專利名稱：雙特異性二價抗vegf/抗ang-2抗體的制作方法
雙特異性二價抗VEGF/抗ANG-2抗體本發(fā)明涉及針對人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF/VEGF-A)且針對人血管生成素-2(ANG-2)的雙特異性二價抗體、其生成方法、含有所述抗體的藥物組合物及其用途。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生牽涉多種病癥的發(fā)病機(jī)制，所述病癥包括實體瘤、眼內(nèi)新生血管性綜合征諸如增殖性視網(wǎng)膜病變或年齡相關(guān)的黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病(Folkman, J.等,J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M.等,Annu. Rev.Physiol. 53 (1991) 217-239 ;和 Garner, A.，Vascular diseases,于Pathobiology ofocular disease, A dynamic approach, Garner, A.和 Klintworth, G. K.(編)，第二版，Marcel Dekker, New York(1994),第1625頁-第1710頁)。在實體瘤的情況中，新血管化允許腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比獲得生長優(yōu)勢和增殖自主性。因而，已觀察到腫瘤切片中微血管的密度與乳腺癌以及幾種其它腫瘤中患者存活間的關(guān)聯(lián)(Weidner，N.等，N EnglJ Med. 324(1991) 1-8;Horak, E. R.等，Lancet 340(1992) 1120-1124;和 Macchiarini, P.等，Lancet 340(1992) 145-146)。VEGF 和抗-VEGF 抗體人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF/VEGF-A) (SEQ ID No: 105)記載于例如Leung, D.W.等，Science 246 (1989) 1306-9;Keck,P.J.等，Science 246 (1989) 1309-12 和Connolly, D. T.等，J. Biol. Chem. 264(1989)20017-24。VEGF 牽涉調(diào)節(jié)正常的和異常的血管發(fā)生和與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管化(Ferrara, N.等，Endocr.Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R. A.等，J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159 ; Brown, L.F.等，Human Pathol.26 (1995)86-91;Brown,L.F.等，CancerRes. 53 (1993)4727-4735 ; Mattern, J.等，Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934 ;和 Dvorak, H. F.等，Am.J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039)。VEGF是已經(jīng)從數(shù)種來源分離的同二聚體糖蛋白。VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞顯示高度特異的促有絲分裂活性。VEGF在胚胎血管生成期間在新血管形成中和在成年期間在血管發(fā)生中具有重要的調(diào)節(jié)功能(Carmeliet，P.等，Nature, 380(1996)435-439;Ferrara, N.等，Nature, 380(1996)439-442;綜述見Ferrara, N.等，Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25)。已經(jīng)在研究中證明了 VEGF發(fā)揮的作用的意義，該研究顯示了單個VEGF等位基因的失活由于不能形成血管系統(tǒng)(vasculature)而導(dǎo)致胚胎致死性(Carmeliet, P.等，Nature, 380(1996)435-439;Ferrara, N.等，Nature, 380(1996)439-442)。另外，VEGF對單核細(xì)胞具有強(qiáng)化學(xué)引誘物活性，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的血纖維蛋白溶酶原激活劑和血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑，而且還能誘導(dǎo)微血管通透性。由于后一種活性，它有時稱為血管通透性因子(VPF)。已經(jīng)綜述了 VEGF的分離和特性；JAL Ferrara, N.等，J. Cellular Biochem. , 47 (1991) 211-218 和 Connolly, D. T. , J.Cellular Biochem.，47 (1991) 219-223。單個 VEGF 基因的 mRNA 可變剪接產(chǎn)生 5 種 VEGF 同等型?？筕EGF中和性抗體抑制多種人腫瘤細(xì)胞系在小鼠中的生長(Kim，K. J.等，Nature362(1993)841-844;Warren, S. R.等，J. Clin. Invest. 95(1995) 1789-1797;Borgstrom, P.等，Cancer Res. 56 (1996) 4032-4039;和 Melnyk, 0.等，Cancer Res. 56 (1996) 921-924)。WO 94/10202、WO 98/45332、WO 2005/00900 和 WO 00/35956 涉及針對 VEGF 的抗體。人源化單克隆抗體貝伐單抗(bevacizumab)(以商品名阿瓦斯汀(Avastin) 銷售)是一種在腫瘤治療中使用的抗VEGF抗體(W0 98/45331)。蘭尼單抗(ranibizumab)(商品名Lucentis+ )是一種與貝伐單抗(阿瓦斯汀)自同一親本鼠抗體衍生的單克隆抗體 片段。它比親本分子小得多，并且已經(jīng)經(jīng)過親和力成熟，從而提供更強(qiáng)的對VEGF-A的結(jié)合(W0 98/45331)。它是一種已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療“濕”型年齡相關(guān)的黃斑變性(ARMD)(即，一種常見形式的年齡相關(guān)的視力喪失)的抗血管生成物。另一種抗VEGF抗體是例如在例如US 2007/0141065中描述的HuMab G6-31。ANG-2 和抗-ANG-2 抗體人血管生成素-2(ANG-2)(或者縮寫為 ANGPT2 或 ANG2) (SEQ ID No: 106)記載于 Maisonpierre, P. C.等，Science 277 (1997) 55-60 和 Cheung, A. H.等，Genomics48 (1998) 389-91 ο 發(fā)現(xiàn)血管生成素-I 和-2 (ANG-1 (SEQ ID No: 107)和 ANG-2 (SEQID No:106))為Tie( S卩，一種在血管內(nèi)皮內(nèi)選擇性表達(dá)的酪氨酸激酶家族)的配體。Yancopoulos, G. D.等，Nature 407 (2000)242-48。目前血管生成素家族有四種確定的成員。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可能代表小鼠和人中相同基因座的廣泛趨異的對應(yīng)物。Kim, I.等，F(xiàn)EBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I.等，J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-1和ANG-2最初是在組織培養(yǎng)實驗中分別作為激動劑和拮抗劑鑒定的(參見，對于 ANG-I:DaviS，S.等，Cell 87(1996) 1161-69;和對于 ANG-2:Maisonpierre, P.C.等，Science 277 (1997) 55-60)。所有已知的血管生成素主要結(jié)合Tie2，而Ang-I和_2兩者都以 3nM(Kd)的親和力結(jié)合 Tie2。Maisonpierre, P. C.等，Science 277 (1997) 55-60。顯示了 Ang-I 支持 EC 存活并促進(jìn)內(nèi)皮完整性，Davis, S. ^ , Cel 187 (1996) 1161-69; Kwak, H.J.等，F(xiàn)EBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, C.等，Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G.等，Science 286 (1999) 2511-2514; Thurston, G.等，Nat. Med. 6 (2000) 460-63，而 ANG-2 具有相反的效果，并且在缺少存活因子VEGF或堿性成纖維細(xì)胞生長因子的情況下，促進(jìn)血管去穩(wěn)定化和消退。Maisonpierre, P. C.等，Science 277(1997)55-60。然而，ANG-2 功能的許多研究已經(jīng)提示了更復(fù)雜的情形。ANG-2可能是血管重塑的一種復(fù)雜的調(diào)節(jié)物，其在血管發(fā)芽和血管消退兩者中發(fā)揮作用。支持ANG-2的此類作用，表達(dá)分析揭示了 ANG-2在血管生成性發(fā)芽的成年背景中與VEGF —起被快速誘導(dǎo)，而ANG-2在血管消退的背景中在沒有VEGF 的情況中被誘導(dǎo)。Holash, J.等，Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J.等，Oncogene18(1999)5356-62)。與背景依賴性作用一致，ANG-2特異性結(jié)合同一內(nèi)皮特異性受體Tie_2(其由Ang-I激活),但是對其激活具有背景依賴性影響。Maisonpierre, P. C.等，Science277(1997)55-60。角膜血管發(fā)生測定法已經(jīng)顯示了 ANG-I和ANG-2兩者都具有類似的效果，與VEGF協(xié)同起作用以促進(jìn)新血管的生長。Asahara, T.等，Circ. Res. 83 (1998) 233-40。由于觀察到在體外于高濃度，ANG-2也可以是促血管生成的，從而提出存在劑量依賴性內(nèi)皮應(yīng)答的可能性。Kim, I.等，Oncogene 19(2000)4549-52。在高濃度時，ANG-2在血清剝奪凋亡期間經(jīng)由PI-3激酶和Akt途徑經(jīng)由激活Tie2充當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡存活因子。Kim，I.等，Oncogene 19(2000)4549-52。其它體外實驗提示，在持續(xù)暴露期間，ANG-2的效果可以逐漸從Tie2的拮抗劑轉(zhuǎn)換為激動劑，并且在后來的時間點，其可以直接促成血管的管形成和新血管穩(wěn)定化。Teichert-Kuliszewska, K.等,Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70。此外，如果在血纖蛋白凝膠上培養(yǎng)EC，那么也觀察到用ANG-2激活Tie2，可能提示ANG-2的作用可能取決于EC分化狀態(tài)。Teichert-Kuliszewska, K.等，Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70。在三維膠原凝膠中培養(yǎng)的微血管EC中，ANG-2也可以誘導(dǎo)Tie2激活，并且促進(jìn)毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)的形成。Mochizuki, Y.等，J. Cell. Sci. 115(2002) 175-83。使用3-D球形共培養(yǎng)物作為血管成熟的體外模型表明，EC與間充質(zhì)細(xì)胞間的直接接觸消除對VEGF的響應(yīng)性，而VEGF和ANG-2的存在誘導(dǎo)發(fā)芽。Korff,T.等，F(xiàn)aseb J. 15 (2001) 447-57。Etoh, T. H.等證明了組成性表達(dá)Tie2的EC，MMP-U ~9和u_PA的表達(dá)在存在VEGF的情況中被ANG-2強(qiáng)烈上調(diào)。Etoh，T.等，Cancer Res. 61 (2001) 2145-53。憑借體內(nèi)瞳孔膜模型，Lobov，I. B.等顯示了在存在內(nèi)源VEGF的情況中ANG-2促進(jìn)毛細(xì)管直徑的快速增加、基底層的重塑、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并刺激新血管的發(fā)芽。Lobov, I. B.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(2002) 11205-10。相·反，ANG-2在沒有內(nèi)源VEGF的情況中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞死亡和血管消退。Lobov, I. B.等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 99(2002) 11205-10。類似地，憑借一種體內(nèi)腫瘤模型，Vajkoczy, P.等證明了多細(xì)胞聚集體經(jīng)由由宿主和腫瘤內(nèi)皮同時表達(dá)VEGFR-2和ANG-2通過血管生成性發(fā)芽啟動血管生長。Vajkoczy, P.等，J. Clin. Invest. 109(2002)777-85。此模型例示了生長中的腫瘤建立的微血管系統(tǒng)的特征在于連續(xù)的重塑，推斷其由VEGF和ANG-2的表達(dá)介導(dǎo)。Vajkoczy, P.等，J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85。Tie-2和血管生成素-I的敲除小鼠研究顯示了類似的表型，并且提示了血管生成素-I刺激的Tie-2磷酸化介導(dǎo)形成中的血管的重塑和穩(wěn)定化，這促進(jìn)血管發(fā)生期間的血管成熟和內(nèi)皮細(xì)胞支持細(xì)胞粘著的維持(Dumont, D. J.等，Genes & Development, 8(1994) 1897-1909;Sato, T. N.，Nature, 376 (1995)70-74;Thurston,G.等，NatureMedicine 6(2000)460-463)。血管生成素_1的作用被認(rèn)為是在成年中保守的，其中它廣泛且組成性表達(dá)(Hanahan, D. , Science, 277 (1997) 48-50 ; Zagzag, D.等,ExpNeurology 159(1999)391-400)。比較而言，血管生成素_2表達(dá)主要受限于血管重塑部位，認(rèn)為其在該處阻斷血管生成素-I的組成性穩(wěn)定化或成熟功能，允許血管恢復(fù)成并保持于可以更為響應(yīng)發(fā)芽信號的可塑狀態(tài)(Hanahan, D. , 1997;Holash, J.等，Oncogene18 (199) 5356-62;Maisonpierre, P. C.，1997)。病理學(xué)血管發(fā)生中血管生成素_2表達(dá)的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多腫瘤類型顯示血管的血管生成素-2表達(dá)(Maisonpierre, P. C.等，Science277(1997)55-60)。功能性研究提示了血管生成素_2牽涉腫瘤血管發(fā)生，并且將血管生成素-2過表達(dá)與小鼠異種移植物模型中腫瘤生長增加聯(lián)系起來(Ahmad, S. A.等，CancerRes.，61 (2001) 1255-1259)。其它研究已經(jīng)將血管生成素_2過表達(dá)與腫瘤高血管分布(hypervascularity)聯(lián)系起來(Etoh, T.等，Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Tanaka, F.等，Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129)。在最近幾年中，已經(jīng)提出了血管生成素-I、血管生成素-2和/或Tie-2為可能的抗癌治療性靶物。例如，US 6, 166, 185, US 5，650，490和US 5，814，464各披露了抗-Tie-2配體和受體抗體。報告了使用可溶性Tie-2的研究降低嚙齒類中腫瘤的數(shù)目和大小(Lin, 1997; Lin 1998)。Siemeister, G.等，Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91 生成了表達(dá)Tie-2的胞外域的人黑素瘤細(xì)胞系，將這些注射到裸鼠中，并且報告了可溶性Tie-2導(dǎo)致對腫瘤生長和腫瘤血管發(fā)生的顯著抑制。鑒于血管生成素-I和血管生成素-2兩者都結(jié)合Tie-2，通過這些研究不清楚血管生成素-I、血管生成素-2或Tie-2是否會是抗癌療法的有吸引力的靶物。然而，有效的抗血管生成素-2療法被認(rèn)為對治療疾病諸如癌癥(其中進(jìn)展依賴于異常的血管發(fā)生，其中阻斷該過程可以導(dǎo)致阻止疾病進(jìn)展)是有益的(Folkman, J. , Nature Medicine. I(1995)27-31)。
