專利名稱：跨物種特異性PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙特異性單鏈抗體分子，其包含能夠結(jié)合至人類與非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域，其中該表位是包含在SEQ IDN0. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6以及SEQ ID NO. 8中的氨基酸序列的一部分，所述雙特異性單鏈抗體分子還包含能夠結(jié)合至前列腺-特異性膜抗原(PSMA)的第二結(jié)合域。本發(fā)明還提供編碼所述雙特異性單鏈抗體分子的核酸以及載體與宿主細(xì)胞和用于其生產(chǎn)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含所述雙特異性單鏈抗體分子的藥物組合物以及所述雙特異性單鏈抗體分子的醫(yī)學(xué)用途。
背景技術(shù)：
T細(xì)胞識別由以克隆方式分布的α β以及Y δΤ細(xì)胞受體(TcR)介導(dǎo)，所述T細(xì)胞受體與肽MHC (pMHC)的肽負(fù)載分子相互作用(Davis&Bjorkman, Nature 334 (1988)，395-402)。TcR的抗原特異性鏈不具有信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，而是被耦聯(lián)到保守的多亞基的信號傳導(dǎo)裝置 CD3 (Call, Cell 111 (2002), 967-979, Alarcon, Immuno1. Rev. 191(2003), 38-46, Malissen Immunol. Rev. 191 (2003)，7-27)。將 TcR 連接直接傳送至信號傳導(dǎo)裝置的機(jī)制在T細(xì)胞生物學(xué)中仍然是一個基本的疑問(Alarcon， 上述引用文；Davis, Cell 110 (2002)，285-287)?？雌饋砬宄氖浅掷m(xù)的T細(xì)胞反應(yīng)涉及輔助受體參與、TcR寡聚合以及TcR -pMHC復(fù)合物在免疫學(xué)突觸中的較高次序排列(Davis&van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289-R291, Davis, Nat.1mmunol. 4(2003)，217-224)。然而，非常早的TcR信號傳導(dǎo)在沒有這些事件時發(fā)生，并且可涉及⑶3 ε的配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化(Alarcon,上述引用文；Davis(2002),上述引用文；Gil, J. Biol. Chem. 276(2001)，11174-11179 ;Gil, Cell 109 (2002)，901-912)。信號傳導(dǎo)復(fù)合物的ε、Υ、δ以及ζ亞基彼此締合以形成⑶3 ε-Y異源二聚體、⑶3 ε-δ 異源二聚體以及⑶3 ζ-ζ同源二聚體(Call，上述引用文)。各種研究表明⑶3分子對于a i3TcR的適當(dāng)細(xì)胞表面表達(dá)和正常的T細(xì)胞發(fā)育是重要的(Berkhout’J.Biol. Chem. 263 (1988)，8528-8536 ；ffang, J. Exp. Med. 188(1998)，1375-1380 ；Kappes, Curr. Opin.1mmunol. 7 (1995) ,441-447)。小鼠CD3 ε Y異源二聚體的胞外域片段的溶液結(jié)構(gòu)顯示ε Y亞基均是C2組Ig結(jié)構(gòu)域，它們相互作用以形成獨(dú)特的邊-對-邊的二聚體構(gòu)型(Sun，Cell 105 (2001)，913-923)。雖然富含半胱氨酸的莖似乎在驅(qū)動CD3 二聚時起重要作用(Su，上述引用文；Borroto，J. Biol. Chem. 273 (1998)，12807-12816)，但是經(jīng)由 ⑶3 ε和⑶3 Y的胞外域的相互作用足以將這些蛋白質(zhì)與TcR β組合(Manolios，Eur. J.1mmunol. 24 (1994)，84-92 ；Manolios&Li, Immunol. CellBiol. 73 (1995)，532-536)。雖然仍存在爭議，但是TcR的主要化學(xué)計量學(xué)最有可能包含一個a i3TcR、一個⑶3 ε Y異源二聚體、一個⑶3 ε δ異源二聚體以及一個⑶3 ζ ζ同源二聚體(Call，上述引用文)。鑒于人 CD3 ε y異源二聚體在免疫反應(yīng)中的中心作用，結(jié)合至治療性抗體0ΚΤ3的這個復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)最近已被闡明(Kjer-Nielsen, PNAS 101，(2004)，7675-7680)。
許多治療策略通過靶向TcR信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫，特別是在臨床上廣泛應(yīng)用于免疫抑制方案的抗人CD3單克隆抗體(mAb)。CD3-特異性小鼠mAb 0KT3是第一個被許可使用于人的 mAb (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29),并且在移植(Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993),422-430 ；Chatenoud, Nat. Rev.1mmunol. 3 (2003), 123-132 ； Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352)、I 型糖尿病(Chatenoud (2003)，上述引用文)以及牛皮癬(Utset，J. Rheumatol. 29 (2002)，1907-1913)中被廣泛地用于臨床免疫抑制劑。此外，抗_CD3mAb可引起局部的T細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及克隆不應(yīng)答(Smith，J. Exp. Med. 185 (1997)，1413-1422)。0KT3在文獻(xiàn)中被描述為有效的T細(xì)胞有絲分裂原(Van Wauve, J.1mmunol. 124 (1980), 2708-18)以及有效的 T 細(xì)胞殺手(Wong, Transplantation 50(1990)，683-9)。0KT3以時間依賴的方式展現(xiàn)這些活性；隨著T細(xì)胞的早期活化導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放，在進(jìn)一步管理0KT3后阻止所有已知的T細(xì)胞功能。正是由于T細(xì)胞功能的這一較晚阻斷，0KT3作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用在用于降低或甚至消除同種異體移植組織排斥的治療方案中。
0KT3最可能通過阻斷所有T細(xì)胞的功能來改變同種異體移植的組織排斥，這在急性排斥中發(fā)揮了重要作用。0KT3與人T細(xì)胞膜上的CD3復(fù)合物反應(yīng)并阻斷CD3復(fù)合物的功能，所述CD3復(fù)合物與T細(xì)胞的抗原識別結(jié)構(gòu)(TCR)結(jié)合并且對于信號傳導(dǎo)是必要的。哪一個TCR/⑶3的亞基由0KT3結(jié)合已經(jīng)是許多研究的主題。雖然一些證據(jù)指出，0KT3 對 TCR/CD3 復(fù)合物的 ε -亞基有特異性(Tunnacliffe, Int.1mmunol.1 (1989)，546-50 ； Kjer-Nielsen, PNAS 101，(2004)，7675-7680)。進(jìn)一步的證據(jù)表明，0KT3 結(jié)合 TCR/CD3 復(fù)合物需要這個復(fù)合物的其他亞基存在(Salmeron, J.1mmunol. 147 (1991), 3047-52)。
其他熟知的對CD3分子特異的抗體已列于Tunnacliffe, Int.1mmunol.1 (1989)，546-50。正如上面所指出的，這些CD3特異性抗體能夠誘導(dǎo)各種T細(xì)胞反應(yīng)，例如淋巴因子產(chǎn)生(Von ffussow, J.1mmunol. 127 (1981), 1197 ；Palacious, J.1mmunol. 128(1982)，337)、增殖(Van Wauve, J.1mmunol. 124(1980)，2708-18)以及抑制 T 細(xì)胞誘導(dǎo)(Kunicka,在 “Lymphocyte Typing II ” I (1986)，223 中)。也就是說，取決于實(shí)驗(yàn)情況，CD3特異性單克隆抗體可抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(Leewenberg, J.1mmunol. 134(1985), 3770 ；Phillips, J. Tmmunol. 136(1986) 1579 ；Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 78 (1981)，4500 ；Itoh, Cell.1mmunol. 108 (1987)，283-96 ；Mentzer, J.1mmunol. 135 (1985), 34 ；Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579 ；Choi (2001),Eur. J.1mmunol. 31, 94-106 ；Xu(2000), Cell Immunol. 200, 16-26 ；Kimball(1995), Transpl. Tmmunol · 3, 212-221)。
雖然已報道了許多本領(lǐng)域中描述的⑶3抗體識別⑶3復(fù)合物的⑶3 ε亞基，事實(shí)上它們多數(shù)結(jié)合構(gòu)象表位，并且，因此只識別在TCR原生環(huán)境中的CD3e。構(gòu)象表位的特征在于存在兩個或更多個在一級序列中分開的離散的氨基酸殘基，當(dāng)多肽折疊成天然蛋白質(zhì)/抗原時，所述殘基在分子的表面上聚到一起(Sela，(1969) Science 166，1365和 Laver, (1990)Cell 61，553_6)。在現(xiàn)有技術(shù)中描述的CD3 ε抗體所結(jié)合的構(gòu)象表位可被分成2個組。在主要的組中，所述表位由2個⑶3亞基(例如，⑶3 ε鏈、⑶3 Y或⑶3 δ 鏈的2個⑶3亞基)形成。例如，在一些研究中已發(fā)現(xiàn)最被廣泛使用的⑶3 ε單克隆抗體003、1了31、此!11'1、706和1^11-4不結(jié)合至單獨(dú)被^3-8鏈轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。然而，這些抗體染色細(xì)胞由⑶3 ε加上⑶3 Y或⑶3δ的組合雙重轉(zhuǎn)染(Tunnacliffe，上述引用文；Law, Int.1mmunol. 14(2002), 389-400 ；Salmeron, J.1mmunol. 147(1991), 3047-52 ； Coulie, Eur. J.1mmunol. 21 (1991), 1703-9)。在第二個較小的組中，構(gòu)象表位在CD3 ε亞基本身內(nèi)形成。這個組的成員例如已針對變性的⑶3 ε出現(xiàn)的mAb APA l/l(Risueno, Blood 106 (2005)，601-8)。一并考慮，多數(shù)在本領(lǐng)域中被描述的⑶3 ε抗體識別位于兩個或更多個⑶3亞基上的構(gòu)象表位。形成這些表位3-維結(jié)構(gòu)的離散的氨基酸殘基可因此坐落在 ⑶3 ε亞基本身上或在⑶3 ε亞基和其他⑶3亞基(諸如⑶3 Y或⑶3 δ )上。
另一個關(guān)于CD3抗體的問題是許多CD3抗體已被發(fā)現(xiàn)具有物種特異性?？?CD3 單克隆抗體(如一般而言適用于任何其他的單克隆抗體)通過高特異性識別它們的靶分子而起作用。它們只識別在它們的靶CD3分子上的單一位點(diǎn)或表位。例如，一個對CD3復(fù)合物特異的最廣泛使用且表征最充分的單克隆抗體是0ΚΤ-3。這個抗體與黑猩猩CD3反應(yīng)但不與其它靈長類動物(例如獼猴)的CD3同源物或與狗的CD3反應(yīng)(Sandusky等人，J. Med. Primatol. 15 (1986)，441-451 )。相似地，W02005/118635 或 W02007/033230 描述人單克隆CD3e抗體，其與人CD3e但不與小鼠、大鼠、兔子或非黑猩猩靈長類動物(例如恒河猴、石蟹獼猴或狒狒)的⑶3 ε反應(yīng)。抗-⑶3單克隆抗體UCHT-1也與來自黑猩猩的⑶3 反應(yīng)但不與來自獼猴的CD3反應(yīng)(自有數(shù)據(jù))。另一方面，也有識別獼猴抗原但不識別它們的人對應(yīng)物的單克隆抗體的實(shí)例。這個組的一個實(shí)例是針對來自獼猴的CD3的單克隆抗 # FN-18 (Uda 等人，J. Med. Primatol. 30 (2001)，141-147)。有趣地，已發(fā)現(xiàn)來自大約 12% 石蟹獼猴的外周血淋巴細(xì)胞由于獼猴的CD3抗原的多態(tài)性而缺乏與抗-恒河猴的CD3單克隆抗體(FN-18)反應(yīng)的活性。Uda等人描述了相較于與FN-18抗體反應(yīng)的源自動物的 CD3，不與FN-18抗體反應(yīng)的石蟹獼猴的CD3序列中的2個氨基酸的替換(Uda等人，J Med Primatol. 32 (2003)，105-10 ；Uda 等人，J Med Primatol. 33 (2004)，34-7)。
識別能力(S卩，物種特異性，不僅CD3單克隆抗體(以及它們的片段)是固有的，對于一般的單克隆抗體也是固有的)對于所述抗體發(fā)展作為用于治療人類疾病的治療藥物而言是一個重大的阻礙。為了獲得上市許可，任何新的候選藥物必須經(jīng)過嚴(yán)格的測試。這個測 試可以細(xì)分成臨床前以及臨床階段，而臨床階段進(jìn)一步被細(xì)分成一般已知的臨床Ι、π和III 期，在人類患者中進(jìn)行，臨床前階段在動物中進(jìn)行。臨床前測試的目的是證明候選藥物具有所需的活性并且最重要地是安全的。只有當(dāng)動物的安全性以及該候選藥物可能的有效性已在臨床測試前建立時，這個候選藥物將被批準(zhǔn)由各自的監(jiān)管機(jī)構(gòu)用于人類臨床測試。可通過下列3種方式在動物中測試候選藥物的安全性(i)在相關(guān)物種中，即在藥物候選物可識別同源物抗原的物種中，(ii)在含有人抗原的轉(zhuǎn)基因動物中，以及(iii)通過使用可以結(jié)合動物體內(nèi)存在的同源物抗原的候選藥物替代品。轉(zhuǎn)基因動物的限制使得這個技術(shù)通常被限制于嚙齒類動物。嚙齒類動物與人在生理學(xué)上有顯著的不同，安全性結(jié)果不能輕易地外推到人類。候選藥物替代品的局限性在于與實(shí)際候選藥物相比是不同的物質(zhì)組成，并且使用的動物經(jīng)常是如上面所討論的具有局限的嚙齒類動物。因此，相比于候選藥物，在嚙齒類動物中產(chǎn)生的臨床前數(shù)據(jù)的預(yù)測能力有限。安全性測試方法的選擇是利用相關(guān)的物種， 優(yōu)選低等的靈長類動物。本領(lǐng)域描述的適用于人的治療性干預(yù)的單克隆抗體的現(xiàn)有限制是相關(guān)物種是較高等的靈長類動物，特別是黑猩猩。黑猩猩被認(rèn)為是瀕危物種，并且由于它們類似人類的本質(zhì)，這類動物用于藥物安全性測試在歐洲已被禁止，并且在其他地方也被嚴(yán)格限制。為了將細(xì)胞毒性T細(xì)胞重定向至病理細(xì)胞，CD3已成功地被用作雙特異性單鏈抗體的靶標(biāo)，導(dǎo)致病變細(xì)胞從不同的生物體內(nèi)耗竭(W099/54440 ；W0 04/106380)。例如， Bargou等人(Science 321 (2008) :974-7)最近報道的具有臨床活性的CD19xCD3雙特異性抗體構(gòu)建體被稱為blinatumomab，其具有使人患者的所有細(xì)胞毒性T細(xì)胞用于癌細(xì)胞裂解的潛力。在非霍奇金氏淋巴瘤患者中，使用低至每天每平方米O. 005毫克的劑量導(dǎo)致血液中的靶細(xì)胞的消除。部分以及完全的腫瘤消退最先在O. 015毫克的劑量水平觀察到，并且在O. 06毫克的劑量水平下治療的全部7位患者均經(jīng)歷了腫瘤消退。Blinatumomab也導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從骨髓以及肝中清除。雖然這個研究建立了關(guān)于雙特異性單鏈抗體形式在治療血細(xì)胞衍生癌的治療效力的臨床證據(jù)或概念，但是仍然需要用于治療其他類型癌癥的成功概念。在2008年，估計有186，320男性在美國將被新診斷出患有前列腺癌，并且大約 28，660男性將死于這種疾病。最近一份關(guān)于癌癥死亡率的報告顯示在2004年，美國人中前列腺癌的總死亡率為每100，000例有25例。在20世紀(jì)80年代末，廣泛地采用前列腺-特異性抗原(PSA)測試，在前列腺癌的管理上代表了一個重大的改進(jìn)。這個測試測量血中PSA 蛋白的量，其在前列腺癌患者中往往是升高的。在1986年，美國食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了使用PSA測試來監(jiān)測具有前列腺癌的患者，并且在1994年還批準(zhǔn)其用作本病的篩選試驗(yàn)。由于PSA測試在美國廣泛地實(shí)施，約90%的前列腺癌在早期被診斷出，并且，因此患者在診斷后存活更久。然而，需要NC1-資助的前列腺、肺、結(jié)腸直腸與卵巢(PLCO)篩查試驗(yàn)以及篩查前列腺癌的歐洲研究(ERSPC)這2個進(jìn)行中的臨床試驗(yàn)的結(jié)果，以確定PSA篩查是否能拯救生命。在過去25年中進(jìn)行著的臨床試驗(yàn)已調(diào)查了天然與合成的化合物在預(yù)防前列腺癌的效力。例如，招收近19，000位健康男性的前列腺癌預(yù)防試驗(yàn)(PCPT)發(fā)現(xiàn)被批準(zhǔn)用于治療良性前列腺增生(BPH，一種非癌的前列腺腫大)的藥物非那雄胺，將罹患前列腺癌的風(fēng)險減少25%。另一個試驗(yàn)，硒與維生素E癌癥預(yù)防試驗(yàn)(SELECT)研究超過35，000位男性以確定每天補(bǔ)充硒以及維生素E是否可降低健康男性前列腺癌的發(fā)病率。其他預(yù)防前列腺癌的試驗(yàn)?zāi)壳罢谠u估綜合維生素、維生素C與D、大豆、綠茶以及在番茄中被發(fā)現(xiàn)的天然化合物番茄紅素的保護(hù)潛力。一篇在2005年報導(dǎo)的研究顯示，特定基因融合于60%至 80%的被分析的前列腺腫瘤中。這個研究代表首次在前列腺癌中觀察到非隨機(jī)基因重排。 這種基因的改變最終可用作生物標(biāo)記物，以幫助本病的診斷及可能的治療。其他研究已表明在8號染色體特定區(qū)域內(nèi)的遺傳變異可以增加人罹患前列腺癌的風(fēng)險。這些基因變異導(dǎo)致約25%的前列腺癌發(fā)生在白人男性中。它們是第一個被確認(rèn)增加罹患前列腺癌風(fēng)險的基因變異體，并且可幫助科學(xué)家更好地了解這個疾病的遺傳原因。也有持續(xù)的研究探討了在患者血液中循環(huán)的蛋白質(zhì)如何可用于改善前列腺以及其他癌癥的診斷。在2005年，科學(xué)家鑒定了由患者的免疫系統(tǒng)響應(yīng)于前列腺腫瘤而產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)是一種自身抗體，其能夠以大于90%的準(zhǔn)確度來檢測血液樣品中前列腺癌細(xì)胞的存在。當(dāng)與PSA組合使用時，這些以及其他的血液蛋白最終可用于減少僅用PSA測試獲得的假陽性結(jié)果的數(shù)目，并且因此降低了由于假陽性PSA測試結(jié)果而每年進(jìn)行的大量的不必要的前列腺活檢。
除了 PSA之外，已經(jīng)鑒定了數(shù)種用于前列腺癌的其他標(biāo)記物，包括例如前列腺的 6次跨膜的上皮抗原(STEAP) (Hubert等人，PNAS 96 (1999)，14523-14528)、前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA) (Reiter 等人，Proc. Nat. Acad. Sc1. 95:1735-1740，1998)以及前列腺特異性膜抗原(PSMA ;PSM) (Israeli等人，Cancer Res. 53(1993) )0 PSMA起初由源自淋巴結(jié)前列腺腺癌(LNCaP)細(xì)胞系的部分純化的膜制劑免疫的單克隆抗體(MAb)7Ell定義(Horoszewicz 等人，Anticancer Res. 7 (1987)，927-35)?？寺【幋a PSMA 蛋白的 2. 65kb 的 cDNA 片段，隨后映射到染色體llpll. 2 (Israeli等人，上述引用文;0，Keefe等人,Biochem. Biophys. Acta 1443(1998)，113-127)。PSMA的初步分析證明了在前列腺分泌上皮細(xì)胞內(nèi)的廣泛表達(dá)。免疫組化染色顯示=PSMA在增生以及良性組織中缺乏至中度表達(dá)，而惡性組織以最大強(qiáng)度染色(Horoszewicz等人,上述引用文)。后續(xù)的研究證實(shí)了這些結(jié)果，并表明PSMA 表達(dá)為目前在幾乎每個被檢查的前列腺組織的普遍特征。這些報告進(jìn)一步表明PSMA的表達(dá)與腫瘤侵襲性特別成比例地增加(Burger等人，Int. J. Cancer 100 (2002)，228-237 ； Chang 等人，Cancer Res. 59 (1999)，3192-98 ；Chang 等人,Urology 57(2001), 1179-83 ； Kawakami 和 Nakayama, Cancer Re s. 57 (1997)，2321-24 ; Liu 等人，Cancer Res. 57 (1997)，3629-34 ；Lopes 等人，Cancer Res. 50 (1990)，6423-29 ；Silver 等人，Clin. Cancer Res. 9 (2003)，6357—62 ;Sweat 等人，Urology 52 (1998), 637-40 ;Troyer 等人，Int. J. Cancer 62 (1995)，552-558 ;Wright 等人，Urology 48 (1996)，326-334)。與在 PSMA 表達(dá)和腫瘤分期之間的相關(guān)性一致，PSMA的水平提高與雄性激素-非依賴性前列腺癌(PCa) 有關(guān)。前列腺癌患者的組織樣本分析表明，在身體閹割或雄性激素耗竭的治療后PSMA的水平升高。不像前列腺特異性抗原的表達(dá)即在雄性激素消除后PSMA減量調(diào)節(jié)，在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤樣品中PSMA表達(dá)均顯著地增加(Kawakami等人、Wright等人,上述引用文)。 與在雄性激素-非依賴性的腫瘤中表達(dá)升高相一致，PSMA轉(zhuǎn)錄也被認(rèn)為是由類固醇減量調(diào)節(jié)，并且睪丸激素給藥介導(dǎo)PSMA蛋白以及mRNA的水平顯著地降低(Israeli等人，Cancer Res. 54(1994)，1807-11 ;Wright等人，上述引用文)。PSMA也在繼發(fā)性前列腺腫瘤以及隱匿性轉(zhuǎn)移疾病中高度表達(dá)。免疫組化分析顯示相較于良性前列腺組織，位于淋巴結(jié)、骨、軟組織和肺的轉(zhuǎn)移病灶內(nèi)的PSMA的表達(dá)相對激烈和均一(Chang等人(2001)，上述引用文； Murphy等人，Cancer 78 (1996)，809-818 ;Swea t等人，上述引用文)。一些報告還顯示，在包括腎臟近端小管的亞組、小腸刷狀緣膜的一些細(xì)胞以及在結(jié)腸隱窩的稀少細(xì)胞的前列腺外組織中，PSMA 表達(dá)有限(Chang 等人(1999)、Horoszewicz 等人、Israeli 等人(1994)、 Lopes等人、Troyer等人,上述引用文)。然而，PSMA在這些組織中的水平通常是2到3個數(shù)量級，小于在前列腺中觀察到的(Sokoloff等人，Prostate 43 (2000)，150-157)。PSMA也表達(dá)于多數(shù)被檢查的實(shí)體癌的腫瘤相關(guān)的血管新生系統(tǒng)中，但是在正常的血管內(nèi)皮中是缺少的(Chang等人(1999)、Liu等人、Silver等人，上述引用文)。雖然PSMA在血管內(nèi)表達(dá)的顯著性是未知的，但是與腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性使PSMA成為用于治療多種形式的惡性腫瘤的潛在靶標(biāo)。
雖然已經(jīng)把許多的精力放在鑒定用于癌癥治療方法的新靶標(biāo)上，但是癌癥仍是最常被診斷的疾病之一。鑒于此，仍然需要對于癌癥的有效治療。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種雙特異性單鏈抗體分子，其包含能夠結(jié)合至人類及非黑猩猩靈長類動物CD3e鏈的表位的第一結(jié)合域，其中，該表位是包含在SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 8中的氨基酸序列的一部分；和能夠結(jié)合至前列腺_特異性膜抗原 (PSMA)的第二結(jié)合域。
雖然本領(lǐng)域描述的T細(xì)胞-接合的雙特異性單鏈抗體對于治療惡性疾病有很大的治療潛力，但是這些雙特異性分子大多數(shù)被限制在它們是物種特異性的并且只識別人類抗原，以及由于基因相似性可能識別黑猩猩對應(yīng)物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供一種雙特異性單鏈抗體，其包含對于人類以及非黑猩猩靈長類動物的CD3 ε鏈顯示具有跨物種特異性的結(jié)合域。
在本發(fā)明中令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，相比于本領(lǐng)域描述的全部其它已知的CD3e的表位，當(dāng)CD3 ε的胞外域的N-端1-27個氨基酸殘基多肽片段從其在CD3復(fù)合物中的原生環(huán)境取出時(并且任選地融合到外源氨基酸序列，例如EpCAM或免疫球蛋白Fe部分時)，所述多肽片段維持其三維結(jié)構(gòu)完整性。因此，本發(fā)明提供一種雙特異性單鏈抗體分子，其包含第一結(jié)合域，所述第一結(jié)合域能夠結(jié)合至人類以及至少一種非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的 ⑶3 ε (⑶3 ε是，例如，從它的原生環(huán)境取出和/或由T-細(xì)胞包含的(存在于其表面))的胞外域的N-端1-27個氨基酸殘基多肽片段的表位，其中，該表位是包含在SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 8中的氨基酸序列的一部分；以及第二結(jié)合域，所述第二結(jié)合域能夠結(jié)合至前列腺-特異性膜抗原(PSMA)。在此處及其它地方被提及的非黑猩猩靈長類動物是優(yōu)選的。至少一種(或其中所選或全部)靈長類動物選自白鬢狨；絨頂檉柳猴、 松鼠猴以及馬來猴(SEQ ID 631或SEQ ID 632或者這兩者)是特別優(yōu)選的。恒河獼猴(也被稱為恒河猴)也設(shè)想作為另一種優(yōu)選的靈長類動物。因此設(shè)想本發(fā)明的抗體結(jié)合至(能夠結(jié)合至)人類以及白鬢狨、絨頂檉柳猴、松鼠猴和馬來猴(SEQ ID 631或SEQ ID 632或者這兩者)、以及任選地恒河獼猴的CD3 ε的胞外域的N-端1-27個氨基酸殘基多肽片段的環(huán)境獨(dú)立表位?？筛鶕?jù)在WO 2008/119567 (特別是WO 2008/119567的實(shí)施例2)中的操作獲得(可由此獲得)或制造如本文定義的包含第一結(jié)合域的雙特異性單鏈抗體分子。為此，設(shè)想(a)用人類和/或松鼠猴的CD3 ε的胞外域的N-端1_27個氨基酸殘基多肽片段免疫小鼠；(b)產(chǎn)生免疫鼠抗體scFv文庫；(c)通過測試至少結(jié)合至SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、 SEQ ID NO. 6和SEQID NO. 8的能力來鑒定CD3 ε特異性結(jié)合物。
本發(fā)明所提供的環(huán)境獨(dú)立的⑶3表位對應(yīng)于⑶3 ε的前27個N-端氨基酸或者這 27個氨基酸伸展物的功能性片段。如本文所用，關(guān)于CD3表位的用語“環(huán)境獨(dú)立”意指本文描述的本發(fā)明的結(jié)合分子/抗體分子的結(jié)合不會引起構(gòu)象、序列、在抗原決定簇或表位周圍的結(jié)構(gòu)的改變或修飾。相比之下，由常見的CD3結(jié)合分子(例如，如公開在WO 99/54440 或TO 04/106380)識別的CD3表位位于環(huán)境獨(dú)立表位的CD3 ε鏈C-端至N-端的1_27個氨基酸上，其中若它被嵌在ε鏈的其余部分內(nèi)并通過ε鏈與CD3Y或δ鏈的異二聚體化而被保持在正確的空間位置時，它僅采取正確的構(gòu)象。
如本文提供的作為PSMAxCD3雙特異性單鏈分子的一部分的抗-CD3結(jié)合域，已在 WO 2008/119567有描述。針對環(huán)境獨(dú)立的⑶3表位產(chǎn)生(且指向)的這些結(jié)合域提供了關(guān)于 T細(xì)胞再分布的驚人的臨床改善，并且因此提供了更有利的安全性。不被理論所限制，由于 CD3表位是環(huán)境獨(dú)立的，形成自給自足的子域而對CD3復(fù)合物的其余部分影響不大，因此， 相比于識別環(huán)境獨(dú)立的CD3表位的常規(guī)CD3結(jié)合分子(如WO 99/54440或W004/106380中提供的分子)，本文提供的PSMAxCD3雙特異性單鏈分子的CD3結(jié)合域在CD3構(gòu)象上誘發(fā)較少的異位變化。
