專利名稱：結(jié)合pcsk9的基于纖連蛋白的支架域蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶克新(kexin)9型(PCSK9)的基于纖連蛋白的支架域蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及該新蛋白質(zhì)在治療應(yīng)用中用于治療動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥及其他膽固醇相關(guān)疾病的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含這些蛋白質(zhì)、編碼這些蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸的細(xì)胞，且涉及包含編碼這些新蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體。
現(xiàn)有技術(shù)動脈粥樣硬化是導(dǎo)致造成工業(yè)化國家大多數(shù)死亡的冠心病(CHD)的動脈疾病(Lusis (2000))?，F(xiàn)已充分確定CHD的若干風(fēng)險因素血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、不良飲食、不活動及緊張。在臨床上最相關(guān)且常見的血脂異常以高甘油三酯血癥存在或不存在下伴隨高膽固醇血癥的·低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白(LDL及VLDL)的增加為特征(Fredrickson等人(1967))。LDL膽固醇的單獨(dú)升高是CHD的最常見風(fēng)險因素之一。PCSK9 (亦稱作HCH0LA3、NARC-1或 3)系屬于分泌性枯草桿菌酶家族的蛋白酶K亞家族的蛋白酶(Naureckiene 等人,Arch. Biochem. Biophy.，420:55-57 (2003))。已顯不，PCSK9是膽固醇穩(wěn)態(tài)及循環(huán)低密度脂蛋白濃度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。循環(huán)PCSK9蛋白通過直接結(jié)合LDL受體并促進(jìn)其在肝細(xì)胞中的降解來控制LDL代謝。PCSK9介導(dǎo)的LDL受體蛋白質(zhì)及活性的下調(diào)可減少LDL從循環(huán)中的清除并提高LDL濃度。已知PCSK9的若干突變形式，包括 S127R、N157K、F216L、R218S 及 D374Y，其中 S127R、F216L 及 D374Y 與常染色體顯性高膽固醇血癥(ADH)關(guān)聯(lián)。人們相信野生型PCSK9可增加LDL受體的更換速率，從而導(dǎo)致LDL 清除降低(Maxwell 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. , 102(6) : 2069-2074 (2005) ；Benjannet等人及Lalanne等人)，而PCSK9的功能喪失突變會導(dǎo)致低密度脂蛋白受體(LDLR)濃度增加、循環(huán)LDL清除增加及血衆(zhòng)膽固醇水平的相應(yīng)降低(Rashid等人，Proc. Natl. Acad.Sc1.，102(15) : 5374-5379 (2005))。因此，PCSK9是治療動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥及其他膽固醇相關(guān)疾病的潛在靶標(biāo)?；诶w連蛋白的支架(fibronectin based scaffolds)是一個蛋白質(zhì)家族，這些蛋白質(zhì)能夠進(jìn)化而結(jié)合任何感興趣的化合物。這些蛋白質(zhì)通常利用源自纖連蛋白III型(Fn3)或Fn3-樣結(jié)構(gòu)域的支架，以具有天然或工程化抗體(亦即，多克隆、單克隆或單鏈抗體)的特征的方式作用，且另外具有結(jié)構(gòu)優(yōu)勢。具體而言，這些抗體模擬物的結(jié)構(gòu)已經(jīng)設(shè)計而具有最優(yōu)的折疊、穩(wěn)定性及溶解性，甚至在通常導(dǎo)致抗體結(jié)構(gòu)及功能損失的條件下亦如此。基于纖連蛋白的支架蛋白質(zhì)的一個實(shí)例是阿德奈汀(Adnectin)(Adnexus, Bristol-Myers Squibb R&D 公司)。
纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域自N末端至C末端按順序包含β或β樣鏈A ;環(huán)AB ；β或β樣鏈B ;環(huán)BC ; β或β樣鏈C ;環(huán)CD ; β或β樣鏈D ;環(huán)DE ; β或β樣鏈E ；環(huán)EF^或β樣鏈F ;環(huán)FG;及β或β樣鏈G。環(huán)AB、BC、CD、DE、EF及FG中的任一者或全部皆可參與靶物結(jié)合。BC、DE及FG環(huán)在結(jié)構(gòu)與功能兩方面皆與免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)類似。美國專利第7，115，396號描述了 Fn3結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，其中改變BC、DE及FG環(huán)可獲得高親和力TNFa結(jié)合物。美國專利申請公開第2007/0148126號描述了 Fn3結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，其中改變BC、DE及FG環(huán)可獲得高親和力VEGFR2結(jié)合物。獲得結(jié)合PCSK9的經(jīng)改良的纖連蛋白域支架蛋白質(zhì)對于治療性處理動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥及其他膽固醇相關(guān)疾病將是有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本申請?zhí)峁┽槍θ祟怭CSK9的阿德奈汀。本發(fā)明的一個方面提供包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的多肽，其中一或多個溶劑可及(solvent accessible)環(huán)已經(jīng)過隨機(jī)化或突變。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域是源自人類纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的野生型第10模塊C°Fn3)的Fn3結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的kiFM多肽與人類uiFr^結(jié)構(gòu)域至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85% 或 90% 同一。在一些實(shí)施方案 中，一或多個選自BC、DE及FG的環(huán)的長度可相對于相應(yīng)的人類纖連蛋白環(huán)延長或縮短。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽包含纖連蛋白III型第10C°Fn3)結(jié)構(gòu)域，其中該10Fn3結(jié)構(gòu)域包含環(huán)AB ;環(huán)此；環(huán)CD ^DE ^EF ;及環(huán)FG ;且選自環(huán)BC、DE及FG中的至少一個環(huán)具有相對于人類wFM結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)環(huán)的序列經(jīng)改變的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽包含含有與非環(huán)區(qū)至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列的Fn3結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的BC環(huán)包含選自由SEQ ID NO:2_17、106-135及301-303組成的組的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的BC環(huán)包含如表3中所展示的SEQ ID N0:2-17、106-135及301-303中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，BC 環(huán)包含序列 PPPSHGYG(SEQ ID NO: 2 的殘基 3_10)、DAPAHAYG (SEQ ID NO: 5的殘基 3-10)、EPFSRLPGGGE (SEQ ID NO: 106 的殘基 3-13)或 DAPADGGYG(SEQ ID NO: 107 的殘基3_11)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的DE環(huán)包含選自SEQ ID NO: 18-27及136-141的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的DE環(huán)包含如表3中所示的SEQ IDNO: 18-27及136-141中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，DE環(huán)包含序列PGKG(SEQ ID NO: 18 的殘基 2-5)、VGVG(SEQ ID NO: 27 的殘基 2-5)或 VSKS (SEQ ID NO: 137的殘基2-5)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的FG環(huán)包含選自SEQ ID NO:28-38及142-172的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的DE環(huán)包含如表3中所示的SEQ IDNO:28-38及142-172中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)包含序列 EYPYKHSGYYHR(SEQ ID N0:28 中的殘基 1-12)、EYPYDYSGYYHR(SEQ ID NO: 142 中的殘基
1-12)或 EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO: 167 中的殘基 1-12)。
