專利名稱：改良的補(bǔ)體受體2(cr2)靶向群的制作方法
改良的補(bǔ)體受體2(CR2)靶向群
相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求于2010年5月14日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/345，035的優(yōu)先權(quán)益，該臨時(shí)申請的公開內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。技術(shù)領(lǐng)域
本申請涉及用于將治療劑包括補(bǔ)體抑制劑靶向遞送至炎癥部位的改良的組合物。
關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明
本發(fā)明的一部分是在國立衛(wèi)生研究院的R01-CA53617號(hào)基金支持的工作中完成的。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景
人補(bǔ)體受體2(CR2/CD21)是145千道爾頓(“kDa”)的跨膜蛋白，由15或16個(gè)短同源重復(fù)序列(SCR)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、28個(gè)氨基酸的單次跨膜結(jié)構(gòu)域以及短的34個(gè)氨基酸的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成(1-5)。每一個(gè)細(xì)胞外SCR都包含約60-70個(gè)氨基酸殘基，并通過3-8個(gè)氨基酸殘基的連接區(qū)連接。所有SCR都含有多個(gè)保守的氨基酸殘基，包括4個(gè)半胱氨酸殘基，其形成連接Cysl-Cys3和Cys2-Cys4的二硫鍵模式。CR2主要存在于B細(xì)胞上，在B細(xì)胞上它被發(fā)現(xiàn)與促進(jìn)正常體液應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的其他膜蛋白形成復(fù)合物￠-9)。利用位于最遠(yuǎn)側(cè)的(即氨基末端的)SCR結(jié)構(gòu)域SCR1-2，CR2結(jié)合四類配體-補(bǔ)體成分3(C3)蛋白水解片段 iC3b、C3dg 和 C3d(10, 11);愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus, EBV) 糖蛋白gp350/220(gp350) (12-14);低親和力IgE受體CD23(15，16);以及細(xì)胞因子干擾素 a (IFNa ) (17-19)。
CR2的主要作用是作為B細(xì)胞輔助受體發(fā)揮功能，通過增強(qiáng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)用于抗原介導(dǎo)的B細(xì)胞活化(20，21)。該功能通過經(jīng)由C3d和表面IgM的共連接來實(shí)現(xiàn)，此時(shí)C3d 被共價(jià)連接至抗原(22-28)。通過EBV的包膜糖蛋白gp350，CR2還是EBV的必需細(xì)胞受體 (12，20，29-31)。在CR2與gp350的連接使EBV病毒與細(xì)胞表面靠得足夠近后，才發(fā)生實(shí)際的細(xì)胞EBV感染(14，32，33)，從而允許病毒gp42與人白細(xì)胞抗原II類分子結(jié)合(34，35)， 并隨后通過三種另外的病毒糖蛋白gB、gH和gL觸發(fā)宿主細(xì)胞融合(36-38)。已表明，IFNa 為CR2的配體，盡管這種相互作用的生理重要性尚不清楚(17-19)。然而，已經(jīng)提出IFNa 和CR2可能參與自身免疫疾病全身性紅斑狼瘡的發(fā)生(39-41)。
CR2_gp350相互作用的誘變研究以及結(jié)構(gòu)研究已提出了 CR2上 為這種相互作用所必需的殘基(20，42，43)。ELISA和流式細(xì)胞術(shù)被用來測試用于gp350和CR2結(jié)合的候選CR2突變體(20，42，43)。在最近的研究中，發(fā)現(xiàn)CR2上的特定殘基(包括 R13, S15, R28, R36, K41, K57, K67, R83 和 R89)突變時(shí)對 gp350_ 結(jié)合具有不利影響(42，43)。 在單獨(dú)的研究中，還強(qiáng)調(diào)了 SCRl第一保守半胱氨酸間區(qū)的殘基P8-S15以及SCRl和SCR2間的連接區(qū)是發(fā)生gp350結(jié)合所必需的(20)。利用軟件對接程序HADDOCK，這些數(shù)據(jù)結(jié)合靶向 gp35分子的單獨(dú)的誘變分析被用于驅(qū)動(dòng)CR2-gp350相互作用的in silico模型(43-45)。 該分析表明CR2上的主要相互作用在SCRl與連接SCRl和SCR2的連接區(qū)之間，并且對于gp350，在結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域2之間的連接區(qū)(43)。