在用本發(fā)明所述的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體治療的開始階段期間，由本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的CD3結(jié)合域識別的環(huán)境獨(dú)立的CD3表位與T細(xì)胞再分布(T 細(xì)胞再分布等同于T細(xì)胞絕對計數(shù)的首次下降期和隨后的恢復(fù))相關(guān)較少或無相關(guān)。相比于本領(lǐng)域已知的識別環(huán)境依賴的⑶3表位的常規(guī)⑶3結(jié)合分子，這些使得本發(fā)明的PSMAx⑶3 雙特異性單鏈抗體具有較佳的安全性。特別地，因?yàn)門細(xì)胞再分布在用CD3結(jié)合分子治療的開始階段期間是不良事件的主要風(fēng)險因素，如CNS不良事件，所以通過識別環(huán)境獨(dú)立的而不是環(huán)境依賴的CD3表位的本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體具有很大的安全性，優(yōu)于本領(lǐng)域已知的CD3結(jié)合分子。在用常規(guī)CD3結(jié)合分子治療的開始階段期間具有與T細(xì)胞再分布有關(guān)的這類CNS不良事件的患者通常思維混淆和迷失方向，在一些情況下，還會出現(xiàn)尿失禁?；煜且环N精神狀態(tài)的改變，其中患者不能夠以他或她的正常的清晰水平來思考?；颊咄ǔｋy以集中，并且思考不僅模糊不清而且時常顯著地被放慢。在用常規(guī)⑶3結(jié)合分子治療的開始階段期間具有與T細(xì)胞再分布有關(guān)的CNS不良事件的患者還可能喪失記憶。頻繁地，思維混淆導(dǎo)致喪失識別人、地方、時間或日期的能力。迷失方向的感覺在思維混淆中是常見的，并且做出判斷的能力受損。在用常規(guī)CD3結(jié)合分子治療的開始階段期間與T細(xì)胞再分布有關(guān)的CNS不良事件還進(jìn)一步包括語音模糊不清和/或選字困難。這種障礙可能會削弱語言的表達(dá)與理解，以及閱讀和寫作。除了尿失禁之外，在一些患者中，在用常規(guī)CD3結(jié)合分子治療的開始階段期間與T細(xì)胞再分布有關(guān)的CNS不良事件還可能伴有眩暈以及頭昏眼花。
在提及的⑶3 ε的N-端27個氨基酸多肽片段內(nèi)的3維結(jié)構(gòu)的維持可用于產(chǎn)生能夠以相同的結(jié)合親和力在體外結(jié)合至N-端CD3 ε多肽片段以及在體內(nèi)結(jié)合至在T細(xì)胞上的原生的CD3復(fù)合物(的CD3 ε亞基)的結(jié)合域，優(yōu)選人類的結(jié)合域。這些數(shù)據(jù)有力地表明如本文描述的N-端片段形成類似于其體內(nèi)正常存在的結(jié)構(gòu)的三級構(gòu)象。進(jìn)行了關(guān)于 ⑶3 ε的N-端多肽片段的氨基酸1-27的結(jié)構(gòu)完整的重要性的非常靈敏的測試。CD3 ε的 N-端多肽片段的氨基酸1-27的各個氨基酸被改變成丙氨酸(丙氨酸掃描)，以測試CD3 ε 的N-端多肽片段的氨基酸1-27對于輕微破壞的靈敏度。CD3特異性結(jié)合域作為本發(fā)明的 PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的一部分，用于測試與CD3 ε的N-端多肽片段的氨基酸1_27 的丙氨酸-突變體的結(jié)合(見W02008/119567)。 在片段的N-端處的前5個氨基酸殘基以及在CD3 ε的N-端多肽片段的氨基酸1-27的第23和25位的2個氨基酸的個別互換，對于這些抗體分子的結(jié)合是關(guān)鍵的。將包含殘基Q (在第I位處的谷氨酰胺)、D (在第2位處的天冬氨酸)、G (在第3位處的甘氨酸)、N (在第4位處的天冬酰胺)以及E (在第5位處的谷氨酸)的第1-5位的區(qū)域中的氨基酸殘基替換成丙氨酸，消除了本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)與所述片段的結(jié)合。然而，對于至少一些本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)， 在提及的片段T (在第23位處的蘇氨酸)以及I (在第25位處的異亮氨酸)的C-端處的2 個氨基酸殘基，降低了對本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)的結(jié)合能。
意外地，已發(fā)現(xiàn)如此分離的本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的 PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)，不僅識別人CD3 ε的N-端片段，而且識別各種靈長類動物的CD3 ε的相應(yīng)同源片段，所述靈長類動物包括新世界猴(狨猴，白鬢狨；絨頂檉柳猴；松鼠猴)和舊世界猴(馬來猴，也被稱為石蟹獼猴；或恒河獼猴，也被稱為恒河猴)。因此，檢測到本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的多靈長類動物特異性。下列的序列分析證實(shí)，人類和靈長類動物在CD3 ε的胞外域的N-端處共有高度同源的序列延伸物。
前面所提及的⑶3 ε的N-端片段的氨基酸序列描述于SEQ ID NO. 2 (人類)、SEQ ID NO. 4 (白鬢狨)；SEQ ID NO. 6 (絨頂檉柳猴)；SEQ ID NO. 8 (松鼠猴)；SEQ ID NO. 631 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTILTC 或 SEQ IDN0. 632 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILT(馬來猴， 也被稱為石蟹獼猴)以及SEQ ID NO. 633 QDGNEEMGSITQTPYHVSISGTTVILT (恒河獼猴，也被稱為恒河猴)。
本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的第二結(jié)合域結(jié)合至前列腺-特異性膜抗原(PSMA)。優(yōu)選地，該P(yáng)SMAxCD3雙特異性單鏈抗體的第二結(jié)合域結(jié)合至人類PSMA或非黑猩猩靈長類動物PSMA ;更優(yōu)選地，它結(jié)合至人類PSMA以及非黑猩猩靈長類動物PSMA，并且因此是跨物種特異性的；更優(yōu)選地，結(jié)合至人類PSMA以及獼猴PSMA (并且因此也是跨物種特異性的)。特別優(yōu)選地，獼猴PSMA是石蟹獼猴PSMA和/或恒河猴PSMA。然而，不排除在本發(fā)明范圍外的是該第二結(jié)合域也可結(jié)合至其他物種的PSMA同源物(例如嚙齒類動物的 PSMA同源物)。
前列腺癌是男性的第二大癌癥。在2008年，估計美國有186，320位男性將被新診斷出患有前列腺癌，并且大約28，660位男性將死于這種疾病?；记傲邢侔┑娘L(fēng)險與年齡強(qiáng)相關(guān)非常少的病例為出現(xiàn)在50歲以下的男性中，而四分之三的病例發(fā)生在超過65歲的男性中。最大數(shù)目的病例被診斷出現(xiàn)在70-74歲的男性中。目前，老年人口的增長率顯著高于總?cè)丝?。?025-2030年，預(yù)測指出60歲以上人口的增長速度將是總?cè)丝诘?. 5倍。在下半個世紀(jì)，預(yù)測世界各地老年人的比例將超過2倍，這意味著未來診斷出的前列腺癌的發(fā)生率將進(jìn)一步增加。PSMA的高度受限表達(dá)和它在前列腺癌的發(fā)展階段與轉(zhuǎn)移性疾病中的增量調(diào)節(jié)以及它在許多不同類型的其他實(shí)體瘤的腫瘤血管上作為新抗原的作用使得PSMA 能夠作為以抗體為基礎(chǔ)的癌癥治療的 有吸引力的靶標(biāo)抗原。正如在下列實(shí)施例中所示，本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體提供了殺死表達(dá)PSMA的人類癌細(xì)胞(如作為例示的人類前列腺癌細(xì)胞系LNCaP)的有利工具。此外，本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的細(xì)胞毒活性要比本領(lǐng)域描述的抗體的細(xì)胞毒活性高。由于優(yōu)選本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的CD3和PSMA結(jié)合域均是跨物種特異性的(即，與人類以及非黑猩猩靈長類動物抗原反應(yīng))，它可用于這些結(jié)合域在靈長類動物中以及以相同形式作為人用藥物的安全性、 活性和/或藥代動力學(xué)特征的臨床前評價。
有利地，本發(fā)明還提供包含結(jié)合至人類PSMA以及獼猴PSMA同源物(即，非黑猩猩靈長類動物的同源物)的第二結(jié)合域的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該雙特異性單鏈抗體因此包含對于人類以及非黑猩猩靈長類動物PSMA顯示具有跨物種特異性的第二結(jié)合域。在這種情況下，同樣的雙特異性單鏈抗體分子可用于這些結(jié)合域在靈長類動物中和作為人用藥物的安全性、活性和/或藥代動力學(xué)特征的臨床前評價。換言之，相同分子可用于在臨床前動物研究以及人類的臨床研究。這使得結(jié)果高度可比較，并且相較于物種-特異性替代分子，動物研究的預(yù)測能力大幅增加。由于本發(fā)明的 PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的CD3和PSMA結(jié)合域都是跨物種特異性的，即，與人類以及非黑猩猩靈長類動物的抗原反應(yīng)，其可用于這些結(jié)合域在靈長類動物以及以同樣的形式作為人用藥物的安全性、活性和/或藥代動力學(xué)特征的臨床前評價。將會理解的是在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的第一和第二結(jié)合域的跨物種特異性是相同的。
在本發(fā)明中已發(fā)現(xiàn)，可以產(chǎn)生一種PSMAx⑶3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的 PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)，其中相同的分子可用于臨床前動物試驗(yàn)以及臨床研究并甚至用于人類的治療。這是由于意想不到地發(fā)現(xiàn)該P(yáng)SMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的 PSMAx⑶3雙特異性單鏈抗體)除了分別結(jié)合至人類⑶3 ε以及PSMA之外，(并且由于可能與黑猩猩對應(yīng)物的基因相似性)，還可結(jié)合至非黑猩猩靈長類動物(包括新世界猴以及舊世界猴)的所述抗原的同源物。正如下面實(shí)施例中所示，本發(fā)明的所述PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)可用作治療劑來對抗各種疾病，包括、但不限于癌癥。該P(yáng)SMAxCD3雙特異性單鏈抗體特別有利地用于治療癌癥，優(yōu)選實(shí)體瘤，更優(yōu)選癌以及前列腺癌。鑒于上述，需要構(gòu)建PSMAx⑶3雙特異性單鏈抗體的替代物，以測試遠(yuǎn)離親源(人類)的物種的消失。結(jié)果，因?yàn)橐庥麑⑺幬锿度氲脚R床試驗(yàn)以及后續(xù)的市場許可和治療藥物的給藥，將相同的分子用于動物臨床前試驗(yàn)。能夠使用與日后施用給人類的相同分子來進(jìn)行臨床前動物試驗(yàn)，實(shí)際上消除了或者至少大大降低了在臨床前動物試驗(yàn)中所獲得的數(shù)據(jù)對人類方案的適用性有限的危險。簡而言之，使用與將實(shí)際施用給人類的相同分子在動物中獲得臨床前安全性數(shù)據(jù)，確實(shí)會確保該數(shù)據(jù)對人類相關(guān)方案適用。相比之下，在使用替代分子的常規(guī)方法中，這種替代分子必須被以分子方式適應(yīng)于用于臨床前安全評價的動物試驗(yàn)體系。因此，用于人類治療的分子實(shí)際上在序列上以及可能在結(jié)構(gòu)上不同于用于臨床前試驗(yàn)藥代動力學(xué)參數(shù)和/或生物活性的替代分子，結(jié)果是在臨床前動物試驗(yàn)中所獲得的數(shù)據(jù)對于人類方案的適用性/可轉(zhuǎn)移性有限。替代分子的使用需要構(gòu)建、生產(chǎn)、純化以及表征全新的構(gòu)建體。這將導(dǎo)致需要額外的開發(fā)成本和時間來獲得該分子?？傊?，除了用于人類治療的實(shí)際藥物，還得單獨(dú)開發(fā)替代物，故需要進(jìn)行2種分子的2個開發(fā)生產(chǎn)線。因此， 顯示具有跨物種特異性的本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3 雙特異性單鏈抗體)的一個主要優(yōu)點(diǎn)是，可以將相同的分子用作人類以及臨床前動物試驗(yàn)中的治療劑。
優(yōu)選地，所述本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體的第一或第二結(jié)合域的至少一者是 CDR-移植的、人源化的或人類的，如下文更詳細(xì)所述。優(yōu)選地，所述本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體的第一以及第二結(jié)合域均是CDR-移植的、人源化的或人類的。對于本發(fā)明的PSMAxCD3 雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)，對人類患者給藥時，抵抗所述結(jié)合分子的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生對抗被最大可能程度地排除。
本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)的另一個主要優(yōu)點(diǎn)是，它適用于各種靈長類動物的臨床前試驗(yàn)。理想的候選藥物在動物中的作用應(yīng)該能夠反應(yīng)出該候選藥物施用給人類后的預(yù)期作用。結(jié)果，因此從此類臨床前試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)一般而言應(yīng)該具有對人類方案的高度預(yù)測力。然而，從最近的TGN1412 (CD28單克隆抗體)I期臨床試驗(yàn)的不幸結(jié)果可知，候選藥物在靈長類動物物種和人類中有不同作用在石蟹獼猴的動物研究中已觀察到所述抗體在臨床前試驗(yàn)中沒有或僅有有限的不良反應(yīng)，但是6位人類患者在施用所述抗體后發(fā)展為多臟器功能衰竭(Lancet 368(2006)，2206-7)。這些劇烈的、非預(yù)期負(fù)面事件的結(jié)果表明，將臨床前試驗(yàn)限制于僅一種(非黑猩猩靈長類動物)物種未必是足夠的。事實(shí)上，本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體結(jié)合至一系列的新世界猴和舊世界猴，可有助于克服上述例子中所面臨的問題。因此，本發(fā)明提供在開發(fā)和測試用于人類治療的藥物時將物種差異的影響最小化的手段和方法。
關(guān)于本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)，使測試動物適應(yīng)于意欲施用給人類的候選藥物，例如，建立轉(zhuǎn)基因動物，也不再是必要的。根據(jù)本發(fā)明的用途和方法顯示具有跨物種特異性的本發(fā)明PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)可直接用于非黑猩猩靈長類動物的臨床前試驗(yàn)，沒有動物的任何遺傳操作。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，使測試動物適應(yīng)于候選藥物的方法經(jīng)常承受如下風(fēng)險在臨床前安全性測試中獲得的結(jié)果較少有代表性，并且由于該動物的修飾對于人類的預(yù)測力較低。例如，在轉(zhuǎn)基因動物中，由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)常被高度過表達(dá)。因此，所獲得的抗體對抗該蛋白質(zhì)抗原的生物活性的數(shù)據(jù)可能在它們對人類 (該蛋白質(zhì)在人中以更低、更生理學(xué)的水平表達(dá))的預(yù)測值方面有限。
顯示具有跨物種特異性的本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的 PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)的用途的另一個優(yōu)點(diǎn)是以下事實(shí)黑猩猩作為一種瀕危物種， 被避免用于動物試驗(yàn)。黑猩猩是人類最接近的親屬，并且最近根據(jù)基因組測序數(shù)據(jù)而被分入人科(WiIdman等人，PNAS 100 (2003)，7181 )。因此，用黑猩猩獲得的數(shù)據(jù)通常被認(rèn)為是對于人類高度預(yù)測的。然而，由于它們的狀態(tài)為瀕危物種，可用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的黑猩猩的數(shù)目被高度限制。如上所述的，因此，維持黑猩猩用于動物試驗(yàn)是昂貴并且具有倫理問題的。本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)的使用避免了在臨床前試驗(yàn)期間的倫理異議以及財政負(fù)擔(dān)，并且沒有損害質(zhì)量(即，所獲得的動物試驗(yàn)數(shù)據(jù)的適用性)。鑒于此，本發(fā)明的優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的使用在黑猩猩研究上提供了一個合理選擇。
本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)的又一優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)用它作為動物臨床前試驗(yàn)(例如在動物藥代動力學(xué)研究的過程中)的一部分時，提取多個血液樣本的能力。 非黑猩猩靈長類動物要比低等動物(例如，小鼠)更容易進(jìn)行多次血液提取。多個血液樣品的提取允許持續(xù)測試血液參數(shù)，以測定由本發(fā)明的 PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)誘導(dǎo)的生物效應(yīng)。 再者，多個血液樣品的提取使研究者能夠評估如本文定義的本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)的藥代動力學(xué)特征。此外，反映在血液參數(shù)中的可由所述本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)誘導(dǎo)的可能副作用，可在施用所述抗體過程期間提取的不同血液樣品中進(jìn)行測量。這允許測定如本文定義的本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體(優(yōu)選人類的PSMAxCD3 雙特異性單鏈抗體)的可能毒性。
顯示具有跨物種特異性的如本文定義的本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體 (優(yōu)選人類的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體)的優(yōu)點(diǎn)，可被簡要地概述如下
第一，用于臨床前試驗(yàn)的如本文定義的本發(fā)明的(優(yōu)選人類的)PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體與用于人類患者的抗體是相同的。因此，不再需要開發(fā)在藥代動力學(xué)性質(zhì)以及生物活性上可能不同的2個獨(dú)立分子。這是高度有利的，原因在于，例如相比于傳統(tǒng)替代方法，所述藥代動力學(xué)結(jié)果能夠直接轉(zhuǎn)移和應(yīng)用于人類情況。
第二，與替代方法相比，將如本文定義的本發(fā)明的(優(yōu)選人類的)PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體用于制備人類的治療藥物時，成本和勞動密集度更低。
第三，如本文定義的本發(fā)明的(優(yōu)選人類的)PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體可用于的臨床前試驗(yàn)不僅為在一種靈長類動物物種中，而且在一系列不同的靈長類動物物種中，從而限制了靈長類動物和人類之間潛在的物種差異的風(fēng)險。
第四，如果必需，作為瀕危物種的黑猩猩可避免用于動物試驗(yàn)。
第五，可提取多個血液樣本以用于廣泛的藥物動力學(xué)研究。
第六，由于根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合分子(優(yōu)選人類的結(jié)合分子)的人類來源，當(dāng)給人類患者施用時，產(chǎn)生的對抗所述結(jié)合分子的免疫反應(yīng)被降到最低。排除了誘導(dǎo)出對源自非人類物種的候選藥物特異性的抗體的免疫反應(yīng)，所述非人類物種例如導(dǎo)致出現(xiàn)對抗鼠來源的治療分子的人類抗小鼠抗體(HAMA)的小鼠。
最后但并非最不重要的是，本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的治療用途提供一種新穎、有創(chuàng)造性的用于癌癥的治療方法，所述癌癥優(yōu)選為實(shí)體瘤，更優(yōu)選為癌和前列腺癌。如在下述實(shí)施例中所示的，本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體為殺死表達(dá)PSMA 的人類前列腺癌細(xì)胞提供了有利的工具。再者，本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體的細(xì)胞毒活性要比本領(lǐng)域描述的抗體的活性高。
正如上述指出的，本發(fā)明提供多肽，即，雙特異性單鏈抗體，其包含能夠結(jié)合至人類及非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域以及能夠結(jié)合至PSMA的第二結(jié)合域。所述第二結(jié)合域優(yōu)選地結(jié)合至人類PSMA以及非黑猩猩靈長類動物PSMA。雙特異性單鏈抗體分子作為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選雙特異性單鏈抗體要求的候選藥物，其優(yōu)點(diǎn)是此類分子用于臨床前動物試驗(yàn)以及臨床研究甚至用于人類的治療。在本發(fā)明的跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該結(jié)合至PSMA的第二結(jié)合域是人類的。在根據(jù)本發(fā)明的跨物種特異性的雙特異性分子中，該結(jié)合至人類與 非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的結(jié)合域以VH-VL或VL-VH的次序位于該雙特異性分子的N-端或C-端處。在所述第一和第二結(jié)合域中呈VH-以及VL-鏈不同排列的根據(jù)本發(fā)明的跨物種特異性的雙特異性分子，其實(shí)例描述于所附的實(shí)施例中。
如本文所用的，“雙特異性單鏈抗體”表示包含2個結(jié)合域的單多肽鏈。每個結(jié)合域包含一個來自抗體重鏈(“VH區(qū)域”)的可變區(qū)域，其中，所述第一結(jié)合域的VH區(qū)域特異性地結(jié)合至⑶3 ε分子，所述第二結(jié)合域的VH區(qū)域特異性地結(jié)合至PSMA。2個結(jié)合域任選地由短間隔多肽彼此相連。間隔多肽的非限制性實(shí)例是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS)及其重復(fù)序列。每個結(jié)合域可另外包含一個來自抗體輕鏈(“VL區(qū)域”)的可變區(qū)域，在所述第一和第二結(jié)合域內(nèi)的該VH區(qū)域和VL區(qū)域經(jīng)由連接多肽彼此相連，例如在EP 623679B1中所陳述和要求的類型，但在任何情況下長到足以允許所述第一結(jié)合域的VH區(qū)域和VL區(qū)域以及所述第二結(jié)合域的VH區(qū)域和VL區(qū)域彼此配對，以使得它們能夠一起特異性地結(jié)合至相應(yīng)的第一和第二結(jié)合域。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”是本領(lǐng)域熟知的，并且描述生物化合物。蛋白質(zhì)包括一或多個氨基酸鏈(多肽)，從而氨基酸經(jīng)由肽鍵彼此結(jié)合。如本文所述的，術(shù)語“多肽”描述由超過30個氨基酸組成的分子類別。依據(jù)本發(fā)明，只要蛋白質(zhì)由單鏈多肽組成，則多肽類別包括“蛋白質(zhì)”。此外，符合該定義，術(shù)語“多肽”描述蛋白質(zhì)的片段，只要這些片段由超過30個氨基酸組成即可。多肽可進(jìn)一步形成多聚體，如二聚體、三聚體和較高級的寡聚物(即，由一個以上的多肽分子組成)。形成此類二聚體、三聚體等的多肽分子可以是相同的或不同的。此類多聚體的對應(yīng)的高階結(jié)構(gòu)相應(yīng)稱為同源-或異源二聚體、同源-或異源三聚體等。異源多聚體的實(shí)例是抗體分子，其自然發(fā)生形式由2條相同的輕多肽鏈和2條相同的重多肽鏈組成。 術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”也指經(jīng)天然修飾的多肽/蛋白質(zhì)，其中所述修飾通過如翻譯后修飾(例如糖基化、乙?；?、磷酸化等等)進(jìn)行。此類修飾是本領(lǐng)域熟知的。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“結(jié)合域”表征多肽的特異性地結(jié)合至/相互作用于給定靶標(biāo)結(jié)構(gòu)/抗原/表位的結(jié)構(gòu)域。因此，該結(jié)合域是“抗原相互作用位點(diǎn)”。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗原相互作用位點(diǎn)”定義多肽的基序，該基序能夠特異性地與特定抗原或特異抗原組(例如， 在不同物種中的相同抗原)相互作用。所述結(jié)合/相互作用也理解為定義“特異性識別”。 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“特異性地識別”指抗體分子能夠特異性地相互作用于和/或結(jié)合至抗原的至少2個氨基酸，優(yōu)選至少3個氨基酸，更優(yōu)選至少4個氨基酸，例如如本文定義的人類 CD3抗原。此類結(jié)合可以“鎖鑰原理”的特異性為例。因此，在結(jié)合域的氨基酸序列中的特定基序和抗原彼此結(jié)合，以形成它們的一級、二級或三級結(jié)構(gòu)以及導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)的二級修飾。 抗原相互作用位點(diǎn)與其特異性抗原的特異性相互作用也可導(dǎo)致所述位置與抗原的簡單結(jié)合。再者，結(jié)合域/抗原相互作用位點(diǎn)與其特異性抗原的特異性相互作用或者導(dǎo)致信號的啟動，例如，起因于誘到抗原構(gòu)象形的改變、抗原的寡聚合等。與本發(fā)明相符的結(jié)合域的優(yōu)選實(shí)施例是抗體。該結(jié)合域可以是單克隆抗體或多克隆抗體或者源自單克隆抗體或多克隆抗體。
術(shù)語“抗體”包含仍然維持結(jié)合特異性的衍生物或功能性片段。生產(chǎn)抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且描述于，例如Harlow和Lane “Antibodies, ALaboratory Manual，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 ；Harlow 和 Lane “Using Antibodies:A Laboratory Manual，，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1999 以及 Little “Recombinant Antibodies for Immunotherapy，，Cambridge University Press 2009。術(shù)語“抗體”還包括不同類別的免疫球蛋白(Ig’ s)(如，IgA, IgG, IgM, IgD和IgE) 及其亞類(如IgGl、IgG2等)。
術(shù)語“抗體”的定義還包括如嵌合的、單鏈和人源化抗體以及抗體片段(尤其像Fab 片段)的實(shí)施方案?？贵w片段或衍生物進(jìn)一步包括F (ab’)2、Fv、scFv片段或單結(jié)構(gòu)域抗體、單可變結(jié)構(gòu)域抗體或者僅包含一個可變結(jié)構(gòu)域(可以是特異性地結(jié)合至抗原或表位而無關(guān)其它V區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的VH或VL)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；參見，例如，Harlow和 Lane (1988)與(1999)以及Little (2009)，上述引用文。所述免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域不僅包括經(jīng)分離的抗體單可變結(jié)構(gòu)域多肽，而且包括含有抗體單可變結(jié)構(gòu)域多肽序列的一個或多個單體的較大多肽。