另外，一些小組已經(jīng)報告了結(jié)合血管生成素-2的抗體和肽的用途。參見例如US6，166，185 和 US 2003/10124129、WO 03/030833、WO 2006/068953、WO 03/057134 或 US2006/0122370。血管生成素-2的病灶性表達(dá)(focal expression)的效果研究已經(jīng)顯示了，拮抗血管生成素-l/Tie-2信號松弛緊密的血管結(jié)構(gòu)，由此將EC暴露于來自血管發(fā)生誘導(dǎo)劑例如VEGF的激活信號(Hanahan, D.，Science, 277(1997)48-50)。源自對血管生成素-I的抑制的此促血管生成效果指示抗血管生成素-I療法不會是有效的抗癌治療。ANG-2在發(fā)育期間在發(fā)生血管重塑的部位表達(dá)。Maisonpierre, P. C.等，Science277(1997)55-60。在成年個體中，ANG-2表達(dá)限于血管重塑的部位以及高度血管化腫瘤，包括膠質(zhì)瘤(Osada, H.等,Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09; Koga, K.等,CancerRes. 61 (2001) 6248-54)、肝細(xì)胞癌(Tanaka, S.等，J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45)、胃癌(Etoh，T.等，Cancer Re s. 61(2001)2145-5 3; Le e,J. H.等，Int.J. Oncol. 18 (2001) 355-61)、甲狀腺腫瘤(Bunone, G.等，Am J Pathol 155(1999) 1967-76)、非小細(xì)胞肺癌(Wong，M. P.等，LungCancer 29 (2000) 11-22)、和結(jié)腸癌(Ahmad, S.A.等，Cancer 92(2001) 1138-43)、和前列腺癌(Wurmbach, J. H.等，AnticancerRes. 20(2000)5217-20)。發(fā)現(xiàn)了一些腫瘤細(xì)胞表達(dá) ANG-2。例如，Tanaka, S.等，Ι-α in. Invest. 103 (1999) 341-45檢測到人肝細(xì)胞癌(HCC)的12份標(biāo)本之10份中的ANG_2mRNA。Ellis的小組報告了 ANG-2在腫瘤上皮中遍在表達(dá)。Ahmad, S. A.等，Cancer92(2001) 1138-43。其他研究者報告了類似的發(fā)現(xiàn)。Chen, L.,等.，J. Tongji Med.Univ. 21 (2001)228-35。通過檢測存檔的人乳腺癌標(biāo)本中的ANG_2mRNA水平，Sfiligoi，C.等，Int. J. Cancer 103(2003)466-74報告了 ANG_2mRNA與輔助性淋巴結(jié)侵入、短的無疾病時間和不良的總體存活顯著有關(guān)。Tanaka, F.等，Cancer Res. 62 (2002) 7124-29審查了分別為病理學(xué)I至IIIA期的總共236名非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者。使用免疫組織化學(xué)，他們發(fā)現(xiàn)16. 9%的NSCLC患者呈ANG-2陽性。ANG-2陽性腫瘤的微血管密度顯著高于ANG-2陰性的。僅在VEGF表達(dá)較高時看到ANG-2的此類血管生成效果。此外，ANG-2的陽性表達(dá)是預(yù)測不良術(shù)后存活的重要因子。Tanaka, F.等，CancerRes. 62(2002)7124-7129。然而，他們沒有發(fā)現(xiàn)Ang-I表達(dá)和微血管密度間的顯著關(guān)聯(lián)。Tanaka, F.等，CancerRes. 62 (2002) 7124-7129。這些結(jié)果提示了 ANG-2是數(shù)類癌癥患者不良預(yù)后的指示物。最近，使用ANG-2敲除小鼠模型，Yancopoulos的小組報告了 ANG-2是出生后血管發(fā)生需要的。Gale, N. W.等，Dev.Cell 3(2002)411-23。他們顯示了 ANG-2敲除小鼠不發(fā)生眼中玻璃狀體(hyaloid)血管系統(tǒng)的發(fā)育編程性消退，而且它們的視網(wǎng)膜血管不能從中心視網(wǎng)膜動脈發(fā)芽。Gale, N. W.等，Dev. Cell3 (2002) 411-23。他們還發(fā)現(xiàn)了 ANG-2的缺失導(dǎo)致淋巴脈管系統(tǒng)的樣式形成(patterning)和功能的深刻缺陷。Gale, N. W.等，Dev.Cell3(2002)411-23。用Ang-I的遺傳拯救改正淋巴的，而非血管發(fā)生缺陷。Gale, N. W.等，Dev.Cell 3(2002)411-23。Peters和他的同事報告了可溶性Tie2在作為重組蛋白或在病毒表達(dá)載體中投遞時抑制小鼠模型中鼠乳腺癌和黑素瘤的體內(nèi)生長。Lin，P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA95 (1998) 8829-34; Lin, P.等，J. Clin. Invest. 100(1997)2072-78。如此處理的腫瘤組織中的血管密度得到很大地降低。另外，可溶性Tie2阻斷由腫瘤細(xì)胞條件化培養(yǎng)基刺激的大鼠角膜中的血管發(fā)生(Lin, P.等，J. Clin. Invest. 100(1997)2072-78)。此外，Isner 和他的小組證明了，向VEGF添加ANG-2比單獨的VEGF促進(jìn)顯著更長的且更為環(huán)繞的新血管分布。Asahara, T.等，Circ. Res. 83 (1998) 233-40。過量的可溶性 Tie2 受體排除通過 ANG-2調(diào)控 VEGF 誘導(dǎo)的新血管化。Asahara, T.等，Circ. Res. 83 (1998) 233-40。Siemeister, G.等，Cancer Res. 59:3(1999)3185-91用裸鼠異種移植物顯示了，異種移植物中Flt-I或Tie2的胞外配體結(jié)合域的過表達(dá)導(dǎo)致對途徑的顯著抑制不能由另一途徑補(bǔ)償，提示應(yīng)當(dāng)認(rèn)為VEGF受體途徑和Tie2途徑是對于體內(nèi)血管發(fā)生過程必需的兩種獨立的介導(dǎo)物?！iemeister, G.等，Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91。這得到新近 White, R.，R.等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA100 (2003) 5028-33的出版物證明。在他們的研究中，證明了特異性結(jié)合并抑制ANG-2的核酸酶抗性RNA適體顯著抑制大鼠角膜微袋(micropocket)血管發(fā)生模型中由bFGF誘導(dǎo)的新血管化。雙特異性抗體最近已經(jīng)開發(fā)出極其多種重組抗體形式，例如通過融合例如IgG抗體形式和單鏈域得到的四價雙特異性抗體(參見，例如Coloma, M.J.等，NatureBiotech 15(1997) 159-163;WO 2001/077342 ；和 Morrison, S. L.，NatureBiotech25 (2007) 1233-1234)。還已經(jīng)開發(fā)了能夠結(jié)合兩種或更多種抗原且不再保留抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的幾種其它新形式,諸如雙抗體、三抗體或四抗體、微型抗體、幾種單鏈形式(scFv、雙-scFv)(Holliger, P.等，Nature Biotech23(2005) 1126-1136;Fischer,N. , Leger, 0. , Pathobiology 74(2007)3-14;Shen, J.等,Journal of ImmunologicalMethods 318(2007)65-74;Wu, C.等，NatureBiotech. 25(2007) 1290-1297)。所有此類形式使用接頭來將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與別的結(jié)合蛋白(例如scFv)融合或融合例如兩個Fab片段或scFv (Fischer, N. , Leger, 0. , Pathobiology 74(2007)3-14)。必須牢記的是,可能想要通過維持與天然存在的抗體的高度相似性來保留經(jīng)由Fe受體結(jié)合介導(dǎo)的效應(yīng)器功能，諸如例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。在WO 2007/024715中報告了雙重可變域免疫球蛋白工程化為多價且多特異性的結(jié)合蛋白。在US 6，897，044中報告了用于制備生物學(xué)活性抗體二聚體的方法。在US7，129，330中報告了具有經(jīng)由肽接頭彼此連接的至少四個可變域的多價FV抗體構(gòu)建物。在US 2005/0079170中報告了二聚體和多聚體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。在US 6，511，663中報告了包含通過連接結(jié)構(gòu)彼此共價結(jié)合的三或四個Fab片段的三或四價單特異性抗原結(jié)合蛋白，該蛋白質(zhì)并非天然的免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報告了四價雙特異性抗體，其可以在原核和真核細(xì)胞中有效表達(dá)的，并且在治療和診斷方法中是有用的。在US 2005/0163782中報告了一種自包含兩類多肽二聚體的混合物相對于未經(jīng)由至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體分離或優(yōu)先合成經(jīng)由至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。在US 5，959，083中報告了雙特異的四價的受體。在WO 2001/077342中報告了具有三個或更多個功能性抗原結(jié)合位點的工程化抗體。 在WO 1997/001580中報告了多特異性且多價的抗原結(jié)合多肽。WO 1992/004053報告了同綴合物，其通常通過合成交聯(lián)共價連接結(jié)合相同抗原決定簇的IgG類單克隆抗體制備。在WO 1991/06305中報告了對抗原具有高親合力的寡聚單克隆抗體，其中分泌通常為IgG類的寡聚體，其具有連接在一起的兩個或更多個免疫球蛋白單體以形成四價或六價IgG分子。在US 6，350，860中報告了綿羊衍生的抗體和工程化抗體構(gòu)建物，其可以用于治療干擾素Y活性病原性疾病。在US 2005/0100543中報告了作為雙特異性抗體的多價載體的靶向性構(gòu)建體，即靶向性構(gòu)建體的每個分子可以充當(dāng)兩個或更多個雙特異性抗體的載體。在WO 1995/009917中報告了遺傳上工程化的雙特異的四價的抗體。在WO 2007/109254中報告了由穩(wěn)定化的scFv組成或包含穩(wěn)定化的scFv的穩(wěn)定化的結(jié)合分子。VEGF和ANG-2抑制劑的組合WO 2007/068895涉及ANG-2拮抗劑和VEGF、KDR和/或FLTL拮抗劑的組合。WO2007/089445涉及ANG-2和VEGF抑制劑組合。WO 2003/106501涉及結(jié)合血管生成素并含有多聚化域的融合蛋白。W02008/132568涉及結(jié)合血管生成素和VEGF的融合蛋白。WO 2003/020906涉及具有受體的多個配體結(jié)合域的多價蛋白質(zhì)綴合物。WO 2009/136352涉及抗血管生成化合物。發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于i)所述第一抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO: I作為重鏈可變域(VH)，和SEQ ID NO:2作為輕鏈可變域(VL);且ii)所述第二抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO: 3作為重鏈可變域(VH)，和SEQ IDNO:4作為輕鏈可變域(VL)。在本發(fā)明的一個方面，依照本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；和b)特異性結(jié)合ANG-2的全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈和經(jīng)修飾的輕鏈，其中恒定域CL和CHl彼此替換。在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 7作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO:5作為所述第一全長抗體的輕鏈,和b)氨基酸序列SEQ ID NO:8作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO:6作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 11作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDN0:9作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID NO: 12作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO: 10作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 15作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO: 13作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID NO: 16作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO: 14作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。本發(fā)明的又一些方面是包含所述雙特異性抗體的藥物組合物、用于治療癌癥的所 述組合物、所述雙特異性抗體用于制造用于治療癌癥的藥物的用途、通過對需要此類治療的患者施用所述雙特異性抗體治療患有癌癥的患者的方法。本發(fā)明的又一些方面是包含所述雙特異性抗體的藥物組合物、用于治療血管疾病的所述組合物、所述雙特異性抗體用于制造用于治療血管疾病的藥物的用途、通過對需要此類治療的患者施用所述雙特異性抗體治療患有血管疾病的患者的方法。本發(fā)明的又一方面是編碼依照本發(fā)明的雙特異性抗體的鏈的核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有依照本發(fā)明的所述核酸，能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸的表達(dá)載體，和含有所述載體，用于重組生成依照本發(fā)明的雙特異性抗體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步包括包含依照本發(fā)明的載體的原核或真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步包括用于生成依照本發(fā)明的雙特異性抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)依照本發(fā)明的核酸，并從所述細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液回收所述雙特異性抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包括通過此類用于生成雙特異性抗體的方法獲得的抗體。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO:8 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列。依照本發(fā)明的雙特異性二價抗體對需要VEGF和ANG-2靶向療法的人患者顯示益處。依照本發(fā)明的抗體具有對患有此類疾病，特別是患有癌癥的患者產(chǎn)生益處的高度有價值的特性。依照本發(fā)明的雙特異性抗體在腫瘤生長抑制和/或抑制腫瘤血管發(fā)生或血管疾病中是高度有效的。依照本發(fā)明的雙特異性二價抗體，依照本發(fā)明的雙特異性二價〈VEGF-ANG-2〉抗體顯示有價值的藥動學(xué)/藥效學(xué)特性，如例如穩(wěn)定性、良好的(即緩慢的)清除率(例如在低劑量)。依照本發(fā)明的雙特異性抗體在下列方面是高度有效的a)腫瘤生長抑制(例如，憑借依照本發(fā)明的雙特異性抗體，與兩種單特異性抗體的組合相比，已經(jīng)可以在更低的濃度實現(xiàn)腫瘤停滯(stasis)(例如，在實施例9和10的Colo205和KPL-4腫瘤模型中，與10mg/kg的ANG2i_LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的組合相比，用10mg/kg的XMAbl已經(jīng)實現(xiàn)腫瘤停滯)，和/或b)抑制腫瘤血管發(fā)生或血管疾病(例如，與兩種單特異性抗體的組合相比，用依照本發(fā)明的雙特異性抗體已經(jīng)可以在更低的濃度實現(xiàn)最大抗血管發(fā)生果(例如，在實施例8的小鼠角膜血管發(fā)生測定法中，與10mg/kg的ANG2i-LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的組合相比，用10mg/kg的XMAbl已經(jīng)實現(xiàn)最大抗血管發(fā)生效果)。附圖簡述圖I Xmab例子的例示性二價雙特異性抗體形式,其包含經(jīng)突起_進(jìn)入_空穴(Knobs-into-Holes)修飾的 CH3 域。圖2a OAscFab例子的例示性二價雙特異性抗體形式,其包含經(jīng)突起_進(jìn)入_空穴修飾的CH3域。 圖2b 例子OAscXFabl的例示性二價雙特異性抗體形式，其包含經(jīng)突起_進(jìn)入-空穴修飾的CH3域。圖2c例子0AscXFab2和0AscXFab3的例示性二價雙特異性抗體形式，其包含經(jīng)突起-進(jìn)入-空穴修飾的CH3域。圖3〈VEGF-Ang-2>XMabl對VEGF (第I步)，接著結(jié)合hAng-2 (第二步)的同時結(jié)
入
口 ο圖4用于量化結(jié)合活性單抗<Ang2/VEGF>抗體的ELISA原理。圖5用于量化結(jié)合活性<Ang2/VEGF>XMabl抗體的ELISA校準(zhǔn)曲線。圖6小鼠角膜血管發(fā)生測定法通過施用依照本發(fā)明的雙特異性抗體抑制血管從緣(Iimbus)向 VEGF 梯度長出(outgrowth)。圖7小鼠角膜血管發(fā)生測定法通過施用依照本發(fā)明的雙特異性抗體抑制從緣(Iimbus)向VEGF梯度的血管發(fā)生/血管-比較雙特異<Ang2/VEGF>抗體XMabl、〈Ang2>單抗ANG2i-LC06 (LC06)、〈VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i_LC06和<VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)的組合。圖8在人結(jié)腸直腸癌Colo205的小鼠異種移植物(小腫瘤)中通過依照本發(fā)明的雙特異性抗體的體內(nèi)腫瘤生長抑制比較雙特異<Ang2/VEGF>抗體XMabl、<Ang2>單抗ANG2i-LC06 (LC06)、〈VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i_LC06和<VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)的組合。圖9在人結(jié)腸直腸癌Colo205的小鼠異種移植物(大腫瘤)中通過依照本發(fā)明的雙特異性抗體的體內(nèi)腫瘤生長抑制比較雙特異<Ang2/VEGF>抗體XMabl、<Ang2>MabANG2i-LC06(LC06)、〈VEGF>Mab 貝伐單抗(阿瓦斯汀)以及 ANG2i_LC06 和 <VEGF>Mab 貝伐單抗(阿瓦斯汀)的組合。