通過IFNa模擬gp350和C3d結(jié)合的這一發(fā)現(xiàn)以及觀測到的所有三種配體結(jié)合 CR2上相似區(qū)域的結(jié)果，已經(jīng)提出，CR2為IFNa的受體(18，19)。模擬物被表明也具有功能(18)。解析了 C3d和IFN a的結(jié)構(gòu)后，發(fā)現(xiàn)推定的CR2結(jié)合序列具有相似的結(jié)構(gòu)基序。IFN a 被描述為能夠結(jié)合CR2的多種形式，從全長CR2到SCR1-2，盡管結(jié)合的程度不同(17)。盡管已表明CR2為IFNa的受體，但CR2SCR1-2中的IFNa結(jié)合位點(diǎn)是未知的。
進(jìn)一步分析CR2與已知配體的相互作用，以鑒定參與結(jié)合這些配體的特定氨基酸殘基，使得設(shè)計(jì)對每種已知的CR2配體(例如，C3蛋白水解片段iC3b、C3dg和C3d ；EBV糖蛋白gp350 KD23和IFNa )具有確定的結(jié)合特異性的修飾的CR2分子成為可能。
概述
本文提供了涉及能夠選擇性遞送補(bǔ)體活性調(diào)節(jié)劑的可溶性蛋白的組合物和方法。 通過對組合物的對應(yīng)于CR2的至少前兩個(gè)N-末端SCR結(jié)構(gòu)域的靶向蛋白部分中的特定氨基酸進(jìn)行選擇性突變，來實(shí)現(xiàn)這些調(diào)節(jié)劑的靶向遞送。取決于引入靶向部分中的突變的特定組合，補(bǔ)體活性調(diào)節(jié)劑可以被選擇性遞送至CR2特定配體的需要補(bǔ)體系統(tǒng)活化或抑制的部位。
因此，在一方面，本文提供了包含構(gòu)建體的可溶性組合物，其中所述構(gòu)建體包含(a)包含SEQ ID NO:1的CR2蛋白或其生物活性片段的補(bǔ)體受體2 (CR2)部分，其中所述CR2 部分含有CR2蛋白的至少前兩個(gè)N-末端SCR結(jié)構(gòu)域；以及(b)補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分；其中所述 CR2部分含有在選自Nil，R36, K41, Y64和K67的氨基酸殘基處的至少一個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建體是融合蛋白。
在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分包含補(bǔ)體抑制劑或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑或其生物活性片段選自人膜補(bǔ)體蛋白(MCP) (SEQ ID NO: 10)、人衰變加速因子(DAF) (SEQ ID NO: 11)、小鼠DAF(SEQ ID NO: 12)、小鼠補(bǔ)體受體1-相關(guān)基因/ 蛋白 y (Crry) (SEQ IDN0:4)、人 CD59 (SEQ ID N0:3)、小鼠 CD59 亞型 A(SEQ ID NO:6)、小鼠 CD59亞型B(SEQ ID NO: 7)、人補(bǔ)體受體 I (CRl) (SEQ ID NO:9)、人H 因子(SEQ ID NO: 5)和小鼠 H 因子(SEQ ID NO:8)。
在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含人膜補(bǔ)體蛋白(MCP) (SEQ IDN0:10)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，人MCP (SEQ ID NO: 10)的生物活性片段選自MCP的 SCR1-4(SEQ ID NO: 10的氨基酸35-285)、SCR1_4加絲氨酸/蘇氨酸富集的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 10的氨基酸35-326)、以及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 10的氨基酸35-343)。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含人DAF(SEQ ID NO: 11)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中， A DAF(SEQ ID NO: 11)的生物活性片段選自SCR1-4 (SEQ IDN0:11的氨基酸25-285)以及 SCR1-4加O-糖基化的絲氨酸/蘇氨酸富集的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 11的氨基酸25-353)。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含小鼠DAF(SEQ ID NO: 12)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，小鼠DAF (SEQ ID NO: 12)的生物活性片段選自SCR1-4(SEQ ID N0:12的氨基酸 35-286)和SCR1-4加O-糖基化的絲氨酸/蘇氨酸-富集的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 12的氨基酸35-362)。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含Crry (SEQ ID NO:4)或其生物活性片段。 在某些實(shí)施方案中，Crry (SEQ IDNO:4)的生物活性片段選自小鼠Crry蛋白的SCR1-5 (SEQ ID NO:4的氨基酸41-400)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:4的氨基酸41-405)。