專利名稱：去端肽膠原及其分離方法、改性去端肽膠原及其制備方法、膠原型基質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及去端肽膠原的分離方法以及使用該方法制備的高純度去端肽膠原，特別涉及去端肽膠原的分離方法，其包括以下步驟通過有效并方便地去除雜質(zhì)，經(jīng)濟地從動物組織中分離高純度去端肽膠原，及使用相同的方法制備的高純度去端肽膠原。
另外，本發(fā)明涉及改性去端肽膠原的制備方法，所述改性去端肽膠原溶解于中性溶液中，具有顯著的生物相容性，適用于各種制劑且使用方便，以及使用相同方法制備的高純度改性去端肽膠原。
此外，本發(fā)明涉及機械強度提高并具有三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)的膠原型基質(zhì)，及其制備方法，其包括以下步驟形成密集層和多孔層，并使用上述去端肽膠原和改性去端肽膠原使上述密集層和多孔層交聯(lián)。
背景技術(shù)：
為了使生物功能組織再生，最佳地需要建立使各種細(xì)胞能夠分化和增殖的培養(yǎng)環(huán)境。為此，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)對于維持組織形狀及支持細(xì)胞生長起著重要作用。
基本上，為了建立人造組織，需要用于提供細(xì)胞生長和細(xì)胞增殖環(huán)境的技術(shù)。在人造組織的組織工程領(lǐng)域中，使用諸如膠原或蛋白聚糖的細(xì)胞外基質(zhì)以提供細(xì)胞生長的環(huán)境，而且添加用于細(xì)胞增殖的多種生長因子。
作為人造組織的生物材料，廣泛使用天然高分子，其可能包括膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白及類似的細(xì)胞外基質(zhì)。例如，膠原或纖連蛋白含有肽序列，所述序列誘導(dǎo)細(xì)胞粘附并包含精氨酸_甘氨酸-天門冬氨酸(下文中被稱為“RGD肽”)。當(dāng)RGD肽被人工地置于生物材料表面時，其能夠在生物材料表面提供產(chǎn)生細(xì)胞粘附的環(huán)境。因此，RGD肽使生物材料表面與相鄰細(xì)胞結(jié)合以模仿固有組織的功能。
特別地，在使用蛋白質(zhì)的生物材料領(lǐng)域，據(jù)信膠原是上述多種天然高分子中最重要的。原因是膠原幾乎存在于生物體的所有組織中且其提供細(xì)胞支持和細(xì)胞分裂的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)。此外，膠原是附著細(xì)胞、形成并維持器官和組織，及最終構(gòu)建生物體的不可缺少的材料。
細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白成分膠原，主要存在于包括骨骼和牙齒的硬組織中，但也存在于包括皮膚、肌腱和血管的軟組織中。在哺乳動物中，膠原約占整體蛋白質(zhì)的三分之一，且按順序地組裝細(xì)胞以形成組織或器官的基本結(jié)構(gòu)。多細(xì)胞動物在沒有膠原的情況下無法存活。因此，當(dāng)使生物體內(nèi)的病變組織恢復(fù)成正常組織時，組織的細(xì)胞外基質(zhì)可以賦予病變組織細(xì)胞的再生能力。因此，給人造組織替代物的基礎(chǔ)基質(zhì)提供膠原是非常有利的。
存在許多含有膠原的組織，諸如皮膚、韌帶、骨骼、血管、羊膜、心包、心瓣膜、胎盤、 角膜等，但膠原的種類取決于組織而彼此不同。特別地，I型膠原是組織工程領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的，因為其存在于幾乎所有組織中，包括皮膚、韌帶、骨骼等。
另外，I型膠原的兩端具有稱為端肽的非螺旋結(jié)構(gòu)域。該端肽成為免疫反應(yīng)的主要原因。事實上，當(dāng)I型膠原用作藥品或化妝品等的原料時，優(yōu)選使用通過去除端肽的去端肽膠原。
目前，一般的I型膠原的分離方法采用的步驟包括，用胰蛋白酶處理動物組織，分離細(xì)胞，然后去除細(xì)胞外基質(zhì)的礦物質(zhì)和各種蛋白，并使用其固有的極性或酸溶解度去除其他不溶于酸的膠原。通常，在I型膠原的分離過程中，進行沉淀、利用尿素緩沖液的色譜分析、離心等，并用胃蛋白酶處理以去除上述引起免疫反應(yīng)的端肽。
遺憾地，這些方法中存在許多問題。分離I型膠原的過程并不方便，且因為其需要多步驟處理，消耗了大量時間和成本。此外，為了僅分離I型膠原，在后面的步驟要去除所需的尿素，且在去除端肽后需要去除或滅活胃蛋白酶。也就是說，I型膠原的常規(guī)分離方法使分離過程更復(fù)雜并困難。而且，很難經(jīng)濟地獲得高純度的I型膠原。
此外，包含膠原的生物材料由于其低強度及生物降解性具有限制。其不能直接應(yīng)用于人體組織，即使膠原對于治療損傷是有效的。
針對膠原的這種屬性，研究人員已經(jīng)積極推進了關(guān)于使用膠原的人造組織的研究。此外，從動物組織中提取膠原的方法也正在研究中。