圖10在人乳腺癌KPL-4的小鼠異種移植物(小腫瘤)中通過依照本發(fā)明的雙特異性抗體的體內(nèi)腫瘤生長抑制比較雙特異<Ang2/VEGF>抗體XMab I、<Ang2>單抗ANG2i-LC06 (LC06)、〈VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i_LC06和<VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)的組合。圖11在人乳腺癌KPL-4的小鼠異種移植物(大腫瘤)中通過依照本發(fā)明的雙特異性抗體的體內(nèi)腫瘤生長抑制比較雙特異<Ang2/VEGF>抗體XMab I、<Ang2>單抗ANG2i-LC06 (LC06)、〈VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i_LC06和<VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)的組合。圖12在胃癌N87的小鼠異種移植物中通過依照本發(fā)明的雙特異性抗體的體內(nèi)腫瘤生長抑制比較雙特異性<Ang2/VEGF>抗體XMabl、<Ang2>單抗ANG2i_LC06 (LC06)、<VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)以及ANG2i-LC06和<VEGF>單抗貝伐單抗(阿瓦斯汀)的組合。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于i)所述第一抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO: I作為重鏈可變域(VH)，和SEQ ID NO: 2 作為輕鏈可變域(VL);且ii)所述第二抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO: 3作為重鏈可變域(VH)，和SEQ IDNO:4作為輕鏈可變域(VL)。在本發(fā)明的一個方面，依照本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合ANG-2的全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈和經(jīng)修飾的輕鏈，其中恒定區(qū)CL和CHl彼此替換。特異性結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG_2)的雙特異性抗體的此雙特異性二價抗體形式記載于WO 2009/080253(參見圖I中包括經(jīng)突起-進(jìn)入-空穴修飾的CH3域的例示性方案)。將基于此雙特異性二價抗體形式的抗體在本發(fā)明的例子中命名為Xmab。在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 7作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO:5作為所述第一全長抗體的輕鏈,和b)氨基酸序列SEQ ID NO:8作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO:6作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 11作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDN0:9作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID NO: 12作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO: 10作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 15作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO: 13作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID NO: 16作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO: 14作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 19作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO: 17作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID NO: 20作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO: 18作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 23作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO: 21作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID N0:24作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO:22作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。在一個實施方案中，這類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 27作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID·NO:25作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID NO: 28作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和氨基酸序列SEQ ID NO:26作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO:8 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 24 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28 的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個方面，依照本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合ANG-2的第二全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端經(jīng)由肽接頭與輕鏈的C端連接。在圖2a中顯示了特異性結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的此雙特異性抗體的此雙特異性二價抗體形式的例示性方案，其包含經(jīng)突起-進(jìn)入-空穴修飾的CH3域。將基于此雙特異性二價抗體形式的抗體在本發(fā)明的例子中命名為OascFab。
在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 30作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO: 31作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID NO:29作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和第二全長抗體的輕鏈。 在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 33作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO:34作為所述第一全長抗體的輕鏈,和b)氨基酸序列SEQ ID NO:32作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和第二全長抗體的輕鏈。在一個實施方案中，通過在下列位置之間引入二硫鍵將第二全長抗體的重和輕鏈的抗體重鏈可變域(VH)和抗體輕鏈可變域(VL)進(jìn)行二硫化物穩(wěn)定化重鏈可變域第44位至輕鏈可變域第100位(總是依照Kabat的EU索引編號；Kabat, E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，PublicHealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))。通過在第二全長抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)VH和V L之間引入二硫鍵來實現(xiàn)這類進(jìn)一步的二硫化物穩(wěn)定化。在例如 WO 94/029350, Rajagopal, V.等，Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi等，Nuclear Medicine&Biology,第 25 卷(1998)387-393;或 Schmidt, Μ·等，Oncogene18(1999) 1711-1721中描述了引入非天然的二硫橋進(jìn)行穩(wěn)定化的技術(shù)。如此，在一個實施方案中，此類雙特異性二價抗體的特征在于包含第二全長抗體重鏈和輕鏈的可變域之間，即重鏈可變域第44位和輕鏈可變域第100位之間的二硫鍵，并包含a)氨基酸序列SEQ ID NO: 36作為所述第一全長抗體的重鏈，和氨基酸序列SEQ IDNO:37作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)氨基酸序列SEQ ID NO:35作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和所述第二全長抗體的輕鏈的。在本發(fā)明的另一個方面，依照本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合ANG-2的第二全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端經(jīng)由肽接頭與輕鏈的C端連接；且其中可變域VL和VH彼此替換。在圖2b中顯示了特異性結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的此雙特異性抗體的此雙特異性二價抗體形式的例示性方案，其包括經(jīng)突起-進(jìn)入-空穴修飾的CH3域。將基于此雙特異性二價抗體形式的抗體在本發(fā)明的例子中命名為 OAscXFabl。在一個實施方案中，此類雙特異性抗體的特征在于包含a)SEQ ID NO:39作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO:40作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)SEQ ID NO:38作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和所述第二全長抗體的輕鏈。
在本發(fā)明的另一個方面，依照本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合ANG-2的第二全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端經(jīng)由肽接頭與輕鏈的C端連接；且其中恒定域CL和CHl彼此替換。在圖2c中顯示了特異性結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的此雙特異性抗體的此雙特異性二價抗體形式的例示性方案，其包括經(jīng)突起-進(jìn)入-空穴修飾的CH3域。將基于此雙特異性二價抗體形式的抗體在例子中命名為0AscXFab2 和 0AscXFab3。在一個實施方案中，此類雙特異性抗體的特征在于包含 a)SEQ ID NO:42作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO:43作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)SEQ ID NO:41作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和所述第二全長抗體的輕鏈。在一個實施方案中，此類雙特異性抗體的特征在于包含a)SEQ ID NO:45作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO:46作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)SEQ ID NO:44作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和所述第二全長抗體的輕鏈。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 29、SEQ ID NO: 30 和 SEQ ID NO: 31 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 32、SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 34 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 35、SEQ ID NO: 36 和 SEQ ID NO: 37 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO: 38、SEQ ID NO: 39 和 SEQ ID NO:40 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO:41, SEQ ID N0:42 和 SEQ ID NO:43 的氨基酸序列。因而，本發(fā)明的一個實施方案是包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合ANG-2的第二抗原結(jié)合位點的雙特異性二價抗體，其特征在于包含SEQ IDNO:44, SEQ ID N0:45 和 SEQ ID NO:46 的氨基酸序列。優(yōu)選地，通過“突起-進(jìn)入-空穴”技術(shù)改變依照本發(fā)明的雙特異性二價抗體的CH3域，所述“突起-進(jìn)入-空穴”技術(shù)以幾個例子更為詳細(xì)地記載于例如WO96/027011, Ridgway J. B.等，Protein Eng 9 (1996)617-621;和 Merchant, A. Μ.等，NatBiotechnol 16(1998)677-681。在此方法中，改變兩個CH3域的相互作用表面以提高含有這兩個CH3域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)這兩個CH3域每個都可以是“突起”，而另一個是“空穴”。二硫橋的引入使異二聚體穩(wěn)定化(Merchant, A. M等，Nature Biotech16 (1998) 677-681; Atwell, S.,等· J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)并增加產(chǎn)量。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，依照本發(fā)明的所有雙特異性抗體的特征在于一條重鏈的CH3域和另一條重鏈的CH3域各在包含抗體CH3域之間的初始界面的界面處相遇；其中改變所述界面以促進(jìn)雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3域，從而在一條重鏈的CH3域中與雙特異性抗體內(nèi)另一條重鏈的CH3域的初始界面相 遇的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基用具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在一條重鏈的CH3域的界面內(nèi)產(chǎn)生突出，該突出可位于另一條重鏈的CH3域的界面內(nèi)的穴內(nèi)，且b)改變另一條重鏈的CH3域，從而在第二 CH3域中與雙特異性抗體內(nèi)的第一 CH3域的初始界面相遇的初始界面內(nèi)，氨基酸殘基被具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在第二 CH3域的界面內(nèi)產(chǎn)生穴，第一 CH3域的界面內(nèi)的突出可位于該穴內(nèi)。如此，優(yōu)選地，依照本發(fā)明的抗體特征在于a)的全長抗體的重鏈CH3域和b)的全長抗體的重鏈CH3域各在包含抗體CH3域之間的初始界面中的改變的界面處相遇；其中i)在一條重鏈的CH3域中，氨基酸殘基用具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在一條重鏈的CH3域的界面內(nèi)產(chǎn)生突出，該突出可位于另一條重鏈的CH3域的界面內(nèi)的穴中，且其中ii)在另一條重鏈的CH3域，氨基酸殘基被具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在第二 CH3域的界面內(nèi)產(chǎn)生穴，第一 CH3域的界面內(nèi)的突出可位于該穴內(nèi)。優(yōu)選地，所述具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自下組精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。優(yōu)選地，所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自下組丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)。在本發(fā)明的一個方面，通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3域的相應(yīng)位置中的氨基酸，使得可以形成這兩個CH3域間的二硫橋來進(jìn)一步改變這兩個CH3域。在一個實施方案中，雙特異性抗體包含“突起鏈”的CH3域中的T366W突變和“空穴鏈”的CH3域中的T366S、L368A、Y407V突變。也可以使用CH3域之間的別的鏈間二硫橋(Merchant, A. M 等，Nature Biotech 16 (1998) 677-681)，例如，通過將 Y349C 突變弓丨入“突起鏈”的CH3域中并將E356C突變或S354C突變引入“空穴鏈”的CH3域中來進(jìn)行。