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含人⑶59 (SEQ ID NO: 3)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中， 人CD59(SEQ ID NO: 3)的生物活性片段包含缺乏其GPI錨的人CD59的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 3的氨基酸26-101)。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含小鼠CD59亞型A (SEQ ID NO:6)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，小鼠⑶59亞型A(SEQ ID NO:6)的生物活性片段包含缺乏其GPI錨的小鼠CD59亞型A的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ IDN0:6的氨基酸24-95)。 在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含小鼠⑶59亞型B (SEQ ID NO: 7)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，小鼠⑶59亞型B (SEQ ID NO: 7)的生物活性片段包含缺乏其GPI錨的小鼠⑶59亞型B的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 7的氨基酸24-103)。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含人CRl (SEQ ID NO:9)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，人CRl (SEQ ID NO: 9)的生物活性片段選自 SCR1-3 (SEQ ID NO: 9 的氨基酸 42-234)、SCR1-4 (SEQ ID NO: 9 的氨基酸 42-295)、SCR1-10 (SEQID NO: 9 的氨基酸 42-684)、SCR8-10 (SEQ ID NO: 9 的氨基酸 491-684)、SCR8-11(SEQ ID NO: 9 的氨基酸 491-745)、SCR15-17 (SEQ ID NO: 9 的氨基酸 941-1134)、SCR15-18 (SEQ ID N0:9 的氨基酸 941-1195)以及 SCR22-28 (SEQ ID NO:9 的氨基酸1394-1842)。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含人H因子(SEQ ID NO: 5)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，人H因子(SEQ ID NO:5)的生物活性片段選自SCR1_4(SEQ ID N0:5的氨基酸21-262)、SCR1-5(SEQ ID NO: 5 的氨基酸 21-320)、SCR1_8 (SEQID NO: 5 的氨基酸21-507)以及SCR1-18(SEQ ID NO:5的氨基酸21-1104)。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體抑制劑包含小鼠H因子(SEQ ID NO:8)或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，小鼠H因子 (SEQ ID NO: 8)的生物活性片段選自 SCR1-4(SEQ ID NO: 8 的氨基酸 19-264)、SCR1_5 (SEQID N0:8的氨基酸19-322)、SCR1-8(SEQ ID NO: 8 的氨基酸 19-507)以及 SCR1-18 (SEQ ID NO: 8 的氨基酸19-1109)。
在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分包含補(bǔ)體活化劑或其生物活性片段。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)體活化劑或其生物活性片段選自人IgGpA IgeIFc結(jié)構(gòu)域、人IgM、人IgM Fe結(jié)構(gòu)域、小鼠IgG3、小鼠IgG3Fc結(jié)構(gòu)域、小鼠IgM、小鼠IgM Fe結(jié)構(gòu)域和眼鏡蛇毒因子 (CVF)。
在某些實(shí)施方案中，與其中CR2或其生物活性片段不含任何氨基酸取代的構(gòu)建體相比，上述構(gòu)建體顯示對EBV-gp350或IFNa降低的結(jié)合親和力。在某些實(shí)施方案中，與其中CR2或其生物活性片段不含任何氨基酸取代的構(gòu)建體相比，上述構(gòu)建體顯示對EBV-gp350降低的結(jié)合親和力。在某些實(shí)施方案中，CR2或其生物活性片段含有選自 Nil, R36, K41, Y64和K67的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施方案中，與其中CR2或其生物活性片段不含任何氨基酸取代的構(gòu)建體相比，上述構(gòu)建體顯示對IFNa降低的結(jié)合親和力。在某些實(shí)施方案中，CR2或其片段含有對選自S42和K50的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸取代。