各種操作程序是本領(lǐng)域已知的，并且可被用于生產(chǎn)此類抗體和/或片段。因此，所述(抗體)衍生物也可通過模擬肽生產(chǎn)。進(jìn)一步地，所述生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(尤其是參見美國專利4，946，778)可適用于生產(chǎn)對選定多肽具有特異性的單鏈抗體。此外，轉(zhuǎn)基因動物可被用于表達(dá)對本發(fā)明的多肽和融合蛋白質(zhì)特異性的人源化或人類抗體。為了制備單克隆抗體，可以使用提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體的任何技術(shù)。這類技術(shù)的實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(KiihledB Milstein Nature 256 (1975)，495-497)、三體瘤技術(shù)、人類 B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor, Immunology Today 4 (1983)，72)以及生產(chǎn)人類單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.(1985)，77-96)。如用于BIAcore系統(tǒng)的表面等離子體共振可被用于增加結(jié)合至靶標(biāo)多肽 (如CD3 ε或PSMA)的表位的卩遼菌體抗體的效率(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7(1996), 97-105 ；Malmborg, J.1mmunol. Methods 183 (1995)，7-13)。還可以設(shè)想，在本發(fā)明上下文中術(shù)語“抗體”包括可在如下文所述的宿主中表達(dá)的抗體構(gòu)建體，例如，可經(jīng)由尤其是病毒或質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體構(gòu)建體。
如根據(jù)本發(fā)明所用的術(shù)語“特異性相互作用”指結(jié)合域不或不顯著地與多肽交叉反應(yīng)，所述多肽具有與被結(jié)合域結(jié)合的那些多肽類似的結(jié)構(gòu)并且由與目標(biāo)多肽相同的細(xì)胞表達(dá)?？梢詼y試處于調(diào)查中的一組結(jié)合域的交叉反應(yīng)，例如通過評估在常規(guī)條件下所述組結(jié)合域的結(jié)合(參見，例如，Harlow和Lane (1988)與(1999)以及Little (2009)，上述引用文。結(jié)合域與特異性抗原的特異性相互作用的實(shí)例包括配體對其受體的特異性。所述定義特別包括配體的相互作用，在結(jié)合至其特異性受體時配體誘發(fā)信號。所述定義還特別包括的所述相互作用的實(shí)例，為抗原決定簇(表位)與抗體的結(jié)合域(抗原結(jié)合位點(diǎn))的相互作用。
如本文所用的術(shù)語“跨物種特異性”或“物種間特異性”指本文描述的結(jié)合域與人類以及非黑猩猩靈長類動物中的相同靶標(biāo)分子結(jié)合。因此，“跨物種特異性”或“物種間特異性”被理解為對在不同物種中表達(dá)的相同分子“X”而非對非“X”的分子的物種間反應(yīng)性。例如，可通過FACS分析測定識別例如人類⑶3 ε的單克隆抗體對非黑猩猩靈長類動物⑶3 ε (例如獼猴CD3 ε )的跨物種特異性。所述FACS分析以下述方式進(jìn)行測試各個單克隆抗體與分別表達(dá)所述人類和非黑猩猩靈長類動物CD3 ε抗原的人類和非黑猩猩靈長類動物細(xì)胞(例如，獼猴細(xì)胞)的結(jié)合。適當(dāng)?shù)姆治鰧⑹居谙旅娴膶?shí)施例中。上面所提及的主題物比照應(yīng)用于PSMA抗原例如，可通過FACS分析測定識別例如人類PSMA的單克隆抗體對非黑猩猩靈長類動物PSMA (例如獼猴PSMA)的跨物種特異性。所述FACS分析以下述方式進(jìn)行 測試各個單克隆抗體與分別表達(dá)所述人類和非黑猩猩靈長類動物PSMA抗原的人類和非黑猩猩靈長 類動物細(xì)胞(例如，獼猴細(xì)胞)的結(jié)合。
如本文所用的，⑶3 ε代表作為T細(xì)胞受體的一部分表達(dá)的分子并且具有如通常將其歸屬在現(xiàn)有技術(shù)中的含義。在人類，它包括個別的或獨(dú)立地組合形式的所有已知的CD3 亞基，例如，⑶3 ε、⑶3δ、⑶3γ、⑶3ζ、⑶3 α和⑶3 β。如本文所指的非黑猩猩靈長類動物的非人類CD3抗原是例如馬來猴CD3以及恒河獼猴CD3。在馬來猴中，它包括CD3 ε FN-18 陰性和⑶3 ε FN-18陽性、⑶3 Y以及⑶3 δ。在恒河獼猴中，它包括⑶3 ε、⑶3 Y以及 ⑶3 δ。優(yōu)選地，如本文所用的所述⑶3是⑶3 ε。
人類CD3 ε顯示于GenBank登錄號ΝΜ_000733并且包含SEQ ID NO.1。人類CD3 Y 顯示于GenBank登錄號ΝΜ_000073。人類CD3 δ顯示于GenBank登錄號ΝΜ_000732。
馬來猴的⑶3 ε “FN-18陰性”(即，因?yàn)槿缟厦嫠岬降亩鄳B(tài)性而不被單克隆抗體FN-18識別的CD3 ε )被顯示在GenBank登錄號ΑΒ073994。
馬來猴的⑶3 ε “FN-18陽性”(即，被單克隆抗體FN-18識別的⑶3 ε )顯示于 GenBank登錄號ΑΒ073993。馬來猴的CD3 Y顯示于GenBank登錄號ΑΒ073992。馬來猴的 □)3δ 顯示于 GenBank 登錄號 ΑΒ073991。
恒河獼猴的各個⑶3 ε、Y以及δ同源物的核酸序列以及氨基酸序列可通過本領(lǐng)域描述的重組技術(shù)(Sambrook等人Molecular Cloning: A LaboratoryManual; Cold SpringHarbor Laboratory Press, 3rd edition 2001)進(jìn)行鑒定和分離。這比照適用于如本文定義的其他非黑猩猩靈長類動物的CD3e、Y和δ同源物。白鬢狨、松鼠猴以及絨頂檉柳猴的氨基酸序列的鑒定描述于所附的實(shí)施例中。白鬢狨的CD3e胞外域的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO: 3，絨頂檉柳猴的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 5，松鼠猴的氨基酸序列顯示于 SEQID NO:7。
人類PSMA顯示于GenBank登錄號’AY101595’。獼猴的PSMA同源物的克隆描述于下列的實(shí)施例中，對應(yīng)的cDNA和氨基酸序列分別顯示于SEQID NO. 223以及SEQ ID NO. 224。
與上面一致地，術(shù)語“表位”定義由如本文定義的結(jié)合域特異性地結(jié)合/鑒定的抗原決定簇。該結(jié)合域可特異性地結(jié)合至/相互作用于構(gòu)象或連續(xù)的表位，所述表位對于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)是特有的，例如人類和非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈或者人類和非黑猩猩靈長類動物PSMA。多肽抗原的構(gòu)象或不連續(xù)表位的特征在于存在2個或更多個在一級序列中分開的離散的氨基酸殘基，當(dāng)該多肽折疊成天然蛋白質(zhì)/抗原時，所述殘基在該分子的表面上聚在一起(Sela, (1969) Science 166，1365 和 Laver, (1990) Cell 61,553-6)。促成所述表位的2個或更多個離散的氨基酸殘基存在于一個或多個多肽鏈的分離部分。當(dāng)所述多肽鏈折疊成3維結(jié)構(gòu)以構(gòu)成該表位時，這些殘基在該分子的表面上聚在一起。相比之下，連續(xù)或線性表位由2個或更多個離散的氨基酸殘基組成，該氨基酸殘基存在于多肽鏈的單一線性區(qū)段。在本發(fā)明中，“環(huán)境依賴的”CD3表位指所述表位的構(gòu)象。此位于CD3的ε鏈的環(huán)境依賴表位，若它被嵌在ε鏈的其余部分內(nèi)并通過ε鏈與CD3Y或δ鏈的異二聚體化而被保持在正確位置時，僅發(fā)展它的正確構(gòu)象。相比之下，如本文提供的環(huán)境獨(dú)立的CD3表位指 CD3 ε的N-端1-27個氨基酸殘基多肽或其功能性片段。在將此N-端1_27個氨基酸殘基多肽或其功能性片段從其在CD3復(fù)合物的天然環(huán)境中取出時，維持其3維結(jié)構(gòu)完整性和正確的構(gòu)象。因此，該N-端1-27個氨基酸殘基多肽或其功能性片段(作為CD3e胞外域的一部分)的環(huán)境獨(dú)立性提供了完全不同于在WO 2004/10 6380中結(jié)合用于制備人類結(jié)合分子的方法描述的CD3e的表位。所述方法采用單獨(dú)表達(dá)的重組CD3e。這個單獨(dú)表達(dá)的重組 CD3 ε的構(gòu)象不同于在其天然形式下采取的構(gòu)象，所述天然形式即TCR/CD3復(fù)合物的CD3 ε 亞基作為TCR/⑶3復(fù)合物的⑶3 δ或⑶3- Y亞基的非共價復(fù)合物一部分存在的形式。當(dāng)此單獨(dú)表達(dá)的重組CD3 ε蛋白用作用于選擇來自抗體文庫的抗體的抗原時，對該抗原特異性的抗體從該文庫中被識別出來，雖然此文庫不含具有對自身抗原/自體抗原特異性的抗體。這是由于以下事實(shí)單獨(dú)表達(dá)的重組CD3 ε蛋白質(zhì)不在體內(nèi)存在；它不是自體抗原。因此，表達(dá)對這個蛋白質(zhì)特異性的抗體的B細(xì)胞亞群在體內(nèi)沒有被耗竭；從該類B細(xì)胞構(gòu)建的抗體文庫將含有對單獨(dú)表達(dá)的重組CD3 ε蛋白特異性的抗體的遺傳材料。
然而，由于該環(huán)境獨(dú)立的N-端1-27個氨基酸殘基多肽或其功能性片段是以其天然形式折疊的表位，與本發(fā)明一致的結(jié)合域不能通過基于在W02004/106380中描述的手段的方法進(jìn)行鑒定。因此，可能會在測試中證實(shí)，如公開于WO 2004/106380的結(jié)合分子不能結(jié)合至⑶3 ε鏈的N-端1-27個氨基酸殘基。因此，傳統(tǒng)的抗-⑶3結(jié)合分子或抗-⑶3 抗體分子(例如，如公開于WO 99/54440中)相比于本文提供的環(huán)境獨(dú)立的N-端1_27個氨基酸殘基多肽或功能性片段，在更靠近C-端的位置處結(jié)合CD3e鏈?，F(xiàn)有技術(shù)中的抗體分子0KT3和UCHT-1也對TCR/⑶3復(fù)合物的在氨基酸殘基35至85的ε -亞基具有特異性，并且這些抗體的表位也更靠近C-端。此外，UCHT-1結(jié)合的CD3 ε鏈位于氨基酸殘基 43 至 77 的區(qū)域(Tunnacliffe, Int.1mmunol.1 (1989), 546-50 ;Kjer_Nielsen, PNAS 101，(2004), 7675-7680 ； Salmeron, J.1mmunol. 147 (1991)，3047-52)。因此，現(xiàn)有技術(shù)的抗-CD3分子沒有結(jié)合至并且沒有指向?qū)贡疚亩x的環(huán)境獨(dú)立的N-端1-27個氨基酸殘基表位(或其功能性片段)。特別地，本領(lǐng)域的技術(shù)狀態(tài)無法提供特異性結(jié)合至環(huán)境獨(dú)立的 N-端1-27個氨基酸殘基表位并且是跨物種特異性(即，結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物 CD3 ε )的抗-CD3分子。
為了產(chǎn)生包含于本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的結(jié)合域(優(yōu)選人類的結(jié)合域)， 可使用例如結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物CD3 ε (例如獼猴CD3 ε )的單克隆抗體或者結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物PSMA的單克隆抗體。
如本文所用的，“人類(human)”以及“人”(man)指物種智人。就本文描述的構(gòu)建體的醫(yī)學(xué)用途而言，人類患者用相同的分子進(jìn)行治療。
優(yōu)選地，所述本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體的第一或第二結(jié)合域的至少一者是 CDR-移植的、人源化的或人類的。優(yōu)選地，所述本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體的第一以及第二結(jié)合域是CDR-移植的、人源化的或人類的。
如本文所用的，術(shù)語“人類”抗體被理解意為如本文定義的雙特異性單鏈抗體包括人類生殖細(xì)胞系抗體譜所含有的氨基酸序列。出于本文定義的目的，如果雙特異性單鏈抗體由此類人類生殖細(xì)胞系氨基酸序列組成的話，即，若要考慮的雙特異性單鏈抗體的氨基酸序列與表達(dá)的人類生殖細(xì)胞系氨基酸序列相同的話，所述雙特異性單鏈抗體可因此被視為人類的。如果如本文定義的雙特異性單鏈抗體由偏離它的(它們的)最親近的人類生殖細(xì)胞系序列的序列不超過預(yù)期(由體細(xì)胞超突變的印記導(dǎo)致的)的序列組成，所述雙特異性單鏈抗體也可被視為人類的。此外，許多非人類哺乳動物(例如嚙齒類動物，如小鼠和大鼠)的抗體包含其中一個可預(yù)期也存在于表達(dá)的人類抗體譜的VH⑶R3氨基酸序列。出于本發(fā)明的目的，可預(yù)期存在于表達(dá)的人類譜的人類或非人類來源的任何此類序列也被視為 “人類的”。
如本文所用的，術(shù)語“人源化的”、“人源化”、“類人的”或其語法上相關(guān)的變體可在涉及雙特異性單鏈抗體時被互換使用，該雙特異性單鏈抗體包含在其至少一個結(jié)合域中的至少一個互補(bǔ)決定區(qū)(“CDR”)，所述CDR來自非人類抗體或其片段。人源化手段描述于例如WO 91/09968和US6，407, 213中。作為非限制性實(shí)例，該術(shù)語包括以下情況其中至少一個結(jié)合域的可變區(qū)包括來自另一非人類動物(如嚙齒類動物)的單CDR區(qū)域，例如VH的第三 ⑶R區(qū)域(⑶RH3);以及以下情況其中可變區(qū)之一或二者在其相應(yīng)的第一、第二和第三⑶R 中的每一個處都包含來自所述非人類動物的CDR。在該雙特異性單鏈抗體的結(jié)合域的所有 CDR已由來自例如嚙齒類動物的相應(yīng)等價物替換時，典型地叫法為“CDR-移植”，并且這個術(shù)語被理解為由如本文所用的術(shù)語“人源化的”或其語法上相關(guān)的變體包括。術(shù)語“人源化的”或其語法上相關(guān)的變體還包含以下情況其中除了在該第一和/或第二結(jié)合域的VH和 /或VL內(nèi)替換一個或多個⑶R區(qū)域之外，還在⑶R之間的框架(“FR”)區(qū)域內(nèi)已產(chǎn)生至少一個單一氨基酸殘基的進(jìn)一步突變(例如替換)，使得在那個/那些位置處的氨基酸對應(yīng)于在動物(用于替換的CDR區(qū)域源自所述動物)的那個/那些位置處的氨基酸。如本領(lǐng)域已知的，為了恢復(fù)用作其靶標(biāo)分子的CDR-供體的非人類抗體的初始結(jié)合親合力，經(jīng)常在CDR-移植后在框架區(qū)域內(nèi)進(jìn)行此類個別突變。除了上述的框架區(qū)域中的氨基酸替換外，術(shù)語“人源化的”可進(jìn)一步包括將來自非人類動物的CDR區(qū)域的氨基酸替換成來自人類抗體的對應(yīng)的 CDR區(qū)域的氨基酸的氨基酸替換。
如本文所用的，術(shù)語“同源物”或“同源”應(yīng)被理解為如下在蛋白質(zhì)和DNA之間的同源性經(jīng)常根據(jù)序列相似性而被斷定，特別是在生物信息學(xué)中。例如，一般而言，若2個或更多個基因具有高度相似的DNA序列，則它們很可能是同源的。但是序列相似性可從不同的祖先產(chǎn)生短序列的相似可能是偶然的，而且序列相似可能是因?yàn)檫@兩者均被選擇結(jié)合至特定蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)錄因子。這樣的序列是相似的，但沒有同源性。同源的序列區(qū)域也被稱為保守的。這不與氨基酸序列的保守相混淆，在后者情況下，特定位置處的氨基酸已改變但氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)保持不變。同源的序列有2種類型直系同源和旁系同源。如果同源的序列因?yàn)槲锓N形成事件而被分開，則它們是直系同源的當(dāng)物種分化成2個分開的物種時，在所形成的物種中的單一基因的分化副本被稱為是直系同源的。直系同源物或直系同源基因是彼此相似的不同物種中的基因，因?yàn)樗鼈冊醋韵嗤淖嫦取?個相似的基因是直系同源的最有力的證據(jù)是基因譜系的系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果。在一個進(jìn)化枝內(nèi)發(fā)現(xiàn)的基因是直系同源物，來自相同的祖先。直系同源物經(jīng)常、但非總是具有相同的功能。直系同源序列給生物體的分類學(xué)分類研究提供有用的信息。遺傳分化的圖譜可用于追蹤生物體的關(guān)系。關(guān)系非常接近的2個生物體在2個直系同源物之間可能顯示非常相似的DNA序列。相比之下，在進(jìn)化上從另一個生物體進(jìn)一步進(jìn)化的生物體可能在研究的直系同源物的序列上顯示出較大分化。如果同源的序列因?yàn)榛驈?fù)制事件而被分開，則它們是旁系同源的若生物體的基因被復(fù)制到占據(jù)相同基因組的2個不同的位置，那么這2個拷貝是旁系同源的。 旁系同源的一組序列稱為互相為旁系同源物。旁系同源物通常具有相同或相似的功能，但有時候則不是這樣由于在重復(fù)基因的一個拷貝上缺乏初始的篩選壓力，因此這個拷貝自由突變并且獲得新功能。實(shí)例可見于嚙齒類動物(如大鼠和小鼠)。嚙齒類動物具有一對旁系同源的胰島素基因，雖然不清楚是否已發(fā)生功能上的任何分化。旁系同 源基因常常屬于相同物種，但這不是必需的例如，人類的血紅蛋白基因與黑猩猩的肌紅蛋白基因是旁系同源物。這在生物信息學(xué)上是一個常見的問題當(dāng)已測序不同物種的基因組并且已發(fā)現(xiàn)同源基因時，不能立即推斷這些基因具有相同或相似的功能，因?yàn)樗鼈兛赡苁枪δ芤逊只呐韵低次铩?br> 如本文所用的，“非黑猩猩靈長類動物(non-chimpanzee primate或non-chimp primate)”或其語法上的變體是指不是黑猩猩的任何靈長類動物(B卩，非人類)(B卩，不是屬于黑猩猩屬的動物)，并且包括侏儒黑猩猩(Panpaniscus)以及黑猩猩(Pan troglodytes) (也被稱為 Anthropopithecus troglodytes 或猩猩(Simia satyrus)物種。然而,將被理解的是本發(fā)明的抗體還可以以它們的第一和/或第二結(jié)合域結(jié)合至所述黑猩猩的相應(yīng)表位/片段等。如果需要，本發(fā)明僅避免用黑猩猩實(shí)施的動物試驗(yàn)。因此在另一個實(shí)施方案中，還設(shè)想的是本發(fā)明的抗體還可以以其第一和/或第二結(jié)合域結(jié)合至黑猩猩的相應(yīng)表位。“靈長類動物(primate或primates”、“靈長類動物物種(primatespecies)”或其語法上的變體代表被分成原猴類和類人猿類的2個亞目的真哺乳亞綱哺乳動物的一目，并且包括猿、猴以及狐猴。特別地，如本文使用的“靈長類動物”包括原猴亞目(非眼鏡猴原猴)，包括下目Lemuriformes (它本身包括超科鼠狐猴以及狐猴)、下目Chiromyiformes (它本身包括猴科)以及下目LOTisifOTmes (它本身包括懶猴和嬰猴科)。如本文使用的“靈長類動物” 還包括簡鼻亞目，包括下目Tarsiiformes (它本身包括眼鏡猴科)、下目Simiiformes (它本身包括廣鼻類或新世界猴以及狹鼻類，狹鼻類包括猴科或舊世界猴)。
在本發(fā)明的含義內(nèi)，非黑猩猩靈長類動物物種可被理解為是狐猴、眼鏡猴、長臂猴、一絨猿(屬于卷尾猴科的新世界猴)或舊世界猴(屬于猴超科)。
如本文所用的，“舊世界猴”包括任何落在 猴超科內(nèi)的猴子，猴超科本身被細(xì)分成 猴亞科，主要是非洲屬但包括亞洲和北非的獼猴的分化屬；和疣猴亞科，它包括大部分的亞洲屬和非洲疣猴。
特別地，在猴亞科內(nèi)，有益的非黑猩猩靈長類動物可來自TribeCercopithecini， 在短肢猴屬(genus Allenopithecus)(菲氏葉猴(Allen’s SwampMonkey),短肢猴(Allenopithecus nigroviridis))內(nèi)；在侏長尾猴屬(genusMiopithecus)(侏長尾猴(Angolan Talapoin),侏長尾猴(Miopithecus talapoin);加蓬侏長尾猴 (Gabon Talapoin)，加蓬侏長尾猴(Miopithecus ogouensis))內(nèi)；在赤猴屬(genus Erythrocebus)(赤猴(Patas Monkey)，赤猴(Erythrocebuspatas))內(nèi)；在綠猴屬 (genus Chlorocebus)(綠猴(Green Monkey),綠猴(Chlorocebus sabaceus)；素領(lǐng)猴(Grivet)，綠猴(Chlorocebus aethiops);貝爾山綠猴(Bale Mountains Vervet)， 貝爾山綠猴(Chlorocebusdjamdjamensis);坦塔夢斯綠猴(Tantalus Monkey), 坦塔夢斯綠猴(Chlorocebus tantalus);黑長尾猴(Vervet Monkey),黑長尾猴 (Chlorocebuspygerythrus);布魯克綠猴(Malbrouck)，布魯克綠猴(Chlorocebus cynosures)]內(nèi)；或者在長尾猴屬(genus Cercopithecus)(德賴斯長尾猴(Dryas Monkey) 或 Salongo Monkey，德賴斯長尾猴(Cercopithecus dryas);黛安娜長尾(DianaMonkey)， 黛安娜長尾(Cercopithecus diana)；加納長尾猴(Roloway Monkey),羅洛威須長尾猴(Cercopithecus roloway)；大白鼻猴(Greater Spot-nosedMonkey)，大白鼻長尾猴 (Cercopithecus nictitans);藍(lán)猴(Blue Monkey),青長尾猴(Cercopithecus mitis)； 銀長尾猴(Silver Monkey),銀長尾猴(Cercopithecus doggetti)；金長尾猴(Golden Monkey)，金長尾猴(Cercopithecus kandti);賽克斯猴(Sykes’ s Monkey),白喉長尾猴(Cercopithecus albogularis);摩那猴(Mona Monkey),白額長尾猴(Cercopithecus mona);坎氏摩那猴(Campbell，s Mona Monkey)，坎氏長尾猴(Cercopithecus campbelli)； 洛氏摩那猴(Lowe’s Mona Monkey)，洛氏長尾猴(Cercopithecus Iowei);冠毛長尾猴 (Crested Mona Monkey)，冠毛長尾猴(Cercopithecus pogonias);狼莫納猴(Wolf ' s Mona Monkey)，郞氏長尾猴(Cercopithecus wolfi);丹氏長尾猴(Dent，s Mona Monkey), 丹氏長尾猴(Cercopithecus denti);小白鼻長尾猴(Lesser Spot-nosed Monkey)，小白鼻長尾猴(Cercopithecus petaurista)；白領(lǐng)青長尾猴(White-throatedGuenon)，赤腹長尾猴(Cercopithecus erythrogaster)，斯氏長尾猴(Sclater，sGuenon),斯氏長尾猴 (Cercopithecus sclateri );紅耳長尾猴(Red-earedGuenon)，紅耳長尾猴(Cercopithecus erythrotis);髭長尾猴(MoustachedGuenon)，髭長尾猴(Cercopithecus cephus);紅尾長尾猴(Red-tailed Monkey)，紅尾長尾猴(Cercopithecus ascanius);爾氏長尾猴 (L，Hoesti s Monkey),爾氏長尾猴(Cercopithecus Ihoesti );高山長尾猴(Preuss，s Monkey),高山長尾猴(Cercopithecus preussi);陽光長尾猴(Sun-tailed Monkey),陽光長尾猴(Cercopithecus solatus);哈姆林氏猴(Hamlyn，s Monkey)或楽面猴(Owl-faced Monkey)，楽面長尾猴(Cercopithecus hamlyni);德氏長尾猴(DeBrazza，s Monkey),白臀長尾猴(Cercopithecus neglectus))內(nèi)。
或者，有益的非黑猩猩靈長類動物(也在猴亞科以及在Tribe Papionini內(nèi))可來自在稱猴屬(genus Macaca)(巴巴利稱猴(Barbary Macaque)，巴巴利稱猴(Macaca sylvanus)；獅尾猴(Lion-tailed Macaque)，獅尾猴(Macacasilenus);南方豚尾稱猴 (Southern Pig-tailed Macaque)或豚尾稱猴(Beruk)，豚尾稱猴(Macaca nemestrina);北方豚尾猴(Northern Pig-tailed Macaque)，北方豚尾稱猴(Macaca leonina);明打威稱猴 (Pagai Island Macaque)或明打威稱猴(Bokkoi)，明打威稱猴(Macaca pagensis);西比路島稱猴(SiberutMacaque)，西比路島稱猴(Macaca siberu);摩爾稱猴(Moor Macaque)，摩爾稱猴(Macaca maura)；穿靴稱猴(Booted Macaque)，穿靴稱猴(Macacaochreata);通金稱猴(Tonkean Macaque)，通金稱猴(Macaca tonkeana);黑克稱猴(Heck，s Macaque)，黑克稱猴(Macaca hecki);淺黑稱猴(GorontaloMacaque)，淺黑稱猴(Macaca ni griscens);黑冠稱猴(Celebes CrestedMacaque)或黑〃猴〃 (Black〃Ape〃)，黑冠稱猴(Macaca nigra);石蟹稱猴或食蟹猴(Crab-eating Macaque)或長尾猴(Lo ng-tailed Macaque)或猴(Kera)，馬來猴(Macaca fascicularis);短尾猴(Stump-tailed Macaque)或短尾猴(BearMacaque)， 短尾猴(Macaca arctoides);恒河稱猴(Rhesus Macaque)，稱猴(Macaque)；臺灣稱猴 (Formosan Rock Macaque)，臺灣稱猴(Macacacyclopis);日本稱猴(Japanese Macaque)， 日本稱猴(Macaca fuscata);斯里蘭卡猴(Toque Macaque)，斯里蘭卡猴(Macaca sinica)； 綺帽稱猴(BonnetMacaque)，冠毛稱猴(Macaca radiata)；巴巴利稱猴(Barbary Macaque)， 巴巴利稱猴(Macaca sylvanmus) ^^^(Assam Macaque)，熊猴(Macacaassamensis);藏稱猴(Tibetan Macaque)或藏稱猴(Milne-Edwards，Macaque)，藏稱猴(Macaca thibetana)； 阿魯納卡稱猴(Arunachal Macaque)或阿魯納卡稱猴(Munzala)，阿魯納卡稱猴(Macaca munzala))內(nèi)；在白臉猴屬(genusLophocebus)(白頰白眉猴(Gray-cheeked Mangabey)，白顆白眉猴(Lophocebusalbigena) ;Lophocebus albigena albigena ；Lophocebus albigena osmani ； Lophocebus albigena johnstoni ;黑毛白眉猴(Black Crested Mangabey),黑毛白眉猴(Lophocebus aterrimus) ^pdenboschis Mangabey， Lophocebusopdnboschi ； 高地白瞼猴(Highland Mangabey)，高地白瞼猴(Lophocebuskipunji))內(nèi)；在狒狒屬 (genus Papio)(阿拉伯狒狒(Hamadryas Baboon)，阿拉伯狒狒(Papio hamadryas);幾內(nèi)亞狒狒(Guinea Baboon)，幾內(nèi)亞狒狒(Papio papio);綠狒狒(Olive Baboon)，獵神狒狒(Papio Anubis);黃狒狒(Yellow Baboon)，草原狒狒(Papio cynocephalus);南非大狒(ChacmaBaboon)，豚尾狒狒(Papio ursinus))內(nèi)；在獅尾狒屬(genus Theropithecus) (獅尾狒(Gelada)，獅尾狒(Theropithecus gelada))內(nèi);在白眉猴屬(genusCercocebus) (烏黑白眉猴(Sooty Mangabey),白頂白眉猴(Cercocebus atys) ；Cercocebus atys atys ；Cercocebus atys Iunulatus ;白領(lǐng)白眼瞼猴(CollaredMangabey)，白領(lǐng)白眼瞼猴 (Cercocebus torquatus);敏白眉猴(AgileMangabey)，敏白眉猴(Cercocebus agilis)； 金腹白眉猴(Golden-belIiedMangabey)，金腹白眉猴(Cercocebus chrysogaster), 塔納河白眉猴(Tana RiverMangabey),冠毛白眉猴(Cercocebus galeritus)；測、 氏白瞼猴(SanjeMangabey)，測、氏白瞼猴(Cercocebus sanjei))內(nèi)；或者在山魈屬(genusMandriIIus)(山魁(Mandrill)，山魁(Mandrillus sphinx);鬼狒(Drill)，鬼狒 (Mandrillus Ieucophaeus))內(nèi)。
最優(yōu)選的是馬來猴(也被稱為石蟹獼猴，因此，在實(shí)施例中被命名為“石蟹猴”)以及恒河獼猴(恒河猴，被命名為“羅猴”)。