關(guān)于這些，韓國專利公開號10-0465015已描述了高純度I型膠原的制備方法，其包括以下步驟酶處理去除非膠原物質(zhì)以降低免疫性，用有機溶劑提取脂類雜質(zhì)和不溶性膠原，并去除脂類雜質(zhì)和不溶性膠原。然而，韓國專利公開號10-0465015中描述的使用無機溶劑的情況下，當(dāng)應(yīng)用于人體時，膠原可能變性，且毒性有機溶劑可能導(dǎo)致人體的不良反應(yīng)。
另外，在韓國專利公開號10-0676285中，已公開了從豬中分離膠原的方法,其包括以下步驟將豬的骨組織、軟骨組織、皮膚組織、肌腱/腱組織磨碎至粉末或片狀，用酸處理，然后用胃蛋白酶重復(fù)處理以首先分離I型膠原，重復(fù)3次鹽處理并滴定至中性3 次以去除雜質(zhì)，在30至37° C的低溫下中和，然后離心以使膠原沉淀。韓國專利公開號 10-0676285的方法對于防止膠原變性及去除脂類和不溶性物質(zhì)是有利的，但該方法復(fù)雜地包含多次鹽處理及滴定至中性狀態(tài)的步驟，且不足以經(jīng)濟地分離高純度的I型膠原得到良好產(chǎn)率。
由于這些缺點，據(jù)信從動物組織中高產(chǎn)率地分離I型膠原的過程，同時完全去除脂類、蛋白質(zhì)雜質(zhì)、各種不溶性雜質(zhì)、殘留的尿素、胃蛋白酶及其他剩余的酶，各種鹽類等是非常復(fù)雜和困難的技術(shù)。與此同時，在韓國專利公開號10-2002-0029859中已公開了去端肽膠原的制備方法，其包括用酸溶液均質(zhì)化哺乳動物的軟組織或硬組織，然后立即酶處理， 用典型方法分離并純化的步驟。即使該方法有利地組合并簡化了膠原純化之前的步驟，其在純化后面的步驟進行了透析和過濾以提高純度。
迄今為止，在提取膠原的過程中，已采用幾種方法以在首先分離膠原后去除各種雜質(zhì)而提高純度，所述方法包括透析、反復(fù)數(shù)次的過濾，或使用3至4個不同孔徑的過濾器重疊過濾。然而，這種透析方法不能有效地提高純度，因為膜的孔徑大小限制在12，000至 14，000道爾頓之間。使用3至4個不同孔徑的過濾器重疊過濾不能再循環(huán)且成本高，因為其消耗一些昂貴的過濾器。
因此，在屬于本發(fā)明的這個領(lǐng)域，有必要提供一種去端肽膠原的分離方法，其包括以下步驟通過有效并方便地去除雜質(zhì)，經(jīng)濟地從動物組織中分離高純度去端肽膠原。
相應(yīng)地，為了解決上述常規(guī)方法中的上述問題，本發(fā)明人提供了膠原的分離方法，5其中組合使用可重復(fù)使用過濾器的超濾和滲濾，因此，完成了通過單一步驟能高純度提取膠原的方法。
而且，本發(fā)明人開發(fā)了一種制備改性去端肽膠原的方法，所述改性去端肽膠原溶解于中性溶液，具有顯著的生物相容性，適用于各種制劑且更方便使用。這種方法能使固有膠原不需要任何水解作用直接應(yīng)用于多種領(lǐng)域，其包括化妝品領(lǐng)域、藥品領(lǐng)域和食品領(lǐng)域等，所述水解作用包括膠原的肽解和酶消化。此外，本發(fā)明人在上述方法基礎(chǔ)上提出了制造多孔基質(zhì)的方法，其包括以下步驟形成包含密集層和多孔層(2種膠原層的孔隙率彼此不同)的膠原雙層結(jié)構(gòu)，并使密集層和多孔層交聯(lián)。事實上，本發(fā)明的發(fā)明人制造了機械強度提高的三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)，并由此解決了低強度和生物降解性的問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種去端肽膠原的分離方法，其包括以下步驟通過有效并方便地去除雜質(zhì)，經(jīng)濟地從動物組織中分離高純度去端肽膠原，及使用相同方法制備的高純度去端肽膠原。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種改性去端肽膠原的制備方法，該改性去端肽膠原使膠原溶解于中性溶液以改善生物相容性，且適用于各種制劑并更方便使用，及使用相同方法制備的改性去端肽膠原。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種機械強度提高并具有三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)的膠原型基質(zhì)，及其制備方法，其包括以下步驟形成密集層和多孔層(2種膠原層的孔隙率彼此不同)，并使用上述去端肽膠原和改性去端肽膠原使密集層和多孔層交聯(lián)。
發(fā)明詳述
首先，下面將詳細(xì)地解釋本說明書中使用的術(shù)語。
如本文所使用的，術(shù)語“超濾”指的是介于精密過濾和反滲透壓法之間的過濾方法，特別是使用由濾膜引起的壓差分離和過濾材料，以去除高分子中的小分子的方法。超濾中使用的濾膜孔徑大小取決于靶材料，具有各種不同的范圍。