在另一方面，本文提供了降低構(gòu)建體對EBV_gp350的結(jié)合親和力的方法，所述構(gòu)建體包含(a)包含SEQ ID NO:1的CR2蛋白或其生物活性片段的補(bǔ)體受體2 (CR2)部分， 其中所述CR2部分含有CR2部分的至少前兩個(gè)N-末端SCR結(jié)構(gòu)域；以及(b)補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分，所述方法包括突變選自Nil，R36, K41, Y64和K 67的至少一個(gè)氨基酸殘基。
在另一方面，本文提供了降低構(gòu)建體對IFNa的結(jié)合親和力的方法，所述構(gòu)建體包含(a)包含SEQ ID NO:1的CR2蛋白或其生物活性片段的補(bǔ)體受體2 (CR2)部分，其中所述CR2部分含有CR2部分的至少前兩個(gè)N-末端SCR結(jié)構(gòu)域；以及(b)補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分， 所述方法包括突變選自S42和K50的至少一個(gè)氨基酸殘基。
附圖簡述


圖1. NMR滴定分析顯示CR2的SCRl和SCR2都參與連接gp350。在用漸增量的 gp350滴定期間，采集的15N-標(biāo)記的CR2SCRl-2(0. 6mM，在1/3X PBS中)的兩個(gè)疊加的1H-15N 橫向弛豫優(yōu)化光譜-異核單量子相干(TR0SY-HSQC)譜。黑色代表沒有g(shù)p350，以及灰色代表飽和量的gp350。插圖化學(xué)位移變化的詳細(xì)視圖。此處使用的CR2的編號(hào)方案基于成熟蛋白的氨基酸序列。
圖2. NMR滴定分析顯示了 CR2的SCRl和SCR2都參與連接IFN α。在用漸增量的 IFNa滴定期間，采集的15N-標(biāo)記的CR2SCRl-2(0. 6mM，在1/3Χ PBS中)的5個(gè)疊加的1H-15N TR0SY-HSQC 譜。
圖3. NMR導(dǎo)出的CR2-配體結(jié)合殘基比較。直方圖說明了 CR2SCR1-2在結(jié)合C3d、 IFNa或gP350時(shí)主鏈酰胺中誘導(dǎo)的化學(xué)位移變化。
圖4A、4B和4C. CR2SCR1-2X射線晶體結(jié)構(gòu)在其配體_結(jié)合態(tài)(C3d未顯示)的表面表征，帶有NMR-確定的配體結(jié)合殘基。圖4A.NMR-確定的gp350結(jié)合殘基?；疑珰埢聿皇躦p350滴定影響的殘基。SCR1、連接區(qū)和SCR2上的黑色殘基代表參與gp350與 CR2SCR1-2結(jié)合的殘基。圖4B. NMR確定的IFNa結(jié)合殘基?；疑珰埢聿皇躀FNa滴定影響的殘基。SCR1、連接區(qū)和SCR2上的黑色殘基代表參與IFNa與CR2SCR1-2結(jié)合的殘基。圖4C. NMR確定的配體獨(dú)特的和共享的結(jié)合殘基。黑色殘基代表獨(dú)特地參與CR2與 IFNa和gp350結(jié)合的殘基。深灰色殘基代表獨(dú)特地參與CR2與C3d結(jié)合的殘基。淺灰色殘基代表參與所有三種CR2配體結(jié)合事件的殘基。
圖5. HADDOCK CR2_gp350對接模型，其中NMR導(dǎo)出的CR2_gp350配體結(jié)合殘基突出顯示。來自Young等(43)的模型。黑色帶狀物代表gp350，以及淺灰色代表修飾gp350 表面的糖基基團(tuán)。深灰色帶狀物代表CR2SCR1-2。插圖，在Young等的對接模型上繪制的、 NMR導(dǎo)出的結(jié)合殘基與gp350間理論上的側(cè)鏈相互作用的放大視圖。
表1.來自NMR滴定和ITC的CR2結(jié)合常數(shù)。顯示了利用監(jiān)測化學(xué)位移變化的NMR 滴定確定的CR2-配體相互作用緊密結(jié)合常數(shù)的弱極限和上限。還顯示了利用ITC確定的 CR2-配體結(jié)合常數(shù)。UL，上限。ITC，等溫滴定量熱法。
表2. CR2配體結(jié)合殘基的比較。顯示了參與每一 CR2-配體結(jié)合相互作用的殘基。 用星號(hào)標(biāo)注的殘基對各自的結(jié)合相互作用是獨(dú)特的。
序列簡述
SEQIDNO:1
SEQIDNO: 2
SEQID NO: 3
SEQIDNO: 4
SEQIDNO: 5
SEQIDNO: 6
SEQIDNO: 7
SEQIDNO: 8蛋白y(Crry)的完整氨基酸序列。