在疣猴亞科內(nèi)，有益的非黑猩猩靈長類動物可來自于非洲族群，在疣猴屬 (genus Colobus)(黑撫猴(Black Colobus),黑撫猴(Colobus satanas);安哥拉撫猴(Angola Colobus)，安哥拉撫猴(Colobus angolensis)；黑白撫猴(King Colobus)， 黑白撫猴(Colobus polykomos);花斑撫猴(UrsineColobus)，花斑撫猴(Colobus vellerosus);東黑白撫猴(Mantled Guereza),東黑白撫猴(Colobus guereza))內(nèi)； 在紅撫猴屬(genus Piliocolobus)(西方紅撫猴(Western Red Colobus),西方紅撫猴(Piliocolobus badius) ；PiIiocolobus badius badius ；PiIiocolobus badius temminckii ;紅色殘余部分猿(Piliocolobus badius waldronae);東方紅撫(Pennant，s Colobus)，東方紅撫(Piliocolobus pennantii) ；Piliocolobus pennantii pennantii ； 尼日爾三角洲紅色撫猴(Piliocolobus pennantii epieni) ;Pi I iocolobus pennantii bouvieri ;普氏紅撫猴(Preuss’s Red Colobus)，普氏紅撫猴(Piliocolobus preussi)； Thollon’sRed Colobus, Piliocolobus tholloni ;中非紅撫猴(Central African Red Colobus),中非紅撫猴(Piliocolobus foai) ；Piliocolobus foai foai ；Piliocolobus foai ellioti ；Piliocolobus foai oustaleti ；Piliocolobus foai semlikiensis ； Piliocolobus foaiparmentierorum ;烏干達(dá)紅撫猴(Ugandan Red Colobus)，烏干達(dá)紅撫猴(Piliocolobus tephrosceles) ；Uzyngwa Red Colobus, Piliocolobus gordonorum ;桑給巴爾紅撫猴(Zanzibar Red Colobus)，桑給巴爾紅撫猴(Piliocolobuskirkii );塔那河紅撫猴(Tana River Red Colobus)，塔那河紅撫猴(Piliocolobusrufomitratus))內(nèi)；或在綠撫猴屬(genus Procolobus)(綠撫 猴(Olive Colobus)，綠撫猴(Procolobus verus)) 內(nèi)。
在疣猴亞科內(nèi)，有益的非黑猩猩靈長類動物可或者來自葉猴(Langur)(葉猴(leaf monkey))族群，在長尾葉猴屬(genus Semnopithecus)內(nèi)(尼泊爾長尾葉猴(Nepal Gray Langur),喜山長尾葉猴(Semnopithecusschistaceus);嘻什米爾長尾葉猴(Kashmir Gray Langur),嘻什米爾長尾葉猴(Semnopithecus ajax)；達(dá)頓灰葉猴(Tarai Gray Langur),達(dá)頓灰葉猴(Semnopithecus hector)，哈努曼葉猴 (Northern Plains Gray Langur)，哈努曼葉猴(Semnopithecus entellus);黑足長尾葉猴(Black-footed Gray Langur),黑足長尾葉猴(Semnopithecus hypoleucos);南平原灰葉猴(Southern PlainsGray Langur),南平原灰葉猴(Semnopithecus dussumieri)； (Tufted GrayLangur)，毛冠灰葉猴(Semnopithecus priam))內(nèi)；在紫臉葉猴(T. vetulus) 族群或?yàn)跞~猴屬(genus Trachypithecus)(紫臉葉猴(Purple-faced Langur)，紫臉葉猴 (Trachypithecus vetulus);尼爾吉里猴(Nilgiri Langur)，黑烏葉猴(Trachypithecus johnii))內(nèi);在烏葉猴屬(genus Trachypithecus)的銀色烏葉猴(T. cristatus)族群(爪卩圭葉猴(Javan Lutung),烏葉猴(Trachypithecusauratus)；銀葉猴(Silvery Leaf Monkey)或銀葉猴(Silvery Lutung)，銀色烏葉猴(Trachypithecus cristatus)； Indochinese Lutung, Trachypithecusgermaini ;丹那沙林烏葉猴(Tenasserim Lutung),丹那沙林烏葉猴(Trachypithecus barbei))內(nèi)；在烏葉猴屬的郁烏葉猴(T. obscures) 族群(眼鏡食葉猴(Dusky Leaf Monkey)或眼鏡食葉猴(Spectacled Leaf Monkey), 郁烏葉猴(Trachypithecus obscurus);菲氏葉猴(Phayre’s Leaf Monkey),菲氏葉猴 (Trachypithecus phayrei))內(nèi)；在烏葉猴屬的戴帽葉猴(T. pileatus)族群(戴帽葉猴 (Capped Langur),戴帽葉猴(Trachypithecus pileatus);邵力殊葉猴(Shortridge’ s Langur)，邵力殊葉猴(Trachypithecus shortridgei);金葉猴(Gee’s Golden Langur), 金葉猴(Trachypithecus geei))內(nèi)；在烏葉猴屬的黑葉猴(T. francoisi)族群(黑葉猴(Francois’Langur)，黑葉猴(Trachypithecus francoisi);海亭葉猴(Hatinh Langur),海亭葉猴(Trachypithecus hatinhensis)；白頭葉猴(White-headed Langur), 白頭葉猴(Trachypithecus poliocephalus);老挺葉猴(Laotian Langur),老挺葉猴(Trachypithecus laotum);德氏黑葉猴(Delacour，s Langur),德氏黑葉猴 (Trachypithecus delacouri);印支黑烏葉猴(Indochinese Black Langur),印支黑烏葉猴(Trachypithecus ebenus))內(nèi);或者在萊猴屬(genus Presbytis)(蘇門答臘葉猴 (Sumatran Surili)，黑脊葉猴(Presbytis melalophos);印尼葉猴(Banded Surili)，印尼葉猴(Presbytis femoralis);沙勞越葉猴(SarawakSurili)，沙勞越葉猴(Presbytis chrysom elas);白腿葉猴(White-thighed Surili),白腿葉猴(Presbytis siamensis)； 白額葉猴(White-fronted Surili),白額葉猴(Presbytis frontata);爪睡葉猴(Javan Surili),爪卩圭葉猴(Presbytis comata);托馬斯葉猴(Thomas’ s Langur),托馬斯葉猴 (Presbytis thomasi);何氏葉猴(Hose’s Langur)，何氏葉猴(Presbytis hosei);紅葉猴(Maroon Leaf Monkey)，紅葉猴(Presbytis rubicunda);孟他維島長尾葉猴(Mentawai Langur)或白頰葉猴(Joja)，白頰葉猴(Presbytis potenziani);納土納島葉猴(Natuna IslandSurili)，納土納島葉猴(Presbytis natunae))內(nèi)。
在疣猴亞科內(nèi)，有益的非黑猩猩靈長類動物可或者來自仰鼻族群(Odd-Nosed group)，在白臀葉猴屬(genus Pygathrix)(白臀葉猴(Red-shanked Douc)，白臀葉猴 (Pygathrix nemaeus);黑腿白臀葉猴(Black-shanked Douc),黑腿白臀葉猴(Pygathrix nigripes);灰腿白臀葉猴(Gray-shanked Douc),灰腿白臀葉猴(Pygathrix cinerea)) 內(nèi)；在仰鼻猴屬(genus Rhinopithecus)(川金絲猴(Golden Snub-nosed Monkey)，川金絲猴(Rhinopithecus roxellana);潰金絲猴(Black Snub-nosed Monkey)，潰金絲猴 (Rhinopithecus bieti );齡金絲猴(Gray Snub-nosed Monkey)，齡金絲猴(Rhinopithecus brelichi);越南金絲猴(Tonkin Snub-nosed Langur),越南金絲猴(Rhinopithecus avunculus))內(nèi)；在長鼻猴屬(genus Nasalis)(象鼻猴(Proboscis Monkey)，長鼻猴 (Nasalislarvatus))內(nèi)；或者在豚尾葉猴屬(genus Simias)(豚尾葉猴(Pig-tailed Langur)，豚尾葉猴(Simias concolor))內(nèi)。
如此處所用的，術(shù)語“狨猴(marmoset)”代表任何狨屬(genus Callithrix) 的新世界猴，例如屬于狨亞屬(subgenus Callithrix)(原文如此！)(普通狨(Common Marmoset),普通滅(Callithrix (Callithrx) jacchus);黑耳滅猴(Black-tufted Marmoset)，叢尾滅(Callithrix (Callithrix)penicillata);維氏滅(Wied’s Marmoset)， 維氏滅(Callithrix (Callithrix ) kuhlii)；白頭滅(White-headed Marmoset)，白頭滅(Callithrix (Callitrix) geoffroyi)；黃冠滅(Buffy-headed Marmoset)，黃冠滅(Callithrix (Callithrix ) flviceps)，白耳滅(Buffy-tufted Marmoset)，白耳滅(Callithrix (Callithrix) aurita))的大西洋滅猴(Atlantic marmosets)；屬于 Mico 亞屬(里約滅猴(Rio AcariMarmoset)，里約滅猴(Callithrix (Mico) acariensis)； Manicore Marmoset，Callithrix (Mico) manicorensis ;銀毛猴(Silvery Marmoset)，銀毛猴(Callithrix(Mico) argentata);白滅(White Marmoset)，白滅(Callithrix(Mico) leucippe)；艾氏滅(Emilia’s Marmoset)，艾氏滅(Callithrix (Mico) emiliae);黑頭滅(Black-headed Marmoset),黑頭滅(Callithrix (Mico) nigriceps);馬氏滅 (Marca’s Marmoset)，馬氏滅(Callithrix (Mico) marcai)；黑尾滅(Black-tailed Marmoset)，黑尾滅(Callithrix (Mico) melanura)；白肩滅(Santarem Marmoset)，白肩 滅(Callithrix (Mico) humeralifera) ；Maues Marmoset，Callithrix (Mico) mauesi ;黃肢滅(Gold-and-whiteMarmoset)，黃肢滅(Callithrix (Mico) chrysoleuca)； 賀氏 滅(Hershkovitz’sMarmoset)， 賀氏 滅(Callithrix (Mico) intermedia)； SatereMarmosetj Callithrix (Mico) saterei)白勺亞馬遜 可I戎f矣(Amazonian marmosets)；M 于盧氏亞屬(subgenus Callibella)(盧氏倭滅(Callithrix (Callibella) humilis))的 Roosmalensi Dwarf Marmoset ;或者屬于倭滅亞屬(subgenus Cebuella)(倭滅(Callithrix (Cebuella) pygmaea)的侏儒狨猴(Pygmy Marmoset)。
新世界猴的其它屬包括獠狨屬(包括絨頂檉柳猴-族群、絹毛猴族群、黑須檉柳猴族群、長須檉柳猴族群、斑絹猴族群以及烙印檉柳猴族群)的獠狨(tamarins)以及Samiri 屬(即，松鼠猴、紅背松鼠猴、馬河松鼠、亞馬遜松鼠猴、黑松鼠猴)的松鼠猴。
在本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該非黑猩猩靈長類動物是舊世界猴。在該多肽的一個更優(yōu)選實(shí)施方案中，該舊世界猴是狒狒屬獼猴屬的猴子。 最優(yōu)選地，稱猴屬的猴子是熊猴(Assamese macaque)(熊猴(Macaca assamensis))、巴巴利稱猴(Barbary macaque)(巴巴利稱猴(Macaca sylvanus))、綺帽稱猴(Bonnet Macaque) (冠毛稱猴(Macacaradiata))、穿靴(Booted)或蘇拉 威西穿靴稱猴(Sulawes1-Booted macaque)(穿靴稱猴(Macaca ochreata))、蘇拉威西冠猴(Sulawesi crested macaque) (黑冠稱猴(Macaca nigra))、臺灣稱猴(Formosan rock macaque)(臺灣稱猴(Macaca cyclopis))、日本雪稱猴(Japanese snow Macaque)或日本稱猴(Japanese macaque) (日本稱猴(Macaca fuscata))、食蟹猴(Cynomologusmonkey)或食蟹猴(crab-eating macaque)或長尾猴(Long-tailed macaque)或爪卩圭稱猴(Java macaque)(馬來猴(Macaca fascicularis))、獅尾猴(Lion-tailed Macaque)(獅尾猴(Macaca silenus))、豚尾稱猴 (Pigtailedmacaque)(豚尾稱猴(Macaca nemestrina))、恒河稱猴(Rhesus Macaque)(恒河稱猴(Macaca mulatta))、藏稱猴(Tibetan macaque)(藏稱猴(Macacathibetana))、通金稱猴(Tonkean Macaque)(通金稱猴(Macaca tonkeana))、斯里蘭卡猴(Toque macaque) (斯里蘭卡猴(Macaca sinica))、短尾猴(Stump-tailed macaque)或胭脂猴(Red-faced macaque)或短尾猴(Bearmacaque)(短尾猴(Macaca arctoides))或者摩爾稱猴(Moor macaque)(摩爾稱猴(Macaca maurus))。最優(yōu)選地，狒狒屬的猴子是阿拉伯狒狒(Hamadryas Baboon),阿拉伯狒狒(Papio hamadryas);幾內(nèi)亞狒狒(GuineaBaboon)，幾內(nèi)亞狒狒(Papio papio);綠狒狒(Olive Baboon)，獵神狒狒(PapioAnubis);黃狒狒(Yellow Baboon)，草原狒狒(Papio cynocephalus);南非大狒(Chacma Baboon)，豚尾狒狒(Papio ursinus)。
在本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的一個可選擇的優(yōu)選的實(shí)施方案中，該非黑猩猩靈長類動物是新世界猴。在該多肽的一個更優(yōu)選地實(shí)施例中，該新世界猴是狨屬(狨猿)、 獠狨屬或Samiri屬的猴子。最優(yōu)選地，狨屬的猴子是白鬢狨，獠狨屬的猴子是絨頂檉柳猴以及Samiri屬的猴子是松鼠猴。
如本文所用的，術(shù)語“細(xì)胞表面抗原”是指展示在細(xì)胞表面上的分子。在大多數(shù)情況下，這個分子將位于細(xì)胞的原生質(zhì)膜中或其上，使得這個分子的至少一部分以三級結(jié)構(gòu)的形式保持從細(xì)胞外可接觸。位于原生質(zhì)膜中的細(xì)胞表面分子的非限制性的實(shí)例是其三級構(gòu)象包括親水性和疏水性區(qū)域的跨膜蛋白。這里，至少一個疏水性區(qū)域容許該細(xì)胞表面分子嵌入或者插入細(xì)胞的疏水性原生質(zhì)膜中，而親水性區(qū)域在原生質(zhì)膜的任一側(cè)分別延伸至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外隙中。位于原生質(zhì)膜上的細(xì)胞表面分子的非限制性實(shí)例是以下蛋白所述蛋白在半胱氨酸殘基處被修飾以帶有棕櫚?；?、在C-端半胱氨酸殘基處被修飾以帶有法尼基或者在C-端被修飾以帶有糖基磷脂酰肌醇(“GPI”)錨。這些基團(tuán)容許蛋白質(zhì)共價連接至原生質(zhì)膜的外表面，在此處它們保持可以被外細(xì)胞分子(例如抗體)識別。細(xì)胞表面抗原的實(shí)例是CD3e和PSMA。如上述的，PSMA是細(xì)胞表面抗原，是用于治療癌癥(包括但不限于實(shí)體瘤，優(yōu)選癌和前列腺癌)的靶標(biāo)。
鑒于此，PSMA也可被表征為腫瘤抗原。如本文所用的，術(shù)語“腫瘤抗原”可理解為那些存在于腫瘤細(xì)胞上的抗原。這些抗原以胞外部分呈現(xiàn)在細(xì)胞表面上，所述胞外部分常與所述分子的跨膜和胞質(zhì)部分相組合。這些抗原有時候僅由腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)，而從未由正常細(xì)胞呈現(xiàn)。腫瘤抗原可專門表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上，或者相比于正常細(xì)胞，腫瘤抗原可呈現(xiàn)腫瘤特異性突變。在這種情況下，它們被稱為腫瘤-特異性抗原。更常見的是由腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞呈現(xiàn)的抗原，它們被稱為腫瘤相關(guān)抗原。相比于正常細(xì)胞，這些腫瘤相關(guān)抗原可被過度表達(dá)，或者由于腫瘤組織與正常組織相比結(jié)構(gòu)較不緊密，這些腫瘤相關(guān)抗原在腫瘤細(xì)胞中可以進(jìn)行抗體結(jié)合。一個符合本發(fā)明的腫瘤抗原的實(shí)例是PSMA。
如上面描述的，本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子以所述第一結(jié)合域結(jié)合至人類以及非黑猩猩靈長類動物 ⑶3 ε (epsilin)鏈的表位，其中，該表位是包含在如SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 8中所示的27個氨基酸殘基或者其功能性片段中的氨基酸序列的一部分。
按照本發(fā)明，對于本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子優(yōu)選的是所述表位是包含 26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6 或 5 個氨基酸的氨基酸序列的一部分。
更優(yōu)選地,其中，所述表位至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (QDGNE)0
在本發(fā)明中，該N-端1-27個氨基酸殘基的功能性片段是指，當(dāng)從其在CD3復(fù)合物的天然環(huán)境中取出(并且被融合至異源氨基酸序列，例如EpCAM或免疫球蛋白Fe部分，如在 WO 2008/119567的實(shí)施例3.1中公開的)時，所述功能性片段仍然是維持其3維結(jié)構(gòu)完整性的環(huán)境獨(dú)立的表位。在CD3 ε的27個氨基酸N-端多肽或其功能性片段內(nèi)的3維結(jié)構(gòu)的維持可被用于產(chǎn)生結(jié)合域，所述結(jié)合域以相同結(jié)合親和力在體外結(jié)合至N-端CD3 ε多肽片段，在體內(nèi)結(jié)合至T細(xì)胞上的天然CD3復(fù)合物(的CD3 ε亞基)。在本發(fā)明中，該N-端 1-27個氨基酸殘基的功能性片段是指本文提供的CD3結(jié)合域仍然可以以環(huán)境獨(dú)立的方式結(jié)合至此類功能性片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于表位定位的方法，從而確定表位的哪些氨基酸殘基可被此類抗-CD3的結(jié)合域識別(例如，丙氨酸掃描；參見WO 2008/119567的實(shí)施例)。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子包括能夠結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的(第一)結(jié)合域和能夠結(jié)合至細(xì)胞表面抗原 PSMA的第二結(jié)合域。
在本發(fā)明中，進(jìn)一步優(yōu)選地所述第二結(jié)合域結(jié)合至人類細(xì)胞表面抗原PSMA和/ 或非黑猩猩靈長類動物PSMA。特別優(yōu)選地，所述第二結(jié)合域結(jié)合至人類PSMA以及非黑猩猩靈長類動物PSMA，優(yōu)選獼猴PSMA。要理解的是所述第二結(jié)合域結(jié)合至至少一種非黑猩猩靈長類動物PSMA，然而，它也可結(jié)合至2、3或更多種非黑猩猩靈長類動物PSMA同源物。例如，所述第二結(jié)合域可結(jié)合至石蟹獼猴PSMA和恒河猴PSMA。
包括本文描述的所有方法、用途、試劑盒等的本發(fā)明也與所述第二結(jié)合域本身 (即，非上下文中的雙特異性單鏈抗體)相關(guān)。“本身”進(jìn)一步包括非本文描述的雙特異性單鏈抗體的抗體形式，例如抗體片段(包含該第二結(jié)構(gòu)域)、人源化抗體、包含該第二結(jié)構(gòu)域的融合蛋白等。本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體以外的抗體形式也如上所述。
為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的第二結(jié)合域(例如，如本文定義的雙特異性單鏈抗體)，還可以利用結(jié)合至相應(yīng)的人類和/或非黑猩猩靈長類動物的細(xì)胞表面抗原(如PSMA)的單克隆抗體。針對如本文定義的雙特異性多肽的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合域例如可通過本領(lǐng)域描述的重組方法來自跨物種特異性的單克隆抗體。結(jié)合至人類細(xì)胞表面抗原以及黑猩猩靈長類動物的所述細(xì)胞表面抗原的同源物的單克隆抗體，可以通過如上所述的 FACS分析進(jìn)行測定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是跨物種特異性抗體也可由文獻(xiàn) (Milstein和K0hler，Nature 256(1975),495-7)中描述的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生。例如，小鼠可選擇地用人類和非黑猩猩靈長類動物細(xì)胞表面抗原(諸如PSMA)進(jìn)行免疫。從這些小鼠中， 經(jīng)由雜交瘤技術(shù)分離生產(chǎn)跨物種特異 性抗體的雜交瘤細(xì)胞,然后通過如上所述的FACS進(jìn)行分析。雙特異性多肽(如本文描述的顯示具有跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體)的產(chǎn)生和分析示于下面的實(shí)施例。顯示具有跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)包括在此所列舉的觀點(diǎn)。
對于本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子特別優(yōu)選的是能夠結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物CD3e鏈的表位的第一結(jié)合域包含VL區(qū)域，所述VL區(qū)域含有選自下列的 CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3
(a)如 SEQ ID NO. 27 中所示的 CDR-Ll、如 SEQ ID NO. 28 中所示的 CDR-L2 以及如 SEQ ID NO. 29 中所示的 CDR-L3 ；
(b)如 SEQ ID NO. 117 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO. 118 中所示的 CDR-L2 以及如SEQ ID NO. 119中所示的CDR-L3 ;以及
(c)如 SEQ ID NO. 153 中所示的 CDR—L1、如 SEQ ID NO. 154 中所示的 CDR-L2 以及如 SEQ ID NO. 155 中所示的 CDR-L3。
可變區(qū)域，即可變輕鏈(“L”或“VL”)以及可變重鏈(“H”或“VH”)在本領(lǐng)域中理解為提供抗體的結(jié)合域。這個可變區(qū)域含有互補(bǔ)決定區(qū)。
術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)是本領(lǐng)域熟知的，用于指示抗體的抗原特異性。術(shù)語 “⑶R-L”或“L⑶R”或“IXDR”是指在VL中的⑶R，而術(shù)語“⑶R-H”或“H⑶R”或HCDR”是指在VH中的CDR。
在本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的一個可選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，該能夠結(jié)合至人類以及非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域包含VH區(qū)域，所述VH區(qū)域含有選自下列的CDR-Hl、CDR-H2以及CDR-H3
(a)如 SEQ ID NO. 12 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 13 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQ ID NO. 14 中所示的 CDR-H3 ；
(b)如 SEQ ID NO. 30 中所示的 CDR-H1、如 SEQ ID NO. 31 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQ ID NO. 32 中所示的 CDR-H3 ；
(c)如 SEQ ID NO. 48 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 49 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQ ID NO. 50 中所示的 CDR-H3 ；
(d)如 SEQ ID NO. 66 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 67 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQ ID NO. 68 中所示的 CDR-H3 ；
(e)如 SEQ ID NO. 84 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 85 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQ ID NO. 86 中所示的 CDR-H3 ；
(f)如 SEQ ID NO. 102 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO. 103 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQ ID NO. 104 中所示的 CDR-H3 ；
(g)如 SEQ ID NO. 120 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 121 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQ ID NO. 122 中所示的 CDR-H3 ；
(h)如 SEQ ID NO. 138 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO. 139 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQ ID NO. 140 中所示的 CDR-H3 ；
(i)如 SEQ ID NO. 156 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO. 157 中所示的 CDR-H2 以及如SEQ ID NO. 158中所示的CDR-H3 ;以及
(j)如 SEQ ID NO. 174 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 175 中所示的 CDR-H2 以及如 SE Q ID NO. 176 中所示的 CDR-H3。
進(jìn)一步優(yōu)選地，該能夠結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物⑶3 ε鏈的表位的結(jié)合域包含 VL 區(qū)域，所述 VL 區(qū)域選自如 SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 125、SEQ ID NO. 129、SEQ ID NO. 161 或 SEQ ID NO. 165 中所示的 VL 區(qū)域。
可選擇地優(yōu)選地該能夠結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物⑶3 ε鏈表位的第一結(jié)合域包含VH區(qū)域，所述VH區(qū)域選自如SEQ ID NO. 15、SEQ IDN0. 19,SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 5KSEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 73、SEQ ID NO. 87,SEQ ID NO. 91、SEQ ID NO. 105、SEQ ID NO. 109、SEQ ID NO. 123、SEQ ID NO. 127、SEQ ID NO. 141、 SEQ ID NO. 145、SEQ ID NO. 159、SEQ ID NO. 163、SEQ ID NO. 177 或 SEQID NO. 181 中所示的VH區(qū)域。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的特征在于該能夠結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域，其包含選自下列的VL區(qū)域和VH區(qū)域
(a)如 SEQ ID NO. 17 或 SEQ ID NO. 21 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 15 或 SEQ ID NO. 19中所示的VH區(qū)域；
(b)如 SEQ ID NO. 35 或 SEQ ID NO. 39 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 33 或 SEQ ID NO. 37中所示的VH區(qū)域；