在一些實(shí)施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域可以以氨基酸取代、插入或缺失開始及/或結(jié)束。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303中所示的BC環(huán)序列中的一個環(huán)序列；SEQ ID N0:18-27及136-141中所示的一個DE環(huán)序列；及SEQ ID NO:28-38及142-172中所示的一個FG環(huán)序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)包含一個BC環(huán)序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO: 2-17、106-135及301-303中任一者的陰影部分；一個DE環(huán)序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO: 18-27及136-141中任一者的陰影部分；及一個FG環(huán)序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO: 28-38及142-172中任一者的陰影部分。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO:2-38、106-172及301-303中的任一者至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 同一的 BC、DE 及 FG 環(huán)氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)包含與如上文所述表3中所示的BC、DE及FG環(huán)的陰影部分中的任一者至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 同一的 BC、DE 及 FG 環(huán)
氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO: 39-76、173-290及304-309
中任一者的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO: 39-76、173-290及304-309中任一者的第3至96位的Fn3結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。在一個方面，本發(fā)明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SW(X1)zX2GGEQ IDNO: 323)的BC環(huán)，其中X1為任意氨基酸，Z為6至9的數(shù)值，且X2SY或H。在一個方面，本發(fā)明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列PX1X1X1X3I^SEQ IDNO: 324)的DE環(huán)，其中X1為任意氨基酸且X3為G或S。

在一個方面，本發(fā)明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325)的 FG 環(huán)，其中 X1 為任意氨基酸;X4 為 Y 或 F ；X5 為 Y、F或W;且&系3或A。在某些實(shí)施方案中，X4及X5系各自獨(dú)立選自Y、F、W或H的芳香族殘基。在一個方面，本發(fā)明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SW(X1)ZX2G(SEQID NO:323)的BC環(huán)、具有序列PX1X1X1X3I^SEQ ID NO:324)的DE環(huán)及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325)的 FG 環(huán)，如本文所定義。在一個方面，本發(fā)明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SWEPFSRLPGGGE (SEQID NO: 106)的BC環(huán)、具有序列PX1X1X1X3I^SEQId NO:324)的DE環(huán)、及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325)的 FG 環(huán)，如本文所定義。在一個方面，本公開提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列(X1)zX2GGEQ IDNO:449)的BC環(huán)，其中X1為任意氨基酸，Z為6至9的數(shù)值，且X2SY或H。在一個方面，本公開提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列PX1X1X1X3I^SEQ IDNO:450)的DE環(huán)，其中X1為任意氨基酸，且X3SG或S。在一個方面，本公開提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQ ID N0:451)的 FG 環(huán)，其中 X1 為任意氨基酸;X4 為 Y 或 F ；X5 為 Y、F或W;且X6 SS或A。在某些實(shí)施方案中，X4及X5為各自獨(dú)立選自Y、F、W或H的芳香族殘基。
在一個方面，本發(fā)明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列(X1)ZX2GGEQID NO:449)的BC環(huán)、具有序列X1X1X1XjSEQ ID NO:450)的DE環(huán)及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQ ID N0:451)的 FG 環(huán)，如本文所定義。在一些實(shí)施方案中，PCSK9阿德奈汀的N末端存在至少一個氨基酸缺失。在一些實(shí)施方案中，PCSK9阿德奈汀的C末端存在至少一個氨基酸缺失、插入或取代。在一些實(shí)施方案中，將接頭添加至PCSK9阿德奈汀的C末端。在一些實(shí)施方案中，PCSK9阿德奈汀可與非1QFn3部分(例如人類血清白蛋白(HSA))偶聯(lián)，如 PCT 公開第 W02009/133208 號及第 W02009/083804 中所述。在一些實(shí)施方案中，PCSK9阿德奈汀在AB、⑶及EF環(huán)氨基酸序列中可具有突變，如PCT公開第W02009/133208號及第W02009/083804號中所述。在一個方面中，抗PCSK9阿德奈汀進(jìn)一步包含藥動學(xué)(PK)部分。在一個實(shí)施方案中，PK部分包含聚乙二醇(PEG)。在某些實(shí)施方案中，PK部分包含F(xiàn)e區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，PK包含一或多個結(jié)合血清白蛋白的阿德奈汀。例示性抗PCSK9阿德奈汀-Fe融合蛋白質(zhì)展示于表I中。例示性結(jié)合抗PCSK9-血清白蛋白的阿德奈汀包含SEQ ID N0:618或619。在某些實(shí)施方案中，具有PK部分的抗PCSK9阿德奈汀包含如SEQ IDNO: 322中所述的序列。在另一方面中，抗PCSK9阿德奈汀不包含任何PK部分(即，“裸露的”抗PCSK9阿德奈汀)。在某些實(shí)施方案中，可以利用可充分達(dá)成期望治療效果的頻率施用裸露的抗PCSK9阿德奈汀。在另一實(shí)施方案中 ，可使用延長釋放制劑(例如，皮下制劑)施用裸露抗PCSK9阿德奈汀。在一些實(shí)施方案中，延長釋放制劑增加吸收期的長度、或延長該藥效學(xué)效應(yīng)、或二者。僅僅為了舉例說明，延長釋放制劑包含丙二醇/PBS溶液。在一個方面，本申請?zhí)峁┛捎糜谥委焺用}粥樣硬化、高膽固醇血癥及其他膽固醇相關(guān)疾病的抗PCSK9阿德奈汀。在一個方面，本發(fā)明提供融合多肽，其包含結(jié)合血清白蛋白的纖連蛋白III型第
10(10Fn3)結(jié)構(gòu)域及抗PCSK9阿德奈汀，其中所述結(jié)合血清白蛋白的1QFn3結(jié)構(gòu)域以ΙμΜ或更低的Kd結(jié)合至血清白蛋白(例如，HSA)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合至血清白蛋白的uiFr^結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO:330至少70%同一的氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合至血清白蛋白的1QFn3結(jié)構(gòu)域包含具有SEQ ID NO: 331中所述氨基酸序列的BC環(huán)、具有SEQ IDNO: 332中所述氨基酸序列的DE環(huán)、及具有SEQ ID NO: 333中所述氨基酸序列的FG環(huán)。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合至血清白蛋白的kiFM結(jié)構(gòu)域包含以下中的一或多者具有SEQ IDN0:331中所述氨基酸序列的BC環(huán)、具有SEQID NO:332中所述氨基酸序列的DE環(huán)及具有SEQ ID NO: 333中所述氨基酸序列的FG環(huán)。在一個實(shí)施方案中，融合多肽的結(jié)合血清白蛋白的uiFr^結(jié)構(gòu)域亦結(jié)合至以下中的一或多者稱猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)或鼠血清白蛋白(MuSA)。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合至血清白蛋白的kiFM結(jié)構(gòu)域不與RhSA、CySA或MuSA中的一或多者交叉反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，融合多肽的結(jié)合血清白蛋白的uiFr^結(jié)構(gòu)域以I μ M或更低的Kd結(jié)合至HSA。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合血清白蛋白的wFM結(jié)構(gòu)域以500nM或更低的Kd結(jié)合至HSA。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合血清白蛋白的1QFn3結(jié)構(gòu)域以至少200nM、100nM、50nM、20nM、IOnM 或 5nM 的 Kd 結(jié)合至 HSA。在其他實(shí)施方案中，融合多肽的結(jié)合血清白蛋白的uiFr^結(jié)構(gòu)域結(jié)合至HSA的結(jié)構(gòu)域I或II。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合血清白蛋白的uiFr^結(jié)構(gòu)域結(jié)合至HSA的結(jié)構(gòu)域I與