SEQ ID N0:9是人補(bǔ)體受體1(CR1)的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 10是人膜輔蛋白(MCP)的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 11是人衰變加速因子(DAF/⑶55)的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 12是小鼠衰變加速因子(DAF/⑶55)的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 13是來自單眼斑眼鏡蛇(monocled cobra)(孟加拉眼鏡蛇 (Najakaouthia))的眼鏡蛇毒因子(CVF)的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 14是人IgGi重鏈，C結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 15是人IgGi輕鏈，C結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 16是人IgGfc結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 17是人IgM重鏈，C結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 18是人IgM輕鏈，C結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 19是人IgM Fc結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO:20是小鼠IgG3重鏈，C結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO:21是小鼠IgG3輕鏈，C結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO:22是小鼠IgG3Fc結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 23是小鼠IgM重鏈，C結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 24是小鼠IgM輕鏈，C結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO:25是小鼠IgM Fc結(jié)構(gòu)域的完整氨基酸序列。SEQ ID NO: 26是人CR2的前兩個(gè)N-末端SCR間的連接序列。.SEQ ID NO: 27是人CR2的前兩個(gè)N-末端SCR間的連接序列。SEQ ID NO: 28是人CR2的第四和第五N-末端短同源重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域間的連接序 列。詳細(xì)描述補(bǔ)體是重要的免疫組分，但補(bǔ)體系統(tǒng)不適當(dāng)?shù)暮瓦^度的活化參與了許多病理和炎 癥狀況。介導(dǎo)組織損傷的補(bǔ)體活化產(chǎn)物在補(bǔ)體途徑的多個(gè)點(diǎn)產(chǎn)生。細(xì)胞表面的補(bǔ)體活化導(dǎo) 致血清補(bǔ)體成分3 (C3)的裂解，以及作為免疫效應(yīng)細(xì)胞調(diào)理素的C3片段與細(xì)胞表面的共價(jià) 連接。產(chǎn)生的C3片段包括為強(qiáng)效過敏毒素的可溶性肽C3a，以及為補(bǔ)體旁路途徑C3轉(zhuǎn)化 酶組分的C3b。在該途徑后期，血清補(bǔ)體成分5 (C5)被裂解以釋放可溶性C5a，后者為另一 強(qiáng)效的過敏毒素和化學(xué)引誘物，有廣泛的生物活性特性。C5的裂解還啟動(dòng)了膜攻擊復(fù)合物 (MAC)即在細(xì)胞膜內(nèi)組裝的溶細(xì)胞蛋白復(fù)合物的形成，最終導(dǎo)致受調(diào)理細(xì)胞的溶解。補(bǔ)體成分3(C3)是酶原。完整的C3以高濃度(l-2mg/ml)循環(huán)。M. Janzi et al. ,Mol. Cell. Proteomics (2005) 4 (12) : 1942-1947。在補(bǔ)體活化期，完整的 C3 被裂解形 成C3b，其為補(bǔ)體旁路途徑C3轉(zhuǎn)化酶的組分，并被共價(jià)連接至靶標(biāo)表面。內(nèi)源性補(bǔ)體調(diào)節(jié) 蛋白使組織結(jié)合的C3b失活以形成iC3b和最終的35千道爾頓(“kD”)的C3d片段。C3d 片段仍固定在組織，并作為補(bǔ)體介導(dǎo)的炎癥的持久標(biāo)志物。I. Leivo et al.，J. Cell. Biol. (1986)103:1091-1100。將補(bǔ)體抑制劑靶向遞送至補(bǔ)體活化和疾病部位能夠提高它們的功效。因?yàn)檠a(bǔ)體在 宿主防御和免疫形成中、以及在免疫體內(nèi)平衡機(jī)制諸如免疫復(fù)合物分解代謝和凋亡細(xì)胞清 除中發(fā)揮重要作用，補(bǔ)體抑制劑的靶向遞送減少了由系統(tǒng)性補(bǔ)體抑制特別是長期補(bǔ)體抑制導(dǎo)致的潛在嚴(yán)重副作用。
通用技術(shù)