在另一個實施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗體包含在兩個CH3域之一中的Y349C、T366W突變和在兩個CH3域的另一個中的E356C、T366S、L368A、Y407V突變。在另一個優(yōu)選的實施方案中，雙特異性抗體包含在兩個CH3域之一中的Y349C、T366W突變和在兩個CH3域的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變(一個CH3域中的額外的Y349C突變和另一個CH3中的額外的E356C或S354C突變，其形成鏈間二硫橋)(總是依照Kabat的 EU 索弓 I編號；Kabat, Ε. A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，Public Health Service, N ational Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。而且或者/另外，也可以使用其它突起-進(jìn)入-空穴技術(shù)，如EP 1870459A1描述的。如此，雙特異性抗體的另一個例子是“突起鏈”的CH3域中的R409D;K370E突變和“空穴鏈”的CH3域中的D399K;E357K突變(總是依照Kabat的EU索引編號；Kabat, Ε. A.等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第五版，Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD(1991))。在另一個實施方案中，雙特異性抗體包含“突起鏈”的CH3域中的T366W突變和“空 穴鏈”的CH3域中的T366S、L368A、Y407V突變以及另外地，“突起鏈”的CH3域中的R409D、K370E突變和“空穴鏈”的CH3域中的D399K、E357K突變。在另一個實施方案中，雙特異性抗體包含在兩個CH3域之一中的Y349C、T366W突變和在兩個CH3域的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變，或者所述三價、雙特異性抗體包含在兩個CH3域之一中的Y349C、T366W突變和在兩個CH3域的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變以及另外地，“突起鏈”的CH3域中的R409D;K370E突變和“空穴鏈”的CH3域中的D399K;E357K突變。在本發(fā)明的一個實施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于具有下列一項或多項特性(在如實施例3至7中所描述的測定法中測定)-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合VEGF；-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合ANG-2；-雙特異性二價抗體以15nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以IOnM或更小的IC50)抑制經(jīng)Tie2轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中ANG-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制ANG-2對Tie2的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制VEGF對VEGF受體的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以IOnM或更小的IC50(在一個實施方案中，以5nM或更小的IC50)抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖。在一個實施方案中，所述雙特異性二價抗體的特征在于包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于i)所述第一抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO: I作為重鏈可變域(VH) JPSEQ ID NO: 2作為輕鏈可變域(VL);且ii)所述第二抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO: 3作為重鏈可變域(VH)，和SEQ IDNO:4作為輕鏈可變域(VL)；且具有下列一項或多項特性(在如實施例3至7中所描述的測定法中測定):
-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合VEGF；-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合ANG-2；-雙特異性二價抗體以15nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以IOnM或更小的IC50)抑制經(jīng)Tie2轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中ANG-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制ANG-2對Tie2的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制VEGF對VEGF受體的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以IOnM或更小的IC50(在一個實施方案中，以5nM或更小的IC50)抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖?！ぴ诒景l(fā)明的一個方面，依照本發(fā)明的此類雙特異性抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合ANG-2的全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈和經(jīng)修飾的輕鏈，其中恒定區(qū)CL和CHl彼此替換；且具有下列一項或多項特性(在如實施例3至7中所描述的測定法中測定)-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合VEGF；-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合ANG-2；-雙特異性二價抗體以15nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以IOnM或更小的IC50)抑制經(jīng)Tie2轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中ANG-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制ANG-2對Tie2的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制VEGF對VEGF受體的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以IOnM或更小的IC50(在一個實施方案中，以5nM或更小的IC50)抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖。在一個實施方案中，雙特異性二價抗體的特征在于包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于i)所述第一抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO: I且在⑶R中具有不超過I處氨基酸殘基替代作為重鏈可變域(VH)，和SEQ ID NO:2且在CDR中具有不超過I處氨基酸殘基替代作為輕鏈可變域(VL);且ii)所述第二抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO:3且在⑶R中具有不超過I處氨基酸殘基替代作為重鏈可變域(VH)，和SEQ ID NO:4且在⑶R中具有不超過I處氨基酸殘基替代作為輕鏈可變域(VL)。在一個實施方案中，所述雙特異性二價抗體的特征在于包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于i)所述第一抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO: I且在⑶R中具有不超過I處氨基酸殘基替代作為重鏈可變域(VH)，和SEQ ID NO:2且在CDR中具有不超過I處氨基酸殘基替代作為輕鏈可變域(VL);且ii)所述第二抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO:3且在⑶R中具有不超過I處氨基酸殘基替代作為重鏈可變域(VH)，和SEQ ID NO:4且在⑶R中具有不超過I處氨基酸殘基替代作為輕鏈可變域(VL)；且具有下列一項或多項特性(在測如實施例3至7中所描述的定法中測定)-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合VEGF；-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合ANG-2；-雙特異性二價抗體以15nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以IOnM或更小的IC50)抑制經(jīng)Tie2轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中ANG-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制ANG-2對Tie2的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制VEGF對VEGF受體的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以IOnM或更小的IC50(在一個實施方案中，以5nM或更小的IC50)抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖。 在本發(fā)明的一個方面，依照本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；且其中所述第一全長抗體的重鏈包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列且在⑶R中具有不超過I處氨基酸殘基替代，且所述第一全長抗體的輕鏈包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列且在CDR中具有不超過I處氨基酸殘基替代，和b)特異性結(jié)合ANG-2的全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈和經(jīng)修飾的輕鏈，其中恒定域CL和CHl彼此替換，且其中所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列且在CDR中具有不超過I處氨基酸殘基替代，且所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈包含SEQ IDN0:6的氨基酸序列且在CDR中具有不超過I處氨基酸殘基替代。在本發(fā)明的一個方面，依照本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈，且其中所述第一全長抗體的重鏈包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列且在⑶R中具有不超過I處氨基酸殘基替代，且所述第一全長抗體的輕鏈包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列且在CDR中具有不超過I處氨基酸殘基替代，和b)特異性結(jié)合ANG-2的全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈和經(jīng)修飾的輕鏈，其中恒定域CL和CHl彼此替換，且其中所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列且在CDR在具有不超過I處氨基酸殘基替代，且所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈包含SEQ IDN0:6的氨基酸序列且在CDR中具有不超過I處氨基酸殘基替代；且具有下列一項或多項特性(在如實施例3至7中所描述的測定法中測定)-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合VEGF；-雙特異性二價抗體以5nM或更小的結(jié)合親和力的KD值結(jié)合ANG-2；-雙特異性二價抗體以15nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以IOnM或更小的IC50)抑制經(jīng)Tie2轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中ANG-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制ANG-2對Tie2的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以20nM或更小的IC50(在一個實施方案中，以15nM或更小的IC50)抑制VEGF對VEGF受體的結(jié)合；-雙特異性二價抗體以IOnM或更小的IC50(在一個實施方案中，以5nM或更小的IC50)抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖。如本文中使用的，“抗體”指包含抗原結(jié)合位點的結(jié)合蛋白。如本文中使用的，術(shù)語“結(jié)合位點”或“抗原結(jié)合位點”指抗體分子中配體實際結(jié)合的區(qū)域。術(shù)語“抗原結(jié)合位點”包含抗體重鏈可變域(VH)和抗體輕鏈可變域(VL) (VH/VL對)?？贵w特異性指抗體對特定抗原表位的選擇性識別。例如，天然抗體是單特異性的。依照本發(fā)明的“雙特異性抗體”是具有兩種不同抗原結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明的抗體對兩種不同抗原，即作為第一抗原的VEGF和作為第二抗原的ANG-2是特異性的。 如本文中所使用的，術(shù)語“單特異性”抗體指具有各自結(jié)合相同抗原的同一表位的一個或多個結(jié)合位點的抗體。如本申請內(nèi)使用的，術(shù)語“價”指抗體分子中存在規(guī)定數(shù)目的結(jié)合位點。因此，術(shù)語“二價”、“四價”和“六價”分別指抗體分子中存在兩個結(jié)合位點、四個結(jié)合位點和六個結(jié)合位點。依照本發(fā)明的雙特異性抗體是“二價的”。如本文中所使用的，術(shù)語“VEGF”指人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF/VEGF-A) (SEQ IDNO: 47),其記載于例如 Leung, D. W.等，Science 246 (1989) 1306-9; Keck, P. J.等，Science246(1989) 1309-12 和 Connolly，D. T.等，J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24。VEGF牽涉調(diào)節(jié)正常的和異常的血管發(fā)生和與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管化(Ferrara, N.等，Endocr.Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R. A.等，J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L. F.等，HumanPathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L. F.等，Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J.等,Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934;及 Dvorak, H. F.等,Am.J. Pathol. 146(1995) 1029-1039)。VEGF是已經(jīng)自數(shù)個來源分離的同二聚體糖蛋白。VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞顯示高度特異的促有絲分裂活性。如本文中所使用的，術(shù)語“ANG-2”指血管生成素_2 (ANG-2)(或縮寫為ANGPT2或ANG2) (SEQ ID NO:48)，其記載于例如 Maisonpierre, P. C.等，Science 277(1997)55-60和 Cheung, A. H.等，Genomics 48(1998)389-91。發(fā)現(xiàn)血管生成素-I 和 _2 為 Tie (即，一種在血管內(nèi)皮內(nèi)選擇性表達(dá)的酪氨酸激酶家族)的配體。Yancopoulos, G. D.等，Nature407(2000)242-48。目前血管生成素家族有四種確定的成員。血管生成素_3和-4(Ang_3和Ang-4)可以代表小鼠和人中相同基因基因座的廣泛趨異的對應(yīng)物。Kim，I.等，F(xiàn)EBSLet, 443(1999)353-56;Kim, I.等，J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-I 和 ANG-2最初是在組織培養(yǎng)實驗中分別作為激動劑和拮抗劑鑒定的(參見，對于ANG-I:Davis，S.等，Cell 87(1996) 1161-69;和對于 ANG-2:Maisonpierre, P. C.等，Science277(1997)55-60)。所有已知的血管生成素主要結(jié)合Tie2，而Ang-I和_2兩者都以3nM(Kd)的親和力結(jié)合 Tie2。Maisonpierre, P. C.等，Science 277(1997)55-60。本發(fā)明的雙特異性抗體的抗原結(jié)合位點含有6個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其以不同程度促成結(jié)合位點對抗原的親和力。存在著3個重鏈可變域⑶R (⑶RH1XDRH2和⑶RH3)和3個輕鏈可變域⑶R (⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3)。通過與匯編的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫比較來確定CDR和框架區(qū)(FR)的范圍，在所述數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)依照序列間的可變性限定那些區(qū)域。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括由更少的CDR組成的功能性抗原結(jié)合位點(即，其中結(jié)合特異性由3、4或5個⑶R決定)。例如，小于完整的一組6個⑶R對于結(jié)合可以是足夠的。在一些情況中，VH或VL域會是足夠的。本發(fā)明的抗體進(jìn)一步包含一種或多種免疫球蛋白類的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白類包括IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE同種型及在IgG和IgA的情況中包括其亞型。