如本文所使用的，術(shù)語“滲濾”指的是逐漸提高所需材料的比例的方法。在滲濾過程中，在進料液(原液)、滯留物和濾液中，比濾膜孔徑大的分子被濃縮，且比濾膜孔徑小的分子被過濾以通過濾膜。但是，在滯留物中，純化的分子被部分保留，且如果需要，可恢復(fù)為原液。在這種情況下，添加凈化水以稀釋所獲得的分子，重復(fù)通過濾膜濃縮并純化以逐漸增加所需材料的比例。
下文中，將使用本說明書中使用的上述術(shù)語詳細(xì)地描述本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的一方面涉及去端肽膠原的分離方法，其包括以下步驟
(a)在容器中制備含有去端肽膠原而不含任何端肽的樣品；
(b)將含有去端肽膠原的樣品從容器中轉(zhuǎn)移至具有濾膜的過濾模塊，并對過濾模塊施壓使樣品通過濾膜進行超濾；
(C)收集在超濾步驟中通過濾膜過濾后從過濾模塊流出的去端肽膠原溶液；
(d)測量通過濾膜過濾的去端肽膠原溶液的流速以確定超濾速率；
(e)當(dāng)超濾速率達到預(yù)定水平或低于預(yù)定水平時停止超濾；
(f)收集濾膜上滯留的樣品的滯留物并回收到容器中，向收集的滯留物中加水，并將其轉(zhuǎn)移到具有濾膜的過濾模塊中進行滲濾；
(g)收集在滲濾步驟中通過濾膜過濾后從過濾模塊流出的去端肽膠原溶液；
(h)重復(fù)步驟(f)和步驟(g)。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法中，在步驟(b)中，通過泵裝置的泵送將含有去端肽膠原的樣品從容器中轉(zhuǎn)移至具有濾膜的過濾模塊，且對過濾模塊施加大約10至30psi的壓力。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法中，在步驟(e)中，當(dāng)超濾速率漸減地達到約lg/min或更低時停止超濾。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法中，在步驟(f)中，可向回收到容器中的滯留物加入與超濾過濾的溶液等體積的凈化水。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法中，滲濾可以至少重復(fù)5 次。
與此同時，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原通過上述分離去端肽膠原的方法進行制備。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面涉及琥珀酰化去端肽膠原的制備方法，其包括以下步驟
(a)使去端肽膠原溶液與琥珀酰酐反應(yīng)，并使去端肽膠原和琥珀酰酐的反應(yīng)溶液維持在堿性條件下；
(b)低溫下，攪拌去端肽膠原和琥珀酰酐的反應(yīng)物一段時間；
(c)在步驟(b)的攪拌后，使去端肽膠原和琥珀酰酐的反應(yīng)物在約pH值 Γ Ο的條件下維持一段時間；
(d)通過加入酸將去端肽膠原和琥珀酰酐的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化成酸性狀態(tài)，從而形成琥珀?；ザ穗哪z原的沉淀物；
(e)分離并獲得琥珀?；ザ穗哪z原的沉淀物。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的琥珀?；ザ穗哪z原的制備方法中，優(yōu)選地，重復(fù)步驟(b)和步驟(c)，更優(yōu)選地步驟(b)和步驟(c)重復(fù)至少4次。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的琥珀?；ザ穗哪z原的制備方法進一步包括使用酸性蒸餾水洗滌琥珀?；ザ穗哪z原沉淀物的步驟。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的琥珀?；ザ穗哪z原的制備方法進一步包括將琥珀?；ザ穗哪z原的沉淀物凍干的步驟。
與此同時，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的琥珀?；ザ穗哪z原通過上述制備琥珀?；ザ穗哪z原的方法進行制備。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面涉及酯化去端肽膠原的制備方法，其包括以下步驟
(a)通過在乙醇或甲醇中加入去端肽膠原而制備去端肽膠原膠體，通過加入酸，將去端肽膠原膠體轉(zhuǎn)化成酸性狀態(tài)，然后攪拌；
(b)在步驟(a)的攪拌后，將去端肽膠原膠體轉(zhuǎn)化成接近中性狀態(tài)，
(c)在步驟(b)的將去端肽膠原膠體轉(zhuǎn)化成接近中性狀態(tài)后，通過離心收集酯化去端肽膠原的沉淀物；以及
(d)將步驟(C)中獲得的酯化去端肽膠原的沉淀物倒入透析膜以在凈化水中進行透析。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的酯化去端肽膠原的制備方法進一步包括在步驟(d)的透析后，將酯化去端肽膠原的沉淀物凍干的步驟。