除外另外說明，實(shí)踐本發(fā)明會(huì)應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分解釋，諸如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook et al. , 1989)和 Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第三版(Sambrook and Russell, 2001),(在本文被共同稱為 “Sambrook”)； Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. , eds. , 1987,包括 2001 全年的增刊);PCR: The Polymerase Chain Reaction(Mullis et al. , eds. , 1994);CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry John ffiley&Sons, Inc. , New York, 2000), Handbook of Experimental Immunology,第 4 版(D. M. ffeir&C. C. Blackwell, eds. , Blackwell Science Inc. , 1987);以及 GeneTransfer vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller&M. P. Calos, eds.，1987)。
補(bǔ)體受體2
人補(bǔ)體受體2，也被稱為 CD21(CR2/CD21) (SEQ ID N0:1 和 SEQ IDN0:2)，是 C3 結(jié)合蛋白家族的 145kD的跨膜蛋白，包含15或16個(gè)短同源重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域，所述短同源重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域?yàn)楸碚鬟@類蛋白的結(jié)構(gòu)單位。CR2表達(dá)在成熟B細(xì)胞以及濾泡樹突狀細(xì)胞上，并在體液免疫中發(fā)揮重要作用。J. Hannan et al. , Biochem. Soc. Trans. (2002) 30:983-989 ; K. A. Young et al. , J. Biol. Chem. (2007) 282 (50) : 36614-36625。CR2 蛋白不結(jié)合完整的C3蛋白，而是通過位于CR2蛋白前兩個(gè)氨基-末端的短同源重復(fù)序列 (“SCRsl-2”)內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合C3蛋白的降解產(chǎn)物，包括C3b、iC3b和C3d裂解片段。因此，CR2的SCR1-2結(jié)構(gòu)域區(qū)別C3的裂解(即活化)形式和完整的循環(huán)的C3。作為靶向群， CR2的SCRsl-2因此能夠區(qū)別循環(huán)的C3和在補(bǔ)體活化期間產(chǎn)生的C3片段。盡管CR2對C3d 的親和力僅為 620_658nM (J. Hannan et al. , Biochem. Soc. Trans. (2002) 30:983-989; J. M. Guthridge et al. , Biochem. (2001) 40:5931-5941)，但 CR2 對成簇的 C3d 的親合力使其成為將分子靶向補(bǔ)體活化部位的有效方法。
C3的裂解最初導(dǎo)致C3b在活化細(xì)胞表面的產(chǎn)生和沉積。C3b片段參與放大補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的酶復(fù)合物的產(chǎn)生。在細(xì)胞表面，C3b被迅速轉(zhuǎn)化為失活的iC3b，特別是當(dāng)C3b沉積在含補(bǔ)體活化調(diào)節(jié)劑的宿主細(xì)胞表面(即大多數(shù)宿主組織)時(shí)。即便在膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑缺乏的情況下，相當(dāng)高水平的iC3b由于血清H因子和血清I因子的作用而形成。隨后， iC3b通過I因子以及其他蛋白酶和輔因子被消化生成膜結(jié)合片段C3dg及隨后的C3d，然而該過程是相對緩慢的。因此，CR2的C3配體一旦生成，壽命相對較長，并以高濃度存在于補(bǔ)體活化部位。
定義
一般提及的“組合物(the composition) ”或“組合物(compositions) ”包括本發(fā)明的組合物并適用于本發(fā)明的組合物。
如本文所用的，單數(shù)形式的冠詞“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代，除非另外說明。 例如，短語“生物活性CR2片段(a biologically active CR2fragment) ”包括一個(gè)或多個(gè)生物活性CR2片段。
本文提及“約”某值或參數(shù)包括(以及描述)涉及該值或參數(shù)自身的實(shí)施方案。例如，提及“約V’的描述包括對“X”的描述。
應(yīng)理解，本文描述的本發(fā)明的各方面和實(shí)施方案包括由和/或基本由這些方面和實(shí)施方案組成。
如本文所用的，術(shù)語“個(gè)體”指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。哺乳動(dòng)物包括但不限于用于研究的動(dòng)物、家畜、農(nóng)場動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、寵物、靈長類、小鼠和大鼠。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體是人。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體為非人的個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體是用于研究與補(bǔ)體旁路途徑有關(guān)的疾病的動(dòng)物模型。