(c)如 SEQ ID NO. 53 或 SEQ ID NO. 57 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 51 或 SEQ ID NO. 55中所示的VH區(qū)域；
(d)如 SEQ ID NO. 71 或 SEQ ID NO. 75 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 69 或 SEQ ID NO. 73中所示的VH區(qū)域；
(e)如 SEQ ID NO. 89 或 SEQ ID NO. 93 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 87 或 SEQ ID NO. 91中所示的VH區(qū)域；
(f)如 SEQ ID NO. 107 或 SEQ ID NO. 111 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 105 或SEQ ID NO. 109中所示的VH區(qū)域；
(g)如 SEQ ID NO. 125 或 SEQ ID NO. 129 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 123 或SEQ ID NO. 127中所示的VH區(qū)域；
(h)如 SEQ ID NO. 143 或 SEQ ID NO. 147 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 141 或SEQ ID NO. 145中所示的VH區(qū)域；
(i)如 SEQ ID NO. 161 或 SEQ ID NO. 165 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 159 或SEQ ID NO. 163中所示的VH區(qū)域；以及
(j)如 SEQ ID NO. 179 或 SEQ ID NO. 183 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 177 或SEQ ID NO. 181中所示的VH區(qū)域。
根據(jù)本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的一個優(yōu)選實(shí)施方案，在該結(jié)合至CD3 ε的第一結(jié)合域中成對的VH-區(qū)域和VL-區(qū)域呈單鏈抗體(scFv)的形式。該VH和VL區(qū)域以 VH-VL或VL-VH的次序排列。優(yōu)選地，該VH-區(qū)域的N-端被定位到一個連接序列。該VL-區(qū)域的C-端被定位到連接序列。換句話說，在本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的CD3結(jié)合域中的結(jié)構(gòu)域排列優(yōu)選地是VH-VL，其中所述CD3結(jié)合域的C-端位于第二 (細(xì)胞表面抗原，如 PSMA)結(jié)合域。優(yōu)選地，該VH-VL是或包含SEQ ID NO. 185。
本發(fā)明的如上所述的雙特異性單鏈抗體分子的一個優(yōu)選實(shí)施方案的特征在于 該能夠結(jié)合至人類和非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域包含選自SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 41,SEQ ID NO. 43,SEQ ID NO. 59,SEQ ID NO. 6KSEQ ID NO. 77,SEQ ID NO. 79,SEQID NO. 95,SEQ ID NO. 97,SEQ ID NO. 113,SEQ ID NO. 115,SEQ ID NO. 131、SEQ ID NO. 133、SEQ ID NO. 149,SEQ ID NO. 151、SEQ ID NO. 167、SEQ ID NO. 169、 SEQ ID NO. 185 或 SEQ ID NO. 187 的氨基酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述的雙特異性單鏈抗體,其中所述第二結(jié)合域結(jié)合至該細(xì)胞表面抗原PSMA。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，上述表征的雙特異性單鏈抗體分子包含下列序列組作為在該第二結(jié)合域中的⑶R HlXDR Η2、 ⑶R Η3、⑶RLlXDR L2以及⑶R L3，所述序列組選自
a)SEQ IDNO :226-228的CDRH1-3以及SEQIDNO:231-233的CDRL1-3
b)SEQ IDNO :240-242的CDRH1-3以及SEQIDNO :245-247的CDRL1-3
c)SEQ IDNO :254-256的CDRH1-3以及SEQIDNO:259-261的CDRL1-3
d) SEQ IDNO :268-270的CDRH1-3以及SEQIDNO :273-275的CDRL1-3
e)SEQ IDNO:618-620的CDRH1-3以及SEQIDNO :623-625的CDRL1-3
f) SEQ IDNO :282-284的CDRH1-3以及SEQIDNO :287-289的CDRL1-30124]g) SEQIDNO :296-298的CDRH1-3以及SEQIDNO:301-303的CDRL1-30125]h) SEQIDN0:310-312的CDRH1-3以及SEQIDN0:315-317的CDRL1-30126]i)SEQIDNO :324-326的CDRH1-3以及SEQIDNO:329-331的CDRL1-30127]j) SEQIDNO :338-340的CDRH1-3以及SEQIDNO :343-345的CDRL1-30128]k) SEQIDNO :352-354的CDRH1-3以及SEQIDNO :357-359的CDRL1-30129]I) SEQIDNO :366-368的CDRH1-3以及SEQIDNO:371-373的CDRL1-30130]m) SEQIDNO :380-382的CDRH1-3以及SEQIDNO :385-387的CDRL1-30131]n) SEQIDNO :394-396的CDRH1-3以及SEQIDNO :399-401的CDRL1-30132]o) SEQIDNO:408-410的CDRH1-3以及SEQIDN0:413-415的CDRL1-30133]P) SEQIDNO :422-424的CDRH1-3以及SEQIDNO :427-429的CDRL1-30134]q) SEQIDNO :436-438的CDRH1-3以及SEQIDNO:441-443的CDRL1-30135]r) SEQIDNO :450-452的CDRH1-3以及SEQIDNO :455-457的CDRL1-30136]s)SEQIDNO :464-466的CDRH1-3以及SEQIDNO :469-471的CDRL1-30137]t)SEQIDNO :478-480的CDRH1-3以及SEQIDNO :483-485的CDRL1-30138]u) SEQIDNO :492-494的CDRH1-3以及SEQIDNO :497-499的CDRL1-30139]v) SEQIDNO :506-508的CDRH1-3以及SEQIDN0:511-513的CDRL1-30140]w) SEQIDNO :520-522的CDRH1-3以及SEQIDNO :525-527的CDRL1-30141]x) SEQIDNO :534-536的CDRH1-3以及SEQIDNO:539-541的CDRL1-30142]y) SEQIDNO :548-550的CDRH1-3以及SEQIDNO :553-555的CDRL1-30143]z)SEQIDNO :562-564的CDRH1-3以及SEQIDNO :567-569的CDRL1-30144]aa) SEQ ID NO:576-578 的 CDR Hl-3 以及 SEQ ID NO: 581-583 的 CDRLl-0145]ab) SEQ ID NO :590-592 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO :595-597 的 CDRL1-3 ;以及， 0146]ac) SEQ ID NO: 604-606 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO:609-611 的 CDRL1-3。0147]雙特異性單鏈抗體分子的優(yōu)選組包括下列序列的組作為在該第二結(jié)合域中的⑶R H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2 以及 CDR L3，其選自0148]a)SEQ IDNO :226-228的CDRH1-3以及SEQIDNO:231-233的CDRL1-3 ；0149]b)SEQ IDNO :240-242的CDRH1-3以及SEQIDNO :245-247的CDRL1-3 ；0150]c)SEQ IDNO :254-256的CDRH1-3以及SEQIDNO:259-261的CDRL1-3 ；0151]d) SEQ IDNO :268-270的CDRH1-3以及SEQIDNO :273-275的CDRL1-3 ；0152]e)SEQ IDNO:618-620的CDRH1-3以及SEQIDNO :623-625的CDRL1-3。以及，0153] 這些分子包含結(jié)合至該細(xì)胞表面抗原PSMA的第二結(jié)合域，所述第二結(jié)合域由源自親本PSMA特異性結(jié)合分子的Vh-鏈和源自對不同抗原(即，也被稱為CD326的上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM))有特異性的結(jié)合分子的鏈組成。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)具有此源自親本 PSMA特異性結(jié)合分子的Vh-鏈和源自親本EpCAM特異性結(jié)合分子的鏈的特定組合的結(jié)合分子專門結(jié)合至PSMA而不是EpCAM。這個被包含在本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子中的 PSMA特異性結(jié)合域組的結(jié)合特異性在所附的實(shí)施例3中描述。
雙特異性單鏈抗體分子的另一優(yōu)選組包括下列序列的組作為在該第二結(jié)合域中的 CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2 以及 CDR L3，其選自
a) SEQ ID NO:282-284 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO:287-289 的 CDRL1-3 ；0156]b)SEQ ID NO:296-298 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO:301-303 的 CDRL1-30157]c)SEQ ID NO:310-312 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO:315-317 的 CDRL1-30158]d) SEQ ID NO: 324-326 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO: 329-331 的 CDRL1-30159]e)SEQ ID NO:338-341 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO:343-345 的 CDRL1-30160]f) SEQ ID NO: 352-354 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO: 357-359 的 CDRL1-3 ;以及，0161]g) SEQ ID NO: 366-368 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO: 371-373 的 CDRL1-3。0162]雙特異性單鏈抗體分子的另一優(yōu)選組包括下列序列的組作為在該第二結(jié)合域中的CDRH1、CDR H2、CDR H3、CDRL1、CDR L2以及CDR L3，其選自
a) SEQIDNO :380-382的CDRH1-3以及SEQIDNO :385-387的CDRL1-3
b)SEQIDNO :394-396的CDRH1-3以及SEQIDNO :399-401的CDRL1-3
c)SEQIDNO:408-410的CDRH1-3以及SEQIDN0:413-415的CDRL1-3
d) SEQIDNO :422-424的CDRH1-3以及SEQIDNO :427-429的CDRL1-3
e)SEQIDNO :436-438的CDRH1-3以及SEQIDNO:441-443的CDRL1-3
f) SEQIDNO :450-452的CDRH1-3以及SEQIDNO :455-457的CDRL1-3
g) SEQIDNO :464-466的CDRH1-3以及SEQIDNO :469-471的CDRL1-3
h) SEQIDNO :478-480的CDRH1-3以及SEQIDNO :483-485的CDRL1-3
i)SEQIDNO :492-494的CDRH1-3以及SEQIDNO :497-499的CDRL1-3
j) SEQIDNO :506-508的CDRH1-3以及SEQIDN0:511-513的CDRL1-3
k) SEQIDNO :520-522的CDRH1-3以及SEQIDNO :525-527的CDRL1-3
I) SEQIDNO :534-536的CDRH1-3以及SEQIDNO:539-541的CDRL1-3
m) SEQIDNO :548-550的CDRH1-3以及SEQIDNO :553-555的CDRL1-3
n) SEQIDNO :562-564的CDRH1-3以及SEQIDNO :567-569的CDRL1-3
o)SEQIDNO :576-578的CDRH1-3以及SEQIDNO:581-583的CDRL1-3
p)SEQIDNO :590-592的CDRH1-3以及SEQIDNO :595-597的CDRL1-3
q) SEQIDNO :604-606的CDRH1-3以及SEQIDNO :609-611的CDRL1-3以及0180] 對于本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子優(yōu)選的是所述結(jié)合至該細(xì)胞表面抗原 PSMA的第二結(jié)合域包括下列序列的組作為在該第二結(jié)合域中的Vh-和鏈，其選自0181]a) SEQIDNO :225的V1Γ鏈以及SEQIDNO:230的Vl--鏈0182]b)SEQIDNO :239的V1Γ鏈以及SEQIDNO:244的Vl--鏈0183]c)SEQIDNO :253的V1Γ鏈以及SEQIDNO:258的Vl--鏈0184]d) SEQIDNO :267的V1Γ鏈以及SEQIDNO:272的Vl--鏈0185]e)SEQIDN0:617的V1Γ鏈以及SEQIDNO:622的Vl--鏈0186]f) SEQIDNO:281的V1Γ鏈以及SEQIDNO:286的Vl--鏈0187]g) SEQIDNO :295的V1Γ鏈以及SEQIDNO:300的Vl--鏈0188]h) SEQIDNO :309的V1Γ鏈以及SEQIDN0:314的Vl--鏈0189]i)SEQIDNO :323的V1Γ鏈以及SEQIDNO :328的Vl--鏈0190]j) SEQIDNO :337的V1Γ鏈以及SEQIDNO :342的Vl--鏈0191]k) SEQIDN0:351的V1Γ鏈以及SEQIDNO :356的Vl--鏈0192]I) SEQIDNO :365的V1Γ鏈以及SEQIDNO :370的Vl--鏈
m) SEQIDNO :379的Vh--鏈以及SEQIDNO:384的Vl--鏈
n) SEQIDNO :393的Vh--鏈以及SEQIDNO:398的Vl--鏈
ο) SEQIDNO :407的Vh--鏈以及SEQIDN0:412的Vl--鏈
P) SEQIDN0:421的Vh--鏈以及SEQIDNO :426的Vl--鏈
q) SEQIDNO :435的Vh--鏈以及SEQIDNO :440的Vl--鏈
r) SEQIDNO :449的Vh--鏈以及SEQIDNO :454的Vl--鏈
s)SEQIDNO :463的Vh--鏈以及SEQIDNO :468的鏈
t)SEQIDNO :477的Vh--鏈以及SEQIDNO :482的Vl--鏈
u) SEQIDN0:491的Vh--鏈以及SEQIDNO :496的Vl--鏈
v) SEQIDNO :505的Vh--鏈以及SEQIDN0:510的Vl--鏈
w) SEQIDN0:519的Vh--鏈 以及SEQIDNO :524的Vl--鏈
x) SEQIDNO :533的Vh--鏈以及SEQIDNO :538的Vl--鏈
y) SEQIDNO :547的Vh--鏈以及SEQIDNO :552的Vl--鏈
z)SEQIDNO:561的Vh--鏈以及SEQIDNO :566的Vl--鏈
aa)SEQ ID NO :575 的 VH_ 鏈以及 SEQ ID NO: 580 的 VL-鏈
ab) SEQ ID NO: 589 的 Vh-鏈以及 SEQ ID NO: 594 的鏈；以及
ac) SEQ ID NO: 603 的 Vh-鏈以及 SEQ ID NO: 608 的鏈。
上述Vh-和 Vl-鏈也分別示于 SEQ ID NO:235、249、263、277、627、291、305、319、 333、347、361、375、389、403、417、431、445、459、473、487、501、515、529、543、557、571、585、 599 以及 613。
本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的第二結(jié)合域?qū)?yīng)的VL-和VH-區(qū)域以及相應(yīng)的 scFv的序列(氨基酸序列和核苷酸序列)示于序列表中。
在本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子中，該結(jié)合域以VL-VH-VH-VL、VL-VH-VL-VH、 VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的次序排列，如所附的實(shí)施例中所示。優(yōu)選地，該結(jié)合域以VH PSMA-VL PSMA-VH CD3-VL CD3 或 VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3 的次序排列。
本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及上述表征的多肽，其中所述雙特異性單鏈抗體分子包括選自下列的序列
(a)如 SEQ ID NO:237、251、265、279、629、293、307、321、335、349、363、377、391、405、419、433、447、461、475、489、503、517、531、545、559、573、587、601或 615 中的任一個中所示的氨基酸序列；
(b)由如SEQ ID NO:238、252、266、280、630、294、308、322、336、350、364、378、392、406、420、434、448、462、476、490、504、518、532、546、560、574、588、602或 616 中的任一個中所示的核酸序列編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明涉及的雙特異性單鏈抗體分子包含如SEQ ID NO:237、251、265、279、629、 293、307、321、335、349、363、377、391、405、419、433、447、461、475、489、503、517、531、545、 559、573、587、601或615中的任一個中所示的氨基酸序列，以及與SEQ ID N0:237、251、 265、279、629、293、307、321、335、349、363、377、391、405、419、433、447、461、475、489、503、 517、531、545、559、573、587、601或615的氨基酸序列有至少96%同一性、優(yōu)選97%、更優(yōu)選至少98%同一性、最優(yōu)選至少99%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及如SEQ ID NO:238,252、266、280、630、294、308、322、336、350、364、378、392、406、420、434、448、462、476、490、 504、518、532、546、560、574、588、602或616中的任一個所示的相對應(yīng)的核酸序列，以及與示于 SEQ ID N0:238、252、266、280、630、294、308、322、336、350、364、378、392、406、420、 434、448、462、476、490、504、518、532、546、560、574、588、602 或 616 的核酸序列有至少 96% 同一性、優(yōu)選97%、更優(yōu)選至少98%同一性、最優(yōu)選至少99%同一性的核酸序列。應(yīng)當(dāng)理解的是在整個核苷酸或氨基酸序列上確定序列同一性。關(guān)于序列比對，例如，可以使用程序 Gap 或 BestFit (Needleman 和 Wunsch J. Mol. Biol. 48(1970), 443-453 ；Smith 和 Waterman, Adv. App1. Math 2 (1981), 482-489),它被包含在GCG軟體包(Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991))中。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說這是一個常規(guī)的方法，即通過使用例如上述程序之一來測定和鑒定與本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體的核苷酸或氨基酸序列具有例如96% (97%,98%或99%)序列同一性的核苷酸或氨基酸序列。例如，根據(jù)克里克的擺動假說，反密碼子上的5’堿基不像其他2個堿基有空間限制，從而可具有非標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對。換句話說密碼子三聯(lián)體中的第三位可變化，從而在此第三位有區(qū)別的2個三聯(lián)體可編碼相同的氨基酸殘基。所述假說是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見例如http://en. wikipedia. org/wiki/ffobble_Hypothesis ；Crick, JMol Biol 19(1966):548-55)。
在本發(fā)明的PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體中優(yōu)選的結(jié)構(gòu)域排列在下面的實(shí)施例中示出。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該雙特異性單鏈抗體對CD3 ε和由它們的第二結(jié)合域識別的人類與非黑猩猩靈長類動物細(xì)胞表面抗原PSMA是跨物種特異性的。
在一個備選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼上述本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的核酸序列。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體。
許多適合的載體是分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，載體的選擇取決于需要的功能，并且包括質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體以及常規(guī)用于基因工程的其他載體?？梢杂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建各種質(zhì)粒和載體；參見，例如，描述于Sambrook等人(上述引用文)和Ausubel, Current Protocolsin Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989), (1994)的技術(shù)。可選擇地，本發(fā)明的多核苷酸和載體可重構(gòu)成脂質(zhì)體以遞送至靶細(xì)胞。如下面進(jìn)一步詳細(xì)討論地，將克隆載體用于分離DNA的各個序列。在需要表達(dá)特定多肽的情況下，相關(guān)序列可被轉(zhuǎn)移至表達(dá)載體中。典型的克隆載體包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322以及pGBT9。典型的表達(dá)載體包括pTRE、 pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。
優(yōu)選地，所述載體包含的核酸序列是可操作地連接至本文定義的上述核酸序列的調(diào)節(jié)序列。
術(shù)語“調(diào)控序列”是指DNA序列，其對于實(shí)現(xiàn)它們連接的編碼序列的表達(dá)是必要的。此類控制序列的性質(zhì)隨宿主生物體的不同而不同。在原核生物中，一般而言，控制序列包括啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子。在真核生物中，一般而言，控制序列包括啟動子、終止子以及在某些情況下包括增強(qiáng)子、反式作用因子或轉(zhuǎn)錄因子。術(shù)語“控制序列”意在在最低限度上包括其存在為表達(dá)必需的所有組份，并且還可包括另外的有益組份。
術(shù)語“可操作地連接”是指并列位置，其中描述的組份處于允許它們以它們所預(yù)期的方式作用的關(guān)系?！翱刹僮鞯剡B接”至編碼序列的控制序列以使得該編碼序列的表達(dá)在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)的方式而連接。在該控制序列是啟動子的情況下，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是優(yōu)選使用雙鏈核酸。
因此，優(yōu)選地，所列舉的載體是表達(dá)載體?！氨磉_(dá)載體”是一種構(gòu)建體，可被用于轉(zhuǎn)化選擇的宿主并且在該選擇的宿主中提供編碼序列的表達(dá)。表達(dá)載體可以是，例如克隆載體、雙元載體或整合載體。表達(dá)包括優(yōu)選地將核酸分子轉(zhuǎn)錄成可翻譯的mRNA。確保在原核和 /或真核細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在真核細(xì)胞的情況下，它們通常包括確保轉(zhuǎn)錄起始的啟動子和可選的確保轉(zhuǎn)錄終止及轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定的poly-A信號?？赡苋菰S在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件包括，例如，在大腸桿菌中的PL、lac> trp或tac啟動子，而容許在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件的實(shí)例是酵母菌中的AOXl或GALl啟動子或者在哺乳動物或其他動物細(xì)胞中的CMV-、SV40、RSV-啟動子(Rous肉瘤病毒)、CMV-增強(qiáng)子、SV40-增強(qiáng)子或球蛋白內(nèi)含子。
除了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的元件以外，這些調(diào)控元件還可包括轉(zhuǎn)錄終止信號，如在多核苷酸下游的SV40-poly-A位點(diǎn)或tk-poly-A位點(diǎn)。此外,取決于使用的表達(dá)系統(tǒng)，可將能夠把多肽 導(dǎo)向至細(xì)胞隔室或?qū)⑺置谥两橘|(zhì)內(nèi)的前導(dǎo)序列添加至所述的核酸序列的編碼序列中，并且所述前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域熟知的；參見，例如WO 2008/119567。前導(dǎo)序列在適合的階段與翻譯、啟動和終止序列一起裝配，并且優(yōu)選地，前導(dǎo)序列能夠指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)或其部分分泌至細(xì)胞周質(zhì)間隙或細(xì)胞外介質(zhì)內(nèi)。任選地，異源序列可編碼融合蛋白，該融合蛋白包括賦予所需特性(例如，被表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性或純化簡化)的N-端識別肽；參見， 如上述。在本文中，適合的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表達(dá)載體 pcDV I (Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3 (In-vitrogene)、pEF-DHFR、pEF-ADA 或 pEF-neo (Mack 等人 PNAS (1995) 92, 7021-7025 以及 Raum 等人 Cancer Tmmunol Tmmunoth er (2001)50 (3)，141-150)或 pSPORTl(GIBC0 BRL)。
優(yōu)選地，在能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中，所述表達(dá)控制序列是真核啟動子系統(tǒng)，但也可以使用原核宿主的控制序列。一但該載體被導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗髦?，該宿主被維持在適合核苷酸序列高水平表達(dá)的條件下，并且如果需要，之后可進(jìn)行本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的收集和純化；參見，例如，所附的實(shí)施例。