與此同時，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的酯化去端肽膠原通過上述制備酯化去端肽膠原的方法進行制備。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面涉及膠原型基質(zhì)的制備方法，其包括以下步驟
(a)將通過上述制備去端肽膠原的方法而獲得的去端肽膠原膠體均勻地涂布以形成具有均勻厚度的膜，然后凍干從而形成膠原多孔層；
(b)將通過上述制備去端肽膠原的方法而獲得的去端肽膠原膠體均勻地涂布，并用多孔吸附板按壓，從而濾出水分，并使膠原顆粒緊密連接以形成膠原密集層；
(c)將在步驟(a)中形成的膠原多孔層鋪在步驟(b)中形成的膠原密集層上，并使其在空氣中干燥從而使膠原多孔層與膠原密集層初級結(jié)合；以及
(d)使用交聯(lián)工具，使在步驟(C)中初級結(jié)合的膠原多孔層與膠原密集層之間產(chǎn)生交聯(lián)，從而使膠原多孔層與膠原密集層次級結(jié)合。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的膠原型基質(zhì)的制備方法中，當(dāng)上述交聯(lián)工具為交聯(lián)劑時，該方法進一步包括洗脫交聯(lián)劑的步驟(e)。
更優(yōu)選地，在步驟(e)中，洗脫交聯(lián)劑后進一步凍干包括膠原密集層和膠原多孔層的雙層結(jié)構(gòu)。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的膠原型基質(zhì)的制備方法中，優(yōu)選地，步驟(b)中由多孔吸附板施加的壓力為f20psi。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的膠原型基質(zhì)的制備方法中，交聯(lián)工具可以是 EDC[I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺]或戍二醒。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的膠原型基質(zhì)的制備方法中，向步驟(a)中使用的去端肽膠原膠體中加入透明質(zhì)酸。
與此同時，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的膠原型基質(zhì)通過上述制備膠原型基質(zhì)的方法進行制備。
有益效果
根據(jù)去端肽膠原的分離方法，將利用可重復(fù)使用過濾器進行的超濾過程和滲濾過程的組合，從而通過單一程序，通過有效并方便地去除雜質(zhì)，經(jīng)濟地從動物組織中提取高純度去端肽膠原。
另外，根據(jù)本發(fā)明的改性去端肽膠原的制備方法，能夠制備在中性溶液中溶解的改性去端肽膠原，其具有顯著的生物相容性，適用于各種制劑且更方便使用。有利地，這種改性去端肽膠原能夠完美的應(yīng)用于各個領(lǐng)域，包括化妝品領(lǐng)域、藥品領(lǐng)域和食品領(lǐng)域等，而不需要任何水解作用，包括膠原的肽解和酶消化。
此外，根據(jù)本發(fā)明的膠原型基質(zhì)的制備方法，通過形成包括密集層和多孔層的雙層膠原結(jié)構(gòu)(兩種膠原層的孔隙率彼此不同)并使密集層和多孔層交聯(lián)而制備膠原型基質(zhì)， 密集層和多孔層的交聯(lián)改進了膠原型基質(zhì)的機械強度。通過該方法制備的三維多孔膠原型基質(zhì)有利地克服了以下問題，即，在溶液中多孔膜被破壞并部分損失，且容易從密集層分離。
本發(fā)明的以上和其它目的、特征及優(yōu)勢結(jié)合以下詳細(xì)描述和


，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將更加明確。
圖I示出了通過根據(jù)本發(fā)明的去端肽膠原的分離方法，用于分離和純化去端肽膠原的純化裝置100的方框圖，上述分離方法組合了超濾過程和滲濾過程。
圖2和圖3是圖表和表格，其分別示出了在去除水后，通過根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原的定量結(jié)果(樣品濃度為O. 5mg/mL)。
圖4是一幅圖片和一幅圖，其分別示出了進行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)后用考馬斯亮藍染色的電泳結(jié)果，和通過根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原的定量分析結(jié)果。
圖5示出了通過對根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原進行電泳和蛋白質(zhì)印跡，鑒定純化的去端肽膠原為I型膠原的圖片。
圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原的圓二色譜的分析結(jié)果的圖表。