如本文中所使用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一氨基酸組成的抗體分子制備物。術(shù)語“嵌合抗體”指包含來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)和自不同來源或物種衍生的恒定區(qū)的至少一部分的抗體，其通常通過重組DNA技術(shù)來制備。包含鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體是優(yōu)選的。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是那些其中的恒定區(qū)已經(jīng)自初始抗體的恒定區(qū)修飾或改變以生成依照本發(fā)明的特性(特別地關(guān)于Clq結(jié)合/或Fe受體(FcR)結(jié)合)的。此類嵌合抗體又稱為“類轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段的免疫球蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物。用于生成嵌合抗體的方法牽涉常規(guī)的重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，其是本領(lǐng)域中公知的。參見例如Morrison, S. L.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984)6851-6855;US5，202，238 和 US 5，204，244。術(shù)語“人源化抗體”指其中的框架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(OTR)已經(jīng)進(jìn)行過修飾以包含與親本免疫球蛋白的特異性相比不同特異性的免疫球蛋白CDR的抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，將鼠CDR嫁接入人抗體的框架區(qū)中以制備“人源化抗體”。參見例如Riechmann, L.等，Nature 332 (1988) 323-327;及 Neuberger, Μ· S.等，Nature 314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDR對應(yīng)于那些代表識別上文關(guān)于嵌合抗體所記錄的抗原的序列的。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是那些其中的恒定區(qū)已經(jīng)另外自初始抗體的恒定區(qū)進(jìn)行過修飾或改變以生成依照本發(fā)明的特性(特別地關(guān)于Clq結(jié)合/或Fe受體(FcR)結(jié)合)的。如本文中所使用的，術(shù)語“人抗體”意圖包括具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk, Μ. Α.和van deffinkel, J. G.，Curr· Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。還可以在轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中生成人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物在免疫后能夠在沒有內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況中生成人抗體的完整全集或選集。在此類種系突變體小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列會導(dǎo)致抗原考驗后人抗體的生成(參見例如Jakobovits, A.等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90 (1993)2551-2555;Jakobovits, A.等，Nature 362 (1993)255-258;Brueggemann, Μ.等，Yearlmmunol. 7 (1993) 33-40)。還可以在卩遼菌體展示文庫中生成人抗體(Hoogenboom, H. R.，和 Winter, G. J.，Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D.等，J. Mol.Biol. 222(1991)581-597)。Cole, A.等及Boerner，P等的技術(shù)還可用于制備人單克隆抗體(Cole, A.等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A. L.,第 77 頁(1985);及Boerner, P.等，J. Immunol. 147 (1991)86-95)。如已經(jīng)關(guān)于依照本發(fā)明的嵌合的和人源化的抗體所提及的，如本文中所使用的，術(shù)語“人抗體”還包含此類如下的抗體，其在恒定區(qū)中進(jìn)行修飾以生成依照本發(fā)明的特性(特別地關(guān)于Clq結(jié)合/或FcR結(jié)合)，例如通過“類轉(zhuǎn)換”，即Fe部分的變化或突變(例如自IgGl至IgG4和/或IgGl/IgG4突變)來實現(xiàn)。
如本文中所使用的，術(shù)語“重組人抗體”意圖包括通過重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的所有人抗體，諸如自宿主細(xì)胞諸如NSO或CHO細(xì)胞或自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)分離的抗體或使用轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。依照本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)進(jìn)行過體內(nèi)體細(xì)胞高突變。如此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是如下的序列，其盡管自人種系VH和VL序列衍生和與之相關(guān)，但是可以不在體內(nèi)的人抗體種系全集內(nèi)天然存在。如本文中所使用的，“可變域”(輕鏈可變域(VL)、重鏈可變域(VH))意指直接牽涉抗體對抗原結(jié)合的每對輕鏈和重鏈。人輕鏈和重鏈可變域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，并且每個域包含通過3個“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，⑶R)連接的4個序列廣泛保守的框架(FR)區(qū)?？蚣軈^(qū)采用β-片層構(gòu)象，而⑶R可以形成連接β-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的⑶R通過框架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)，并且與來自另一條鏈的CDR—起形成抗原結(jié)合位點?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在依照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中發(fā)揮特別重要的作用，并且因此提供本發(fā)明的又一個目的。
術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”或“高變區(qū)”在本文中使用時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”的氨基酸殘基?！翱蚣堋被颉癋R”區(qū)是那些與如本文中定義的高變區(qū)殘基不同的可變域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈包含N至C端的域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。每條鏈上的CDR被此類框架氨基酸分開。特別地，重鏈的⑶R3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。依照Kabat, Ε. Α.等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD (1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義來確定CDR和FR區(qū)(包括依照Kabat的EU索引的編號，在下文中縮寫為依照Kabat的編號)。如本文中所使用的，術(shù)語“結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指在體外測定法中，優(yōu)選地在使用純化的野生型抗原的等離振子共振測定法(BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)(實施例3)中抗體對抗原(人VEGF或人ANG-2)表位的結(jié)合。通過術(shù)語ka (來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的結(jié)合速率常數(shù))、kD (解離常數(shù))、和KD(kD/ka)來限定結(jié)合親和力。在一個實施方案中，結(jié)合或特異性結(jié)合意味著10_8mol/l或更小,優(yōu)選10_9M至10_13mol/l的結(jié)合親和力(Kd)。術(shù)語“表位”包括能夠與抗體特異性結(jié)合的任何多肽決定簇。在某些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面聚組，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；?、或磺酰基，并且在某些實施方案中可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特定的電荷特征。表位是抗原中被抗體結(jié)合的區(qū)域。在某些實施方案中，在抗體優(yōu)先識別其在蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中的靶抗原時，其被說成特異性結(jié)合抗原。術(shù)語“全長抗體”指由兩條“全長抗體重鏈”和兩條“全長抗體輕鏈”組成的抗體(參見圖I)?！叭L抗體重鏈”是以N端至C端方向由抗體重鏈可變域(VH)、抗體重鏈恒定域I (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)(HR)、抗體重鏈恒定域2 (CH2)、和抗體重鏈恒定域3 (CH3)(縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3);和任選地，抗體重鏈恒定域4 (CH4)(在亞類IgE的抗體的情況中)組成的多肽。優(yōu)選地，“全長抗體重鏈”是以N端至C端方向由VH、CHU HR、CH2和CH3組成的多肽?！叭L抗體輕鏈”是以N端至C端方向由抗體輕鏈可變域(VL)和抗體輕鏈恒定域(CL)組成的多肽，縮寫為VL-CL。抗體輕鏈恒定域(CL)可以是κ (卡帕)或λ (拉姆達(dá))。兩條全長抗體鏈經(jīng)由CL域和CHl域之間的以及全長抗體重鏈鉸鏈區(qū)之間的多肽間二硫鍵連接在一起。典型的全長抗體的例子是天然抗體，如IgG(例如IgG I和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。依照本發(fā)明的全長抗體可以來自單一物種，例如人，或者它們可以是嵌合化的(chimerized)或人源化的抗體。依照本發(fā)明的全長抗體包含各由一對VH和VL形成的兩個抗原結(jié)合位點，它們都特異性結(jié)合相同抗原。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端指所述重鏈或輕鏈的C端的最后一個氨基酸。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的N端指所述重鏈或輕鏈的N端的最后一個氨基酸。如本發(fā)明內(nèi)所使用的，術(shù)語“肽接 頭”指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選是合成起源的。依照本發(fā)明的這些肽用于經(jīng)由肽接頭將輕鏈的C端與第二全長抗體(其特異性結(jié)合第二抗原)的重鏈N端連接。第二全長抗體重鏈和輕鏈內(nèi)的肽接頭是具有長度為至少30個氨基酸，優(yōu)選地長度為32至50個氨基酸的氨基酸序列的肽。在一個實施方案中，所述接頭是具有長度為32至40個氨基酸的氨基酸序列的肽。在一個實施方案中，所述接頭是(GxS)n，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，(x=3, n=8、9或10且m=0、l、2或3)或(x=4且n=6、7或8且m=0、1、2或3),優(yōu)選地x=4, n=6或7且m=0、1、2或3,更優(yōu)選地x=4、n=7且m=2。在一個實施方案中，所述接頭是(G4S) 6G2。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“恒定區(qū)”意指抗體中與可變區(qū)不同的域的總和。恒定區(qū)不直接牽涉抗原的結(jié)合，但是展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列,抗體分成類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些中的數(shù)種可以進(jìn)一步分成亞類，諸如IgGU IgG2、IgG3、和IgG4、IgAl和IgA2。與不同類別的抗體對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作α、δ、ε、Y、和μ。可以在所有5種抗體類別中都找到的輕鏈恒定區(qū)稱作K (卡帕)和λ (拉姆達(dá))。如本申請中所使用的，術(shù)語“自人起源衍生的恒定區(qū)”意指亞類IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4的人抗體的重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈κ或λ恒定區(qū)。此類恒定區(qū)是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如由Kabat, Ε. Α.(參見例如Johnson, G.和Wu, Τ· Τ·，Nucleic AcidsRes. 28 (2000) 214-218; Kabat, E. A.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788)描述。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的雙特異性二價抗體具有人IgGl亞類的恒定區(qū)。雖然IgG4亞類的抗體顯示降低的Fe受體(FcgRIIIa)結(jié)合，但是其它IgG亞類的抗體顯示結(jié)合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297 (喪失Fe碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、和His435是在改變時也提供降低的Fe受體結(jié)合的殘基(Shields,R. L.等，J.Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Lund, J.等，F(xiàn)ASEBJ. 9 (1995) 115-119 ; Morgan, A.等，Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0307434)。在一個實施方案中，依照本發(fā)明的抗體與IgGl抗體相比具有降低的FcR結(jié)合，而雙特異性二價抗體就FcR結(jié)合而言是IgG4亞類的或具有S228、L234、L235和/或D265中的突變的IgGl亞類的，和/或含有PVA236突變。在一個實施方案中，全長親本抗體中的突變是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一個實施方案中，雙特異性二價抗體中的突變在IgG4 S228P和L235E中及在IgGlL234A和L235A中。
在本發(fā)明的另一個方面，雙特異性二價抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合第一抗原的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合第二抗原的第二全長抗體的重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的N端經(jīng)由肽接頭與所述輕鏈的C端連接；且其中可變域VL和VH或恒定域CL和CHl彼此替換。優(yōu)選地，通過“突起-進(jìn)入-空穴”技術(shù)改變此雙特異性二價抗體形式的CH3域，所述“突起-進(jìn)入-空穴”技術(shù)以幾個例子更為詳細(xì)地記載于例如WO 96/027011，RidgwayJ. B.等，Protein Eng 9 (1996) 617-621;和 Merchant, A. M.等，Nat Biotechnol16(1998)677-681。在此方法中，改變兩個CH3域的相互作用表面以提高含有這兩個CH3域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個CH3域每個都可以是“突起”，而另 一個是“空穴”。二硫橋的引入使異二聚體穩(wěn)定化(Merchant, A. M等，Nature Biotech16 (1998) 677-681; Atwell, S.,等· J. Mol. Biol. 270 (1997) 26 - 35)并增加產(chǎn)量。關(guān)于更多詳情和實施方案，見上文。在本發(fā)明的另一個方面，雙特異性二價抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合第一抗原的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合第二抗原的第二全長抗體的重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的N端經(jīng)由肽接頭與所述輕鏈的C端連接；且其中可變域VL和VH彼此替換。在圖2b中顯示了此雙特異性二價抗體的例示性方案，其包括經(jīng)突起-進(jìn)入-空穴修飾的CH3域?；诖穗p特異性二價抗體形式的抗體在例子中命名為OAscXFabl。在一個實施方案中，此類雙特異性抗體的特征在于包含a)SEQ ID NO:39作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO:40作為所述第一全長抗體的輕鏈，且b)SEQ ID NO:38作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和所述第二全長抗體的輕鏈。在本發(fā)明的另一個方面，雙特異性二價抗體的特征在于包含a)特異性結(jié)合第一抗原的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；b)特異性結(jié)合第二抗原的第二全長抗體的重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的N端經(jīng)由肽接頭與所述輕鏈的C端連接；且其中恒定域CL和CHl彼此替換。在圖2c中顯示了此雙特異性二價抗體形式的抗體的例示性方案，其包括經(jīng)突起-進(jìn)入-空穴的修飾的CH3域?；诖穗p特異性二價抗體形式的抗體在例子中命名為0AscXFab2 和 0AscXFab3。在一個實施方案中，此類雙特異性抗體的特征在于包含a)SEQ ID NO:42作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO:43作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)SEQ ID NO:41作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和所述第二全長抗體的輕鏈。在一個實施方案中，此類雙特異性抗體的特征在于包含