被用于表達(dá)細(xì)胞周期相互作用蛋白的另一種表達(dá)系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)用作載體，以在草地貪夜蛾細(xì)胞中或在粉紋夜蛾幼蟲中表達(dá)外源基因。上述的核酸分子的編碼序列可被克隆至病毒的非必需區(qū)域， 如，多角體蛋白基因，并且被放置在多角體蛋白啟動子的控制之下。所述編碼序列的成功插入將使多角體蛋白基因處于非活動狀態(tài)并且產(chǎn)生缺乏外殼蛋白殼的重組病毒。然后用重組病毒感染草地貪夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾幼蟲，本發(fā)明的蛋白在其中表達(dá)(Smith, J. Virol. 46(1983)，584 !Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sc1. USA 91(1994)，3224-3227)。
附加的調(diào)控元件可包括轉(zhuǎn)錄以及翻譯增強(qiáng)子。有利地，上述的本發(fā)明的載體包括可選擇的和/或可評價(scorable)標(biāo)記物。
可用于選擇被轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及例如植物組織和植物的選擇性標(biāo)記物基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，所述選擇性標(biāo)記物基因包括，例如，以抗代謝物抗性作為選擇基礎(chǔ)的賦予對甲氨蝶呤抗性的 dhfr (Reiss, Plant Physiol. (LifeSc1. Adv.) 13 (1994), 143-149)； 賦予對氨基糖苷類新霉素、卡那霉素以及巴龍霉素抗性的npt (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983)，987-995)以及賦予對潮霉素抗性的 hygro (Marsh, Gene 32 (1984)，481-485)。 還描述了另外的可選擇的基因，即容許細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸的trpB ;容許細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸的 hisD(Hartman, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 85 (1988), 8047);容許細(xì)胞利用甘露糖(WO 94/20627)的甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶以及賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑、2- ( 二氟甲基)-DL_鳥氨酸、DFMO抗性的ODC (鳥氨酸脫羧酶)(McConlogue, 1987, In:Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) 或者賦予對殺稻痕菌素S抗性的來自土曲霉的脫氨酶(Tamura, Biosc1. Biotechnol. Biochem. 59(1995)，2336-2338)。
有用的可評價標(biāo)記物也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且有市售。有利地， 所述標(biāo)記物是編碼螢光素 BI (Giacomin,Pl. Sc1. 116 (1996), 59-72 ；Scikantha, J. Bact. 178(1996)，121 )、綠色螢光蛋白(Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47)或 β _ 葡萄糖醛酸酶(Jefferson，EMBO J. 6 (1987)，3901-3907)的基因。這個實(shí)施方案對于簡單以及快速篩選含有所述載體的細(xì)胞、組織以及生物體是特別有用的。
如上所述，為了達(dá)到例如純化還有基因治療的目的，所述核酸分子可被單獨(dú)使用或作為載體的一部分使用，以在細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子。這些含有編碼上述任一種本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的DNA序列的核酸分子或載體被導(dǎo)入細(xì)胞，繼而所述細(xì)胞產(chǎn)生目標(biāo)多肽?；谕ㄟ^離體或體內(nèi)技術(shù)將治療基因?qū)爰?xì)胞的基因治療，是基因轉(zhuǎn)移的最重要的應(yīng)用之一。用于體外或體內(nèi)基因治療的適合的載體、方法或基因遞送系統(tǒng)已描述于文獻(xiàn)中并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的；參見，例如， Giordano, NatureMedicine 2(1996), 534-539 ；Schaper,Circ.Res.79 (1996),911-919 ； Anderson, Science 2 56 (1992),808-813 ；Verma,Nature 389 (1994), 239 ； Isner,Lancet 348 (1996), 370-374 ；Muhlhauser, Circ. Res. 77(1995), 1077-1086 ； Onodera,Blood91 (1998), 30-36 ；Verma, Gene Ther.5 (1998), 692-699 ；N abel, Ann. NY Acad.Sc1. 811 (1997)，289-292 ；Verzeletti, Hum. Gene Ther.9 (1998)，2243-51 ； Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716 ；W0 94/29469 ；W0 97/00957, US5, 580, 859 ；US 5，589，466 ;或者 Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640; dos Santos Coura和Nardi Virol J. (2007)，4:99。所述核酸分子和載體可被設(shè)計為直接導(dǎo)入或通過脂質(zhì)體或病毒(例如，腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是生殖細(xì)胞系細(xì)胞、胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞或者由其衍生的，最優(yōu)選地，所述細(xì)胞是干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的實(shí)例尤其可以是如描述于Nagy, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 90 (1993)，8424-8428 中的干細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主。所述宿主可以通過將上述的本發(fā)明的載體或上述的本發(fā)明的核酸分子導(dǎo)入該宿主內(nèi)產(chǎn)生。在宿主中至少一種載體或至少一種核酸分子的存在可調(diào)節(jié)編碼上述的單鏈抗體構(gòu)建體的基因的表達(dá)。
導(dǎo)入宿主內(nèi)的本發(fā)明所述的核酸分子或載體可合并至該宿主的基因組內(nèi)或它可被維持在染色體外。
宿主可以是任何原核或真核細(xì)胞。
術(shù)語“原核生物”是指包括所有可被DNA或RNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)菌。原核生物宿主可包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，例如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌以及枯草芽孢桿菌。術(shù)語“真核生物”是指包括酵母菌、高等植物、 昆蟲和優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞。取決于在重組生產(chǎn)過程中采用的宿主，由本發(fā)明的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)可被糖基化或非糖基化。特別優(yōu)選的是使用含有本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子編碼序列的質(zhì)?；虿《?，并且該編碼序列以遺傳方式融合了 N-端FLAG-標(biāo)簽和/或 C-端His-標(biāo)簽。優(yōu)選地，所述FLAG-標(biāo)簽的長度是大約4至8個氨基酸、最優(yōu)選8個氨基酸?？梢允褂蒙鲜龅亩嗪塑账幔岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的技術(shù)來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主。 再者，用于制備融合、可操作地連接的基因和例如在哺乳動物細(xì)胞和細(xì)菌中表達(dá)它們的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(Sambrook，上述引文)。
優(yōu)選地，所述宿主是細(xì)菌或昆蟲、真菌、植物或動物細(xì)胞。
特別設(shè)想的是所述宿主可以是哺乳動物細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞株如SP2/0或NS/0。如在W02008/119567的實(shí)施例中對于同類的其他分子所示例的，特別優(yōu)選的是CHO-細(xì)胞作為宿主。
更優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是人類細(xì)胞或人類細(xì)胞株，例如per. c6 (Kroos, Biotechnol. Prog. , 2003, 19:163-168)。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的方法，所述方法包括在允許本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主并從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的多肽。
被轉(zhuǎn)化的宿主可在發(fā)酵罐中生長并且根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)以達(dá)到最佳的細(xì)胞生長。然后可以從生長培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解液、或細(xì)胞膜組分中分離本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子。例如經(jīng)微生物表達(dá)的雙特異性單鏈抗體分子的分離和純化可以通過任何常規(guī)方法，例如，制備色譜分離和免疫學(xué)分離，正如那些涉及使用靶向例如本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的標(biāo)簽的或如在所附實(shí)施例中描述的單克隆或多克隆抗體的方法。
允許表達(dá)的培養(yǎng)宿主的條件是本領(lǐng)域已知的，且取決于用于此方法的宿主系統(tǒng)和表達(dá)系統(tǒng)/載體。為了達(dá)到允許重組多肽表達(dá)的條件而被修飾的參數(shù)是本領(lǐng)域已知的。因此，適當(dāng)?shù)臈l件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員無需進(jìn)一步的創(chuàng)造性工作投入的情況下確定。
經(jīng)表達(dá)后，本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)操作程序被純化，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳以及類似操作；參見，Scopes, "Protein Pur ification〃，Springer-Verlag, NY (1982)。對于藥學(xué)用途,優(yōu)選具有至少大約90至95%同質(zhì)性的基本上純的多肽，最優(yōu)選98至99%或更高同質(zhì)性。經(jīng)純化后(部分的或根據(jù)需要達(dá)到同質(zhì))，本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子可被用于治療(包括體外)或者開發(fā)和執(zhí)行分析程序。此外，用于從培養(yǎng)物中回收本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的方法詳細(xì)描述于所附的 WO 2008/119567的關(guān)于同類的其他分子的實(shí)施例中。回收也可以通過分離能夠結(jié)合至人類以及非黑猩猩靈長類動物CD3 ε的表位的本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括下列步驟
(a)使該多妝與含有氨基酸序列 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 211)或 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-1le-Gly (SEQ ID NO. 212)的最多 27 個氨基酸的 CD3 ε的胞外域的N-端片段(經(jīng)由它的C-端被固定至固相)接觸；
(b)洗脫與所述片段結(jié)合的多肽；以及
(C)從(b)的洗脫液中分離該多肽。
優(yōu)選地，本發(fā)明通過上述方法所分離的多肽具有人類來源。
這個方法或本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的分離被理解為用于從多個候選多肽中分離一種或多種不同多肽(對其N-端包括氨基酸序列 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 211)或 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-1le-Gly (SEQ ID NO. 212)的 CD3 ε 的胞外域片段具有相同的特異性)的方法以及用于從溶液中純化多肽的方法。對于后一用于從溶液中純化雙特異性單鏈抗體分子的方法的非限制性實(shí)例是例如從培養(yǎng)懸浮液或來自此類培養(yǎng)物的制備物中純化被重組表達(dá)的雙特異性單鏈抗體分子。
如上所述的，用于這個方法的片段是靈長類動物CD3 ε分子的胞外域的N-端片段。不同物種的⑶3 ε分子的胞外域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、3、5和7中所示。2種形式的N-端八聚體示于SEQ ID NO: 211和212。優(yōu)選地，這個N-端對于所述由本發(fā)明的方法識別的多肽的結(jié)合而言是自由獲取的。術(shù)語“自由獲取的”在本發(fā)明的上下文中被理解為無外加的動機(jī)，如His-標(biāo)簽。該His-標(biāo)簽與本文描述的結(jié)合分子的干擾在WO 2008/119567 中描述。
根據(jù)所述方法，所述片段經(jīng)由它的C-端被固定至固相。本領(lǐng)域的技術(shù)人員依賴本發(fā)明的方法使用的實(shí)施方案將容易并且無創(chuàng)造性工作困擾地選擇合適的固相支持物。 固體支持物包括但不限于基質(zhì)類珠粒(例如瓊脂糖珠、瓊脂糖凝膠珠、聚苯乙烯珠、葡聚糖珠)、板(培養(yǎng)板或多孔板)以及已知的芯片(例如來自Biaeore )。將該片段固定/固定化至所述固相支持物的手段和方法的選擇取決于選擇的固相支持物。通常使用 的用于固定 /固定化的方法是通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯耦合。這種耦合以及用于固定/固定化的替代方法的化學(xué)機(jī)理是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，來自Hermanson “Bioconjugate Techniques”，Academic Press, Inc. (1996)。對于固定至/固定化在色譜載體上,通常使用下列工具NHS_活化的瓊脂糖凝膠(例如GE LifeScience-Amersham的HiTrap-NHS)、 CnBr-活化的瓊脂糖凝膠(例如，GE LifeScience-Amersham)、NHS-活化的葡聚糖珠 (Sigma)或活化的聚甲基丙烯酸酯。這些試劑也可用在批次方法中。此外，包括氧化鐵的葡聚糖珠(例如，可獲得自Miltenyi)可用在批次方法中。這些珠?？膳c磁體組合使用，以從溶液中分離珠粒?？赏ㄟ^使用NHS活化的羧甲基葡聚糖，將多肽固定在Biacore芯片(例如 CM5芯片)上。適當(dāng)?shù)墓滔嘀С治锏钠渌鼘?shí)例是胺活性的多孔板(例如Nunc Immobilizer 板)。
根據(jù)該方法，所述CD3 ε的胞外域的片段可直接地或通過氨基酸的延伸物(可以是連接物或其他蛋白質(zhì)/多肽部分)偶合至該固相支持物?？蛇x擇地，CD3e的胞外域可通過一個或多個接頭分子被間接耦合。
用于洗脫結(jié)合至被固定化的表位的肽或多肽的手段和方法是本領(lǐng)域公知的。同樣適用于從洗脫液中分離被識別的多肽(們)的方法。
用于從多個候選多肽中分離一種或多種不同雙特異性單鏈抗體分子(對于在其 N-端包括氨基酸序列 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly (X 是 Met 或 lie)的 0)3 ε 的胞外域的片段具有相同的特異性)的方法可包括下列用于選擇抗原特異性實(shí)體的方法的一個或多個步驟
⑶3 ε特異性結(jié)合域可選自抗體衍生庫。噬菌體展示文庫可根據(jù)如描述于“Phage Display:A Laboratory Manual; Ed. Barbas, Burton, Scott&Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001的標(biāo)準(zhǔn)操作程序來構(gòu)建?？贵w庫中的抗體片段的形式可以是scFv，但一般而言也可以是Fab片段或甚至單域抗體片段。為了分離抗體片段，可使用天然的抗體片段文庫。對于選擇潛在的低免疫原性的結(jié)合實(shí)體用于以后的治療，人類抗體片段文庫對于人類抗體片段的直接選擇可以是有利的。在一些情況下，它們可形成合成抗體文庫的基礎(chǔ)(Knappik等人J Mol. Biol. 2000，296:57ff)。相對應(yīng)的形式可以是Fab、scFv (如下所述的)或域抗體(dAbs,如在Holt等人,Trends Biotechnol. 2003, 21:484 ff中所綜述的)。
在本領(lǐng)域中還已知的是在許多情況下沒有對抗靶標(biāo)抗原的可用的免疫人類抗體源。因此用靶標(biāo)抗原和分離自動物組織例如脾臟或PBMC的各自的抗體文庫免疫動物。N-端片段可被生物素化或共價地連結(jié)至蛋白質(zhì)，如KLH或牛血清白蛋白(BSA)。根據(jù)常見的方法，嚙齒類動物被用于免疫。一些非人類來源的免疫抗體庫可以因?yàn)槠渌?例如源自駱騎類物種的單域抗體(VHH)的存在)而特別有利(如描述于Muyldermans, J Biotechnol. 74:277 ；De Genst 等人 Dev Como Immunol. 2006, 30:187 ff)。因此抗體文庫的對應(yīng)形式可以是Fab、scFv (如下所述的)或單域抗體(VHH)。
在一個可行的方法中，來自balb/cx C57black雜交的10周齡Fl小鼠可以用全細(xì)胞免疫，所述全細(xì)胞例如表達(dá)N-端呈現(xiàn)為翻譯融合成熟的CD3 ε鏈的N-端氨基酸I 至27的跨膜EpCAM?；蛘?，小鼠可用1-27⑶3 ε -Fe融合蛋白免疫(相應(yīng)的方法描述于WO 2008/119567的實(shí)施例中)。在加強(qiáng)免疫之后，取出血液樣品并且對抗⑶3-陽性T細(xì)胞的抗體血清效價可在如FACS分析中進(jìn)行測試。通常，血清效價在免疫的 動物中顯著地高于在非免疫的動物中。
免疫的動物可形成構(gòu)建免疫抗體文庫的基礎(chǔ)。這種文庫的實(shí)例包括噬菌體展示文庫。這種文庫一般而言可根據(jù)如在 “Phage Display:A LaboratoryManual” ；Ed. Barbas, B urton, Scott&Si lverman; Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2001 中公開的標(biāo)準(zhǔn)操作程序構(gòu)建。
非人類抗體也可通過噬菌體展示而被人源化，這是由于產(chǎn)生更多可變抗體文庫， 這些文庫可隨后在選擇期間針對結(jié)合物進(jìn)行富集。
在噬菌體展示方法中，呈現(xiàn)抗體文庫的噬菌體集合中的任一個都形成用各自抗原作為靶標(biāo)分子選擇結(jié)合實(shí)體的基礎(chǔ)。分離抗原特異性的抗原結(jié)合的噬菌體的中心步驟稱為淘選。因?yàn)榭贵w片段展示在噬菌體的表面上，這個通用的方法被稱為噬菌體展示。選擇的一個優(yōu)選方法為使用小蛋白，如經(jīng)翻譯融合至由噬菌體展示的scFv的N-端的絲狀噬菌體N2域。本領(lǐng)域已知的可用來分離結(jié)合實(shí)體的另一種展示方法是核糖體展示方法(在 Groves&Osbourn, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5:125 ff ；Lipovsek&Pluckthun, JTmmunoI Methods 2004，290:52ff中綜述的)。為了證明scFv噬菌體顆粒結(jié)合至1-27CD3 ε -Fe融合蛋白，帶有經(jīng)克隆的scFv譜的噬菌體文庫可通過PEG (聚乙二醇)從各自的培養(yǎng)上清液中收獲。ScFv噬菌體顆粒與被固定的⑶3 ε Fe融合蛋白一起培養(yǎng)。該被固定的⑶3 ε Fe融合蛋白可被涂覆到固相?？梢韵疵摻Y(jié)合實(shí)體，然后洗脫液可用于感染新鮮的未被感染的細(xì)菌宿主。被編碼人類scFv片段的噬菌粒拷貝成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的的細(xì)菌宿主可就羧芐西林抗性再次進(jìn)行篩選，并且隨后用例如VCMS 13輔助噬菌體感染，以開始第二輪的抗體展示以及體外篩選。通?？偣策M(jìn)行4至5輪篩選。可以使用流式細(xì)胞儀，在⑶3 ε陽性Jurkat細(xì)胞、 HPBall細(xì)胞、PBMC或經(jīng)轉(zhuǎn)染的攜帶融合至表面展示的EpCAM的N-端⑶3 ε序列的真核細(xì)胞上測試經(jīng)分離的結(jié)合實(shí)體的結(jié)合(參見WO 2008/119567)。
優(yōu)選地，上述方法可以是以下方法其中⑶3 ε的胞外域的片段由具有SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 8中所示的任一個的氨基酸序列的多肽的一個或多個片段組成。更優(yōu)選地，所述片段的長度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27 個氨基酸殘基。
這個識別雙特異性單鏈抗體分子的方法可以是一種篩選多個包含結(jié)合至人類以及非黑猩猩靈長類動物CD3 ε的表位的跨物種特異性結(jié)合域的雙特異性單鏈抗體分子的方法?；蛘?，識別的方法是一種純化/分離包含結(jié)合至人類以及非黑猩猩靈長類動物CD3 ε 的表位的跨物種特異性結(jié)合域的雙特異性單鏈抗體分子的方法。
此外，本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物包含本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子或通過如上所述的方法生產(chǎn)的雙特異性單鏈抗體。優(yōu)選地，所述組合物是一種藥物組合物。
本發(fā)明還提供如本文定義的或根據(jù)如本文定義的方法生產(chǎn)的雙特異性單鏈抗體分子，其中所示雙特異性單鏈抗體分子用于預(yù)防、治療或改善癌癥。優(yōu)選地，所述癌癥是實(shí)體瘤，更優(yōu)選地，為癌或前列腺癌。優(yōu)選地，該雙特異性單鏈進(jìn)一步包含載體、穩(wěn)定劑和/或賦形劑的適合制劑。此外，優(yōu)選地，所示雙特異性單鏈抗體分子適合與另外的藥物組合給藥。所述藥物可以是非蛋白質(zhì)性的化合物或蛋白質(zhì)性的化合物，并且可與如本文定義的雙特異性單鏈抗體分子同時地或非同時地給藥。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥物組合物”涉及用于向患者給藥的組合物，優(yōu)選人類患者。 特別優(yōu)選的本發(fā)明的藥物組合物包括靶向?qū)弓h(huán)境獨(dú)立的CD3表位且針對其產(chǎn)生的雙特異性單鏈抗體。優(yōu)選地，所述藥物組合物包括載體、穩(wěn)定劑和/或賦形劑的適合制劑。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物包括用于胃腸外的、透皮的、腔內(nèi)的、動脈內(nèi)的、鞘內(nèi)和 /或鼻內(nèi)給藥或者通過直接注射到組織內(nèi)的組合物。特別設(shè)想的是所述組合物通過輸注或注射向患者給藥。適合的組合物的給藥可有許多方式，例如，通過靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的、肌內(nèi)的、局部的或皮內(nèi)給藥。特別地，本發(fā)明提供該適合的組合物不間斷的給藥。作為非限制性的實(shí)例，可通過患者所戴的計量治療劑到達(dá)患者體內(nèi)的量的小泵系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)不間斷的即連續(xù)給藥。該包含靶向?qū)贡景l(fā)明的環(huán)境獨(dú)立的CD3表位且針對其產(chǎn)生的雙特異性單鏈抗體的藥物組合物可通過使用所述泵系統(tǒng)進(jìn)行給藥。所述泵系統(tǒng)一般而言是本領(lǐng)域已知的，并且通常依靠周期性地更換含有要被輸注的治療劑的藥筒。當(dāng)更換泵系統(tǒng)中的藥筒時， 可能接著發(fā)生到達(dá)患者體內(nèi)的本應(yīng)不間斷流動的治療劑的暫時中斷。在這樣的情況下，在藥筒更換前的給藥階段和在藥筒更換后的給藥階段仍會被認(rèn)為是在藥學(xué)手段的含義內(nèi)，并且本發(fā)明的方法共同構(gòu)成此類治療劑的一個“不間斷給藥”。
這些靶向?qū)贡景l(fā)明的環(huán)境獨(dú)立的⑶3表位且針對其產(chǎn)生的雙特異性單鏈抗體的連續(xù)或不間斷的給藥可借助流體遞送裝置 或小泵系統(tǒng)(包括用于驅(qū)使流體離開儲庫的流體驅(qū)動機(jī)構(gòu)以及用于致動該驅(qū)動機(jī)構(gòu)的致動器)進(jìn)行靜脈內(nèi)或皮下給藥。用于皮下給藥的泵系統(tǒng)可包括用于穿透患者皮膚并將適合的組合遞送到該患者體內(nèi)的針或插管。無需靜脈、動脈或血管，所述泵系統(tǒng)可直接固定或附著至患者皮膚，從而使得泵系統(tǒng)與患者的皮膚可直接接觸。所述泵系統(tǒng)可被附著在患者皮膚24小時至數(shù)天。所述泵系統(tǒng)可以是具有小體積儲庫的小尺寸。作為非限制性的實(shí)例，用于給藥的適合的藥物組合物的儲庫的體積可以是O.1至50ml ο
連續(xù)給藥可以是借助佩戴在皮膚上并定期替換的貼片的透皮給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適于此目的的用于藥物遞送的貼片系統(tǒng)。注意到的是透皮給藥特別地適于不間斷的給藥，因?yàn)橄缺挥猛甑馁N片的調(diào)換可有利地同時以一片新貼片的替換而完成，例如在皮膚的表面上毗連至先用完的貼片以及立即在移除先用完的貼片之前。不會產(chǎn)生流體中斷或動力不足的問題。
包含靶向?qū)弓h(huán)境獨(dú)立的⑶3表位且針對其產(chǎn)生的特別的雙特異性單鏈抗體的本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。適合的藥物載體的實(shí)例是本領(lǐng)域熟知的，包括溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液)、水、乳劑(如油/水乳劑)、各種類型的潤濕劑、無菌溶液、脂質(zhì)體等。包含此類載體的組合物可通過眾所周知的常規(guī)方法配制。制劑可包括碳水化合物、緩沖溶液、氨基酸和/或表面活性劑。碳水化合物可以是非還原糖，優(yōu)選海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇。這樣的制劑可用于可具有和/或不具有泵系統(tǒng)的靜脈內(nèi)或皮下的連續(xù)給藥。氨基酸可以是帶電荷的氨基酸，優(yōu)選賴氨酸、醋酸賴氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或組氨酸。表面活性劑可以是洗滌劑(優(yōu)選>1. 2KD的分子量)和/或聚醚 (優(yōu)選>3KD的分子量)。優(yōu)選地,優(yōu)選洗漆劑的非限制性實(shí)例是Tween 20> Tween 40> Tween 60, Tween 80或Tween 85。優(yōu)選聚醚的非限制性實(shí)例是PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000或 PEG 5000。本發(fā)明使用的緩沖劑系統(tǒng)可優(yōu)選pH 5-9，并且可包括檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽、組氨酸和醋酸鹽。本發(fā)明的組合物可以以適合的劑量給個體給藥，所述劑量可例如通過劑量遞增研究確定，所述研究通過給非黑猩猩靈長類動物(例如，獼猴)施用劑量漸增的顯示具有本文描述的跨物種特異性的本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子進(jìn)行。如上所述，顯示具有本文描述的跨物種特異性的本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子可有利地以在非黑猩猩靈長類動物的臨床前試驗(yàn)中以 及作為人用藥物的同樣形式使用。這些組合物也可與其他蛋白質(zhì)性的和非蛋白質(zhì)性的藥物組合給藥。這些藥物可與包含如本文定義的本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的組合物同時給藥，或者以適時地被定義的間隔和劑量在施用所述多肽之前或之后分開給藥。給藥方案是由主治醫(yī)生和臨床因素決定的。如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的，任何一位患者的劑量均取決于許多因素(包括患者的體型、體表面積、年齡、給藥的特定化合物、性別、給藥時間和途徑、一般健康狀況以及要同時給藥的其他藥物)。用于腸胃外給藥的制劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶液的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、 植物油(如橄欖油)以及可注射的有機(jī)酯(如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇的/水性溶液、 乳劑或懸浮液(包括生理鹽水以及緩沖介質(zhì))。胃腸外的載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖與氯化鈉、乳酸林格氏或固定油。靜脈內(nèi)的載體包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如以林格氏葡萄糖為基礎(chǔ)的那些)以及類似物。防腐劑和其他添加劑也可存在，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體以及類似物。此外，本發(fā)明的組合物可包括蛋白質(zhì)性的載體，例如，血清白蛋白或免疫球蛋白，優(yōu)選人類來源。據(jù)設(shè)想，除了本文定義的本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子之外，本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包括生物活性劑，這取決于組合物的預(yù)期用途。此類藥劑可以是作用于胃腸系統(tǒng)的藥物、作用如細(xì)胞抑制劑的藥物、預(yù)防高尿酸血癥的藥物、抑制免疫反應(yīng)的藥物(例如皮質(zhì)類固醇)、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的藥物、作用于循環(huán)系統(tǒng)的藥物和/或本領(lǐng)域已知的藥劑，例如細(xì)胞因子。
