中，所述GA模塊為來自鏈球菌G148的GA模塊。(3)如⑴所述的GA模塊的部分肽，其中，氨基酸數(shù)為5個 17個。(4)如(I)所述的 GA 模塊的部分肽，其由式=Y22-Y23-Y24-Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y3tl-Y31ィ32ィ33ィ34_丫35_丫36_丫37_1 Ie-Asp-Glu-IIe-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46 表不的氨基酸序列構(gòu)成。[式中，Y22指Lys或缺失，Y23指Asn或缺失，Y24指Leu或缺失，Y25指Ile或缺失，Y26指Asn或缺失，Y27指Asn或缺失，Y28指Ala或缺失，Y29指Lys或缺失，Y30指Thr或缺失，Y31指Val或缺失，Y32指Glu或缺失，Y33指Gly或缺失，Y34指Val或缺失，Y35指Lys或缺失，Y36指Ala或缺失，Y37指Leu或缺失，Y43指Ala或缺失，Y44指Ala或缺失，Y45指Leu或缺失，Y46指Pro或缺失。其中，缺失限定于由Y22和/或Y46起的連續(xù)的缺失(包括Y22或Y46單獨的缺失以及僅Y22和Y46兩處的缺失)。](5)如(4)所述的GA模塊的部分肽，其選自以下的組。Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(序列號 2)Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(序列號 3)Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 4)Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 5)Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 6)Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala (序列號 7)Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 8)Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 9)Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 10)Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (序列號 11)Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(序列號
12)Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala(序列號13)Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-AIa-Leu-Pro (序列號 14)Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (序列號 15)Lys-Asn-Leu-Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-IIe-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (序列號 16)(6) ー種GA模塊的部分肽，其在序列號I表示的GA模塊的氨基酸22位至38位中的一個氨基酸開始，在氨基酸42位至46位中的ー個氨基酸結(jié)束。(7) ー種生理活性復(fù)合體，其通過(I) (6)中任一項所述的GA模塊的部分肽與生理活性物質(zhì)結(jié)合而成。 (8)如(7)所述的生理活性復(fù)合體，所述生理活性物質(zhì)為胃腸激素或它們的衍生物、或者Exendin-4或它們的衍生物。(9)如⑶所述的生理活性復(fù)合體，其中，所述胃腸激素選自由GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、生長抑素、胰淀素和胃饑餓素組成的組。(10)如(7)所述的生理活性復(fù)合體，其是所述GA模塊的部分肽與所述生理活性物質(zhì)介由連接子結(jié)合而成的。(11)如(9)所述的生理活性復(fù)合體，其中，所述GLP-I或其衍生物為由式His_X8_X9_Gly_Thr_Phe_Thr_Ser_Asp_X16_Ser_X18_X19_X20_Glu_X22_X23_Ala_X25_X26-X27-Phe_IIe-X30-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42-X43-X44-X45 表不的氨基酸序列構(gòu)成且具有GLP-I活性的GLP-I或GLP-I衍生物。[式中，X8 為 Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp、Lys 或 Aib，X9 為 Glu、Gly、Asp 或 Lys，X16 為 Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Tyr、Glu、Asp、Trp 或 Lys，X18 為Ser、Ala、Arg、Gly、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp、Trp 或 Lys，X19 為 Tyr、Phe、Trp、Glu、Gin、Asp 或 Lys, X20 為 Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr 或 Lys, X22為 Gly、Ala、Glu、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Asp、Lys、Arg、Cys 或 Aib, X23 為 Gin、Arg、Glu、Asp、Asn 或 Lys, X25 為 Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp 或 Lys, X26 為 Lys、Gin、Glu、Asp、His 或 Arg, X27 為 Glu、Ala、Asp、Lys 或 Leu, X30 為 Ala、Glu、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Asp、Lys、Gin、Tyr、His 或 Arg, X33 為 Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、lie、Glu、Asp或 Lys，X34 為 Lys、Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly 或 Asn，X35 為 Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp、Lys、His、Pro 