圖7和圖8是圖表和表格，其分別示出了為了鑒定是否存在用于去除端肽的胃蛋白酶，而在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原中進行的胃蛋白酶的定量結(jié)果。
圖9是一個數(shù)據(jù)表，其示出了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原的實時PCR結(jié)果，以確定是否存在來自豬的HEV (戊型肝炎病毒)。
圖10是一幅圖片，其示出了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)結(jié)果，以確定是否存在來自豬的JEV (日本腦炎病毒)。
圖11 一幅圖片，其示出了與常規(guī)的膠原相比較，通過根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的用于分離改性去端肽膠原的方法而獲得的琥珀?；ザ穗哪z原(電離的去端肽膠原)的溶解度。
具體實施方式
在以下實施例中將更加清楚的示出本發(fā)明實踐中和優(yōu)選的實施方式。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員，在考慮了本文公開的內(nèi)容后，可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)做出變形和改進。說明書中的參考文獻都已引入的方式納入本發(fā)明中。
實施例I :去端肽膠原的分離
實施例1-1 :動物組織的預(yù)處理
首先，制備作為動物組織的豬皮，并用自來水洗滌豬皮。在該實施例中，用豬皮作為動物組織，但是當(dāng)然也可以使用各種含有膠原的動物組織，例如牛尾、豬軟骨組織、骨組織或肌腱組織等。
將上述洗滌的豬皮切成2cmxl0cm大小的碎片。切好的豬皮浸沒在O. Γ Μ的醋酸溶液中，并在4° C下泡發(fā)16至24小時。從泡發(fā)的豬皮組織中，用小刀去除脂類和上皮，將得到的已去除脂類和上皮的組織切成Icmxlcm大小的碎片。
將切好的Icmxlcm大小的碎片組織用凈化水洗滌5至10次，然后加入到9(Γ99%9的乙醇溶液中，并在4° C下攪拌16至24小時。然后，將切好的Icmxlcm大小的碎片組織過篩以去除乙醇溶液，再次加入到90、9%的乙醇溶液中，并在4° C下攪拌5小時或更久。
然后，將在乙醇溶液中攪拌處理獲得的組織過篩，浸沒在O. f IM的醋酸溶液中， 并泡發(fā)20至60分鐘。泡發(fā)的組織與O. Γ1Μ的醋酸溶液混合。用均化器將混合的組織均化。
實施例1-2 :端肽的去除以及去端肽膠原的提取
(I)用胃蛋白酶處理在實施例1-1中進行預(yù)處理過程而獲得的溶液，在4° C下攪拌2Γ72小時，然后調(diào)節(jié)pH值至8以使胃蛋白酶失活。
(2)將步驟(I)中獲得的溶液在4。C下以7，000 15，OOOg離心10 30分鐘。然后，去除上層脂類和下層雜質(zhì)，收集中間層溶液。
(3)通過離心分離中間層溶液，并稱重，然后加入到f IOM的NaCl溶液中，在4° C 下攪拌1(Γ60分鐘以提取去端肽膠原。
(4)離心步驟(3)中獲得的溶液，從而獲得以沉淀形式的去端肽膠原。
(5)將步驟(4)中以沉淀形式獲得的去端肽膠原加入到9(Γ99%的乙醇溶液中，在 4° C下攪拌16 24小時。
(6)將步驟(5)中獲得溶液再次離心，以獲得沉淀形式的去端肽膠原，再一次重復(fù)步驟(5)。
實施例1-3 :去端肽膠原的分離和純化
(I)離心在實施例1-2中進行去端肽膠原的提取而獲得的溶液，以收集沉淀物，然后加入到O. OfO. IM的尿素溶液中，并在4° C下攪拌16至24小時。
(2)通過單一程序純化步驟(I)中獲得的溶液(下文中，稱為“目的膠原溶液”)， 該程序通過超濾和滲濾過程的組合而進行。為此，如圖I所示制備純化裝置100。圖I的裝置可以手工制造，并用從Pall公司購買的商業(yè)設(shè)備(型號名稱CENTRASETTE 系統(tǒng))組裝。
(3)在圖I中的純化裝置100中的過濾模塊30裝備有濾膜(未示出)。用凈化水洗滌留在濾膜上的NaOH。
(4)進料壓力計32和滯留物壓力計34安裝在如圖I所示的純化裝置100的過濾模塊30中，并釋放注入“目的膠原溶液”的進料部分33，以及使留在過濾模塊30中的滯留物流出返回到進料槽10中的滯留部分35的所有壓力。用水洗滌濾膜的前側(cè)。
(5)調(diào)整在如圖I所示的純化裝置100中的壓力控制閥40以對過濾模塊30的滯留部分35施加l(T30psi的壓力。給從進料部分33自由注入的凈化水增壓以洗滌濾膜的后側(cè)。洗滌后，釋放滯留部分35的壓力。
(6)制備容納“目的膠原溶液”的容器和容納純化的去端肽膠原溶液的容器，并通過軟管將這些容器與圖I的純化裝置100連接。