II二者。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合血清白蛋白的kiFM結(jié)構(gòu)域在5. 5至7. 4的pH范圍結(jié)合至HSA。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合血清白蛋白的1QFn3結(jié)構(gòu)域在pH5. 5以200nM或更低的Kd結(jié)合至HSA。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合血清白蛋白的wFM結(jié)構(gòu)域在5. 5至7. 4的pH范圍以至少 500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM*5nM 的 Kd 結(jié)合至 HSA。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合血清白蛋白的1QFn3結(jié)構(gòu)域在pH5. 5以至少500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、IOnM或5nM的Kd結(jié)合至HSA。在一些實(shí)施方案中，融合多肽在血清白蛋白存在下的血清半衰期為融合多肽在血清白蛋白不存在下的血清半衰期的至少5倍。在某些實(shí)施方案中，融合多肽在血清白蛋白存在下的血清半衰期為融合多肽在血清白蛋白不存在下的血清半衰期的至少2倍、5倍、7倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、27倍或30倍。在一些實(shí)施方案中，血清白蛋白是HSA、RhSA、CySA 或 MuSA 中的任一者。在某些實(shí)施方案中，在血清白蛋白存在下融合多肽的血清半衰期為至少20小時。在某些實(shí)施方案中，在血清白蛋·白存在下融合多肽的血清半衰期系至少10小時、12小時、15小時、20小時、25小時、30小時、40小時、50小時、75小時、90小時、100小時、110小時、120小時、130小時、150小時、170小時或200小時。在一些實(shí)施方案中，融合多肽的半衰期是在靈長類動物(例如，人類或猴)或小鼠中觀察到的。在上述的任一方面及實(shí)施方案中，結(jié)合血清白蛋白的呷113結(jié)構(gòu)域包含選自SEQID NO:334、338、342、346 及 348-370 的序列。


圖1展示例示性抗PCSK9阿德奈汀氨基酸序列的比對。BC、DE及FG環(huán)氨基酸序列分別通過下劃線、斜體/下劃線或粗體/下劃線來標(biāo)識。圖2是描繪PCSK9 :表皮生長因子前體同源結(jié)構(gòu)域(EGFA結(jié)構(gòu)域)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)測定的示意圖，使用該測定來測量抑制PCSK9:LDLR的PCSK9阿德奈汀的效能，如實(shí)施例2中所述。圖3展示自FRET測定生成的曲線，使用該測定來測量PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、1813E02、1922G04 及 1923B02(小圖 A)及克隆 1459D05、2012A04、2011H05及2013E01 (小圖B)對人PCSK9:EGFA的抑制，如實(shí)施例2中所述。圖4展示自FRET測定生成的曲線，使用該測定來測量PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、1813E02、1922G04 及 1923B02(小圖 A)及克隆 2011H05.2012A04 及2013E01 (小圖B)對人類PCSK9:ATI000972相互作用的抑制，如實(shí)施例2中所述。圖5 展示 PCSK9 阿德奈汀克隆 1459D05、1784R)3、1813E02、1922G04 及 1923B02 (小圖A)及克隆2011H05、2012A04及2013E01 (小圖B)在直接結(jié)合人PCSK9FRET測定中的活性，如實(shí)施例2中所述。
圖6展示通過Di1-LDL攝取法測定的H印G2細(xì)胞中對PCSK9活性的抑制，如實(shí)施例2中所述。圖7 展示 PCSK9 阿德奈汀克隆 1459D05、1784F03、2012A04 及 2011H05(小圖 A)及克隆ID2011H05.2012A04及2013E01 (小圖B)對由PCSK9誘導(dǎo)的H印G2細(xì)胞表面LDLR消耗的抑制，如實(shí)施例2中所述。1784F03、2012A04、2011H05及2013E01的EC50 (nM)分別為 15. 98,7. 78,8. 85 及 12. 41 ；75nM 的 PCSK9 阿德奈汀克隆 1459D05、1784F03、2012A04、2011H05 及 2013E01 對 PCSK9 抑制的百分比分別為 66. 8,150. 2,190. 1,177. 4 及 152. 2。圖8展示在過表達(dá)hPCSK9的轉(zhuǎn)基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATI000959 (IOOmg/kg)對血漿膽固醇(小圖A)及血漿未結(jié)合hPCSK9(小圖B)的體內(nèi)效應(yīng)，如實(shí)施例3中所述。ATI000959 含有 40kDa 的帶支鏈 N0FPEG。圖9展示在過表達(dá)hPCSK9的轉(zhuǎn)基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATI001114(10或60mg/kg)對血漿膽固醇水平(小圖A)及血漿未結(jié)合hPCSK9水平(小圖B)的體內(nèi)效應(yīng)，如實(shí)施例3中所述。圖10展示在正常表達(dá)者h(yuǎn)PCSK9轉(zhuǎn)基因小鼠中，以5mg/kg經(jīng)腹膜內(nèi)(1. p.)單劑量施用的PCSK9阿德奈汀ATI000959 (小圖A)或ATIOOl 114 (小圖B)對未結(jié)合血漿hPCSK9的體內(nèi)效應(yīng)(平均值+/-SD)，如實(shí)施例3中所述。圖11展示在正常表達(dá)者h(yuǎn)PCSK9轉(zhuǎn)基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATIOOl114對未結(jié)合hPCSK9的劑量依賴性效應(yīng)，如實(shí)施例3中所述。圖12展示在食蟹猴中，單劑量PCSK9阿德奈汀ATI001114 (5mg/kg，經(jīng)靜脈內(nèi))對LDL-C降低的效應(yīng)(平均值+/-SEM，n=3)，如實(shí)施例3中所述。圖13. PCSK9阿德奈 汀結(jié)合hPCSK9的親和力及化學(xué)計量的ITC測定。PCSK9阿德奈汀以1:1化學(xué)計量結(jié)合詘051(9。左圖展示PCSK9阿德奈汀ATI001081的數(shù)據(jù)。左圖展示PCSK9阿德奈汀ATIOOl 174的數(shù)據(jù)。圖 14. PCSK9 阿德奈汀對 PCSK9:EGFA FRET 測定(左圖)及 PCSK9:AT1-972FRET測定(右圖)的抑制。圖15.抗PCSK9阿德奈汀對由PCSK9誘導(dǎo)的!fepG2細(xì)胞表面LDLR消耗的抑制。圖16.在H印G2細(xì)胞中對PCSK9-AF647細(xì)胞進(jìn)入的抑制。圖17.經(jīng)PRD460處理(經(jīng)腹膜內(nèi)給予)的轉(zhuǎn)基因小鼠中血漿未結(jié)合hPCSK9的水平。圖18.在食蟹猴中，PRD460 (15mg/kg,經(jīng)靜脈內(nèi))對LDL-C及游離PCSK9的效應(yīng)(平均值 +/-SEM，n=3)。圖19.在食蟹猴中，AT1-1081 (亦稱作ATI001081)對未結(jié)合PCSK9水平的效應(yīng)。圖20.在食蟹猴中，AT1-1081對LDL-C水平的效應(yīng)。圖21.存于PBS媒介中的AT1-1081在轉(zhuǎn)基因小鼠中的效應(yīng)。該圖說明了轉(zhuǎn)基因小鼠中未結(jié)合血漿hPCSK9的水平。圖22.在PG媒介中經(jīng)皮下給予的AT1-1081在轉(zhuǎn)基因小鼠中的效應(yīng)。該圖說明了轉(zhuǎn)基因小鼠中未結(jié)合hPCSK9的水平。圖23.小鼠中的體內(nèi)HSA半衰期。以20mg/kg (小圖A)或50mg/kg (小圖B)將HSA注射至裸小鼠中。
圖 24. SABA1.1 (小圖 A)、SABA2.1 (小圖 B)、SABA3.1 (圖 C)及 SABA4.1 (圖 D)在
小鼠中的半衰期測定。圖25.展示SABA1-4在與HSA共注射時在小鼠中的半衰期延長的總結(jié)的線圖。圖26. SABA1.1 (小圖A)及SABA5.1 (小圖B)在食蟹猴中的半衰期測定。圖27.通過直接結(jié)合ELISA測定測得的SABA1. 2與人、小鼠及大鼠的白蛋白的結(jié)
合圖28. SABA1.1與HSA的化學(xué)計量的測定。SABA1.1與HSA以1:1的化學(xué)計量結(jié)