或 Aib，X36 為 Arg、Gly、Lys、Glu、Asp、His 或缺失，X37 為 Gly、Pro、Glu、Lys、Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、Ile、Val、His 或缺失，X38 為 Ser、Lys、Arg、Glu、Asp、His 或缺失，X39 為 Ser、Arg、Lys、Glu、Asp、His 或缺失，X40 為 Gly、Glu、Lys、Asp 或缺失，X41為 Ala、Lys、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp 或缺失，X42 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X43 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X44 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X45 為 Ser、Lys、Val、Glu、Asp 或缺失C ](12)如(11)所述的生理活性復(fù)合體，其中，所述GLP-1或GLP-1衍生物選自由GLP-I(7-37)，[Ser8]-GLP-I (7-37), [Gly8]-GLP—1 (7—37)，[Val8]-GLP—1(7—37)，[Glu22]_GLP-I (7-37)，[Lys22]-GLP-1 (7-37), [Val8，Glu22]-GLP—1 (7—37)，[Val8，Lys22]-GLP-1 (7-37)，[Gly8，Glu22]-GLP-1(7-37)，[Gly8, Lys22]-GLP-1 (7-37), [Val8, Glu30]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Val8, His37]-GLP—1(7—37)，[Gly8, His37]-GLP—1 (7—37)，[Arg34]-GLP-1 (7-37)，[Lysl8]-GLP—1 (7—37)，[Gly8, Glu22, Gly36]-GLP-1(7-37), [Aib8,Aib22]-GLP-1 (7-37)，[Aib8,Aib35]-GLP—1 (7—37)，[Aib8,Aib22,Aib35]-GLP—1 (7—37)，[Glu22, Glu23]-GLP-1(7-37)，[Gly8, Glu22, Glu23]-GLP-1 (7-37)，[Val8, Glu22, Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Val25]-GLP-1 (7-37)，[Val8, Glu22, Ile33]-GLP—1 (7—37)，[Val8,Glu22, Val25, Ile33]_GLP_l (7-37)和它們的 37 位缺失的 GLP-1 (7-36)型、以及它們的 36位與37位缺失的GLP-I (7-35)型組成的組。(13) ー種改善生理活性物質(zhì)的生物體內(nèi)穩(wěn)定性的方法，其特征在于，該方法將(I) (6)中任一項所述的GA模塊的部分肽與生理活性物質(zhì)結(jié)合。(14)如(13)所述的方法，其特征在于，所述生理活性物質(zhì)為GLP-I或其衍生物，該方法將所述GA模塊的部分肽與GLP-I或其衍生物的C末端結(jié)合。
發(fā)明效果通過將本申請發(fā)明的GA模塊的部分肽與生理活性物質(zhì)結(jié)合，能夠保持生理活性物質(zhì)的活性，同時能夠?qū)崿F(xiàn)其血中穩(wěn)定性等生物體內(nèi)穩(wěn)定性的提高。需要說明的是，作為生理活性物質(zhì)，對于胃腸激素或它們的衍生物特別有效。


圖I示出GA模塊的氨基酸序列。GAm(1-46)示出GA模塊46殘基全長，GAm(17-46)示出GA模塊的17位至46位的殘基，GAm(28-44)示出GA模塊的28位至44位的殘基。圖2示出的是將對MIN6細(xì)胞進(jìn)行IOOOpM的天然GLP-I處理時的胰島素分泌量設(shè)為100%時、進(jìn)行各GLP-I肽復(fù)合體處理時所分泌的胰島素分泌量的相對值。圖3示出的是將對MIN6細(xì)胞進(jìn)行IOOOpM的天然GLP-I處理時的胰島素分泌量設(shè)為100%時、進(jìn)行各GLP-I肽復(fù)合體處理時所分泌的胰島素分泌量的相對值。圖4示出的是用各GLP-I肽復(fù)合體對作為2型糖尿病模型小鼠的db/db小鼠皮下給藥時對偶測血糖降低作用進(jìn)行測定的結(jié)果。圖5示出的是用各GLP-I肽復(fù)合體對作為2型糖尿病模型小鼠的db/db小鼠皮下給藥時對偶測血糖降低作用進(jìn)行測定的結(jié)果。
具體實施例方式根據(jù)標(biāo)記的慣例，本說明書中以氨基酸序列表示的肽的左端為N末端，右端為C末端。GA模塊的部分肽是指由序列號I表示的GA模塊的部分序列構(gòu)成的肽?！癎A模塊的部分序列”是指由GA模塊序列的一部分構(gòu)成的序列。具體地說，是指從序列號I表示的GA模塊的ー個末端或兩個末端起缺失ー個氨基酸殘基或連續(xù)的氨基酸殘基的片斷序列。本發(fā)明的GA模塊的部分肽是包含由序列號2規(guī)定的至少5個連續(xù)的氨基酸的肽，其氨基酸數(shù)為5個 25個,更優(yōu)選為5個 17個。若以氨基酸序列表不,本發(fā)明的GA模塊的部分肽為式Y(jié)22-Y23-Y24-Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y30-Y31-Y32-Y33-Y34-Y35-Y36-Y37-Ile-Asp-Glu-Ile-Le^1ィ43ィ44ィ45ィ46。[式中，Y22指Lys或缺失，Y23指Asn或缺失，Y24指Leu或缺失，Y25指Ile或缺失，Y26指Asn或缺失，Y27指Asn或缺失，Y28指Ala或缺失，Y29指Lys或缺失，Y30指Thr或缺失，Y31指Val或缺失，Y32指Glu或缺失，Y33指Gly或缺失，Y34指Val或缺失，Y35指Lys或缺失，Y36指Ala或缺失，Y37指Leu或缺失，Y43指Ala或缺失，Y44指Ala或缺失，Y45指Leu或缺失，Y46指Pro或缺失。其中，缺失限定于由Y22和/或Y46起的連續(xù)的缺失(包括Y22或Y46單獨的缺失以及僅Y22和Y46兩處的缺失)。]已知GA模塊與白蛋白具有高親和性，也被稱為ABD(白蛋白結(jié)合域)。作為GA模塊所報道的序列在天然存在的菌中被報道了 16種肽序列(Biochemistry，2006，45 (10)，3263-3271)。作為GA模塊之一，有ー種由氨基酸46殘基構(gòu)成的序列，其為鏈球菌(Streptococcus)G148株的蛋白G(streptococcal protein G)的特定區(qū)域，其不于序列號 I。在本發(fā)明的實施例中，使用了來自鏈球菌G148的GA模塊。