本文定義的藥物組合物的生物活性可例如通過細(xì)胞毒性分析測定，如在下列實(shí)例中描述W0 99/54440 或 Schlereth 等人(Cancer Immunol.1mmunother. 20 (2005), 1-12)。 如本文所用的，“有效性”或“體內(nèi)有效性“是指使用例如標(biāo)準(zhǔn)化的NCI反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的通過用本發(fā)明的藥物組合物治療的反應(yīng)。使用本發(fā)明的藥物組合物治療成功或體內(nèi)有效性是指該組合物對其預(yù)定目的的有效性，即該組合物引起其所欲的效果的能力，所述效果即，病理細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的耗竭。體內(nèi)有效性可通過對不同的疾病實(shí)體建立的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行監(jiān)測，所述方法包括、但不限于白血細(xì)胞計數(shù)、分類、熒光活化細(xì)胞分選、骨髓穿刺。此外，可使用各種疾病特定臨床化學(xué)參數(shù)和其他建立的標(biāo)準(zhǔn)方法。此外，可使用計算機(jī)輔助體層攝影術(shù)、X-射線、核磁共振斷層掃描(例如，以美國國家癌癥研究所標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)的反應(yīng)評估 [Cheson BD, HorningSJ, Coiffier B,Shipp MA, Fisher RI,Connors JM, Lister TA, Vose Jj Grillo-Lopez A，Hagenbeek A，Cabanillas F，Klippensten D，Hiddemann W,Castellino R，Harris NLj Armitage JOj Carter WiHoppe R，Canellos GP0Reportof an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin’ slymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999Apr; 17 (4) : 1244])、正電子發(fā)射斷層掃描、白血細(xì)胞計數(shù)、分類、熒光活化細(xì)胞分選、骨髓穿剌、淋巴結(jié)活檢/組織學(xué)和各種癌癥特定臨床化學(xué)參數(shù)(例如，乳酸脫氫酶)以及其他既定的標(biāo)準(zhǔn)方法。
在開發(fā)藥物(如本發(fā)明的藥物組合物)中的另一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)是可預(yù)測的藥代動力學(xué)性質(zhì)的調(diào)整。為此，建立了候選藥物的藥代動力學(xué)特征，即，影響特定藥物在給定病況下治療能力的藥代動力學(xué)參數(shù)的圖譜。影響藥物治療某個疾病實(shí)體的能力的藥物藥代動力學(xué)參數(shù)包括、但不限于半衰期、分布容量、肝首過代謝和血清結(jié)合的程度。給定藥物試劑的有效性可被上面所提到的各個參數(shù)影響。
“半衰期”是指50%的施用藥物通過生物處理(例如，代謝、排泄等)而被消除的時間。
所謂“肝首過代謝”是指藥物在與肝臟第一次接觸(B卩，其第一次穿過肝臟的期間) 而被代謝的傾向。
“分布容量”是指遍及身體的各個隔室(例如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的空間、組織以及器官等)時藥物的保留程度，以及藥物在這些隔室內(nèi)的分布。
“血清結(jié)合程度〃是指藥物與血清蛋白(如白蛋白)相互作用并結(jié)合至血清蛋白、從而導(dǎo)致藥物生物活性降低或喪失的傾向。
藥代動力學(xué)參數(shù)還包括生物利用度、滯后時間(Tlag)、Tmax、吸收速率、給定量的施用藥物的更多發(fā)作(onset)和/或Cmax。
“生物有效性”是指藥物在血液隔室中的量。
“滯后時間〃是指藥物的給藥和它在血液或血漿中的檢出與可測性之間的時間延遲。
“Tmax”是在此時間后藥物達(dá)到最大血藥濃度的時間，“Cmax”是獲得的給定藥物的最大血藥濃度。達(dá)到其生物效應(yīng)所需的藥物的血液或組織濃度的時間受所有參數(shù)影響。 顯示具有跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體的藥代動力學(xué)參數(shù)(可在如上所列的非黑猩猩靈長類動物的臨床前動物試驗(yàn)中測定)也在例如Schlereth等人的刊物(Cancer Immunol.1mmunother. 20(2005)，1-12)中提出。
如本文所用的，術(shù)語“毒性”是指在不良事件或嚴(yán)重的不良事件中表現(xiàn)的藥物的毒性效用。這些不良事件可能是指在給藥之后藥物的整體耐受性的缺乏和/或局部耐受性的缺乏。毒性還可包括藥物引起的畸形的或致癌作用。
如本文所用的，術(shù)語“安全性”、“體內(nèi)安全性”或者“耐受性”定義在給藥之后(局部耐受性)以及在藥物應(yīng)用的較長期間，藥物的給藥沒有直接地誘發(fā)嚴(yán)重的不良事件。“安全性”、“體內(nèi)安全性”或者“耐受性”可例如在治療以及后續(xù)時間段期間在規(guī)律的間隔下進(jìn)行評估。測試包括臨床評價(例如器官表現(xiàn))以及實(shí)驗(yàn)室異常的篩選。可進(jìn)行臨床評價，并且根據(jù)NC1-CTC和/或MedDRA標(biāo)準(zhǔn)，可記錄或編碼偏離正常的結(jié)果。器官表現(xiàn)可包括以下標(biāo)準(zhǔn)，如過敏/免疫、血液/骨髓、心律失常、凝血功能以及如在常見不良事件評價標(biāo)準(zhǔn)v3. O (CTCAE)中所提出的類似標(biāo)準(zhǔn)?？杀粶y試的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)包括例如血液學(xué)、臨床化學(xué)、凝血情況與尿液分析以及其他體液如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體的檢查以及類似參數(shù)。因此， 安全性可例如通過體檢、影像學(xué)技術(shù)即超聲、X-射線、CT掃描、磁共振成像(MRI)、使用技術(shù)設(shè)備(如心電圖)的其他測量、生命體征，通過測量實(shí)驗(yàn)室參數(shù)和記錄不良事件來評估。例如，根據(jù)本發(fā)明的用途和方法，非黑猩猩靈長類動物的不良事件可通過組織病理學(xué)和/或組織化學(xué)的方法檢查。
如本文所用的，術(shù)語“有效且無毒的劑量”是指如本文定義的雙特異性單鏈抗體的可耐受的劑量，該劑量高到足以耗竭病理細(xì)胞、腫瘤消除、腫瘤縮小或穩(wěn)定疾病而沒有或基本上沒有主要毒性作用。所述有效且無毒的劑量可例如通過本領(lǐng)域描述的劑量遞增研究測定確定并且應(yīng)該低于誘發(fā)嚴(yán)重不良事件的劑量(即劑量限制毒性，DLT)。
上述術(shù)語也參考例如Preclinical safety evaluation ofbiotechnology-derived pharmaceuticals S6;ICH Harmonised Tripartite Guideline;ICH Steering Committee meeting on July 16，1997。
此外，本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療或改善癌癥的包含本發(fā)明的或根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的雙特異性單鏈抗體分子的藥物組合物。優(yōu)選地，所述癌癥是實(shí)體瘤(優(yōu)選癌或前列腺癌)。優(yōu)選地，所述藥物組合物進(jìn)一步包含載體、穩(wěn)定劑和/或賦形劑的適合制劑。
另一方面，本發(fā)明涉及如上述定義的或根據(jù)上述定義的方法生產(chǎn)的雙特異性單鏈抗體分子/多肽用于制備預(yù)防、治療或改善疾病的藥物組合物的用途。優(yōu)選地，所述疾病是癌癥。更優(yōu)選地，所述癌癥是實(shí)體瘤(優(yōu)選癌或前列腺癌)。
在本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的用途的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物適于與另外的藥物(即，作為共同療法的一部分)組合給藥。在所述共同療法中，活性劑可任選地與本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子包含在相同的藥物組合物中或者可被包含在分開的藥物組合物中。在后一種情況下，所述分開的藥物組合物適于在所述包含本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的藥物組合物的給藥前、同時或之后給藥。所述另外的藥物或藥物組合物可以是非蛋白質(zhì)性的化合物或蛋白質(zhì)性的化合物。在所述另外的藥物是蛋白質(zhì)性的化合物的情況下，有利的是該蛋白質(zhì)性的化合物能夠提供用于免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活信號。
優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)性的化合物或非蛋白質(zhì)性的化合物可與本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子、如上文定義的核酸分子、如上文定義的載體或如上文定義的宿主同時地或非同時地給藥。
本發(fā)明的另一方面涉及一種用于在有此需要的受試者中預(yù)防、治療或改善疾病的方法，所述方法包括施用有效量的本發(fā)明的藥物組合物的步驟。優(yōu)選地，所述疾病是癌癥。 優(yōu)選地，所述癌癥是實(shí)體瘤(優(yōu)選癌或前列腺癌)。
在本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物適于與另外的藥物 (即，作為共同療法的一部分)組合給藥。在所述共同療法中，活性劑可任選地與本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子包含在相同的藥物組合物中或者可被包含在分開的藥物組合物中。在后面的這種情況下，所述分開的藥物組合物適合于在所述包含本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子的藥物組合物的給藥前、同時或之后給藥。所述另外的藥物或藥物組合物可以是非蛋白質(zhì)性的化合物或蛋白質(zhì)性的化合物。在所述另外的藥物是蛋白質(zhì)性的化合物的情況下， 有利的是該蛋白質(zhì)性的化合物能夠提供用于免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活信號。
優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)性的化合物或非蛋白質(zhì)性的化合物可與本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子、如上文定義的核酸分子、如上文定義的載體或如上文定義的宿主同時地或非同時地給藥。
對上述的本發(fā)明的方法優(yōu)選地，所述受試者是人。
又一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體分子、本發(fā)明的核酸分子、 本發(fā)明的載體或本發(fā)明的宿主的試劑盒。
這些以及其他實(shí)施例公開并包含于本發(fā)明的描述部分和實(shí)施例中。免疫學(xué)的重組技術(shù)和方法描述于例如 Sambrook 等人 Molecular Cloning: ALaboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001 ；Lefkovits;Immunology Methods Manual;The Comprehensive Sourcebook ofTechniques;Academic Press,1997 ； Golemis;Protein-Protein I nteractions:AMolecular Cloning Manual;Cold Spring Laboratory Press, 2002。關(guān)于根據(jù)本發(fā)明采用的抗體、方法、用途和化合物中任一個的其它文獻(xiàn)可利用例如電子設(shè)備在公共圖書館查詢系統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫檢索。例如，可利用在互聯(lián)網(wǎng)可獲得的公共數(shù)據(jù)庫 “Medline”，例如在 http: / / www. ncb1. nlm. nih. gov/PubMed/ medline. html上。其他的數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)址，例如http://www. ncb1. nlm. nih. gov/或者在 http://www. embl. de/services/index, html上所列的EMBL服務(wù)首頁，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且，還可使用例如http://www. google, com獲得。


圖1
指定的跨物種特異性的雙特異性單鏈構(gòu)建體與用人類PSMA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞、人類 CD3+T細(xì)胞株HPB-ALL、用獼猴PSMA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞以及獼猴T細(xì)胞株4119LnPx的FACS 結(jié)合分析。如實(shí)施例2.1中所述進(jìn)行FACS染色。粗線代表隨后用抗-his抗體和PE標(biāo)記的檢測抗體孵育的用細(xì)胞培養(yǎng)上清液孵育的細(xì)胞。細(xì)直方圖線反映陰性對照僅用抗-his 抗體和檢測抗體孵育的細(xì)胞。
圖2
由重新定向到靶細(xì)胞株的指定的跨物種特異性的雙特異性單鏈構(gòu)建體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒活性。經(jīng)刺激的CD4_/CD56_人類T細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞，用人類PSMA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用作靶細(xì)胞。分析如實(shí)施例2. 2所述進(jìn)行。
本發(fā)明此外借助以下示例性的非限制性實(shí)施例進(jìn)行描述，所述實(shí)施例使得更好地理解本發(fā)明及其多個優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1PSMA和⑶3跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體分子的產(chǎn)生與表征
1.1人類PSMA抗原在CHO細(xì)胞上的克隆與表達(dá)
通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序的基因合成，將人類PSMA抗原的序列(‘AY101595’，智人前列腺特異膜抗原mRNA,完整的cds,美國國家生物技術(shù)信息中心，http://www. ncb1. nlm. nih. gov/entrez)用于獲得合成分子?；蚝铣善芜€被設(shè)計為含有用于構(gòu)建體真核表達(dá)的Kozak位點(diǎn)和在DNA的起始以及末端的限制性位點(diǎn)。被導(dǎo)入的限制性位點(diǎn)(在5’端的 XbaI和在3’端的Sail)在克隆步驟期間被用在Mack等人(Mack M等人，ProcNatl Acad Sci USA 1995; 92:7021-5 以及 Raum 等人 Cancer ImmunolImmunother (2001) 50 (3))描述的稱為 pEFDHFR的表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)。在序列確認(rèn)之后，使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞，如下所述。經(jīng)序列確認(rèn)的質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞(ATCC No. CRL 9096 ;培養(yǎng)于具有獲自BiochromAG Berlin, Germany的穩(wěn)定的谷氨酰胺的RPMI 1640中，所述RPMI 1640補(bǔ)充有10%FCS、1%青霉素/鏈霉素(全部獲自Biochrom AG Berlin, Germany)和來自細(xì)胞培養(yǎng)級試劑的母液的核苷(獲自 Sigma-AldrichChemie Gmb H, Taufkirchen, Germany)(終濃度為 10yg/ml 腺苷、10μ g/ml脫氧腺苷以及10μ g/ml胸苷)，在培養(yǎng)箱(37°C、95%濕度以及7%C02)中)。根據(jù)制造商的操作規(guī)程，使用PolyFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen GmbH, Hilden, Germany )和5μ g 的質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在24小時的培養(yǎng)后，用PBS洗滌細(xì)胞一次，并且在上述培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)(該培養(yǎng)基沒有補(bǔ)充核苷和經(jīng)透析的FCS (獲自Bioc hrom AG Berlin, Germany獲得))。因此該細(xì)胞培養(yǎng)基不含核苷并由此在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上進(jìn)行篩選。在轉(zhuǎn)染之后大約14 天，觀察到抗性細(xì)胞生長。在另外7至14天后，轉(zhuǎn)染子經(jīng)由FACS測試呈陽性即表達(dá)構(gòu)建體。在DHFR缺乏的CHO細(xì)胞中真核生物的蛋白質(zhì)表達(dá)如由Kaufmann RJ (1990)Methods Enzymol. 185，537-566描述地進(jìn)行。構(gòu)建體的基因擴(kuò)增通過增加甲氨喋呤(MTX)的濃度至高達(dá)20nM MTX的最終濃度而被誘導(dǎo)。
1. 2獼猴PSMA抗原在CHO細(xì)胞上的克隆與表達(dá)
獼猴PSMA (石蟹獼猴)的cDNA序列通過在來自根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程制備的獼猴前列腺的cDNA上的一組5次PCR獲得。下列的反應(yīng)條件1個循環(huán)的在94°C下歷時2分鐘，然后以94°C歷時I分鐘、52°C歷時I分鐘以及72°C歷時1. 5分鐘進(jìn)行40個循環(huán)，接著進(jìn)行72°C 歷時3分鐘的最終循環(huán)，并且使用以下引物
·正向引物5，-cactgtggcccaggttcgagg-3，(SEQ ID NO. 213)
反向引物5，-gacataccacacaaattcaatacgg-3，(SEQID NO. 214)
·正向引物5，-gctctgctcgcgccgagatgtgg-3，(SEQ ID NO. 215)
反向引物5’-acgctggacaccacctccagg-3’(SEQ ID NO. 216)
·正向引物:5，-ggttctactgagtgggcagagg-3，(SEQ ID NO. 217)
反向引物5，-acttgttgtggctgcttggagc-3，(SEQID NO. 218)
·正向引物5，-gggtgaagtcctatccagatgg-3，(SEQ ID NO. 219)
反向引物5’-gtgctctgcctgaagcaattcc-3’(SEQ ID NO. 220)
·正向引物5，-ctcggcttcctcttcgggtgg-3，(SEQ ID NO. 221)
反向引物5’-gcatattcatttgctgggtaacctgg-3’(SEQ ID NO. 222)
這些PCR產(chǎn)生5個重疊片段，所述片段根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程使用PCR引物進(jìn)行分離和測序，并且由此提供編碼獼猴PSMA的成熟蛋白質(zhì)的自第3個密碼子至最后一個密碼子的cDNA 序列的一部分。為了產(chǎn)生用于表達(dá)獼猴PSMA的構(gòu)建體，提供根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程的基因合成獲得 cDNA片段(構(gòu)建體的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO. 223和224)。在這個構(gòu)建體中，其后為終止密碼子的成熟PSMA蛋白質(zhì)的第3個氨基酸至最后一個氨基酸的獼猴PSMA的編碼序列在框架內(nèi)被融合至人類PSMA蛋白質(zhì)的前2個氨基酸的編碼序列。該基因合成片段還被設(shè)計為含有用于構(gòu)建體的真核表達(dá)的Kozak位點(diǎn)和在該含有cDNA的片段的起始以及末端的限制性位點(diǎn)。被導(dǎo)入的限制性位點(diǎn)(在5’端的XbaI以及在3’端的Sail)在下列克隆操作程序中使用?；蚝铣善胃鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程經(jīng)XbaI和SalI被克隆至稱為pEF_DHFR的質(zhì)粒內(nèi)。上述的操作程序根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)程(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring HarbourLaboratory Press, Cold Spring Harbour, New York(2001))進(jìn)行。具有經(jīng)序列確認(rèn)的核苷酸序列的克隆被轉(zhuǎn)染至DHFR缺乏的CHO細(xì)胞內(nèi)， 以用于構(gòu)建體的真核表達(dá)。在DHFR缺乏的CHO細(xì)胞中真核生物的蛋白質(zhì)表達(dá)如由Kaufmann RJ(1990)Methods Enzymol. 185，537-566描述地進(jìn)行。構(gòu)建體的基因擴(kuò)增通過增加甲氨喋呤(MTX)的濃度至高達(dá)20nM MTX的最終濃度而被誘導(dǎo)。
實(shí)施例2
2.1PSMA和CD3跨物種特異性的雙特異性抗體的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合分析
為了測試跨物種特異性的雙特異性抗體構(gòu)建體關(guān)于對人類和獼猴PSMA以及對人類和獼猴CD3的結(jié)合能力的功能，進(jìn)行了 FACS分析。為此，將用人類PSMA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和人類CD3陽性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig, ACC483)用于檢查對人類抗原的結(jié)合。通過使用產(chǎn)生的獼猴PSMA轉(zhuǎn)染子和獼猴T細(xì)胞系4119LnPx(由Fickenscher 教授(Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernbe)友情提供；公開于 Knappe A 等人，和Fickenscher H.，Blood 2000，95，3256-61中]測試對獼猴抗原的結(jié)合反應(yīng)性。
流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)行如下
不同細(xì)胞株的200. 000個細(xì)胞與50 μ I的經(jīng)純化的跨物種特異性的雙特異性抗體構(gòu)建體的蛋白質(zhì)(2 μ g/ml)或表達(dá)跨物種特異性的雙特異性抗體構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液在冰上孵育，歷時30分鐘。這些細(xì)胞在具有2%FCS的PBS中洗滌2次，然后用鼠抗-His抗體(Penta His抗體；Qiagen ;在50 μ I具有2%FCS的PBS中以1:20稀釋)檢測該構(gòu)建體的結(jié)合。洗滌之后，用被綴合至藻紅素的Fcy-特異性抗體(Dianova)(在具有 2%FCS的PBS中以1:100稀釋)檢測結(jié)合的抗-His抗體。未被轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的上清液用作結(jié)合至T細(xì)胞系的陰性對照。具有不相關(guān)的靶標(biāo)特異性的單鏈構(gòu)建體用作結(jié)合至經(jīng)PSMA 轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的陰性對照。
在FACS-Calibur設(shè)備上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)；CelIQuest軟件用于獲得和分析數(shù)據(jù)(Becton Dickinson biosciences, Heidelberg)。FAC S 染色和測量突光強(qiáng)度如在 Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, ffiley-1nterscience, 2002)中描述地進(jìn)行。
可清楚地檢測到對PSMA跨物種特異性的和對人類與獼猴CD3跨物種特異性的單鏈分子的雙特異性結(jié)合，如圖1所示。在FACS分析中，相比于各自的陰性對照，所有構(gòu)建體均顯示結(jié)合至CD3和PSMA。證明了雙特異性抗體對人類和獼猴CD3以及對人類和獼猴PSMA 抗原的跨物種特異性。
2. 2PSMA和⑶3跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體的生物活性
使用人類PSMA陽性細(xì)胞系CHO細(xì)胞，在體外細(xì)胞毒性分析中通過鉻51 (51Cr)釋放，分析產(chǎn)生的雙特異性單鏈抗體的生物活性。作為效應(yīng)細(xì)胞，使用經(jīng)刺激的人類CD4/CD56 耗竭的PBMC。
經(jīng)刺激的⑶4/⑶56耗竭的PBMC的產(chǎn)生如下進(jìn)行
在37°C下，用終濃度為I μ g/ml的市售抗-CD3特異性抗體(例如0KT3，Othoclone) 涂布皮氏培養(yǎng)皿(145mm直徑，Greiner bio-one Gmb H, Frickenhausen) I小時。未結(jié)合的蛋白質(zhì)通過PBS的一個洗滌步驟而被去除。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程通過Ficoll密度梯度離心從外周血(30-50ml人類血液)分離新鮮的PBMC。將3_5x IO7PBMC添加至已涂布的皮氏培養(yǎng)皿中的120ml的RPMI 1640中，所述RPMI 1640具有穩(wěn)定的谷氨酰胺/10%FCS/IL_220U/ml (Proleukin, Chiron),并且刺激2天。在第3天，收集這些細(xì)胞并且用RPMI 1640洗漆I次。 將IL-2添加至20U/ml的最終濃度，并且這些細(xì)胞在與上述相同的細(xì)胞培養(yǎng)基中再次培養(yǎng) I天。通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)程耗竭⑶4+T細(xì)胞和⑶56+NK細(xì)胞，富集了⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。