合圖29. SABA1. 2對HSA的重組結(jié)構(gòu)域片段的結(jié)合的Biacore貨分析。圖30.以Impk及IOmpk給予的SABA1. 2在食蟹猴中的藥動學(xué)概貌。圖31.經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下以Impk給予的SABA1. 2在猴中的藥動學(xué)概貌。發(fā)明詳述定義“多肽”意指任何兩個或更多個氨基酸的序列，無論其長度、翻譯后修飾或功能。在本文中，”多肽”、”肽”與”蛋白質(zhì)”可互換使用。多肽可包括天然氨基酸及非天然氨基酸，例如闡述于美國專利第6，559，126號中者，該專利以引用方式并入本文中。多肽亦可以多種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方式中的任一者來修飾(例如，氨基酸可用保護(hù)基團(tuán)修飾；羧基末端氨基酸可變成末端酰胺基；氨基末端殘基可用基團(tuán)修飾以(例如)增強(qiáng)親脂性；或多肽可經(jīng)化學(xué)糖基化或以其他方式修飾以增加穩(wěn)定性或體內(nèi)半衰期)。多肽的修飾可包括另一結(jié)構(gòu)(例如環(huán)狀化合物或其他分子)與多肽的附接，亦可包括含有一或多個構(gòu)型改變(即，R或S ;或L或D)的氨基酸的多肽。本發(fā)明的肽為源自纖連蛋白的第10III型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，它們已經(jīng)過修飾而特異性結(jié)合至PCSK9，并且在本文中被稱作”抗PCSK9阿德奈汀”或”PCSK9阿德奈汀”。術(shù)語”PK”是”藥動學(xué)”的縮寫，且涵蓋化合物的包括(例如)被受試者吸收、分布、代謝及消除的性質(zhì)?！?PK調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)”或” PK部分”指任何當(dāng)與生物活性分子融合或一起施用時影響生物活性分子的藥動學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)、肽或部分。PK調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或PK部分的實(shí)例包括PEG、人血清白蛋白(HSA)結(jié)合物(如美國專利申請公開第2005/0287153號及第2007/0003549號、PCT專利申請公開第W02009/083804號及第W02009/133208號中所公開的、及如本文中所述的SABA分子)、人血清白蛋白、Fe或Fe片段及其變體、及糖(例如，唾液酸)。本文中的”氨基酸 序列百分比同一性(%) ”定義為在比對各序列及(若需要)引入缺口以達(dá)成最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分的條件下，候選序列中與所選序列中的氨基酸殘基同一的氨基酸殘基的百分比。為測定氨基酸序列同一性百分比目的的比對可以通過本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)之內(nèi)的多種方式來達(dá)成，例如，使用可公開獲得的電腦軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNAStar)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定用于測量比對的合適參數(shù)，包括在所比較序列全長范圍內(nèi)達(dá)到最大比對所需要的任何算法?！胺蛛x”的多肽是已經(jīng)被鑒定并與其天然環(huán)境的成分分離和/或從其天然環(huán)境的成分回收的多肽。其天然環(huán)境的污染性成分是會干擾所述多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素及其他蛋白質(zhì)性溶質(zhì)或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將多肽純化至(I)含有95重量％以上的多肽，且最優(yōu)選含有99重量％以上的多肽，如通過Lowry方法測定的；(2)可通過使用旋杯式序列分析儀至少獲得N末端或內(nèi)部氨基酸序列殘基的程度；或(3)均一，如通過SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色所測量的。分離的多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽，因?yàn)橹辽儆幸环N多肽天然環(huán)境的成分不會存在。不過，通常來說，分離的多肽會通過至少一個純化步驟來制備。符號”mpk”、”mg/kg”或”mg/kg”指毫克每千克。所有符號在本公開通篇中可互換使用。氨基酸序列或化合物的”半衰期”通?？啥x為在活體內(nèi)多肽血清濃度降低50%(例如由于天然機(jī)制而導(dǎo)致的序列或化合物的降解及/或序列或化合物的清除或螯合)所耗費(fèi)的時間。半衰期可以本身已知的任意方式(例如藉由藥動學(xué)分析)來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到適宜的技術(shù)，適宜的技術(shù)通常可涉及例如以下步驟向靈長類動物適宜地施用適宜劑量的本發(fā)明的氨基酸序列或化合物；以規(guī)律的間隔收集來自該靈長類動物的血樣或其他試樣；測定本發(fā)明的氨基酸序列或化合物在該血樣中的水平或濃度；并根據(jù)由此獲得的數(shù)據(jù)(的作圖)計算到本發(fā)明的氨基酸序列或化合物的水平或濃度相對于給予時的初始水平降低50%為止所經(jīng)過的時間?？蓞⒄绽鐦?biāo)準(zhǔn)手冊，例如Kenneth，A等人Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996)。亦可參照 Gibaldi, M.等人，Pharmacokinetics,第 2 修訂版，MarcelDekker (1982)。半衰期可使用諸如t1/2_a、 1/2-β、HL_A_z及曲線下面積(AUC)等參數(shù)來表示。在本說明書中，”半衰期的增加”系指這些參數(shù)中的任一個、這些參數(shù)中的任兩個、這些參數(shù)中的任三個或這些參數(shù)中的所有四個的增加?！卑胨テ诘难娱L”尤其系指t1/2_i3及/或HL_λ_ζ的增加，同時有或無t1/2_a及/或AUC或二者的增加。概述本申請?zhí)峁?針對人類PCSK9的阿德奈汀。為了鑒定PCSK9特異性的拮抗劑，將PCSK9提交至大型阿德奈汀合成文庫。對結(jié)合至PCSK9的阿德奈汀篩選PCSK9結(jié)合、生物物理學(xué)性質(zhì)及PCSK9抑制活性。將抗PCSK9阿德奈汀突變，并通過降低靶物濃度將它們置于進(jìn)一步選擇壓力下，選擇具有緩慢解離速率(off-rate)的抗PCSK9阿德奈汀。通過此優(yōu)化過程，將一個阿德奈汀家族鑒定為具有有利的生物化學(xué)及生物物理學(xué)性質(zhì)的PCSK9特異性抑制劑?；诶w連蛋白的支架本申請的一個方面提供包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域的多肽，其中一或多個溶劑可及環(huán)已被隨機(jī)化或突變。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域源自人纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域C°Fn3)的野生型第 10 模塊的 Fn3 結(jié)構(gòu)域VSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO:1) 在 lclFn3 序列中，BC、DE 及FG環(huán)帶下劃線。如本文所述，可改變kiFM的非配體結(jié)合序列，即“％113支架”，前提為kiFM保持配體結(jié)合功能及/或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。已報導(dǎo)多種突變型kiFM支架。在一個方面中，Asp7、Glu9及Asp23中的一或多者被替換成另一氨基酸(例如非帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(例如，Asn,Lys等))。已報導(dǎo)與野生型形式相比，這些突變在中性pH下具有促進(jìn)突變kiFM的更大穩(wěn)定性的效應(yīng)(參見，PCT專利申請公開第W002/04523號)。以公開了多種其他的uiFr^支架中有益的或中性的改變。例如，參見Batori等人，Protein Eng. 15 (12) : 1015-1020 (2002年 12 月)；Koide 等人，Biochemistry40 (34) : 10326-10333 (2001 年 8 月 28 日)。10Fn3蛋白質(zhì)的變體與野生型二者都具有相同的結(jié)構(gòu)特征，即命名為A至G的7個β鏈結(jié)構(gòu)域序列及連結(jié)該7個β鏈結(jié)構(gòu)域序列的6個環(huán)區(qū)(AB環(huán)、BC環(huán)、⑶環(huán)、DE環(huán)、EF環(huán)及FG環(huán))。位于最靠近N-及C末端處的β鏈在溶液中可采取β樣構(gòu)象。在SEQ IDNO:1中，AB環(huán)對應(yīng)于殘基15-16，BC環(huán)對應(yīng)于殘基21-30，CD環(huán)對應(yīng)于殘基39-45，DE環(huán)對應(yīng)于殘基51-56，EF環(huán)對應(yīng)于殘基60-66，且FG環(huán)對應(yīng)于殘基76-87 (Xu等人，Chemistry&Biology9:933-942(2002))ο在一些實(shí)施方案中，1QFn3多肽可與展示于SEQ ID NO:1中的人1QFn3結(jié)構(gòu)域至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一。大部分變化通常會發(fā)生在一或多個這些環(huán)中。uiFr^多肽的每一個β或β樣鏈均可基本上由與SEQ ID NO:1的相應(yīng)β或β樣鏈的序列至少80%、85%、90%、95%或100%同一的氨基酸序列組成，前提為此變化不會破壞多肽在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施方案中，本公開提供包含纖連蛋白III型第10C°Fn3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中該uiFr^結(jié)構(gòu)域包含環(huán)AB ;環(huán)BC ;環(huán)CD ;環(huán)DE ;環(huán)EF ;及環(huán)FG ;且至少一個選自環(huán)BC、DE及FG的環(huán)具有相對于人kiFM結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)環(huán)的序列經(jīng)改變的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，BC及FG環(huán)是經(jīng)改變的，且在一些實(shí)施方案中，BC、DE及FG環(huán)是經(jīng)改變的，S卩，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域包含非天然存在的環(huán)。在一些實(shí)施方案中，AB、⑶及/或EF環(huán)是經(jīng)改變的?！苯?jīng)改變的”意指相對于模板序列(相應(yīng)人類纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)的一處或多處氨基酸序列改變，包括氨基酸添加、缺失及取代。氨基酸序列的改變可以通過有意的、盲目的或自發(fā)的序列變化，通常是核酸編碼序列的序列變化來達(dá)成，并且可以通過任何技術(shù)(例如PCR、易錯PCR或化學(xué)DNA合成)來進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，選自BC、DE及FG的一或多個環(huán)的長度可相對于相應(yīng)人類纖連蛋白環(huán)延長或縮短。在一些實(shí)施方案中，環(huán)的長度可延長2至25個氨基酸。