通過附加至生理活性物質(zhì)等，本發(fā)明的GA模塊的部分肽為增強生理活性物質(zhì)等功能的肽。對該肽進(jìn)行置換或附加的部位因生理活性物質(zhì)等而異，但可以基于生理活性物質(zhì)等的性質(zhì)和特征、根據(jù)公知的方法來適宜選擇最佳部位。例如，對于GLP-I而言，若將肽結(jié)合于N末端則會顯著損害活性，因而優(yōu)選附加至C末端。已知的是，胰淀素即使在N末端進(jìn)行修飾也顯示出活性，因而能夠進(jìn)行N末端修飾(W02007/022123)。另外已知的是，VIP通過N末端的こ?；蛘攮h(huán)肽化、或C末端的氨基酸修飾也顯示出活性(W02008/003612)，能夠進(jìn)行C末端修飾?！吧砘钚晕镔|(zhì)”原本是調(diào)節(jié)生物體的功能的物質(zhì)，通常，為肽或蛋白質(zhì)、或者與它們功能非常類似的物質(zhì)，能夠用于疾病的治療或診斷。通常，由于肽性的物質(zhì)多，因而也被稱為生理活性肽。作為生理活性物質(zhì)，有胃腸激素、生長激素、或它們的衍生物等。胃腸激素包括胰高血糖素、GLP-1 (glucagons like peptide-1,胰高血糖素樣肽-I)、GLP-2、GIP (Gastric Inhibitory Polypeptide,腸抑胃肽)、胃泌素、選擇素、縮膽囊素、胃動素、神經(jīng)降壓素、生長抑素(Somatostatin)、胰淀素(Amylin)、胃饑餓素(Ghrelin)和VIP(Vasoactive Intestinal Polypeptide,血管活性腸肽)等。此處,生理活性物質(zhì)不僅包括天然物，還包括人工合成物。即，也包括天然的生理活性物質(zhì)的一部分氨基酸被置換、缺失或附加(例如，插入)而成的物質(zhì)。這樣的肽設(shè)計以效果的增強、選擇性的強化或者對于肽分解的穩(wěn)定性等為目的而進(jìn)行，雖然因生理活性物質(zhì)而異，但能夠利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。另外，也可以是糖鏈、脂肪酸、脂質(zhì)、核酸等與肽鏈結(jié)合的生理活性物質(zhì)。需要說明的是，Exendin-4是ー種由美洲希拉毒蜥的唾液腺分泌物發(fā)現(xiàn)的具有GLP-I樣活性的生理活性肽，除了 Exendin-4 (1-39)以タ卜，還已知Exendin-4 (1-39) -LysLysLysLysLys>Exendin-4 (1-39) -LysLysLysLysLysLys 等衍生物，它們也可以視為GLP-I的衍生物?！癎LP-1衍生物”是指GLP-I (為了強調(diào)與GLP-I衍生物的差異，有時也被稱為天然GLP-1)的一部分氨基酸被置換、缺失或附加而成的物質(zhì)，與GLP-I具有實質(zhì)上同樣的活性。即，與天然GLP-I相比，GLP-I衍生物優(yōu)選具有50% 150%的活性。已知的是，在GLP-I衍生物中，通過8位的置換、22位和23位或者26位和34位的置換等，酶耐性増加。除此之外，GLP-I和GLP-I衍生物還分別記載于W091/11457、W096/29342、W098/08871、W099/43341、W099/43708、W099/43707、W099/43706、W099/43705、W000/07617、W008/005527、W000/34331、W002/046227、W002/098348、W003/087139、W003/018516、W005/000892.W005/027978和W006/087354等中。根據(jù)這些文獻(xiàn)，只要是具有下述氨基酸序列的GLP-I衍生物，則可以說是與天然GLP-I具有實質(zhì)上同樣的活性的GLP-I衍生物。需要說明的是，關(guān)于天然GLP-I，不僅是GLP-I (7-36)，GLP-I (7-37) >GLP-1 (7-35)也作為具有同等的活性的天然GLP-I而已知，不論它們的C末端為酰胺體還是羧酸體，均具有同樣的活性。已知GLP-I衍生物的氨基酸序列顯示出下述多樣性。X7-X8-X9_Gly_Thr_Phe_Thr_Ser_Asp_X16_Ser_X18_X19_X20_Glu_X22_X23_Ala_X25_X26_X27-Phe-Ile-X30-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X40-X41-X42-X43-X44-X45[式中，X7 為 His, X8 為 Ala、Gly、Ser> Thr> Leu、lie、Val、Glu、Asp、Lys 或 Aib, X9為 Glu、Gly、Asp 或 Lys, X16 為 Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、 Tyr、Glu、Asp、Trp 或 Lys,X18 為 Ser、Ala、Arg、Gly、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp、Trp 或 Lys, X19 為 Tyr> Phe、Trp、Glu、Gin、Asp 或 Lys, X20 為 Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr或 Lys, X22 為 Gly、Ala、Glu、Ser> Thr> Leu、lie、Val、Asp、Lys、Arg、Cys 或 Aib, X23 為 Gin、Arg、Glu、Asp、Asn 或 Lys, X25 為 Ala、Gly、Ser> Thr> Leu、lie、Val、Glu、Asp 或 Lys, X26 為Lys> Gin、Glu、Asp、His 或 Arg, X27 為 Glu、Ala、Asp、Lys 或 Leu, X30 為 Ala、Glu、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Asp、Lys、Gin、Tyr、His 或 Arg, X33 為 Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、lie、Glu、Asp 或 Lys, X34 為 Lys> Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly 或 Asn, X35 為 Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp、Lys> His、Pro 或 Aib, X36 為 Arg、Gly、Lys> Glu、Asp、His 或缺失，X37 為 Gly、Pro、Glu、Lys> Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、lie、Val、His 或缺失，X38 為 Ser、Lys>Arg、Glu、Asp、His 或缺失，X39 為 Ser、Arg、Lys、Glu、Asp、His 或缺失，X40 為 Gly、Glu、Lys、Asp 或缺失，X41 為 Ala、Lys、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp 或缺失，X42 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X43 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X44 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X45 為 Ser、Lys、Val、Glu、Asp或缺失。]