(7)調(diào)整在如圖I所示的純化裝置100中的壓力控制閥40以對過濾模塊30的滯留部分35施加l(T30psi的壓力。在這種情況下，通過進料泵20的泵送給從進料槽10的通過進料部分33流入到過濾模塊30的“目的膠原溶液”加壓，去端肽膠原通過濾膜并過濾。 結(jié)果是，“目的膠原溶液”首先被超濾，并且部分純化的去端肽膠原從過濾模塊30釋放并收集在之如制備的各器中。
(8)然后，在步驟(7)的超濾中，當(dāng)濾液的速度降低至約lg/min或更低時停止過濾。
(9)此外，為了改進去端肽膠原分離過程的便利性與效率，使用如圖I所示的純化裝置100執(zhí)行由超濾和滲濾組合的單一程序，從而提高去端肽膠原的產(chǎn)率和純度。也就是說，滯留在圖I所示的純化裝置100的過濾模塊30中的濾膜上的滯留物，以一定流速通過過濾模塊30的滯留部分35均勻地回收至進料槽10。在步驟(8)中，當(dāng)超濾的速度達到均勻速率或更低時，停止超濾，接著對回收至進料槽10中的滯留物進行滲濾。然后，將回收到進料槽10中的滯留物加入到與超濾的溶液體積相同體積的凈化水中，并使用圖I所示的純化裝置100將其滲濾5次或更多。
(10)將由步驟(7)中的超濾獲得的去端肽膠原溶液和由步驟(9)中的滲濾獲得的去端肽膠原溶液的PH值調(diào)節(jié)至7. 0，然后凍干，以最終獲得海綿樣的去端肽膠原。
在本實施例中所描述的去端肽膠原的分離方法已經(jīng)克服了如下的問題。當(dāng)幾種過濾器重疊時，純化成本高并且變得很麻煩，因為消耗了很多昂貴的過濾器。也就是說，使用可重復(fù)使用過濾器通過超濾部分地純化了去端肽膠原，直到超濾效率下降到低于預(yù)定的過濾速度。之后，過濾模塊30可以應(yīng)用為滲濾裝置去過濾滯留物，而不需要替換過濾器并重裝裝置。換句話說，在本實施例中所描述的去端肽膠原的分離方法能夠通過使用如圖I所示的純化裝置100的循環(huán)的單一程序有效且方便地去除雜質(zhì)，從動物組織中以高產(chǎn)率節(jié)約地提取并分離高純度的去端肽膠原。
實施例2 :在實施例I中提取并純化的去端肽膠原的純度和安全件等的分析實驗
實施例2-1 :純化的去端肽膠原中的純度、變件狀杰以及類型等的分析
將實施例I中提取并純化的去端肽膠原(樣品濃度為O. 5mg/mL)去除水后定量。如圖2和圖3所示，結(jié)果是發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原具有98%或更高的純度。
另外，通過進行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)并用考馬斯亮藍染色分析實施例I中提取并純化的去端肽膠原。如圖4所示，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原具有α肽鏈，并且具有98%或更高的純度。
此外，使用圓二色譜分析實施例I中提取并純化的去端肽膠原。如圖6中的圖表所證實，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原沒有觀察到變性，并且維持了由氫鍵鍵合的3-肽螺旋(α鏈)結(jié)構(gòu)。
此外，定量用于去除端肽的胃蛋白酶，從而確定在實施例I中純化的去端肽膠原中是否殘留有胃蛋白酶。結(jié)果如圖7和圖8所示，觀察到的結(jié)果是，在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原中，沒有檢測到胃蛋白酶。
因此，根據(jù)本發(fā)明的去端肽膠原的分離方法能夠有效地從動物組織中以高純度純化沒有變性的去端肽膠原。
另一方面，如圖5所示，通過進行電泳和蛋白質(zhì)印跡分析實施例I中提取并純化的去端肽膠原，從而確定膠原類型。結(jié)果是，上述純化的去端肽膠原被鑒定為I型膠原。在蛋白質(zhì)印跡中，利用鼠抗I型膠原單克隆抗體作為初級抗體，并與過氧化物酶共軛的兔抗-鼠 IgG作為次級抗體。
實施例2-2 :純化的去端肽膠原的安全件試驗11
由于實施例I中提取并純化的去端肽膠原來自豬的組織，所以進行安全性試驗以檢測是否有源于豬的病毒。
首先，為了鑒定實施例I中提取并純化的去端肽膠原中是否有來自豬的HEV(戊型肝炎病毒)，進行了實時PCR。結(jié)果如圖9所示，觀察到根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原呈現(xiàn)HEV (來自豬的)陰性。因為沒有檢測到HEV，所以鑒定該去端肽膠原對人類無害。
然后，為了鑒定實施例I中提取并純化的去端肽膠原中是否有來自豬的JEV(日本腦炎病毒)，進行了 RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄PCR)和電泳。由電泳圖的結(jié)果證實，觀察到?jīng)]有出現(xiàn)相當(dāng)于JEV的基因條帶。因此，因為沒有檢測到JEV，所以確定根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原對人類無害。