用PBS清洗靶細(xì)胞2次并且在37°C下，在最終體積為100 μ I的具有50%FCS的 RPMI中用11.1MBq51Cr進(jìn)行標(biāo)記，歷時45分鐘。隨后用5mlRPMI洗滌這些被標(biāo)記的靶細(xì)胞 3次并且接著用于細(xì)胞毒性分析中。該分析在96孔板中、在250 μ I總體積的具有Ε:Τ比 10:1的補(bǔ)充的RPMI (如上面)中進(jìn)行。應(yīng)用I μ g/ml的跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體分子和其20份3倍稀釋液。分析時間是18小時，并且以在上清液中被釋放的鉻相對于最大裂解(添加Triton-Χ)與自發(fā)裂解(無效應(yīng)細(xì)胞)的差值的相對值，測量細(xì)胞毒性。所有測量重復(fù)四次。上清液中的鉻活性的測量用Wizard3” Y計數(shù)器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Germany)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析用 Windows 的 Prism 5 (5· 01 版，GraphPad Software Inc.，SanDiego, California, USA)進(jìn)行。如由軟件所確定的，S形的劑量反應(yīng)曲線典型地具有R2值>0. 90。由分析程序計算出的EC5tl值被用于比較生物活性。
如圖2所示，所有產(chǎn)生的跨物種特異性的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體證明了生物毒活性對抗由經(jīng)刺激的人類CD4/CD56耗竭的PBMC所引發(fā)的PSMA陽性靶細(xì)胞。
實(shí)施例3scFv對抗各種細(xì)胞系的結(jié)合分析
3.1.在大腸桿菌中單鏈抗體構(gòu)建體的表達(dá)
scFv 分子 EpCAM 4-7 (W0 99/25818)、PM74-G3、PM52-H3、PM52-C3、PM75-A10 以及PM91-B6通過使用質(zhì)粒pComb3H5BFlag/His表達(dá)，其中表達(dá)構(gòu)建體(例如scFv)包括 Flag-標(biāo)簽(DYKDDDDK)和His6_標(biāo)簽。各個scFv分子的質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)化到100 μ I熱休克感受態(tài)大腸桿菌TGl中，然后在羧芐西林LB-瓊脂上進(jìn)行涂板。在用ImM IPTG誘導(dǎo)后，用含有VL-和VH-區(qū)段的pComb3H5BFlag/HiS轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生足夠數(shù)量的可溶性scFv。 由于適合的信號序列，該scFv-鏈被輸出至細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)，在該處它折疊成功能性構(gòu)象。
挑取來自轉(zhuǎn)化板的單個大腸桿菌TGl細(xì)菌菌落，用于細(xì)胞周質(zhì)的小規(guī)模制備并且在補(bǔ)充了 20mM MgCl2和羧芐西林50 μ g/ml的SB-培養(yǎng)基(例如IOml)中生長，以及在收集后再溶解于PBS (例如1ml)。通過4輪的在-70°C下冷凍、在37°C下解凍，細(xì)菌的外膜因?yàn)闇囟葲_擊被破壞，并且可溶性的細(xì)胞周質(zhì)蛋白(包括scFv)被釋放至上清液中。在通過離心去除完整的細(xì)胞和細(xì)胞碎片之后，收集含有抗-PSMA scFv的上清液并且用于結(jié)合至不同細(xì)胞系的測定。
3. 2單鏈抗體構(gòu)建體對各種細(xì)胞系的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合分析
產(chǎn)生scFv 分子 EpCAM 4-7、PM74-G3、PM52-H3、PM52-C3、PM75-A 10 以及 PM91-B6 的大腸桿菌克隆的細(xì)胞周質(zhì)制備物被用來檢驗(yàn)對人類PSMA或人類EpCAM轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株的特異性結(jié)合。未被轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用作陰性對照。
關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)，用50 μ I的scFv細(xì)胞周質(zhì)制備物孵育2，5x10s個細(xì)胞。scFv 對這些細(xì)胞的結(jié)合用在50 μ I具有2%FCS的PBS中的2μ g/ml抗-His抗體(Penta-His 抗體，沒有BSA，Qiagen GmbH, Hilden, FRG)檢測。作為第二步驟試劑，使用R-藻紅素-綴和的親和純化的F(ab’)2片段、山羊抗小鼠IgG (特定的Fe-Y片段)(在50 μ I 具有 2%FCS 的 PBS (Dianova, Hamburg, FRG)中以 1:100 稀釋)。樣品在 FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG)上測量。
流式細(xì)胞術(shù)在FACS-Calibur設(shè)備上進(jìn)行；CelIQuest軟件用于獲得和分析數(shù)據(jù)(Becton Dickinson biosciences, Heidelberg)。FACS 染色和測量突光強(qiáng)度如在 Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, ffiley-1nterscience, 2002)中描述地進(jìn)行。
scFv EpCAM 4_7顯示出對人類EpCAM轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的強(qiáng)結(jié)合，但對人類PSMA 轉(zhuǎn)染的或未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無顯著的結(jié)合。相比之下，scFvPM74-G3、PM52-H3、PM52-C3、 PM75-A10以及PM91-B6顯示出對人類PSMA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的強(qiáng)結(jié)合，但沒有對人類EpCAM 轉(zhuǎn) 染的CHO細(xì)胞或未被轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的強(qiáng)結(jié)合(不同的scFv的細(xì)胞周質(zhì)細(xì)胞提取物在被轉(zhuǎn)染的不同細(xì)胞系上的結(jié)合結(jié)果見表I)。
表1. FACS分析的結(jié)果’+’表不結(jié)合信號，，表不無顯著的結(jié)合信號
SEQ ID (nucl/prot)scFv構(gòu)建體EpCAM轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞PSMA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞未轉(zhuǎn)染的 CHO細(xì)胞KpCAM 4- 7+--PM74-G3-+-PM52-C3-+-PM52-H3-+-PM75-A10-+-PM91-B6+-
權(quán)利要求
1.一種雙特異性單鏈抗體分子，其包含第一結(jié)合域和第二結(jié)合域，所述第一結(jié)合域?yàn)榭乖嗷プ饔梦稽c(diǎn)且能夠結(jié)合至人類與白鬢狨、絨頂檉柳猴或松鼠猴CD3 ε (epsilon)鏈的表位，其中所述表位是包含在SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6以及SEQ ID NO. 8中的氨基酸序列的一部分且至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(QDGNE),所述第二結(jié)合域能夠結(jié)合至前列腺-特異性膜抗原(PSMA)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中，所述表位是包含在SEQID NO. 2、SEQ IDNO. 4、SEQ ID NO. 6以及SEQ ID NO. 8中的氨基酸序列的一部分且至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Gluο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述第一或第二結(jié)合域的至少一個是CDR-移植的、人源化的或人類的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，能夠結(jié)合至人類與非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域包含VL區(qū)域，所述VL區(qū)域含有選自下列的 CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3 (a)如SEQ ID NO. 27 中所示的 CDR-LUSEQ ID NO. 28 中所示的 CDR-L2 以及如 SEQID NO. 29 中所示的 CDR-L3 ；(b)如SEQ ID NO. 117 中所示的 CDR-LUSEQ ID NO. 118 中所示的 CDR-L2 以及如SEQ ID NO. 119中所示的CDR-L3 ;以及(c)如SEQ ID NO. 153 中所示的 CDR-LU SEQ ID NO. 154 中所示的 CDR-L2 以及如SEQ ID NO. 155 中所示的 CDR-L3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，能夠結(jié)合至人類與非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域包含VH區(qū)域，所述VH區(qū)域含有選自下列的 CDR-Hl、CDR-H2 以及 CDR-H3 (a)如SEQ ID NO. 12 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 13 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQID NO. 14 中所示的 CDR-H3 ；(b)如SEQ ID NO. 30 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 31 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQID NO. 32 中所示的 CDR-H3 ；(c)如SEQ ID NO. 48 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 49 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQID NO. 50 中所示的 CDR-H3 ；(d)如SEQ ID NO. 66 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 67 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQID NO. 68 中所示的 CDR-H3 ；(e)如SEQ ID NO. 84 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 85 中所示的 CDR-H2 以及如 SEQID NO. 86 中所示的 CDR-H3 ；(f)如SEQ ID NO. 102 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO. 103 中所示的 CDR-H2 以及如SEQ ID NO. 104 中所示的 CDR-H3 ；(g)如SEQ ID NO. 120 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 121 中所示的 CDR-H2 以及如SEQ ID NO. 122 中所示的 CDR-H3 ；(h)如SEQ ID NO. 138 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO. 139 中所示的 CDR-H2 以及如SEQ ID NO. 140 中所示的 CDR-H3 ；⑴如SEQ ID NO. 156中所示的CDR-HU SEQ ID NO. 157中所示的CDR-H2以及如SEQ ID NO. 158中所示的CDR-H3 ;以及(j)如 SEQ ID NO. 174 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO. 175 中所示的 CDR-H2 以及如SEQ ID NO. 176 中所示的 CDR-H3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，能夠結(jié)合至人類與非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域包含VL區(qū)域，所述VL區(qū)域選自如SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 125、SEQ ID NO. 129、SEQ ID NO. 161 或 SEQ IDNO. 165中所示的VL區(qū)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或3和5中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，能夠結(jié)合至人類與非黑猩猩靈長類動物CD3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域包含VH區(qū)域，所述VH區(qū)域選自如 SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 51、SEQ IDNO. 55,SEQ IDN0. 69,SEQ ID NO. 73,SEQ ID NO. 87,SEQ ID NO. 9KSEQ ID NO. 105,SEQ IDNO. 109、SEQ ID NO. 123、SEQ ID NO. 127、SEQ ID NO. 141,SEQ ID NO. 145,SEQ ID NO. 159、SEQ ID NO. 163、SEQ ID NO. 177 或 SEQ ID NO. 181 中所示的 VH 區(qū)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，能夠結(jié)合至人類與非黑猩猩靈長類動物⑶3 ε鏈的表位的第一結(jié)合域包含選自下列的VL區(qū)域和VH區(qū)域(a)如SEQ ID NO. 17 或 SEQ ID NO. 21 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 15 或 SEQ IDNO. 19中所示的VH區(qū)域；(b)如SEQ ID NO. 35 或 SEQ ID NO. 39 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 33 或 SEQ IDNO. 37中所示的VH區(qū)域；(c)如SEQ ID NO. 53 或 SEQ ID NO. 57 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID N0.51 或 SEQ IDNO. 55中所示的VH區(qū)域；(d)如SEQ ID NO. 71 或 SEQ ID NO. 75 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 69 或 SEQ IDNO. 73中所示的VH區(qū)域；(e)如SEQ ID NO. 89 或 SEQ ID NO. 93 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQID NO. 87 或 SEQ IDNO. 91中所示的VH區(qū)域；(f)如SEQ ID NO. 107 或 SEQ ID NO. 111 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQ ID NO. 105 或SEQ ID NO. 109中所示的VH區(qū)域；(g)如SEQ ID NO. 125 或 SEQ ID NO. 129 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQ ID NO. 123 或SEQ ID NO. 127中所示的VH區(qū)域；(h)如SEQ ID NO. 143 或 SEQ ID NO. 147 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQ ID NO. 141 或SEQ ID NO. 145中所示的VH區(qū)域；⑴如SEQ ID NO. 161或SEQ ID NO. 165中所示的VL區(qū)域以及如SEQ ID NO. 159或SEQ ID NO. 163中所示的VH區(qū)域；以及(j)如 SEQ ID NO. 179 或 SEQ ID NO. 183 中所示的 VL 區(qū)域以及如 SEQ ID NO. 177 或SEQ ID NO. 181中所示的VH區(qū)域。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，能夠結(jié)合至人類與非黑猩猩靈長類動物CD3e鏈的表位的第一結(jié)合域包含選自SEQ IDN0:23、25、41、43、59、61、77、79、.95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185 或 187 的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述第二結(jié)合域能夠結(jié)合至人類PSMA和/或非黑猩猩靈長類動物PSMA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述雙特異性單鏈抗體分子包含下列序列組作為在所述第二結(jié)合域中的⑶R Hl^DR H2、⑶R H3、⑶R L1、⑶R L2以及⑶R L3，所述序列組選自aSEQIDNO :226-228的CDRH1-3以及SEQIDNO:231-233的CDRL1-3 ；bSEQIDNO :240-242的CDRH1-3以及SEQIDNO :245-247的CDRL1-3 ；CSEQIDNO :254-256的CDRH1-3以及SEQIDNO:259-261的CDRL1-3 ；dSEQIDNO :268-270的CDRH1-3以及SEQIDNO:273-275的CDRL1-3 ；eSEQIDN0:618-620的CDRH1-3以及SEQIDN0:623-625的CDRL1-3 ；fSEQIDNO :282-284的CDRH1-3以及SEQIDNO :287-289的CDRL1-3 ；gSEQIDNO :296-298的CDRH1-3以及SEQIDNO:301-303的CDRL1-3 ；hSEQIDN0:310-312的CDRH1-3以及SEQIDN0:315-317的CDRL1-3 ；iSEQIDNO :324-326的CDRH1-3以及SEQIDNO :329-331的CDRL1-3 ；jSEQIDNO :338-340的CDRH1-3以及SEQIDNO :343-345的CDRL1-3 ；kSEQIDNO:352-354的CDRH1-3以及SEQIDNO:357-359的CDRL1-3 ；ISEQIDNO :366-368的CDRH1-3以及SEQIDN0:371-373的CDRL1-3 ；mSEQIDNO :380-382的CDRH1-3以及SEQIDNO:385-387的CDR L1-3ηSEQIDNO :394-396的CDRH1-3以及SEQIDNO :399-401的CDRL1-3 ；OSEQIDN0:408-410的CDRH1-3以及SEQIDN0:413-415的CDRL1-3 ；PSEQIDNO :422-424的CDRH1-3以及SEQIDNO :427-429的CDRL1-3 ；qSEQIDNO :436-438的CDRH1-3以及SEQIDN0:441-443的CDRL1-3 ；rSEQIDNO :450-452的CDRH1-3以及SEQIDNO :455-457的CDRL1-3 ；SSEQIDNO :464-466的CDRH1-3以及SEQIDNO :469-471的CDRL1-3 ；tSEQIDNO :478-480的CDRH1-3以及SEQIDNO :483-485的CDRL1-3 ；USEQIDNO :492-494的CDRH1-3以及SEQIDNO :497-499的CDRL1-3 ；VSEQIDNO :506-508的CDRH1-3以及SEQIDN0:511-513的CDRL1-3 ；WSEQIDNO:520-522的CDRH1-3以及SEQIDNO:525-527的CDR L1-3XSEQIDNO :534-536的CDRH1-3以及SEQIDNO:539-541的CDRL1-3 ；ySEQIDNO :548-550的CDRH1-3以及SEQIDNO:553-555的CDRL1-3 ；ZSEQIDNO :562-564的CDRH1-3以及SEQIDNO :567-569的CDRL1-3 ；aa)SEQ ID NO: 576-578 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO: 581-583 的 CDR L1-3 ；ab)SEQ ID NO :590-592 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO :595-597 的 CDR L1-3 ;以及ac)SEQ ID NO :604-606 的 CDR H1-3 以及 SEQ ID NO :609-611 的 CDR L1-3。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述結(jié)合域以VHPSMA-VLPSMA-VH CD3-VL CD3 或 VL PSMA-VH PSMA-VHCD3-VL CD3 的次序排列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述雙特異性單鏈抗體分子包含選自下列的序列(a)如 SEQ ID N0:237、251、265、279、629、293、307、321、335、349、363、377、391、405、.419、433、447、461、475、489、503、517、531、545、559、573、587、601 或 615 中的任一個所示的氨基酸序列；以及(b)由如 SEQ ID N0:238、252、266、280、630、294、308、322、336、350、364、378、392、406、.420、434、448、462、476、490、504、518、532、546、560、574、588、602 或 616 中的任一個所示的核酸序列編碼的氨基酸序列。
14.一種核酸序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子。
15.—種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的載體，其中，所述載體進(jìn)一步包含可操作地連接至根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸序列的調(diào)節(jié)序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的載體，其中，所述載體是表達(dá)載體。
18.一種用根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主。
19.一種用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子的方法，所述方法包括在允許表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求18所述的宿主，以及從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的多肽。
20.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的或根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法生產(chǎn)的雙特異性單鏈抗體分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其用于預(yù)防、治療或改善癌癥。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的或根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法生產(chǎn)的雙特異性單鏈抗體分子，其用于預(yù)防、治療或改善癌癥。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物或根據(jù)權(quán)利要求22所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述癌癥是實(shí)體瘤，優(yōu)選癌或前列腺癌。
24.根據(jù)權(quán)利要求20、21或23所述的藥物組合物或根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的雙特異性單鏈抗體分子，其任選地進(jìn)一步包含載體、穩(wěn)定劑和/或賦形劑的適合制劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求20、21、23或24所述的藥物組合物或根據(jù)權(quán)利要求22、23或24所述的雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述雙特異性單鏈抗體分子或藥物組合物適于與另外的藥物組合給藥。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物或雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述藥物是非蛋白質(zhì)性的化合物或蛋白質(zhì)性的化合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物組合物或雙特異性單鏈抗體分子，其中，所述蛋白質(zhì)性的化合物或非蛋白質(zhì)性的化合物與根據(jù)權(quán)利要求22、23或24所述的雙特異性單鏈抗體分子或根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的藥物組合物同時地或非同時地給藥。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的或根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法生產(chǎn)的雙特異性單鏈抗體分子在制備用于預(yù)防、治療或改善疾病的藥物組合物中的用途。
29.一種用于在有此需要的受試者中預(yù)防、治療或改善疾病的方法，所述方法包括施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的藥物組合物的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，其中，所述疾病是癌癥。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法或用途，其中，所述癌癥是實(shí)體瘤，優(yōu)選癌或前列腺
32.根據(jù)權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求28、30或31所述的用途，其中，所述藥物組合物與另外的藥物組合給藥。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法或用途，其中，所述藥物是非蛋白質(zhì)性的化合物或蛋白質(zhì)性的化合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法或用途，其中，所述蛋白質(zhì)性的化合物或非蛋白質(zhì)性的化合物與根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的藥物組合物同時地或非同時地給藥。
35.根據(jù)權(quán)利要求29至34中任一項(xiàng)所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求28或30至34所述的用途，其中，所述受試者是人。
36.一種試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的雙特異性單鏈抗體分子、根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求18所述的宿主。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙特異性單鏈抗體分子，其包含能夠結(jié)合至人類與非黑猩猩靈長類動物CD3ε鏈的表位的第一結(jié)合域，其中該表位是包含在SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6以及SEQ ID NO.8中的氨基酸序列的一部分；以及能夠結(jié)合至前列腺-特異性膜抗原(PSMA)的第二結(jié)合域。本發(fā)明還提供編碼所述雙特異性單鏈抗體分子的核酸以及載體與宿主細(xì)胞和用于其生產(chǎn)的方法。本發(fā)明還涉及包含所述雙特異性單鏈抗體分子的藥物組合物以及所述雙特異性單鏈抗體分子的醫(yī)學(xué)用途。
文檔編號C07K16/30GK103025759SQ201180027019
公開日2013年4月3日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者P·庫褔爾, T·勞姆, R·基謝爾, R·魯特布瑟, P·霍夫曼, D·勞, S·曼戈?duì)柕? M·克林格爾, E·沙勒, S·豪斯曼, P·弗盧爾, C·斯泰格爾 申請人:安進(jìn)研發(fā)(慕尼黑)股份有限公司