這些之中，具有X7 X37的序列的GLP-I或其衍生物(X7 X37如上所述)是應(yīng)用了本發(fā)明的GA模塊的部分肽的優(yōu)選的GLP-I或其衍生物。需要說明的是，作為GLP-I或其衍生物，具體已知下述物質(zhì)。GLP-I(7-37)， [Ser8]-GLP-1(7-37)， [Gly8]-GLP-1(7-37)， [Val8]-GLP-1(7-37)，[Glu22]-GLP-1(7-37)，[Lys22]-GLP—1 (7—37)，[Val8, Glu22]-GLP—1(7—37)，[Val8, Lys22-]-GLP-1 (7-37)，[Gly8，Glu22]-GLP-1 (7-37)，[Gly8, Lys22]-GLP-1(7-37), [Val8, Glu30]-GLP-1(7-37)，[Gly8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Val8, His37]-GLP—1(7—37)，[Gly8, His37]-GLP-I(7-37)，[Arg34]-GLP-1(7-37), [Lysl8]-GLP—1(7—37)，[Gly8, Glu22, Gly36]-GLP-1(7-37)，[Aib8，Aib22]-GLP-1(7-37)，[Aib8, Aib35]-GLP—1 (7—37)，[Aib8,Aib22,Aib35]-GLP-1(7-37)，[Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37)，[Gly8, Glu22, Glu23]-GLP-1(7-37), [Val8, Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8, Glu22, Val25]-GLP-1 (7-37)，[Val8, Glu22, Ile33]-GLP-1 (7-37)，[Val8, Glu22, Val25, Ile33]-GLP-1 (7-37)和它們的 37 位缺失的 GLP-1 (7-36)型、以及它們的36位與37位缺失的GLP-I (7-35)型。天然VIP作為具有下述序列的28氨基酸殘基的肽而已知。
His—Ser—Asp—Ala—Val—Phe—Thr—Asp—Asn—Tyr—Thr—Arg—Leu—Arg—Lys—Gin—Met—AIa-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2另外，作為VIP 的衍生物，還已知由 His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-LyS-Gln-Met-Ala-Val-Lys-LyS-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2構(gòu)成的 PACAP-27、由 His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln_Met_Ala_Val_Lys_Lys_Tyr_Leu_Ala_Aia_Val_Leu_Gly_Lys_Arg_Tyr_Lys_Gln_Arg_Val_Lys-Asn-Lys-NH2構(gòu)成的PACAP-38、由 Na-こ酸基-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn_Tyr_Thr_Lys_Leu_Arg_Lys_Gln_Nle_Aia_Ala_Lys_Lys^_Tyr_Leu_Asn_Asp^_Leu_Lys_LyS-Gly-Gly-Thr-NH2(17位Met被置換為正亮氨酸,*:在21位Lys與25位Asp間形成內(nèi)酰胺環(huán))構(gòu)成的R025-1553等。天然生長抑素作為具有下述序列的14氨基酸殘基的肽而已知。
Ala-Gly-Cys-LyS-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH2此處，在3位與14位的半胱氨酸殘基間形成了ニ硫鍵。需要說明的是，可以將8位Trp置換為D-Trp。另タ卜，通過結(jié)構(gòu)功能分析可知，生長抑素的7位至10位的Phe-Trp-Lys-Thr的β轉(zhuǎn)角片斷是活性所必須的序列[Nature, 1979,280(5722)，512-514，Nature, 1981，292 (5818)，55-58]，因而認(rèn)為 I 位至 6 位以及 11 位至14位的氨基酸也可以刪除。這樣的生長抑素衍生物還可以稱為包含氨基酸序列Phe-Trp-Lys-Thr的天然生長抑素的部分肽(可以從N末端和/或C末端連續(xù)缺失)。需要說明的是，除此之外，作為生長抑素衍生物，還有由D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-oI (在半胱氨酸殘基間形成ニ硫鍵)構(gòu)成的奧曲肽、或D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr、D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys_Thr (在半胱氨酸殘基間形成ニ硫鍵)、以及D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thp (在半胱氨酸殘基間形成ニ硫鍵)等報道。天然胰淀素作為具有下述序列的37氨基酸殘基的肽而已知。Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Aia-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2此處，在2位與7位的半胱氨酸殘基間形成了ニ硫鍵。需要說明的是，可以將25位Ala置換為Pro,可以將28位Ser置換為Pro,可以將29位Ser置換為Pro,它們不僅可以是分別單獨的置換，也可以是任意的兩處以上的置換。另外，還已知將GLP-I結(jié)合到N末端的肽類似物。天然胃饑餓素作為具有下述序列的28氨基酸殘基的肽而已知。Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-LyS-Leu-Gln-Pro-Arg-NH2其中，已知胃饑餓素的I位至5位的氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Phe-Leu負(fù)擔(dān)著充分的活性(Biochem Biophys Res Commun. 2001, 284(3)，655-659)，認(rèn)為 6 位至28位的氨基酸也可以刪除。這樣的胃饑餓素衍生物也可以稱為包含氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Phe-Leu的天然胃饑餓素的部分肽(可以從C末端連續(xù)缺失)。需要說明的是，胃饑餓素的3位的Ser被辛?；词箤⒃撔刘；D(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)，也能夠維持活性(JMed Chem. 2000，43(23)，4370-4376)。