根據(jù)上述純化的去端肽膠原的純化、安全性等的分析數(shù)據(jù)，確定根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原為I型膠原并具有高純度，因為在去除端肽過程中添加的胃蛋白酶和其他雜質(zhì)已被去除，并且沒有動物病毒感染。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的去端肽膠原的分離方法純化的去端肽膠原可完美地應(yīng)用于各個領(lǐng)域，包括化妝品領(lǐng)域、藥品領(lǐng)域和食品領(lǐng)域等。
實施例3 :改性去端肽膠原的制備
下文中，將描述改性的琥珀?；ザ穗哪z原和酯化去端肽膠原的制備方法，所述改性使去端肽膠原可溶于中性溶液中，適合于各種制劑，使用更方便并且生物相容性提高。 相比于常規(guī)方法，根據(jù)本發(fā)明的的改性去端肽膠原的制備方法是改良的，其提高了產(chǎn)率和純度。
實施例3-1 :琥珀?；ザ穗哪z原的制備
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的琥珀?；ザ穗哪z原的制備方法如下所述
(I)將相應(yīng)于O. 002 0. 01wt%的去端肽膠原(在實施例I中純化的或市售的都是可以的)加入到O. IM的醋酸溶液中，并在4° C下攪拌Γ2天，以溶解去端肽膠原。
(2)以O(shè). 8 I. 3g :lg(琥珀酰酐步驟(I)中加入的去端肽膠原)的比例，將琥珀酰酐加入到步驟(I)中獲得的去端肽膠原溶液中，利用O. 05 IM的NaOH使pH值保持在擴10 左右10分鐘。
(3)在4° C下攪拌步驟⑵中獲得的溶液30分鐘。
(4)利用O. 05 IM的NaOH使步驟(3)中獲得的溶液的pH值保持在9 10左右10 分鐘。
(5)在4° C下攪拌步驟(4)中獲得的溶液30分鐘。
(6)利用O. 05 I的M NaOH使步驟(5)中獲得的溶液的pH值保持在9 10左右10分鐘。
(7)在4° C下攪拌步驟(6)中獲得的溶液20分鐘。
(8)利用O. 05 IM的NaOH使步驟(7)中獲得的溶液的pH值保持在9 10左右10分鐘。
(9)在4° C下攪拌步驟⑶中獲得的溶液10分鐘。
(10)利用O. 05 IM的NaOH使步驟(9)中獲得的溶液的pH值保持在9 10左右10分鐘。
(11)利用3 7M的HCl將步驟(10)中獲得的溶液的pH值調(diào)節(jié)至4. 03，從而形成琥珀?；ザ穗哪z原的沉淀物，并在4° C下攪拌15分鐘。(12)離心步驟(11)中攪拌獲得的溶液以收集琥珀?；ザ穗哪z原的沉淀物。(13)利用3 7M的HCl將步驟(12)中獲得的去端肽膠原的沉淀物加入(以20mL/g在步驟(I)中加入的去端肽膠原的比例)到PH值調(diào)節(jié)至4. 03的蒸餾水中，并在4° C下攪拌15分鐘，然后洗滌。(14)離心步驟(13)中獲得的溶液以收集洗滌后的琥珀?；ザ穗哪z原的沉淀物。(15)重復(fù)步驟(13)和步驟(14) 一次，并將獲得的洗滌后琥珀酰化去端肽膠原的沉淀物在-70° C下凍干30小時以最終獲得琥珀?；ザ穗哪z原。在下列反應(yīng)式I中示出通過上述過程制備的去端肽膠原的琥珀?；^程反應(yīng)式I
權(quán)利要求
1.一種去端肽膠原的分離方法，其包括以下步驟 (a)在容器中制備含有去端肽膠原而不含任何端肽的樣品； (b)將含有去端肽膠原的樣品從容器中轉(zhuǎn)移至具有濾膜的過濾模塊，并對過濾模塊施壓使樣品通過濾膜進行過濾； (C)收集在步驟(b)中通過濾膜過濾后從過濾模塊流出的去端肽膠原溶液； (d)測量通過濾膜過濾的去端肽膠原溶液的流速以確定超濾速率； (e)當(dāng)超濾速率達到預(yù)定水平或低于預(yù)定水平時停止超濾； (f)收集過濾膜上滯留的樣品的滯留物并回收到容器中，向收集的滯留物中加入水，然后將其轉(zhuǎn)移到具有濾膜的過濾模塊進行滲濾； (g)收集在步驟(f)中通過濾膜過濾后從過濾模塊流出的去端肽膠原溶液；以及 (h)重復(fù)步驟(f)和步驟(g)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的去端肽膠原的分離方法，其中在步驟(b)中，通過泵裝置的泵送將含有去端肽膠原的樣品從容器中轉(zhuǎn)移至具有濾膜的過濾模塊，且對過濾模塊施加10至30 psi的壓力。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的去端肽膠原的分離方法，其中在步驟(e)中，當(dāng)超濾速率達到I g/min或更低時停止超濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的去端肽膠原的分離方法，其中在步驟(f)中，可向回收到容器中的滯留物加入與超濾過濾的溶液等體積的凈化水。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的去端肽膠原的分離方法，其中所述滲濾重復(fù)至少5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的方法制備的去端肽膠原。