a)SEQ ID NO:45作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO:46作為所述第一全長抗體的輕鏈，和b)SEQ ID NO:44作為經(jīng)由肽接頭連接的所述第二全長抗體的重鏈和所述第二全長抗體的輕鏈。通過重組手段來生成依照本發(fā)明的抗體。如此，本發(fā)明的一方面是編碼依照本發(fā)明的抗體的核酸，而又一方面是包含所述編碼依照本發(fā)明的抗體的核酸的細(xì)胞。用于重組生成的方法是現(xiàn)有技術(shù)中普遍已知的，并且包括在原核和真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)，隨后分離抗體，并且通常純化至藥學(xué)可接受純度。對于在宿主細(xì)胞中如前述那樣表達(dá)抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)的方法將編碼各經(jīng)修飾的輕鏈和重鏈的核酸插入表達(dá)載體中。在合適的原核或真核宿主細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞、酵母、或大腸桿菌細(xì)胞中實施表達(dá)，并且自細(xì)胞(上清液或裂解后的細(xì)胞)回收抗體。用于重組生成抗體的通用方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如記載于綜述文章Makrides, S. C. , Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S.等，Protein Expr.Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J. ,Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-160 ; Werner, R. G. , Drug Res. 48(1998)870-880。因而，本發(fā)明的一個實施方案是用于制備依照本發(fā)明的雙特異性抗體的方法，包含下列步驟a)用包含編碼所述抗體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；b)在允許所述抗體分子合成的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；并c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和層析來自培養(yǎng)液適當(dāng)?shù)胤蛛x雙特異性抗體。容易使用常規(guī)規(guī)程將編碼單克隆抗體的DNA和RNA分離并測序。雜交瘤細(xì)胞可以充當(dāng)此類DNA和RNA的來源。一旦分離，可以將DNA插入表達(dá)載體中，然后將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入在其它情況中不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞諸如HEK 293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞中，以獲得重組單克隆抗體在宿主細(xì)胞中的合成。通過將合適的核苷酸變化引入抗體DNA中，或者通過核苷酸合成來制備雙特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)。然而，僅可以在非常有限的范圍中實施此類修飾。例如，修飾不改變上文所提及的抗體特征諸如IgG同種型和抗原結(jié)合，但是可以改善重組生成的產(chǎn)量、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或者便于純化。如本申請中所使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指可以工程化改造以生成依照本發(fā)明的抗體的任何種類的細(xì)胞系統(tǒng)。在一個實施方案中，使用HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。如本文中所使用的，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有此類名稱包括后代。如此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主題細(xì)胞和自其衍生的培養(yǎng)物，而不管傳遞的次數(shù)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意或無意的突變，所有后代在DNA內(nèi)容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變體后代。例如，Barnes,L. M.等，Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.Μ.等，Biotech. Bioeng. 73(2001)261-270 描述了 NSO 細(xì)胞中的表達(dá)。例如，Durocher,Y.等，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 描述了瞬時表達(dá)。Orlandi, R.等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter, P.等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA89 (1992)4285-4289; R Norderhaug1L-等，J.Immunol. Methods 204(1997)77-87描述了可變域的克隆。Schlaeger, E.-J.和 Christensen, K.，于 Cytotechnology30 (1999) 71-83 及 Schlaeger, E. -J.，于 J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 描述了一種優(yōu)選的瞬時表達(dá)系統(tǒng)(HEK 293)。適合于原核生物的控制序列例如包括啟動子，任選地操縱基因序列，和核糖體結(jié)合位點。已知真核細(xì)胞利用啟動子、增強(qiáng)子和多腺苷酸化信號。在將核酸放置在與另一種核酸序列的功能性關(guān)系中時，它是“可操作連接的”。例如，若前序列或分泌前導(dǎo)的DNA以參與多肽分泌的前蛋白表達(dá)，則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列可操作連接；或者若核糖體結(jié)合位點定位為使得便于翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，“可操作連接的”意指所連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)的情況中，是連續(xù)的且在讀碼框中。然而，增強(qiáng) 子不必是連續(xù)的。通過在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)連接。若不存在此類位點，則依照常規(guī)的實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl分帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳、和本領(lǐng)域中公知的其它技術(shù)來實施抗體純化以消除細(xì)胞組分或其它污染物，例如其它細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)。參見 Ausubel, F.等編 Current Protocols inMolecular Biology, GreenePublishing and Wiley Interscience, New York(1987) 不同方法是完善建立的，并且廣泛用于蛋白質(zhì)純化，諸如用微生物蛋白質(zhì)的親和層析(例如，蛋白A或蛋白G親和層析)、離子交換層析(例如，陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式交換)、親硫性吸附(例如，用β -巰基乙醇和其它SH配體)、疏水性相互作用或芳香族吸附層析(例如，用苯基-Sepharose、親氮雜芳烴性樹脂(aza-arenophiIicresin)、或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合物親和層析(例如，用Ni (II)-和Cu (II)-親和材料)、大小排阻層析、和電泳方法(諸如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vi jayalakshmi, Μ. A. , AppI. Biochem.Biotech.75(1998)93-102)?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)依照本發(fā)明的針對人VEGF和人ANG-2的雙特異性抗體具有有價值的特征，諸如高度穩(wěn)定性和有價值的藥動學(xué)/藥效學(xué)特性，例如良好的(即緩慢的)清除率(例如在低劑量)。依照本發(fā)明的雙特異性二價抗體對需要VEGF和ANG-2靶向療法的人患者顯示益處。此外，它們具有生物學(xué)或藥理學(xué)活性，并且顯示體內(nèi)腫瘤生長抑制和/或?qū)δ[瘤血管發(fā)生的抑制。依照本發(fā)明的雙特異性抗體對下列方面是高度有效的a)腫瘤生長抑制(例如，與兩種單特異性抗體的組合相比，憑借依照本發(fā)明的雙特異性抗體已經(jīng)可以在更低的濃度實現(xiàn)腫瘤停滯(stasis)(例如，在實施例9和10的C0L0205和KPL-4腫瘤模型中，與10mg/kg的ANG2i_LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的組合相比，用10mg/kg的XMAbl已經(jīng)實現(xiàn)腫瘤停滯)，和/或b)對腫瘤血管發(fā)生或血管疾病的抑制(例如，與兩種單特異性抗體的組合相比，用依照本發(fā)明的雙特異性抗體已經(jīng)可以在更低的濃度實現(xiàn)最大抗血管生成效果(例如，在實施例8的小鼠角膜血管發(fā)生測定法中，與10mg/kg的ANG2i-LC06+10mg/kg阿瓦斯汀的組合相比，用10mg/kg的XMAbl已經(jīng)實現(xiàn)最大抗血管生成效果)。最終，依照本發(fā)明的針對人VEGF和人ANG-2的二價雙特異性可以具有有價值的效力/毒性譜，而且可以為需要抗VEGF和抗ANG-2療法的患者提供益處。本發(fā)明的一個方面是包含依照本發(fā)明的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個方面是依照本發(fā)明的抗體用于制造藥物組合物的用途。本發(fā)明的又一個方面是制造包含依照本發(fā)明的抗體的藥物組合物的方法。在另一個方面，本發(fā)明提供了含有與藥用載體一起配制的依照本發(fā)明的抗體的組合物，例如藥物組合物。本發(fā)明的一個實施方案是依照本發(fā)明的雙特異性抗體，其用于治療癌癥。本發(fā)明的另一個方面是所述藥物組合物，其用于治療癌癥。
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本發(fā)明的另一個方面是依照本發(fā)明的抗體用于制造用于治療癌癥的藥物的用途。本發(fā)明的另一個方面是通過對需要此類治療的患者施用依照本發(fā)明的抗體來治療患有癌癥的患者的方法。本發(fā)明的另一個方面是所述藥物組合物，其用于預(yù)防轉(zhuǎn)移。本發(fā)明包括依照本發(fā)明的雙特異性抗體，其用于預(yù)防轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的另一個方面是依照本發(fā)明的雙特異性抗體用于制造用于預(yù)防轉(zhuǎn)移的藥物的用途。本發(fā)明的另一個方面是在患有原發(fā)性癌癥的患者中預(yù)防轉(zhuǎn)移的方法，其通過對需要此類預(yù)防治療的患者施用依照本發(fā)明的雙特異性抗體來進(jìn)行。我們可以在正位(orthotopic)和皮下癌癥模型中在體內(nèi)顯示對自發(fā)性轉(zhuǎn)移/繼發(fā)性腫瘤的高度有效預(yù)防(參見實施例9)(與i. V.注射腫瘤細(xì)胞的實驗?zāi)Ｐ托纬蓪Ρ?。這與細(xì)胞自原發(fā)性腫瘤散布并轉(zhuǎn)移到繼發(fā)性器官，如肺或肝(繼發(fā)性腫瘤)的臨床情況相似。依照本發(fā)明的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”指癌性細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤傳送到患者中的別處，然后在那里形成一個或多個部位的繼發(fā)性腫瘤。測定癌癥是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移的手段是本領(lǐng)域中已知的，并且包括骨掃描、胸部X射線(chest X-ray)、CAT掃描、MRI掃描和腫瘤標(biāo)志物測試。如本文中所使用的，術(shù)語“預(yù)防轉(zhuǎn)移”或“預(yù)防繼發(fā)性腫瘤”具有相同的含義，并且指以抑制或降低癌性細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤進(jìn)一步傳送到患者中別處的一個或多個部位的此方式針對患有癌癥的患者中的轉(zhuǎn)移的防范劑。這意味著阻止、延遲或降低原發(fā)性腫瘤或癌癥的轉(zhuǎn)移，并且如此阻止、延遲或降低繼發(fā)性腫瘤的形成。優(yōu)選地，肺轉(zhuǎn)移，即繼發(fā)性腫瘤得到阻止或降低，這意味著癌性細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤到肺的轉(zhuǎn)移性傳送得到阻止或降低。如本文中所使用的，“藥用載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層材料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑，等等。優(yōu)選地，載體適合于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、胃腸外、脊柱或表皮施用(例如通過注射或輸注)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的多種方法來施用本發(fā)明的組合物。如熟練技術(shù)人員會領(lǐng)會的，施用的路徑和/或模式會隨期望的結(jié)果而變化。為了通過某些施用路徑來施用本發(fā)明的化合物，可能有必要用某種材料包被化合物，或者與某種材料共施用化合物以阻止其失活。例如，可以將化合物在合適的載體，例如脂質(zhì)體或稀釋劑中對受試者施用。藥學(xué)可接受稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥用載體包括無菌水溶液或分散體和供臨場制備無菌可注射溶液或分散體用的無菌粉劑。對藥學(xué)活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域中已知的。 如本文中所使用的，短語“胃腸外施用”意指通常通過注射進(jìn)行的與腸和表面施用不同的施用模式，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。如本文中所使用的，術(shù)語癌癥指增殖性疾病，諸如淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、非小細(xì)胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細(xì)胞肺癌(bronchioloalviolarcell lung cancer) >骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌(cancer of the head or neck)、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌(cancer of the analregion)、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌(carcinoma of the fallopiantubes)、子宮內(nèi)膜癌(carcinoma of theendometrium)、宮頸癌(carcinoma of thecervix)、陰道癌(carcinoma of thevagina)、夕卜陰癌(carcinoma of the vulva)、霍奇 金氏病(Hodgkin’ s Disease)、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌(carcinoma of the renal pelvis)、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽管癌(biliary cancer)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)新生物、脊柱軸腫瘤(spinal axis tumor)、腦干膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形細(xì)胞瘤(astrocytoma)、施萬細(xì)胞瘤(schwanomas)、室管膜瘤(ependymona)、髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)、腦脊膜瘤(meningioma)、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma)、垂體腺瘤(pituitary adenoma)和尤因肉瘤(Ewingssarcoma)，包括任何上述癌癥的頑固性型式，或一種或多種上述癌癥的組合。本發(fā)明的另一個方面是依照本發(fā)明的雙特異性抗體或所述藥物組合物作為抗血管生成劑。可以使用此類抗血管生成劑來治療癌癥，特別是實體瘤和其它血管疾病。本發(fā)明的一個實施方案是依照本發(fā)明的雙特異性抗體，其用于治療血管疾病。本發(fā)明的另一個方面是用于治療血管疾病的所述藥物組合物。本發(fā)明的另一個方面是依照本發(fā)明的抗體用于制造用于治療血管疾病的藥物的用途。本發(fā)明的另一個方面是通過對需要此類治療的患者施用依照本發(fā)明的抗體來治療患有血管疾病的患者的方法。術(shù)語“血管疾病”包括癌癥、炎性疾病、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis)、缺血(Ischemia)、創(chuàng)傷、敗血癥、C0PD、哮喘、糖尿病、AMD、視網(wǎng)膜病變、中風(fēng)、肥胖、急性肺損傷、出血、血管滲漏(Vascular leak)，例如細(xì)胞因子誘導(dǎo)的，變態(tài)反應(yīng)、格雷夫斯(Graves)病、橋本氏自身免疫性甲狀腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、巨細(xì)胞動脈炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎、克羅恩(Crohn)氏病、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎，特別是實體瘤的，眼內(nèi)新血管綜合征，諸如增殖性視網(wǎng)膜病變或年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病(Folkman, J.等，J. Biol. Chem. 267(1992) 10931-10934;Klagsbruη, Μ.等，Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239;和 Garner, A.，Vascular diseases,于Pathobiology of ocular disease, A dynamicapproach, Garner, A.和 Klintworth, G.K.，(編)，第二版，Marcel Dekker, NewYork (1994),第 1625 頁-第 1710 頁)。