本發(fā)明中，“生理活性復(fù)合體”是指生理活性物質(zhì)與本發(fā)明的GA模塊的部分肽結(jié)合而成的物質(zhì)。通常，相對于I分子生理活性物質(zhì)，結(jié)合I分子本發(fā)明的GA模塊的部分肽。生理活性復(fù)合體的C末端可以為酰肢體或羧酸體的任ー種。這是因為，對于生理活性物質(zhì)的生物體內(nèi)穩(wěn)定性的增強而言，無論C末端的形態(tài)如何，與本發(fā)明的GA模塊的部分肽的結(jié)合均很重要。作為所述生理活性物質(zhì)與本發(fā)明的GA模塊的部分肽的結(jié)合手段，可以在生理活性物質(zhì)與本發(fā)明的GA模塊的部分肽之間插入短的氨基酸連接子序列?！斑B接子”是指主要能夠起到間隔區(qū)的作用的全部物質(zhì)。連接子優(yōu)選由利用肽鍵連結(jié)的氨基酸構(gòu)成。其中，優(yōu)選由I個 3個氨基酸構(gòu)成，尤其優(yōu)選為Gly-Pro(GP)或Gly-Pro-Ser (GPS)。本說明書中，“生物體內(nèi)穩(wěn)定性”是指在循環(huán)血中、所采集的血漿或血清、各種生物體組織、所采集的各種組織勻漿中的物質(zhì)的穩(wěn)定性。例如，作為血中穩(wěn)定性的指標(biāo)之一，使 用物質(zhì)的血中濃度由最高值至減半為止的時間即血中消失半衰期(有時也稱為血中半衰期、血中濃度半衰期)。對本發(fā)明的GA模塊的部分肽或生理活性復(fù)合體的合成方法沒有特別限定，可以使用現(xiàn)有公知的方法。例如，使用固相合成法、液相合成法等化學(xué)合成法、或者酶合成法、重組DNA技術(shù)等方法即可。導(dǎo)入DNA序列或重組載體的宿主細(xì)胞可以是能夠生產(chǎn)本發(fā)明的肽的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母和更高度的真核細(xì)胞。例如，可以舉出BHK或CHO細(xì)胞株等。后述的實施例均使用了通用性廣的固相合成法，但不必限定于此。本發(fā)明的GA模塊的部分肽應(yīng)用于GLP-I而成的GLP-I肽復(fù)合體能夠應(yīng)用于GLP-I受體刺激有效的各種疾病。即，本發(fā)明的GLP-I肽復(fù)合體能夠用于例如2型糖尿病的處置、I型糖尿病的處置、肥胖的處置和/或食欲抑制等。GLP-I肽復(fù)合體的給藥量由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)各種疾病的各患者適宜決定。一般地，認(rèn)為其給藥量為約lug/天 約IOmg/天。在應(yīng)用于Exendin-4時也可以為該給藥量。本發(fā)明的GLP-I肽復(fù)合體的生物體內(nèi)的穩(wěn)定性高且具有持續(xù)性，因此能夠基于各GLP-I肽復(fù)合體的生物體內(nèi)穩(wěn)定性決定給藥程序。另外，關(guān)于講本發(fā)明的GA模塊的部分肽應(yīng)用于VIP、生長抑素、胰淀素或胃饑餓素等所得到的生理活性復(fù)合體，其能夠應(yīng)用于可適用各生理活性物質(zhì)的各種疾病。關(guān)于這些生理活性復(fù)合體的給藥量，VIP為約50 μ g/天 約Img/天，生長抑素為約50 μ g/天 約Img/天,胰淀素為約5μ g/天 約500 μ g/天,另外胃饑餓素為約100 μ g/天 約Img/天。在針對這些以外的生理活性物質(zhì)來應(yīng)用本發(fā)明的GA模塊的部分肽的情況下，也可以由該生理活性物質(zhì)的已知的給藥量容易地設(shè)定復(fù)合體的給藥量。即，設(shè)定以摩爾換算為等量的給藥量，由此調(diào)整為最佳值即可。本發(fā)明的生理活性復(fù)合體可以利用各種給藥路徑給藥。一般地，對于需要治療的患者，由皮下、靜脈、肺等給藥。除此之外，通過應(yīng)用范圍、生理活性復(fù)合體的性質(zhì)、給藥技術(shù)的組合，適宜選擇由經(jīng)ロ、鼻粘膜、表皮、眼球等的給藥路徑。另外，也可以選擇各生理活性物質(zhì)的已知給藥路徑的給藥。實施例通過以下的實驗例來更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但這些實施例并不限定本發(fā)明，并且可以在不脫離本發(fā)明的范圍的范圍內(nèi)進(jìn)行變化。I GLP-I肽復(fù)合體的合成
作為生物體內(nèi)穩(wěn)定性低的生理活性物質(zhì)，選擇GLP-1，并進(jìn)行驗證。在GLP-I或GLP-I衍生物的C末端附加本發(fā)明的GA模塊的部分肽，作為GLP-I肽復(fù)合體。GLP-I肽復(fù)合體的合成利用固相合成進(jìn)行，通過HPLC純化后，利用質(zhì)譜確認(rèn)合成品。-NH2表示C末端被酰胺化。作為GLP-I，主要使用GLP-I (7-35)，使用8位為天然的丙氨酸、或者置換為絲氨酸或甘氨酸的物質(zhì)。[Ser8]表示從序列號24所示的天然GLP-I的左側(cè)起第2位、即8位的丙氨酸變換為絲氨酸，與8S含義相同。需要說明的是，在該領(lǐng)域中，由于將GLP-I前體的N末端作為I位的關(guān)系，在天然GLP-I中，通常將左端的N末端作為7位。作為所附加的肽，使用序列號I表示的46殘基的GA模塊或其部分肽。序列號I表示的肽是從GA模塊的第I個氨基酸開始并在第46個氨基酸結(jié)束的序列的肽，因此簡記為GAm(1-46),關(guān)于GA模塊的部分肽,將在序列號I表不的GA模塊中從X位的氨基酸開始并在Y位的氨基酸結(jié)束的序列的肽簡記為GAm(X-Y)。