在一些實(shí)施方案中，環(huán)的長度可減少I至11個氨基酸。因此，為了優(yōu)化抗原結(jié)合，可改變kiFM環(huán)的長度以及序列以獲得最大可能的抗原結(jié)合靈活性及親和力。在一些實(shí)施方案中，多肽包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含與SEQ IDN0:1的非環(huán)區(qū)至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列，其中選自BC、DE及FG的至少一個環(huán)是經(jīng)改變的。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)改變的BC環(huán)具有最多10個氨基酸取代、最多4個氨基酸缺失、最多10個氨基酸插入，或其組合。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)改變的DE環(huán)具有最多6個氨基酸取代、最多4個氨基酸缺失、最多13個氨基酸插入，或其組合。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)具有最多12個氨基酸取代、最多11個氨基酸缺失、最多25個氨基酸插入，或其組合。如上文所述，對應(yīng)于SEQ ID NO:1的殘基21_30、51_56及76-87的氨基酸殘基分別界定BC、DE及FG環(huán)。然而，應(yīng)了解，為了實(shí)現(xiàn)對期望的靶物(例如，PCSK9)具有強(qiáng)親和力的kiFM結(jié)合物，并非環(huán)區(qū)域內(nèi)的每一個殘基都需要進(jìn)行修飾。舉例而言，如SEQ ID NO:1中所示的BC環(huán)的殘基21⑶及22 (W)無需為了結(jié)合PCSK9而進(jìn)行修飾。亦即，以高親和力結(jié)合PCSK9的1QFn3結(jié)構(gòu)域可通過僅修飾如SEQ IDNO:1所示的環(huán)BC的殘基23-30來獲得。這一點(diǎn)顯示于表3中例示的BC環(huán)中，其表明僅有跨越陰影位置的殘基被改變。因此，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)該指定的BC環(huán)包含表3中所示的SEQ ID N0:2-17、106-135及301-303中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，BC 環(huán)可包含序列 PPPSHGYG(SEQ ID NO: 2 的殘基 3_10)、DAPAHAYG (SEQ ID NO:5 的殘基 3-10)、EPFSRLPGGGE(SEQ ID NO: 106 的殘基 3-13)或 DAPADGGYG (SEQ ID N0:107 的殘基3-11)。同樣，如SEQ ID NO:1中所示的環(huán)DE的位置51 (P)及56⑴無需進(jìn)行修飾以結(jié)合PCSK9。亦即，以高親和力結(jié)合PCSK9的1QFn3結(jié)構(gòu)域可通過僅修飾如SEQ ID NO:1所示的環(huán)DE的殘基52-55來獲得。這一點(diǎn)顯示于表3中例示的DE環(huán)中，其顯示僅有跨越陰影位置的殘基被改變。因此，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)該指定的DE環(huán)包含如表3中所示的SEQID NO: 18-27及136-141中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，DE環(huán)可包含序列 PGKG(SEQ ID NO: 18 的殘基 2-5)、VGVG(SEQ ID N0:27 的殘基 2-5)或 VSKS(SEQ IDNO: 137 的殘基 2-5)。同樣，如SEQ ID NO:1中所示的FG環(huán)的位置87⑵無需為了結(jié)合PCSK9而進(jìn)行修飾。亦即，以高親和力結(jié)合PCSK9的1QFn3結(jié)構(gòu)域可通過僅修飾如SEQ ID NO:1所示的環(huán)FG的殘基76-86來獲得。這一點(diǎn)顯示于表3中例示的FG環(huán)中，其指示僅有跨越陰影位置的殘基被改變。因此，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)該指定的FG環(huán)包含如表3中所示的SEQ IDNO: 28-38及142-172中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)可包含序列 EYPYKHSGYYHR(SEQ ID N0:28 中的殘基 1-12)、EYPYDYSGYYHR(SEQ ID NO: 142 中的殘基
1-12)或 EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO: 167 中的殘基 1-12)。在一些實(shí)施方案中，本申請揭示，BC、DE及FG環(huán)區(qū)域可以根據(jù)共有序列來概括性地描述。舉例而言，BC環(huán)可由共有序列SW(X1) ZX2G (SEQ IDNO: 323)來概括性地定義，其中X1為任意氨基酸，Z系6至9的數(shù)值 ，且X2SY或H。表3中所示的BC環(huán)，除由SEQ ID NO: 106所界定BC環(huán)以外，是此共有序列的實(shí)例。在其他實(shí)施方案中，Z為選自2至5的數(shù)值。在某些實(shí)施方案中，Z為選自10至15的數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，X2為任意芳香族殘基(即，Y、F、W 或 H)。在另一實(shí)施方案中，DE環(huán)可由共有序列PX1X1X1X3I^SEQ ID NO: 324)來概括性地定義，其中X1為任意氨基酸，且X3為G或S。表3中所示的DE環(huán)是此共有序列的實(shí)例。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)可由共有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQID NO: 325)來概括性地定義，其中X1為任意氨基酸；X4為Y或F ;X5為Y、F或W ;且X6為S或A。在某些實(shí)施方案中，X4及X5為各自獨(dú)立選自Y、F、W或H的芳香族殘基。表3中所示的FG環(huán)是此共有序列的實(shí)例。。因此，在某些實(shí)施方案中，本公開提供結(jié)合PCSK9的阿德奈汀，其包含具有序列Sff (X1) ZX2G(SEQ ID NO: 323)的 BC 環(huán)、具有序列 PX1X1X1X3T (SEQ ID NO: 324)的 DE 環(huán)、及具有序列 EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ IDNO: 325)的 FG 環(huán)，如上文所定義。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合PCSK9的阿德奈汀，其包含具有序列SWEPFSRLPGGGE (SEQ ID NO: 106)的 BC 環(huán)、具有序列 PX1X1X1X3T (SEQ ID NO: 324)的 DE 環(huán)及具有序列 EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ IDNO: 325)的 FG 環(huán)，如上文所定義。
在某些實(shí)施方案中，BC環(huán)可由共有序列(X1)zX2GGEQ ID NO:449)來概括性地定義，其中X1S任意氨基酸，Z為6至9的數(shù)值，且X2SY或H。表3中所示的BC環(huán)，除由SEQID NO: 106所界定的BC環(huán)以外，是此共有序列的實(shí)例。在其他實(shí)施方案中，Z為選自2至5的數(shù)值。在某些實(shí)施方案中，Z為選自10至15的數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，X2為任何芳香族殘基(即，Y、F、W或H)。在某些實(shí)施方案中，DE環(huán)可由共有序列X1X1X1XJSEQ ID NO:450)來概括性地定義，其中X1為任意氨基酸且X3為G或S。此共有序列由表3中所示的DE環(huán)來展示。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)可由共有序列Ex4X1X5X1X1X6Gyx4HiUSEQID NO:451)來概括性地定義，其中X1為任意氨基酸；X4為Y或F ;X5為Y、F或W ;且X6為S或A。在一些實(shí)施方案中，X4及X5為各自獨(dú)立選自Y、F、W或H的芳香族殘基。此共有序列由表3中所示的FG環(huán)來展示。因此，在一個實(shí)施方案中，本公開提供結(jié)合PCSK9的阿德奈汀，其具有包含序列(X1) ZX2G的BC環(huán)、包含序列X1X1X1X3的DE環(huán)、及包含序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR的FG環(huán)，如上文所定義。在某些實(shí)施方案中，以基于kiFM支架的抗體樣蛋白質(zhì)可由以下序列來概括性地定義EVVAAT (X) aSLLI (X) JYRITYGE (X) bQEFTV (X) yATI (X) CDYTITVYAV (X) JSINYRT (SEQID NO:328)?！ぴ赟EQ ID NO: 328中，AB環(huán)由Xa表示，CD環(huán)由Xb表示，EF環(huán)由X。表示，BC環(huán)由Xx表示，DE環(huán)由Xy表示,且FG環(huán)由Xz表示。X表示任意氨基酸,且X后的下標(biāo)表示氨基酸數(shù)目的整數(shù)。具體而言，a 可為 1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3或1-2個氨基酸的范圍內(nèi)的任意值；且b、C、X、y及z可各自獨(dú)立為2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7 或 6-7 個氨基酸的范圍內(nèi)的任意值。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，a為2個氨基酸，b為7個氨基酸，c為7個氨基酸，X為9個氨基酸，y為6個氨基酸，且z為12個氨基酸。β鏈的序列在所有7個支架區(qū)域中相對于SEQ IDNO:1中所展示的相應(yīng)氨基酸可具有以下范圍中的任意個取代、缺失或添加0至10個、O至8個、O至6個、O至5個、O至4個、O至3個、O至2個或O至I個。在例示性實(shí)施方案中，β鏈的序列在所有7個支架區(qū)域中相對于SEQ ID NO:1中所展示的相應(yīng)氨基酸可具有以下范圍中的任意個保守取代0至10個、O至8個、O至6個、O至5個、O至4個、O至3個、O至2個或O至I個。在某些實(shí)施方案中，核心氨基酸殘基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均在核心氨基酸殘基以外的殘基處發(fā)生。在例示性實(shí)施方案中，分別由(X)x、(X)y、及(X)z表示的Be、DE及FG環(huán)被用多肽替代，所述多肽包含來自表3中所示的任意PCSK9結(jié)合物的BC、DE及FG環(huán)序列，或其陰影部分，或共有序列323-325或449-451。在某些實(shí)施方案中，基于kiFM支架的抗體樣蛋白質(zhì)可由以下序列來概括性地定乂 EVVAATPTSLLI (X) JYRITYGETGGNSPVQEFTV (X) yATISGLKPGVDYTITVYAV (X)JSINYRT(SEQ ID NO:329)在SEQ ID NO: 329中，BC環(huán)由Xx表示，DE環(huán)由Xy表示，且FG環(huán)由Xz表示。X表示任意氨基酸，且X后的下標(biāo)表示氨基酸數(shù)目的整數(shù)。具體而言，X、y及Z可各自獨(dú)立為2-20、