這些組合物還可以含有佐劑諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。可以通過無菌規(guī)程，見上文，及通過包括各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸等來確保阻止微生物的存在。還可能期望將等張劑，諸如糖、氯化鈉等納入組合物中。另外，可以通過包括延遲吸收的藥劑諸如單硬脂酸鋁和明膠來引起可注射藥物形式的吸收延遲。不管選擇的施用路徑，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來將本發(fā)明的化合物(其可以以合適的水合形式使用)和/或本發(fā)明的藥物組合物配制成藥學(xué)可接受劑量形式?？梢愿淖兓钚猿煞衷诒景l(fā)明的藥物組合物中的實際劑量水平，從而獲得對于實現(xiàn)特定患者的期望的治療響應(yīng)、組成、和施用模 式有效的，而對患者無毒的活性成分量。選定的劑量水平會取決于多種藥動學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明的特定組合物的活性、施用路徑、施用時間、所采用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時間、與所采用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、所治療的患者的年齡、性別、重量、狀況、一般健康和先前的醫(yī)學(xué)史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的因素。組合物必須是無菌的，而且是流體的，其程度使得組合物通過注射器可投遞。在水夕卜，載體優(yōu)選地是等張緩沖鹽水溶液?？梢岳缤ㄟ^使用涂層材料諸如卵磷脂、在分散體的情況中通過維持所要求的粒度、及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在許多情況中，優(yōu)選在組合物中包含等張齊IJ (例如糖、多元醇諸如甘露醇或山梨醇、和氯化鈉)。如本文中所使用的，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有此類名稱包括后代。如此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主題細(xì)胞和自其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意或無意的突變，所有后代在DNA內(nèi)容上可能不是正好相同的。包括具有與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變體后代。在意圖獨特的名稱的情況中，其從上下文看會是明顯的。如本文中所使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將載體/核酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中的過程。若使用沒有難以應(yīng)付的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則例如通過磷酸鈣沉淀法來實施轉(zhuǎn)染，如Graham, F. L.，van der Eb, A. J. , Virology 52 (1973) 546-467所描述的。然而，也可以使用其它用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，諸如通過核注射或者通過原生質(zhì)體融合來進(jìn)行。若使用原核細(xì)胞或含有堅固細(xì)胞壁構(gòu)造的細(xì)胞，則例如一種轉(zhuǎn)染方法是使用氯化鈣進(jìn)行的鈣處理,如 Cohen, S. N.等，PNAS. 69(1972)2110-2114 所描述的。如本文中所使用的，“表達(dá)”指將核酸轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程和/或隨后將轉(zhuǎn)錄的mRNA(又稱為轉(zhuǎn)錄物)翻譯成肽、多肽、或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和編碼的多肽統(tǒng)稱為基因產(chǎn)物。若多核苷酸是自基因組DNA衍生的，則真核細(xì)胞中的表達(dá)可以包括mRNA的剪接?！拜d體”指將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中和/或在宿主細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的核酸分子，特別是自我復(fù)制的。該術(shù)語包括主要在將DNA或RNA插入細(xì)胞(例如，染色體整合)方面發(fā)揮功能的載體、主要在DNA或RNA復(fù)制方面發(fā)揮功能的復(fù)制載體、和在DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯方面發(fā)揮功能的表達(dá)載體。還包括提供超過一種功能的載體，如所描述的?！氨磉_(dá)載體”指在導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中時可以被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的多核苷酸?！氨磉_(dá)系統(tǒng)”通常指包含能發(fā)揮功能以產(chǎn)生期望的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體的合適的宿主細(xì)胞。提供以下實施例、序列表和圖以幫助理解本發(fā)明，其實際范圍在所附權(quán)利要求書中列出。應(yīng)當(dāng)理解，可以在不背離本發(fā)明的精神的前提下對所列規(guī)程做出修改。序列表(氨基酸序列)的描述SEQIDNO: I<VEGF>貝伐單抗的重鏈可變域VHSEQIDNO: 2<VEGF>貝伐單抗的輕鏈可變域VLSEQIDNO: 3<ANG_2>E6Q 的重鏈可變域 VHSEQIDNO:4<ANG_2>E6Q 的輕鏈可變域 VLSEQIDNO:5XMabl_〈VEGF> 輕鏈
SEQIDNO:6XMabl_〈ANG2> 輕鏈 SEQIDNO:7XMabl_〈VEGF> 重鏈SEQIDNO:8XMabl_〈ANG2> 重鏈SEQIDNO:9XMab2_〈VEGF> 輕鏈SEQIDNO: 10XMab2_〈ANG2> 輕鏈SEQIDNO: 11XMab2_〈VEGF> 重鏈SEQIDNO: 12XMab2_〈ANG2> 重鏈SEQIDNO: 13XMab3_〈VEGF> 輕鏈SEQIDNO: 14XMab3_〈ANG2> 輕鏈SEQIDNO: 15XMab3_〈VEGF> 重鏈SEQIDNO: 16XMab3_〈ANG2> 重鏈SEQIDNO: 17XMab4_〈VEGF> 輕鏈SEQIDNO: 18XMab4_〈ANG2> 輕鏈SEQIDNO: 19XMab4_〈VEGF> 重鏈SEQIDNO:20XMab4_〈ANG2> 重鏈SEQIDNO:21XMab5_〈VEGF> 輕鏈SEQIDNO:22XMab5_〈ANG2> 輕鏈SEQIDNO:23XMab5_〈VEGF> 重鏈SEQIDNO:24XMab5_〈ANG2> 重鏈SEQIDNO:25XMab6_〈VEGF> 輕鏈SEQIDNO:26XMab6_〈ANG2> 輕鏈SEQIDNO:27XMab6_〈VEGF> 重鏈SEQIDNO:28XMab6_〈ANG2> 重鏈SEQIDNO:29OAscFabl-肽連接的 <ANG2> 重鏈和輕鏈SEQIDNO:30OAscFabI-<VEGF> 重鏈SEQIDNO:31OAscFabI-<VEGF> 輕鏈SEQIDNO: 320AscFab2_ 肽連接的 <ANG2> 重鏈和輕鏈SEQIDNO:330AscFab2_〈VEGF> 重鏈SEQIDNO:340AscFab2_〈VEGF> 輕鏈SEQIDNO: 350AscFab3_ 肽連接的 <ANG2> 重鏈和輕鏈SEQIDNO:360AscFab3_〈VEGF> 重鏈SEQIDNO:370AscFab3_〈VEGF> 輕鏈
SEQ ID NO:38OAscXFabl-肽連接的 <ANG2> 重鏈和輕鏈SEQ ID NO:39OAscXFabI-<VEGF> 重鏈SEQ ID NO:40OAscXFabI-<VEGF> 輕鏈SEQ ID NO: 410AscXFab2_ 肽連接的 <ANG2> 重鏈和輕鏈SEQ ID NO:420AscXFab2_〈VEGF> 重鏈SEQ ID NO:430AscXFab2_〈VEGF> 輕鏈SEQ ID NO: 440AscXFab3_ 肽連接的 <ANG2> 重鏈和輕鏈SEQ ID NO:450AscXFab3_〈VEGF> 重鏈
SEQ ID NO:460AscXFab3_〈VEGF> 輕鏈SEQ ID NO:47人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)SEQ ID NO: 48人血管生成素 _2 (ANG-2)
實施例材料和通用方法關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息參見Kabat，E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，PublicHealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗體鏈的氨基酸依照 EU 編號方式(Edelman, G. M.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,PublicHealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))編號并提及。重組DNA技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)的方法來操作DNA,如記載于Sambrook, J.等，Molecular cloning:Alaboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, 1989的。依照制造商的指令使用分子生物學(xué)試劑?；蚝铣煽梢宰酝ㄟ^化學(xué)合成生成的寡核苷酸制備期望的基因區(qū)段。通過寡核苷酸的退火和連接，包括PCR擴(kuò)增，隨后經(jīng)由指定的限制性位點，例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆入基于pPCRScript (Stratagene)的pGA4克隆載體中來裝配基因區(qū)段,其側(cè)翼有單一的限制性內(nèi)切核酸酶切割位點。通過DNA測序來確認(rèn)亞克隆的基因片段的DNA序列。依照給定的規(guī)格在Geneart (Regensburg, Germany)定購基因合成片段。編碼Ang-2/VEGF雙特異性抗體的輕鏈和重鏈的所有基因區(qū)段都被合成為具有編碼前導(dǎo)肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’端DNA序列，和合成的基因的5’和3’端的獨特限制性位點，所述前導(dǎo)肽在真核細(xì)胞中將蛋白質(zhì)靶向分泌。攜帶二硫化物穩(wěn)定化的經(jīng)“突起-進(jìn)入-空穴”修飾的重鏈的DNA序列設(shè)計為在“突起”重鏈中具有S354C和T366W及在“空穴”重鏈中具有 Y349C、T366S、L368A 和 Y407V 突變。DNA序列測定通過在MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany)或 SequiserveGmbH(Vaterstetten, Germany)實施的雙鏈測序來測定DNA序列。DNA和蛋白質(zhì)序列分析及序列數(shù)據(jù)管理
使用GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)軟件包第 10. 2 版和Infomax的Vector NTl高級套件第8. O版來進(jìn)行序列創(chuàng)建、定位、分析、注釋和例示。表達(dá)載體對于所描述的抗體的表達(dá)，應(yīng)用用于瞬時表達(dá)(例如在HEK293EBNA或HEK293-F細(xì)胞中)或用于穩(wěn)定表達(dá)(例如在CHO細(xì)胞中)的表達(dá)質(zhì)粒的變體，其基于具有CMV-內(nèi)含子A啟動子的cDNA構(gòu)造或基于具有CMV啟動子的基因組構(gòu)造(見圖2B)。 在抗體表達(dá)盒外，載體含有-復(fù)制起點，其容許此質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，和-β -內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性。抗體基因的轉(zhuǎn)錄單元由下列元件構(gòu)成-5’端的獨特限制性位點-來自人巨細(xì)胞病毒的立即早期增強(qiáng)子和啟動子，-在cDNA構(gòu)造的情況中接著有內(nèi)含子A序列，-人抗體基因的5’-非翻譯區(qū)，-免疫球蛋白重鏈信號序列，-人抗體鏈(重鏈、經(jīng)修飾的重鏈或輕鏈),其作為cDNA或作為具有免疫球蛋白外顯子-內(nèi)含子構(gòu)造的基因組構(gòu)造-具有多腺苷酸化信號序列的3’非翻譯區(qū)，和-3’端的獨特限制性位點。為了瞬時的和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，通過來自經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒制備物來制備更大量的質(zhì)粒(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，如記載于Current Protocols in CellBiology (2000), Bonifacino, J. S. , Dasso, M. , Harford, J. B. , Lippincott-Schwartz, J.和Yamada, Κ. M.(編)，John Wiley & Sons, Inc 的。HEK293-F系統(tǒng)中的瞬時轉(zhuǎn)染依照制造商的用法說明書(Invitrogen, USA)使用FreeStyle 293表達(dá)系統(tǒng)通過瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎293-F細(xì)胞表達(dá)重組免疫球蛋白變體。簡言之，在37° C/8% CO2在FreeStyle 293表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)懸浮FreeStyle 293-F細(xì)胞，并將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天以1-2χ106個活細(xì)胞/ml的密度在新鮮的培養(yǎng)基中接種。對于用于單特異性親本抗體的250ml轉(zhuǎn)染終體積，以 1:1 摩爾比率使用 325 μ I 293fectin (Invitrogen, Germany)和 250 μ g 重鏈和輕鏈質(zhì)粒 DNA 在Opti-MEM* I 培養(yǎng)基(Invitrogen, USA)中制備 DNA-293fectin 復(fù)合物。對于250ml轉(zhuǎn)染終體積(OAscFab和OAscXFab)，一般以1:1:1摩爾比率使用325 μ I的293fectin (Invitrogen, Germany)和250 μ g的“突起_進(jìn)入_空穴”重鏈I和2以及輕鏈質(zhì)粒DNA在OplI-MHM81I培養(yǎng)基(Invitrogen，USA)中制備具有兩種重鏈和一種輕鏈的“突起-進(jìn)入-空穴"DNA-293fectinTM復(fù)合物。為了表達(dá)產(chǎn)率優(yōu)化，可以改變所述比率。對于 250ml 轉(zhuǎn)染終體積，以 I: I: I: I 摩爾比率使用 325 μ I 293fectin (Invitrogen, Germany)