需要說明的是，序列號I 23表示由GA模塊的全部序列或部分序列構(gòu)成的肽，序列號24 58表示作為生理活性物質(zhì)的GLP-I或其衍生物。實施例I. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (38-42)-NH2 序列號 28 (GAm :序列號 2)實施例2. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (38-44)-NH2 序列號 29 (GAm :序列號 3)實施例3. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (37-44)-NH2 序列號 30 (GAm :序列號 4)實施例4. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (35-44)-NH2 序列號 31 (GAm :序列號 5)實施例5. GLP-I (7-35) -GAm (38-42) -NH2 序列號 32 (GAm :序列號 2)實施例6. GLP-I (7-35)-GAm (35-44)-NH2 序列號 33 (GAm :序列號 5)實施例7. GLP-I (7-35) -GAm (33-43) -NH2 序列號 34 (GAm :序列號 7)實施例8. GLP-I (7-35) -GAm (33-44) -NH2 序列號 35 (GAm :序列號 8)實施例9. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (33-44)-NH2 序列號 36 (GAm :序列號 8)實施例10. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (32-44)-NH2 序列號 37 (GAm :序列號 9)實施例11. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (31-44)-NH2 序列號 38 (GAm :序列號 10)實施例12. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (30-42)-NH2 序列號 39 (GAm :序列號 11)實施例13. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (28-42)-NH2 序列號 40 (GAm:序列號 12)實施例14. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (28-44)-NH2 序列號 41 (GAm :序列號 13)實施例15. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (27-46)-NH2 序列號 42 (GAm :序列號 14)實施例16. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (25-46)-NH2 序列號 43 (GAm :序列號 15)實施例17. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (22-46)-NH2 序列號 44 (GAm :序列號 16)實施例18. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (28-44)序列號 41 (GAm :序列號 13)實施例19. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (33-44)序列號 36 (GAm :序列號 8)實施例20. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (37-44)序列號 30 (GAm :序列號 4)實施例21. GLP-I (7-35) -Gly-Pro-GAm (35-44) -NH2 序列號 45 (GAm :序列號 5)實施例22. GLP-I (7-35) -Gly-Pro-GAm (34-44) -NH2 序列號 46 (GAm :序列號 6)實施例23. GLP-I (7-35) -Gly-Pro-Ser-GAm (34-44) -NH2 序列號 47 (GAm :序列號 6)實施例24. GLP-I (7-35) -Gly-Pro-Ser-GAm (33-44) -NH2 序列號 48 (GAm :序列號 8)比較例I. GLP-I (7-36) -NH2 序列號 24
比較例2. [Ser8]-GLP-1 (7-36) -NH2 序列號 26比較例3. Exendin-4 (1-39)-NH2 序列號 27比較例4. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (1-46)-NH2 序列號 49 (GAm :序列號 I)比較例5. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (17-46)-NH2 序列號 50 (GAm :序列號 17)比較例6. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (21-46)-NH2 序列號 51 (GAm :序列號 18)比較例7. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (28-40)-NH2 序列號 52 (GAm :序列號 19)比較例8. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (28-37)-NH2 序列號 53 (GAm :序列號 20)比較例9. [Ser8]-GLP-I (7-35)-GAm (39-44)-NH2 序列號 54 (GAm :序列號 21)比較例10. GLP-I (7-35)-GAm (38-41)-NH2 序列號 55 (GAm :序列號 22)比較例11. GLP-I (7-35)-GAm (38-40)-NH2 序列號 56 (GAm :序列號 23)比較例12. [Gly8]-GLP-I (7-35)-RPSS-NH2 序列號 57比較例13. [Ser8, Glu22, Glu23]-GLP-1 (7-35) _GPSSGAPPPS_NH2 序列號 58<試驗例I > GLP-I肽復(fù)合體的血漿穩(wěn)定性的評價為了驗證GLP-I肽復(fù)合體的生物體內(nèi)穩(wěn)定性，在體外評價血漿中的穩(wěn)定性。I.方法用ニこ醚麻醉SD大鼠，進(jìn)行全血采集，并分離血漿級分。以最終濃度為O. 5 μ mol/L的方式將各GLP-I肽復(fù)合體添加到血漿中，于37度靜置。在0、8、48小時后回收樣品，用HPLC/MS測定GLP-I肽復(fù)合體的量，由此評價殘存率。關(guān)于GLP-I肽復(fù)合體的殘存率，將O小時回收的樣品的HPLC/MS測定結(jié)果設(shè)為100%，計算出8小時后、48小時后血漿中殘存的比例，由此進(jìn)行評價。2.結(jié)果和考察針對各GLP-I肽復(fù)合體，將分析血漿穩(wěn)定性的結(jié)果作為殘存率并示于表I和表2。(I) GA模塊的部分肽的效果關(guān)于未附加肽的天然GLP-I (比較例I)和8S-GLP-1 (比較例2)，48小時后在血漿中完全被分解。另外，即便是附加了非GA模塊序列的肽的GLP-I肽復(fù)合體(比較例12和