2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7 或 6-7 個氨基酸的范圍內(nèi)的任何值。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，X為9個氨基酸，y為6個氨基酸，且z為12個氨基酸。β鏈的序列在所有7個支架區(qū)域中相對于SEQ ID NO:1中所展示的相應(yīng)氨基酸可具有以下范圍中的任意個取代、缺失或添加0至10個、O至8、0至6個、O至5個、O至4個、O至3個、O至2個或O至I個。在例示性實(shí)施方案中，β鏈的序列在所有7個支架區(qū)域中相對于SEQ ID NO:1中所展示的相應(yīng)氨基酸可具有以下范圍中的任意個保守取代0至10個、O至8個、O至6個、O至5個、O至4個、O至3個、O至2個或O至I個。在某些實(shí)施方案中，核心氨基酸殘基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均在核心氨基酸殘基以外的殘基處發(fā)生。在例示性實(shí)施方案中，分別由(X)x、(X)y、及(X)z表示的BC、DE及FG環(huán)被多肽替代，所述多肽包含來自表3中所示的任意PCSK9結(jié)合物的BC、DE及FG環(huán)序列，或其陰影部分，或共有序列323-325或449-451。在某些實(shí)施方案中，本文所述抗PCSK9阿德奈汀可包含如SEQ ID Ν0:328或329中所述的序列，其中分別由》x、(X)y& (幻2所表示的BC、DE及FG環(huán)被替代為來自表3中任意克隆的指定BC、DE及FG環(huán)的相應(yīng)集合或與表3中所列出的克隆的BC、DE或FG環(huán)序列至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一的序列。在例示性實(shí)施方案中，本文所述抗PCSK9阿德奈汀由SEQ ID NO: 329來定義，且具有來自表3中所列出的任意克隆的BC、DE及FG環(huán)序列的相應(yīng)集合。舉例而言，表3中的克隆1459D05包含分別如SEQ ID N0:2、18及28所述的BC、DE及FG環(huán)。因此，基于這些環(huán)的抗PCSK9阿德奈汀可包含SEQ ID NO: 328或 329，其中(X)x 包含 SEQ ID NO: 2, (X)y 包含 SEQ ID NO: 18，且(X)z 包含 SEQ ID NO: 28。涵蓋利用表3中其他克隆的BC、DE及FG環(huán)的集合、或共有序列323-325或449-451的相似構(gòu)建體。此類抗PCSK9阿德奈汀的支架區(qū)域可相對于SEQID NO:1的支架氨基酸殘基包含下列范圍中的任意個取代、保守取代、缺失或添加0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或O至I。只要抗PCSK9阿德奈汀能夠以期望KD結(jié)合PCSK9即可作出這些支架修飾。在一些實(shí)施方 案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的BC環(huán)包含選自下組的氨基酸序列SffPPPSHGYG (SEQ ID NO: 2)、SWRPPIHAYG (SEQ ID NO: 3)、SWDAPIHAYG (SEQ ID NO:4)、SffDAPAHAYG(SEQ ID NO:5)及 SWDAPAVTYG(SEQ ID NO:6)、SWSPPANGYG(SEQ ID NO:7)、SffTPPPKGYG(SEQ ID NO:8)、SWRPPSHAYG(SEQ ID N0:9), SffDPPSHAYG(SEQ ID NO: 10)、SffEPPSHAYG(SEQ ID NO: 11), SffSPPSHAYG(SEQ ID NO: 12), SffRPPSNGHG(SEQ ID NO: 13)、SffVPPSDDYG(SEQ ID NO:14), SffVPSSHAYG(SEQ ID NO:15),SffDPSSHAYG(SEQ ID NO:16)、及SffEPSSHAYG(SEQ ID N0:17)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的BC環(huán)包含選自SEQ IDNO: 106-135及301-303的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的BC環(huán)包含如表3中所示的SEQ ID N0:2-17、106-135及301-303中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，BC 環(huán)包含序列 PPPSHGYG(SEQ ID NO: 2 的殘基 3_10)、DAPAHAYG (SEQ ID NO: 5的殘基 3-10)、EPFSRLPGGGE (SEQID NO: 106 的殘基 3-13)或 DAPADGGYG (SEQ ID NO: 107 的殘基3_11)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的DE環(huán)包含選自下組的氨基酸序列PPGKGT (SEQ ID NO: 18)、PIVEGT (SEQ ID NO: 19)、PGSEGT (SEQ IDNO: 20)、PGSKGT (SEQID NO: 21)、PGSKST (SEQ ID NO: 22)、PVGRGT (SEQID NO: 23)、PVGEGT (SEQ ID NO: 24)、PIGKGT(SEQ ID NO:25)、PVNEGT(SEQ ID NO:26)、及 PVGVGT(SEQ ID NO:27) 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的DE環(huán)包含選自SEQ ID NO: 136-141的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的DE環(huán)包含如表3中所示的SEQ ID NO: 18-27及136-141中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，DE環(huán)包含序列PGKG(SEQ ID NO: 18的殘基2_5)、VGVG(SEQ ID N0:27 的殘基 2-5)或 VSKS(SEQ ID NO: 137 的殘基 2-5)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的FG環(huán)包含選自下組的氨基酸序列EYPYKHSGYYHRP (SEQ ID NO: 28)、EYTFKHSGYYHRP (SEQ ID NO: 29)、EYTYKGSGYYHRP (SEQID NO:30), EYTYNGAGYYHRP (SEQ ID NO:31)、EYTYIGAGYYHRP (SEQ ID NO:32)、EYTYEGAGYYHRP (SEQ ID NO: 33)、EYAYNGAGYYHRP (SEQ ID NO: 34), EYPffKGSGYYHRP (SEQIDNO:35), EFPFKffSGYYHRP (SEQ ID NO:36), EFPffPHAGYYHRP(SEQ IDN0:37)及EYAFEGAGYYHRP(SEQ ID N0:38)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的FG環(huán)包含選自SEQID NO: 142-172的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)的FG環(huán)包含如表3中所示的SEQ ID N0:28-38及142-172中任一者的陰影部分。舉例而言，在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)包含序列 EYPYKHSGYYHR(SEQ ID NO: 28 中的殘基 1-12)、EYPYDYSGYYHR (SEQ ID NO: 142中的殘基 1-12)或 EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO: 167 的殘基 1-12)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)包含一個BC環(huán)序列，其選自具有SEQIDNO: 2-17、106-135 及 301-303、或如表 3 中所展示的 SEQ ID NO: 2-17、106-135 及 301-303 中任一者的陰影部分的BC環(huán)序列；一個DE環(huán)序列，其選自具有SEQ ID NO: 18-27及136-141、或如表3中所展示的SEQ IDN0:18-27及136-141中任一者的陰影部分的DE環(huán)序列；及一個FG環(huán)序列，其選自SEQ ID NO: 28-38及142-172、或具有如表3中所展示的SEQ ID NO: 28-38及142-172中任一者的陰影部分的FG環(huán)序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)包含與SEQ ID 勵2-38、106-172、301-303中的任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一的BC、DE及FG環(huán)氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含與如表3中所示的 SEQ ID NO:2-38,106-172,301-303 中任一者的陰影部分至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100% 同一的BC、DE及FG環(huán)氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO: 39-76、173-290及304-309中任一者的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO:39-76,173-290及304-309中任一者的位置3_96的Fn3結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含與SEQ IDN0:39-76、173-290及304-309中的任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 同一的氨基酸序列。