和250 μ g “突起-進(jìn)入-空穴”重鏈I和2以及輕鏈質(zhì)粒DNA在Opn-MEM* I培養(yǎng)基(Invitrogen, USA)中制備XMabDNA_293fectin復(fù)合物。為了表達(dá)產(chǎn)率優(yōu)化，可以改變所述比率。在轉(zhuǎn)染后7天通過以14000g離心30分鐘收獲含有抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并將其過濾流過無菌濾器(0.22 μ m)。將上清液于-20° C貯存，直至純化。蛋白質(zhì)測定使用依照Pace, C. N.等，Protein Science, 4 (1995)，2411-1423 基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數(shù)，通過測定280nm的光密度(OD)來測定純化的抗體和衍生物的蛋白質(zhì)濃度。上清液中的抗體濃度測定通過用蛋白A瓊脂糖珠(Roche)的免疫沉淀來評估細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體和衍生物的濃度。將60μ L蛋白A瓊脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris, pH7. 5, 150mMNaCl, l%Nonidet-P40)中清洗三次。隨后，將l_15mL細(xì)胞培養(yǎng)物上清液應(yīng)用于在TBS-NP40 中預(yù)平衡的蛋白A瓊脂糖珠。于室溫溫育I小時后,將珠在Ultrafree-MC-過濾柱(Amicon]上用O. 5mL TBS-NP40清洗一次，用O. 5mL 2x磷酸鹽緩沖鹽水(2xPBS，Roche)清洗兩次，并用O. 5mL IOOmM鈉的檸檬酸鹽pH5，O短暫清洗4次。通過添加35 μ I NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen)來洗脫結(jié)合的抗體。分別將樣品的一半與NuPAGE 樣品還原劑組合或者保持未還原，并于70° C加熱10分鐘。因此，將20 μ I應(yīng)用于4-12% NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(對于非還原性SDS-PAGE用MOPS緩沖液，而對于還原性SDS-PAGE用含NuPAGLi丨抗氧化劑運行緩沖液添加劑(Invitrogen)的MES緩沖液)，并用考馬斯藍(lán)染色。通過蛋白A-HPLC層析測量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體和衍生物的濃度。簡言之，在Dionex HPLC系統(tǒng)上，將含有結(jié)合蛋白A的抗體和衍生物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液應(yīng)用于50mMK2HP04, 300mM NaCl, ρΗ7· 3 中的 HiTrap 蛋白 A 柱(GE Healthcare)，并用 550mM 檸檬酸，pH2. 5自基質(zhì)洗脫。通過UV吸光度和峰面積積分量化洗脫的蛋白質(zhì)。純化的標(biāo)準(zhǔn)IgGl抗體充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品?；蛘?，通過三明治式-IgG-ELISA來測量細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的抗體和衍生物的濃度。簡言之，用100 μ L/孔O. I μ g/mL的生物素化的抗人IgG捕捉分子F(ab，)2<h-Fc Y >BI (Dianova)包被Streptaffell高結(jié)合鏈霉親合素A-96孔微量滴定板(Roche)，于室溫持續(xù)I小時或者備選地于4° C過夜，隨后用200yL/孔PBS、O. 05%Tween(PBST, Sigma)清洗三次。將100 μ L/孔各含有抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在PBS(Sigma)中的稀釋系列添加至孔，并在微量滴定板搖動器上于室溫溫育1_2小時。將孔用 200 μ L/孔 PBST 清洗三次，并用 100 μ I 0. I μ g/mL 的 F (ab <)2<hFcy>P0D (Dianova)作為檢測抗體在微量滴定板搖動器上于室溫檢測結(jié)合的抗體達(dá)1-2小時。用200 μ L/孔PBST將未結(jié)合的檢測抗體洗掉三次，并通過添加100 μ L ABTS/孔來檢測結(jié)合的檢測抗體。在Tecan Fluor光譜儀上以405nm的測量波長(參照波長492nm)實施吸光度測定。雙特異性抗體的純化通過使用蛋白A-Sepharose (GE Healthcare, Sweden)的親和層析和Superdex200大小排阻層析自細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化雙特異性抗體。簡言之，將無菌過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清液應(yīng)用于用PBS緩沖液(IOmM Na2HPO4, ImMKH2PO4, 137mM NaCl和2. 7mMKCl, pH7. 4)平衡的HiTrap蛋白A HP(5ml)柱上。用平衡緩沖液將未結(jié)合的蛋白質(zhì)洗掉。用O. IM檸檬酸鹽緩沖液，ρΗ2· 8將抗體和抗體變體洗脫，并用O. Iml IM Tris, ρΗ8· 5將含有蛋白質(zhì)的級分中和。然后，將洗脫的蛋白質(zhì)級分合并，用Amicon Ultra離心濾器裝置(MWC0:30K，Millipore)濃縮成 3ml 體積，并在用 20mM 組氨酸、140mM NaCl, ρΗ6· O 平衡的Superdex200HiLoad 120ml 16/60 凝膠過濾柱(GE Healthcare, Sweden)上加載。將含有具有小于5%高分子量聚集體的純化的雙特異性抗體的級分合并，并于-80° C以I. Omg/ml等分試樣貯存。SDS-PAGE依照制造商的用法說明書使用NuPAGE 預(yù)制凝膠系統(tǒng)(Invitrogen)。具體地，使用4-20% NuPAGE Novex TRiS-甘氨酸預(yù)制凝膠和Novex TRis-甘氨酸SDS運行緩沖液(參見，例如圖3)。通過添加NuPAGE 樣品還原劑實現(xiàn)樣品的還原，之后運行凝膠。分析用大小排阻層析·通過HPLC層析來實施用于測定抗體的聚集和寡聚狀態(tài)的大小排阻層析。簡言之，將蛋白A純化的抗體應(yīng)用于Agilent HPLC 1100系統(tǒng)上在300mMNaCl、50mM ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04,ρΗ7·5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或者應(yīng)用于Dionex HPLC系統(tǒng)上在2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通過UV吸光度和峰面積級分來量化洗脫的蛋白質(zhì)。BioRad凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)品151-1901充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品(見例如圖4)。質(zhì)譜術(shù)經(jīng)由電噴射離子化質(zhì)譜術(shù)(ESI-MS)來測定并確認(rèn)交換抗體的總脫糖基化質(zhì)量。簡言之，將100 μ g純化的抗體用50mU在IOOmM ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04, pH7中的N-糖苷酶F (PNGaseF, ProZyme)于37° C以多至2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度脫糖基化12-24小時，隨后經(jīng)由Sephadex G25柱(GE Healthcare)上的HPLC脫鹽。脫糖基化并還原后,通過ESI-MS來測定重鏈和輕鏈各自的質(zhì)量。簡言之，將115μ I中的50μ g抗體與60μ I IM TCEP和50μ1 8Μ鹽酸胍一起溫育，隨后脫鹽。在裝備有NanoMate源的Q-Star Elite MS系統(tǒng)上經(jīng)由ESI-MS來測定總質(zhì)量和還原的重鏈和輕鏈的質(zhì)量。HEK293_Tie2細(xì)胞系的生成為了測定血管生成素-2抗體對ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的干擾及ANGPT2對細(xì)胞上的Tie2的結(jié)合，生成重組HEK293_Tie細(xì)胞系。簡言之，使用Fugene (Roche AppliedScience)作為轉(zhuǎn)染試劑將在CMV啟動子和新霉素抗性標(biāo)志物控制下編碼全長人Tie2(SEQID 108)的基于 pcDNA3 的質(zhì)粒(RB22_pcDNA3Topo hTie2)轉(zhuǎn)染入 HEK293 細(xì)胞(ATCC)中，并在DMEM 10%FCS, 500 μ g/ml G418中選擇抗性細(xì)胞。經(jīng)由克隆圓筒分離個別的克隆，隨后通過FACS來分析Tie2表達(dá)。克隆22鑒定為即使在沒有G418的情況中也具有高的且穩(wěn)定的Tie2表達(dá)的克隆(HEK293-Tie2克隆22)。隨后，使用HEK293_Tie2克隆22來進(jìn)行細(xì)胞測定法:ANGPT2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化和ANGPT2細(xì)胞配體結(jié)合測定法。ANGPT2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化測定法依照以下測定法原理來測量ANGPT2抗體對ANGPT2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化的抑制。在沒有或存在ANGPT2抗體的情況中用ANGPT2刺激HEK293_Tie2克隆22達(dá)5分鐘，并通過三明治式ELISA來量化P-Tie2。簡言之，將每孔2xl05個HEK293_Tie2克隆22細(xì)胞在經(jīng)聚-D-賴氨酸包被的96孔微量滴定板上在100 μ I DMEM、10%FCS、500 μ g/ml遺傳霉素中培養(yǎng)過夜。次日，在微量滴定板中制備ANGPT2抗體的滴定行(4倍濃縮的，75 μ I終體積/孔，一式兩份)，并將其與75 μ 1ANGPT2 (R&D systems#623-AN]稀釋(3. 2 μ g/ml作為4倍濃縮溶液)混合。將抗體和ANGPT2于室溫預(yù)溫育15分鐘。將100 μ I混合物添加至HEK293_Tie2克隆22細(xì)胞(與ImM NaV3O4, Sigma#S6508 一起預(yù)溫育5分鐘)，并于37° C溫育5分鐘。隨后，將細(xì)胞用每孔200 μ I冰冷的PBS+lmM NaV3O4來清洗，并通過添加冰上的每孔120 μ I裂解緩沖液(20mM 1^8，？!18.0、1371111似(1、1%冊-40、10%甘油、21111 EDTAUmM NaV3O4UmMPMSF和10 μ g/ml抑肽酶(Aprotinin))來裂解。將細(xì)胞于4° C在微量滴定板搖動器上裂解30分鐘，并在沒有先前離心的情況中及在沒有總蛋白質(zhì)測定的情況中將100 μ I溶胞物直接轉(zhuǎn)移入P_Tie2ELISA微量滴定板(R&D Systems, R&D#DY990)中。依照制造商的指令來量化P-Tie2量，并使用Excel的XLfit4分析插件程序(劑量-響應(yīng)一位點，205模型)來測定抑制的IC50值。IC50值可以在一個實驗內(nèi)比較，但是在實驗間可能存在變化。VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖測定法選擇VEGF誘導(dǎo)的HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，Promocell#C-12200)增殖以測量VEGF抗體的細(xì)胞功能。簡言之，將每96孔5000個HUVEC細(xì)胞(低傳代數(shù)目，小于等于5次 傳代)在經(jīng)膠原I包被的BD Biocoat膠原I 96孔微量滴定板(BD#354407/35640)中在100 μ I饑餓培養(yǎng)基(ΕΒΜ-2內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基2、Promocell#C-22211, O. 5%FCS、青霉素/鏈霉素)中溫育過夜。將變化濃度的抗體與rhVEGF(30ngl/ml終濃度，BD#354107)混合，并于室溫預(yù)溫育15分鐘。隨后，將混合物添加至HUVEC細(xì)胞，并將它們于37° C，5%C02溫育72小時。在分析當(dāng)天，將平板平衡至室溫達(dá)30分鐘，并使用CellTiter-GloTM發(fā)光細(xì)胞存活力測定試劑盒依照手冊(Promega，#G7571/2/3)來測定細(xì)胞存活力/增殖。在光譜儀中測定發(fā)光。實施例Ia雙特異性、二價的經(jīng)域交換的〈VEGF-ANG-2〉抗體分子Xmab的表達(dá)和純化依照在上述材料和方法中所描述的規(guī)程，表達(dá)并純化雙特異性、二價的經(jīng)域交換的〈VEGF-ANG-2〉抗體分子 XMabl、XMab2 和 XMab3。<VEGF> 部分的 VH 和 VL (SEQ ID NO: I和 SEQ ID NO: 2)基于貝伐單抗。<ANG2> 部分的 VH(SEQ ID NO: 3)通過 ANG2i_LC06 的 VH序列(其記載于PCT申請No. PCT/EP2009/007182(W02010/040508)，并且其是經(jīng)由噬菌體展示獲得的進(jìn)一步成熟的序列片段)的E6Q突變(第6位初始氨基酸谷氨酸(E)用谷氨酰胺(Q)替換)衍生。<ANG2>部分的VL(SEQ ID NO:4)自ANG2i_LC06的VL序列(參見PCT申請No. PCT/EP2009/007182(W02010/040508))衍生。表達(dá)并純化雙特異性、二價的經(jīng)域交換的〈VEGF-ANG-2〉抗體分子XMabl、XMab2和XMab3。這些雙特異性二價抗體的相關(guān)輕鏈和重鏈氨基酸序列在 SEQ ID NO: 5-8 (XMabl)、SEQ ID NO: 9-12 (XMab2)和 SEQ IDNO: 13-16 (XMab3)中給出。對于例示性結(jié)構(gòu)，參見圖I。
權(quán)利要求
1.一種雙特異性二價抗體，其包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于 i)所述第一抗原結(jié)合位點包含SEQID NO: I作為重鏈可變域(VH) JPSEQ ID NO: 2作為輕鏈可變域(VL);且 ii)所述第二抗原結(jié)合位點包含SEQID N0:3作為重鏈可變域(VH) JPSEQ ID NO:4作為輕鏈可變域(VL)。
2.依照權(quán)利要求I的雙特異性抗體，其特征在于包含 a)特異性結(jié)合VEGF的第一全長抗體的重鏈和輕鏈； b)特異性結(jié)合ANG-2的全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈和經(jīng)修飾的輕鏈，其中恒定域CL和CHl彼此替換。
3.依照權(quán)利要求2的雙特異性抗體，其特征在于包含 a)SEQ ID NO: 7作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO: 5作為所述第一全長抗體的輕鏈，和 b)SEQID NO:8作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和SEQ ID NO:6作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。
4.依照權(quán)利要求2的雙特異性抗體，其特征在于包含 a)SEQ ID NO: 11作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO: 9作為所述第一全長抗體的輕鏈，和 b)SEQID NO: 12作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和SEQ IDNO: 10作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。
5.依照權(quán)利要求2的雙特異性抗體，其特征在于包含 a)SEQ ID NO: 15作為所述第一全長抗體的重鏈，和SEQ ID NO: 13作為所述第一全長抗體的輕鏈，和 b)SEQID NO: 16作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的重鏈，和SEQ IDN0:14作為所述第二全長抗體的經(jīng)修飾的輕鏈。
6.一種藥物組合物,其包含依照權(quán)利要求I至5中任一項的抗體。
7.依照權(quán)利要求I至5中任一項的雙特異性抗體，其用于治療癌癥。
8.依照權(quán)利要求I至5中任一項的雙特異性抗體，其用于制造用于治療癌癥的藥物。
9.一種治療患有癌癥的患者的方法，其通過對需要此類治療的患者施用依照權(quán)利要求I至5中任一項的抗體來進(jìn)行。
10.依照權(quán)利要求I至5中任一項的雙特異性抗體，其用于治療血管疾病。
11.依照權(quán)利要求I至5中任一項的雙特異性抗體，其用于制造用于治療血管疾病的藥物。
12.—種治療患有血管疾病的患者的方法，其通過對需要此類治療的患者施用依照權(quán)利要求I至5中任一項的抗體來進(jìn)行。
13.一種核酸，其編碼依照權(quán)利要求I至5中任一項的雙特異性抗體。
14.含有依照權(quán)利要求13所述的核酸的表達(dá)載體，其能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。
15.—種原核或真核宿主細(xì)胞，其包含依照權(quán)利要求14的載體。
16.一種用于制備依照權(quán)利要求I至5中任一項的雙特異性抗體的方法，其包括下列步驟 a)用包含編碼所述抗體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞； b)在允許所述抗體分子合成的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；并 c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體。
17.通過權(quán)利要求16的方法獲得的雙特異性抗體。
18.—種雙特異性二價抗體，其包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于包含SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 6、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
19.一種雙特異性二價抗體，其包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于包含SEQ IDNO: 9, SEQ ID NO: 10、SEQ IDN0:11和SEQ ID N0:12的氨基酸序列。
20.一種雙特異性二價抗體，其包含特異性結(jié)合人VEGF的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合人ANG-2的第二抗原結(jié)合位點，其特征在于包含SEQ IDNO:13, SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO: 15和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF/VEGF-A)且針對人血管生成素-2(ANG-2)的雙特異性二價抗體、其生成方法、含有所述抗體的藥物組合物、及其用途。
文檔編號C07K16/22GK102906114SQ201180025164
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者M.貝爾納, S.英霍夫-瓊, A.卡維利, H.凱滕伯杰, C.克萊因, J.T.雷古拉, W.謝弗, J.M.尚茨爾, W.朔伊爾, K-G.斯塔本勞施, M.托馬斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司