13)，48小時后的血漿中殘存率也為0%或12%，血漿穩(wěn)定性極低，與天然GLP-1(比較例I)或8S-GLP-1 (比較例2)程度相同。另ー方面，關(guān)于附加了 GA模塊的部分肽的GLP-I肽復(fù)合體(實施例I 實施例20)，即使在48小時后的大鼠血漿中也以幾乎未分解的狀態(tài)殘存，獲得了比天然GLP-I (比較例I)或8S-GLP-1 (比較例2)明顯更高的血漿穩(wěn)定性。另外，如實施例5 8所示可知在將該肽附加至天然GLP-I的情況下，也獲得了與附加至8S-GLP-1時同樣的血漿穩(wěn)定性。令人驚訝的是，盡管天然GLP-I的血漿穩(wěn)定性極低，但還是顯示出了這樣的結(jié)果。需要說明的是，實施例18 20是C末端的羧酸體，但與酰胺體相同。關(guān)于GA模塊的鏈長，分別附加了長鏈的GAm(l-46)和GAm(17_46)的GLP-I肽復(fù)合體(比較例4和5)48小時后的血漿中殘存率為105%，顯示出極高的血漿穩(wěn)定性。另外，令人驚訝的是，附加了 GAm(38-42)的GLP-I肽復(fù)合體(實施例I和5)48小時后的血漿中殘存率也分別為71%和83%，顯示出顯著高的血漿穩(wěn)定性，可知即使是5殘基的GA模塊的部分肽，也能夠賦予與30殘基的GA模塊的部分肽或GA模塊的全長肽幾乎相同的血漿穩(wěn)定性。
與此相対，分別附加了 GAm(39-44)、GAm(38-41)和 GAm(38-40)的 GLP-1 肽復(fù)合體(比較例9，10，11)48小時后的血漿中殘存率均為0%，被完全分解。另外，分別附加了GAm(28-40)和GAm(28-37)的GLP-I肽復(fù)合體(比較例7，8)48小時后的血漿中殘存率也分別為4%和0%，基本上完全被分解。由此可知，在GA模塊的部分肽中，為了得到血漿穩(wěn)定性，38位的Ile和42位的Leu是必須的。S卩，表明為了獲得血漿穩(wěn)定性所需要的最小的氨基酸序列是 GAm(38-42)所不的 Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(IDEIL)的 5 殘基。(2)介由連接子附加本發(fā)明的GA模塊的部分肽實施例21 實施例24是介由連接子附加了 GA模塊的部分肽的GLP-I肽復(fù)合體，在這些GLP-I肽復(fù)合體中，48小時后也顯示出充分的血漿中殘存率。由此可以確認(rèn)，在介由連接子附加了 GA模塊的部分肽的情況下也確保了血漿穩(wěn)定性。表I
血漿穩(wěn)定性
權(quán)利要求
1.ー種GA模塊的部分肽，其包含氨基酸序列Ile-Asp-Glu-Ile-Leu，氨基酸數(shù)為5個 25個。
2.如權(quán)利要求I所述的GA模塊的部分肽，其中，所述GA模塊為來自鏈球菌G148的GA模塊。
3.如權(quán)利要求I所述的GA模塊的部分肽，其中，氨基酸數(shù)為5個 17個。
4.如權(quán)利要求I所述的GA模塊的部分肽，其由式=Y22-Y23-Y24-Y25-Y26-Y27-Y28-Y29-Y3tl-Y31ィ32_丫33_丫34ィ35ィ36_丫3廠1 Ie-Asp-Glu-IIe-Leu-Y43-Y44-Y45-Y46 表不的氨基酸序列構(gòu)成， 式中，Y22指Lys或缺失，Y23指Asn或缺失，Y24指Leu或缺失，Y25指Ile或缺失，Y26指Asn或缺失，Y27指Asn或缺失，Y28指Ala或缺失，Y29指Lys或缺失，Y30指Thr或缺失，Y31指Val或缺失，Y32指Glu或缺失，Y33指Gly或缺失，Y34指Val或缺失，Y35指Lys或缺失，Y36指Ala或缺失，Y37指Leu或缺失，Y43指Ala或缺失，Y44指Ala或缺失，Y45指Leu或缺失，Y46指Pro或缺失；其中，缺失限定于由Y22和/或Y46起的連續(xù)的缺失，包括Y22或Y46單獨的缺失以及僅Y22和Y46兩處的缺失。
5.如權(quán)利要求4所述的GA模塊的部分肽，其選自以下的組， Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (序列號 2)Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 3)Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 4)Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 5)Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 6)Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala (序列號 7)Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 8)Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 9)Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號 10)Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (序列號 11)Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu (序列號 12)Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala (序列號13)Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (序列號 14)Ile-Asn-Asn-Ala-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Val-Lys-Ala-Leu-Ile-Asp-Glu-Ile-Leu-AIa-Ala-Leu-Pro (序列號 15)Lys_Asn_Leu_Ile_Asn_Asn_Ala_Lys_Thr_Val_Giu_Gly_Val_Lys_Ala_Leu_Ile_Asp_GIu-Ile-Leu-Ala-Ala-Leu-Pro (序列號 16)。
6.如權(quán)利要求I所述的GA模塊的部分肽,其在序列號I表不的GA模塊的氨基酸22位至38位中的一個氨基酸開始，在氨基酸42位至46位中的ー個氨基酸結(jié)束。
7.ー種生理活性復(fù)合體，其通過權(quán)利要求I 6中任一項所述的GA模塊的部分肽與生理活性物質(zhì)結(jié)合而成。
8.如權(quán)利要求7所述的生理活性復(fù)合體，所述生理活性物質(zhì)為胃腸激素或它們的衍生物、或者Exendin-4或它們的衍生物。
9.如權(quán)利要求8所述的生理活性復(fù)合體，其中，所述胃腸激素選自由GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、生長抑素、胰淀素和胃饑餓素組成的組。
10.如權(quán)利要求7所述的生理活性復(fù)合體，其是所述GA模塊的部分肽與所述生理活性物質(zhì)介由連接子結(jié)合而成的。