纖連蛋白天然地經(jīng)由其整聯(lián)蛋白結(jié)合基序”精氨酸-甘氨酸 天冬氨酸”(RGD)結(jié)合某些類型的整聯(lián)蛋白。在一些實(shí)施方案中，多肽包含缺乏(RGD)整聯(lián)蛋白結(jié)合基序的10Fn3結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^氨基酸取代、缺失或插入改變RGD序列來去除整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9阿德奈汀分子可經(jīng)修飾以包含N末端延伸序列及/或C末端延伸。舉例而言，MG序列可位于由SEQ ID NO:1所界定kiFM的N末端處。通常M將被切除，在N末端處留下G?；蛘撸捎萌绫?中所展示的備選N末端序列(在本文中稱作N末端延伸)(即，SEQID NO: 371-379)來替代表4中所示的抗PCSK9阿德奈汀的前10個氨基酸。另外，M、G或MG亦可位于任何具有SEQ ID NO: 371-379的N末端延伸的N末端側(cè)。本文所述抗PCSK9阿德奈汀亦可包含備選C末端尾序列(在本文中稱作C末端延伸序列)。舉例而言，表4中所展示的抗PCSK9阿德奈汀序列可在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的T94的蘇氨酸處截短(S卩，在該序列的INYRT部分之后截短)?？墒褂么私囟绦问阶鳛槌式囟绦问降闹委煼肿?，或可在蘇氨酸殘基后添加備選的C末端延伸。例示性C末端延伸序列作為SEQID NO: 380-395展示于表6中。包含C末端延伸序列的例示性抗PCSK9阿德奈汀展示于表4中。舉例而言，SEQ ID N0:49(克隆1813E02)依次包含天然存在的C末端延伸EIDKPSQ(SEQ ID NO:380)及His6標(biāo)簽。然而，應(yīng)了解，His6標(biāo)簽完全是可選的。在某些實(shí)施方案中，C末端延伸序列(亦稱為”尾”)包含E及D殘基，且長度可為介于8個與50個氨基酸之間、10個與30個氨基酸之間、10個與20個氨基酸之間、5個與10個氨基酸之間、及2個與4個氨基酸之間。在一些實(shí)施方案中，尾序列包括基于ED的接頭，其中該序列包含ED的串聯(lián)重復(fù)。在例示性實(shí)施方案中，尾序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、
3-7、3-5、3、4或5個ED重復(fù)。在某些實(shí)施方案中，基于ED的尾序列亦可包括額外氨基酸殘基，例如E1、EID、ES、EC、EGS及EGC。這些序列部分基于已知的阿德奈汀 尾序列，例如EIDKPSQ(SEQ ID NO: 380)，其中殘基D及K已被去除。在例示性實(shí)施方案中，基于ED的尾在ED重復(fù)前包含E、I或EI殘基。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)設(shè)計抗PCSK9阿德奈汀融合分子時，N或C末端序列可視需要與其他已知接頭序列(例如，表6中的SEQ ID NO:396-419)組合。包含接頭序列的例示性抗PCSK9阿德奈汀展示于表4中(例如，SEQ IDN0:53、55及57)。在一些實(shí)施方案中，可在kiFM結(jié)構(gòu)域的C末端處放置序列以便于藥動學(xué)部分的附接。舉例而言，可將諸如GSGC(SEQ ID NO: 77)等含有半胱氨酸的接頭添加至C末端，以便于對半胱氨酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)聚乙二醇化。藥動學(xué)部分在一個方面中，本 申請?zhí)峁┻M(jìn)一步包含藥動學(xué)(PK)部分的抗PCSK9阿德奈汀。改善的藥動學(xué)可根據(jù)認(rèn)識到的治療需要來評估。通常，增加生物利用度及/或延長劑量間隔時間是理想的，這可能通過增加蛋白質(zhì)給藥后在血清中保持可用的時間來實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，提高蛋白質(zhì)血清濃度隨時間的連續(xù)性(例如，減小剛施用后與即將施用前蛋白質(zhì)血清濃度的差異)是理想的。可以將抗PCSK9阿德奈汀可附接至這樣的部分，該部分將該多肽在哺乳動物(例如，小鼠、大鼠或人類)中的清除率降低至相對于未經(jīng)修飾的抗PCSK9阿德奈汀小于1/3。改善的藥動學(xué)的其他量度可包括血清半衰期，血清半衰期通常分為α階段及β階段。此兩個階段中的任一個或二者可通過添加合適的部分來顯著改善。傾向于延緩蛋白質(zhì)自血液清除的部分(本文中稱為”PK部分”)包括聚氧化烯部分(例如，聚乙二醇、糖(例如唾液酸))及耐受良好的蛋白質(zhì)部分(例如，F(xiàn)e及其片段及變體、轉(zhuǎn)鐵蛋白或血清白蛋白)。抗PCSK9阿德奈汀可融合至白蛋白或白蛋白的片段(部分)或變體，如美國專利申請公開第20070048282號中所述。在一些實(shí)施方案中，PCSK9阿德奈汀可融合至一或多個如本文所述的結(jié)合血清白蛋白的阿德奈汀(serum albumin bindingAdnectin)。在一些實(shí)施方案中，PK部分是血清白蛋白結(jié)合蛋白(serum albumin bindingprotein)，例如美國專利申請公開第2007/0178082號及第2007/0269422號中記載者。在一些實(shí)施方案中，PK部分是血清免疫球蛋白結(jié)合蛋白，例如美國專利申請公開第2007/0178082號中記載者。在一些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含聚乙二醇(PEG)。一或多個PEG分子可附接于蛋白質(zhì)上的不同位置，并且這樣的附接可通過與胺、硫醇或其他適宜的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)來達(dá)成。胺部分可以是例如存在于多肽的N末端、或諸如賴氨酸或精氨酸等氨基酸中的胺基團(tuán)處的一級胺。在一些實(shí)施方案中，PEG部分附接于多肽上選自下組的位置a)N末端；b)介于N末端與最靠N末端的β鏈或β樣鏈之間；c)位于多肽上與祀結(jié)合位點(diǎn)對置的面上的環(huán)；d)介于C末端與最靠C末端的β鏈或β樣鏈之間 ’及e)在C末端。聚乙二醇化可通過定點(diǎn)聚乙二醇化來達(dá)成，其中將適宜反應(yīng)基團(tuán)引入蛋白質(zhì)中以產(chǎn)生優(yōu)先發(fā)生聚乙二醇化的位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾以在期望位置處引入半胱氨酸殘基，從而允許對該半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)聚乙二醇化。PEG的分子量可大幅度變化，且可具支鏈或?yàn)橹辨?。在一個實(shí)施方案中，PEG具有兩條支鏈。在另一實(shí)施方案中，PEG具有4條支鏈。在一些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀融合至免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域、或其片段或變體。在例示性實(shí)施方案中，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域源自IgGl亞類，然而，亦可使用其他亞類(例如，IgG2、IgG3及IgG4)。下文所示的是人類IgGl免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域的序列，且根據(jù)EU編號格式標(biāo)明了 Fe結(jié)構(gòu)域內(nèi)每一區(qū)域的相對位置ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:315)核心鉸鏈序列加下劃線，且CHl區(qū)域?yàn)樾斌w；CH2及CH3區(qū)域?yàn)槠胀ㄎ谋?。?yīng)理解的是，C末端的賴氨酸是可選的。

所述融合物可通過將抗PCSK9阿德奈汀附接至Fe分子的任一端來形成，即，F(xiàn)e-抗PCSK9阿德奈汀或抗PCSK9-阿德奈汀-Fe排列。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)e與抗PCSK9阿德奈汀經(jīng)由接頭融合。例示性接頭序列包括AGGGGSG(SEQ ID NO: 310)、GSGSGSGSGSGS (SEQID NO:311), QPDEPGGS(SEQ ID NO:312)、ELQLEESAAEAQDGELD(SEQ ID N0:313)、TVAAPS(SEQ ID NO:314)、KAGGGGSG(SEQ ID NO:620)、KGSGSGSGSGSGS(SEQ ID N0:621)、KQPDEPGGS (SEQ ID N0:622)、KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 623)、KTVAAPS (SEQ IDNO:624)、KAGGGGSGG(SEQ ID NO:625)、KGSGSGSGSGSGSG(SEQ ID NO:626)、KQPDEPGGSG(SEQID NO: 627)、KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQID NO: 628)、KTVAAPSG (SEQ ID NO: 629)、AGGGGSGG(SEQ ID N0:630)、GSGSGSGSGSGSG(SEQ ID NO:631)、QPDEPGGSG(SEQ ID NO:632),ELQLEESAAEAQDGELDG(SEQ ID NO:633)及 TVAAPSG(SEQ IDNO:634)。在一些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀融合物中所用Fe區(qū)域包含F(xiàn)e分子的鉸鏈區(qū)域。