7 一種制備琥珀?；ザ穗哪z原的方法其包括以下步驟 (a)使去端肽膠原溶液與琥珀酰酐反應(yīng)，并使去端肽膠原和琥珀酰酐的反應(yīng)溶液維持在堿性條件下； (b)低溫下，攪拌去端肽膠原和琥珀酰酐的反應(yīng)物一段時間； (c)在步驟(b)的攪拌后，使去端肽膠原和琥珀酰酐的反應(yīng)物在pH值9 10左右的條件下維持一段時間； (d)通過加入酸將去端肽膠原和琥珀酰酐的反應(yīng)物變成酸性狀態(tài)，從而形成琥珀?；ザ穗哪z原的沉淀物；以及 (e)分離并獲得琥珀酰化去端肽膠原的沉淀物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的琥珀?；ザ穗哪z原的制備方法，其中步驟(b)和步驟(c)重復(fù)至少4次。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的琥珀?；ザ穗哪z原的制備方法，其還包括使用酸性蒸餾水洗滌琥珀?；ザ穗哪z原沉淀物的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的琥珀?；ザ穗哪z原的制備方法，其還包括將琥珀酰化去端肽膠原的沉淀物凍干的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項所述的方法制備的琥珀酰化去端肽膠原。
12.一種酯化去端肽膠原的制備方法，其包括以下步驟 (a)通過在乙醇或甲醇中加入去端肽膠原而制備去端肽膠原膠體，通過加入酸，將去端肽膠原膠體轉(zhuǎn)化成酸性狀態(tài)，然后攪拌；(b)將步驟(a)中攪拌的去端肽膠原膠體轉(zhuǎn)化成中性狀態(tài)， (C)通過離心步驟(b)的轉(zhuǎn)化成中性狀態(tài)的去端肽膠原膠體，收集酯化去端肽膠原沉淀物；以及 (d)將步驟(C)中獲得的酯化去端肽膠原沉淀物倒入透析膜以在凈化水中進行透析。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的酯化去端肽膠原的制備方法，其還包括將步驟(d)的透析后的酯化去端肽膠原的沉淀物凍干的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13中所述的方法制備的酯化去端肽膠原。
15.一種膠原型基質(zhì)的制造方法，其包括以下步驟 (a)將通過根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的方法獲得的去端肽膠原膠體均勻地涂布以形成具有均勻厚度的膜，然后凍干從而形成膠原多孔層； (b)將通過根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的方法獲得的去端肽膠原膠體均勻地涂布，并用多孔吸附板按壓，從而濾出水分，并使膠原顆粒緊密連接以形成膠原密集層； (c)將在步驟(a)中形成的膠原多孔層鋪在步驟(b)中形成的膠原密集層上，并使其在空氣中干燥從而使膠原多孔層與膠原密集層初級結(jié)合；以及 (d)使用交聯(lián)工具，在步驟(c)中初級結(jié)合的膠原多孔層與膠原密集層之間產(chǎn)生交聯(lián)，從而使膠原多孔層與膠原密集層次級結(jié)合。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的膠原型基質(zhì)的制造方法，其中所述交聯(lián)工具是EDC[1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺]或戊二醛。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的膠原型基質(zhì)的制造方法，其還包括當(dāng)交聯(lián)工具是交聯(lián)劑時，洗脫交聯(lián)劑的步驟，且其中在洗脫交聯(lián)劑之后進一步凍干包含膠原密集層和膠原多孔層的雙層結(jié)構(gòu)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的膠原型基質(zhì)的制造方法，其中向步驟(a)中使用的去端肽膠原膠體中加入透明質(zhì)酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項所述的方法制備的膠原型基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種去端肽膠原的分離方法，其中將利用可重復(fù)使用過濾器的超濾過程和滲濾過程組合，從而通過單一程序，通過有效并方便地去除雜質(zhì)，經(jīng)濟地從動物組織中提取高純度去端肽膠原。
文檔編號C07K1/34GK102933595SQ201180028248
公開日2013年2月13日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者樸是耐, 裴相喜, 李勇受 申請人:多林體森株式會社