11.如權(quán)利要求9所述的生理活性復(fù)合體，其中，所述GLP-I或其衍生物為由式His_X8_X9_Gly_Thr_Phe_Thr_Ser_Asp_X16_Ser_X18_X19_X20_Glu_X22_X23_Ala_X25_X26_X27-Phe-Ile-X3ci-Trp-Leu-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-X4tl-X41-X42-X43-X44-X45 表不的氨基酸序列構(gòu)成且具有GLP-I活性的GLP-I或GLP-I衍生物，式中，X8 為 Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp、Lys 或 Aib, X9 為 Glu、Gly、Asp或 Lys, X16 為 Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Tyr、Glu、Asp、Trp 或 Lys, X18 為 Ser、Ala、Arg、Gly、Thr> Leu、lie、Val、Glu、Asp、Trp 或 Lys, X19 為 Tyr> Phe> Trp> Glu、Gin、Asp 或Lys,X20 為 Leu、Met、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、Tyr 或 Lys, X22 為 Gly、Ala、Glu、Ser> Thr> Leu、lie、Val、Asp、Lys、Arg、Cys 或 Aib, X23 為 Gin、Arg、Glu、Asp、Asn或 Lys, X25 為 Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp 或 Lys, X26 為 Lys、Gin、Glu、Asp、His 或 Arg, X27 為 Glu、Ala、Asp、Lys 或 Leu, X30 為 Ala、Glu、Gly、Ser> Thr> Leu、lie、Val、Asp、Lys、Gin、Tyr、His 或 Arg, X33 為 Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、lie、Glu、Asp 或 Lys, X34為 Lys> Arg、Glu、Asp、His、Ala、Gly 或 Asn, X35 為 Gly、Ala、Ser> Thr> Leu、lie、Val、Glu、Asp、Lys、His、Pro 或 Aib, X36 為 Arg、Gly、Lys、Glu、Asp、His 或缺失，X37 為 Gly、Pro、Glu、Lys、Ala、Thr、Ser、Asp、Leu、lie、Val、His 或缺失，X38 為 Ser、Lys、Arg、Glu、Asp、His 或缺失，X39 為 Ser、Arg、Lys、Glu、Asp、His 或缺失，X40 為 Gly、Glu、Lys、Asp 或缺失，X41 為 Ala、Lys> Phe> Trp> Tyr> Glu> Asp 或缺失，X42 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X43 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X44 為 Pro、Lys、Glu、Asp 或缺失，X45 為 Ser、Lys、Val、Glu、Asp 或缺失。
12.如權(quán)利要求11所述的生理活性復(fù)合體，其中，所述GLP-I或GLP-I衍生物選自由GLP-I(7-37)，[Ser8]-GLP-I (7-37)，[Gly8]-GLP—1 (7—37)，[Val8]-GLP—1 (7—37)，[Glu22]_GLP-I (7-37)，[Lys22]-GLP-I (7-37), [Val8, Glu22]-GLP—1(7—37)，[Val8, Lys22]-GLP-1 (7-37)，[Gly8，Glu22]-GLP-1(7-37)，[Gly8, Lys22]-GLP-1 (7-37), [Val8, Glu30]-GLP-1 (7-37)，[Gly8，Glu30]-GLP-1(7-37)，[Val8, His37]-GLP—1(7—37)，[Gly8, His37]-GLP—1(7—37)，[Arg34]-GLP-1(7-37), [Lysl8]-GLP—1 (7—37)，[Gly8, Glu22, Gly36]-GLP-1(7-37), [Aib8,Aib22]-GLP-1 (7-37)，[Aib8, Aib35]-GLP—1 (7—37)，[Aib8, Aib22, Aib35]-GLP—1(7—37)，[Glu22, Glu23]-GLP-1(7-37)，[Gly8, Glu22, Glu23]-GLP-1 (7-37)，[Val8, Glu22, Glu23]-GLP-1(7-37)，[Val8，Glu22，Val25]-GLP-1 (7-37)，[Val8, Glu22, Ile33]-GLP-1 (7-37), [Val8,Glu22, Val25, Ile33]_GLP_l (7-37)和它們的 37 位缺失的 GLP-1 (7-36)型、以及它們的 36位與37位缺失的GLP-I (7-35)型組成的組。
13.—種改善生理活性物質(zhì)的生物體內(nèi)穩(wěn)定性的方法，其特征在于，該方法將權(quán)利要求I 6中任一項所述的GA模塊的部分肽與生理活性物質(zhì)結(jié)合。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述生理活性物質(zhì)為GLP-I或其衍生物，該方法將所述GA模塊的部分肽與GLP-I或其衍生物的C末端結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供一種在保持生理活性物質(zhì)的活性的同時提高該生理活性物質(zhì)的生物體內(nèi)穩(wěn)定性的肽片段、以及附加了該肽片段的生理活性物質(zhì)。本發(fā)明涉及一種氨基酸數(shù)為5個～25個的GA模塊的部分肽，其由GA模塊(序列號1)的部分序列構(gòu)成，包含氨基酸序列Ile-Asp-Glu-Ile-Leu(序列號2)；另外，本發(fā)明涉及該GA模塊的部分肽與生理活性物質(zhì)結(jié)合而成的生理活性復(fù)合體。作為生理活性物質(zhì)，可以舉出GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、生長抑素、胰淀素、胃饑餓素和它們的衍生物等。
文檔編號C07K14/575GK102869676SQ20118002109
公開日2013年1月9日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者岡本昌之, 岡本隆司, 重盛智大, 村瀨貴代, 宮地淳, 竹內(nèi)光明, 田村美由紀(jì), 木下廣志 申請人:株式會社三和化學(xué)研究所