本文所用”鉸鏈”區(qū)域包含跨越IgGl的SEQ ID N0:315中位置104-119的核心鉸鏈殘基(DKTHTCPPCPAPELLG;SEQ ID NO: 316)，其對應(yīng)于按照EU編號法的位置221-236。在某些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀-Fe融合物采取多聚體結(jié)構(gòu)(例如，二聚體)，此部分地是由于SEQ ID NO: 315在鉸鏈區(qū)域內(nèi)的位置109及112 (EU編號分別為226及229)處具有半胱氨酸殘基。在其他實(shí)施方案中，本文所用的鉸鏈區(qū)域可進(jìn)一步包括源自位于核心鉸鏈序列兩側(cè)的CHl及CH2區(qū)域的殘基，如SEQ ID NO:315中所示的。在一些實(shí)施方案中，鉸鏈序列可包括賦予的期望藥動學(xué)性質(zhì)、生物物理學(xué)性質(zhì)及/或生物學(xué)性質(zhì)的取代。一些例示性鉸鏈序列包括EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQID NO: 317 :核心鉸鏈區(qū)域帶下劃線)、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 318;核心鉸鏈區(qū)域帶下劃線)、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 319 ;核心鉸鏈區(qū)域帶下劃線)、DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 320 ;核心鉸鏈區(qū)域帶下劃線)、及DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 321 ;核心鉸鏈區(qū)域帶下劃線)。在一個實(shí)施方案中，SEQID NO: 315的位置122 (EU編號238)處的殘基P已被S替代以消除Fe效應(yīng)物功能；具有SEQ ID N0:318、319及321中的任一者的鉸鏈中示例了該替代。在另一實(shí)施方案中，SEQ IDNO: 315的位置104-105 (EU編號221-222)處的殘基DK已被GS替代以去除潛在的回形針(clip)位點(diǎn)；SEQ ID N0:319中示例了此替代。在另一實(shí)施方案中，SEQ ID N0:315的位置103 (EU編號220)處的C已被S替代以防止在不存在輕鏈時形成不適當(dāng)?shù)碾装彼徭I；SEQ IDNO:317-319中示例了此替代。在某些實(shí)施方案中，抗PCSK9阿德奈汀-Fe融合物可具有以下構(gòu)型1)抗PCSK9阿德奈汀-鉸鏈-Fe或2)鉸鏈-Fe-抗PCSK9阿德奈汀。因此，任何本發(fā)明的抗PCSK9阿德奈汀皆可融合至包含根據(jù)這些構(gòu)型的鉸鏈序列的Fe區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，可使用接頭將抗PCSK9阿德奈汀與鉸鏈-Fe部分接合，舉例而言，一種例示性融合蛋白質(zhì)可具有構(gòu)型鉸鏈-抗PCSK9阿德奈汀-接頭-Fe。另外，依賴于產(chǎn)生融合多肽的系統(tǒng)，融合多肽的N末端處可以放置前導(dǎo)序列。舉例而言，若在哺乳動物系統(tǒng)中產(chǎn)生融合物，則可將諸如METDTLLLffVLLLffVPGSTG (·SEQ ID NO: 326)等前導(dǎo)序列添加至融合分子的N末端。若在大腸桿菌(E.coli)中產(chǎn)生融合物，則融合序列的前端將為甲硫氨酸。以下序列例示哺乳動物系統(tǒng)中產(chǎn)生的抗PCSK9阿德奈汀-鉸鏈-Fe構(gòu)建體METDTLLLWVLLLWVPGSTGGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPPSDDYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFPffPHAGYYHRPISINYRTEIEPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO: 322)。此處，F(xiàn)e 結(jié)構(gòu)域包含如下人類 IgGlCH2 及 CH3 區(qū)域VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:448)及 SEQ ID N0:319 的鉸鏈序列。在 SEQ IDN0:322 中，前導(dǎo)序列以粗體表示，抗PCSK9阿德奈汀序列以斜體表示，且鉸鏈區(qū)域帶下劃線。應(yīng)理解，SEQ IDN0:322末端處的賴氨酸是可選的。如SEQ ID NO:322中所示的多肽融合物(本文中亦稱為PRD460)的效力展示于實(shí)施例4中。表I中展示了例示性PCSK9阿德奈汀-Fe融合物。所有序列皆可以甲硫氨酸或哺乳動物前導(dǎo)序列(例如，SEQ ID NO:326)起始。表1.例示性抗PCSK9阿德奈汀-Fe融合蛋白質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種多肽，其包含纖連蛋白III型第10結(jié)構(gòu)域C°Fn3)，其中該uiFr^的選自環(huán)BC、DE及FG的至少一個環(huán)具有相對于人wFnS結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)環(huán)的序列經(jīng)改變的氨基酸序列，且其中該多肽結(jié)合(前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin9型)PCSK9。
2.權(quán)利要求1所述的多肽，其中該多肽以小于500nM的Kd結(jié)合PCSK9。
3.權(quán)利要求1或2所述的多肽，其中該BC環(huán)包含根據(jù)式(X1)zX2GGEQID NO:449)的序列，其中X1為任意氨基酸，Z為6-9的數(shù)值，且X2為Y或H。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述BC環(huán)包含如表3中所示的SEQIDNO:2-17、107-135及301-303中任一者的陰影部分。
5.權(quán)利要求3或4所述的多肽，其中所述BC環(huán)選自SEQID NO: 2_17、107-135及301-303。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述DE環(huán)包含根據(jù)式X1X1X1XJSEQIDNO:450)的序列，其中X1為任意氨基酸；且&為6或S。
7.權(quán)利要求1、2或6中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述DE環(huán)包含如表3中所示的SEQIDNO: 18-27及136-141中任一者的陰影部分。
8.權(quán)利要求6或7所述的多肽，其中所述DE環(huán)選自SEQID NO: 18-27及136-141。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述FG環(huán)包含根據(jù)式EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQ ID NO:451)的序列，其中 X1 為任意氨基酸;X4 為 Y 或 F ；X5 為 Y、F或W ;且X6為S或A。
10.權(quán)利要求1、2或9中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述FG環(huán)包含如表3中所示的SEQID NO:28-38及142-172中任一者的陰影部分。
11.權(quán)利要求9或10所述的多肽，其中所述FG環(huán)選自SEQID NO: 28-38及142-172。
12.權(quán)利要求1、2、3、6或9中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述BC、DE或FG環(huán)氨基酸序列與 SEQ ID NO:2-38、106-172 及 301-303 中任一者至少 80% 同一。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽包含與SEQID NO:39-76,173-290及304-309中任一者至少80%同一的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的多肽，其進(jìn)一步包含一個或多個選自下組的藥動學(xué)(PK)部分聚乙二醇、唾液酸、Fe、Fe片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結(jié)合蛋白、及血清免疫球蛋白結(jié)合蛋白。
15.權(quán)利要求14所述的多肽，其中所述血清白蛋白結(jié)合蛋白包含纖連蛋白III型第10結(jié)構(gòu)域C°Fn3)。
16.權(quán)利要求15所述的多肽，其中所述uiFr^結(jié)構(gòu)域結(jié)合HSA。
17.權(quán)利要求14所述的多肽，其中所述PK部分是聚乙二醇。
18.—種可藥用的組合物，其包含權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的多肽，其中該組合物基本上不含內(nèi)毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合PCSK9的基于纖連蛋白的支架域蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及新蛋白質(zhì)在治療應(yīng)用中用于治療動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥及其他膽固醇相關(guān)疾病的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含這些蛋白質(zhì)、編碼這些蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸的細(xì)胞，且涉及包含編碼該新蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體。
文檔編號C07K14/78GK103068843SQ201180029216
公開日2013年4月24日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者R.坎普豪森, S.T.克洛德, J.H.戴維斯, F.M.丹赫茲, A.賽埃德-科西, D.利波夫塞克, 羅志鳴, T.S.米切爾, G.C.雷克斯特勞, K.A.拉索, 羅景雄, B.米奧, R.A.帕克, D.F.西特科夫 申請人:百時美施貴寶公司