本說明書中給出的每一最大的數(shù)值限度意圖包括每一較低的數(shù)值限度，如同這種較低的數(shù)值限度被明確地書寫在本文中。本說明書中給出的每一最小的數(shù)值限度包括每一較高的數(shù)值限度，如同這種較高的數(shù)值限度被明確地書寫在本文中。本說明書中給出的每一數(shù)值范圍包括落在這種較寬數(shù)值范圍內(nèi)的每一較窄的數(shù)值范圍，如同這種較窄的數(shù)值范圍都被明確地書寫在本文中。
氨基酸取代
20種氨基酸通常存在于蛋白中。這些氨基酸可以基于它們側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)被分為九類或九組。用一個(gè)氨基酸殘基取代同類或組中的另一個(gè)氨基酸在本文被稱為“保守性” 取代。保守性氨基酸取代經(jīng)常在蛋白中發(fā)生，不會(huì)明顯改變蛋白的構(gòu)象或功能。用一個(gè)氨基酸殘基取代不同類或組中的另一個(gè)氨基酸在本文被稱為“非保守性”取代。相比之下，非保守性氨基酸取代傾向于破壞蛋白的構(gòu)象或功能。
表3:氨基酸分類的實(shí)例
權(quán)利要求
1.能夠?qū)⒀a(bǔ)體調(diào)節(jié)劑靶向遞送至補(bǔ)體系統(tǒng)活化部位的包含構(gòu)建體的可溶性組合物，其中所述構(gòu)建體包含 (a)包含SEQID NO:1的CR2蛋白或其生物活性片段的補(bǔ)體受體2 (CR2)部分，其中所述CR2部分含有CR2蛋白的至少前兩個(gè)N-末端SCR結(jié)構(gòu)域；以及 (b)補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分； 其中所述CR2部分含有降低CR2部分對EBV gp350和干擾素-a (IFN a )的結(jié)合親和力的至少一個(gè)氨基酸取代。
2.如權(quán)利要求1所述的可溶性組合物，其中所述降低CR2部分對EBVgp350的結(jié)合親和力的至少一個(gè)氨基酸取代選自Nil，R36, K41, Y64和K67，以及所述降低CR2部分對IFNa的結(jié)合親和力的至少一個(gè)氨基酸取代選自S42和K50。
3.如權(quán)利要求1所述的可溶性組合物，其中所述構(gòu)建體是融合蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分包含補(bǔ)體抑制劑或其生物活性片段。
5.如權(quán)利要求3所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑或其生物活性片段選自人膜補(bǔ)體蛋白(MCP) (SEQ ID NO: 10)、人衰變加速因子(DAF) (SEQ ID NO: 11)、小鼠 DAF(SEQID NO:12)、小鼠補(bǔ)體受體1-相關(guān)基因 / 蛋白 y(Crry) (SEQ ID NO: 4)、人 CD59 (SEQ ID勵(lì):3)、小鼠0)59亞型4(5￡0 ID勵(lì):6)、小鼠0)59亞型8(5￡0 ID NO: 7)、人補(bǔ)體受體I (CRl)(SEQ ID NO:9)、人 H 因子(SEQ ID NO: 5)和小鼠 H 因子(SEQ ID NO:8)。
6.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含人膜補(bǔ)體蛋白(MCP)(SEQ ID NO: 10)或其生物活性片段。
7.如權(quán)利要求5所述的可溶性組合物，其中所述人MCP(SEQ IDNO: 10)的生物活性片段選自MCP的SCR1-4 (SEQ ID NO: 10的氨基酸35-285)、SCR1-4加絲氨酸/蘇氨酸-富集的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 10的氨基酸35-326)以及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 10的氨基酸35-343)。
8.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含人DAF(SEQIDNO: 11)或其生物活性片段。
9.如權(quán)利要求7所述的可溶性組合物，其中所述人DAF(SEQIDNO: 11)的生物活性片段選自SCR1-4(SEQ ID NO: 11的氨基酸25-285)以及SCR1-4加0-糖基化的絲氨酸/蘇氨酸-富集的結(jié)構(gòu)域(SEQ IDN0:11的氨基酸25-353)。
10.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含小鼠DAF(SEQIDNO: 12)或其生物活性片段。
11.如權(quán)利要求9所述的可溶性組合物，其中所述小鼠DAF(SEQIDNO: 12)的生物活性片段選自SCR1-4(SEQ ID NO: 12的氨基酸35-286)以及SCR1-4加0-糖基化的絲氨酸/蘇氨酸-富集的結(jié)構(gòu)域(SEQID NO: 12的氨基酸35-362)。
12.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含Crry(SEQ ID NO: 4)或其生物活性片段。
13.如權(quán)利要求11所述的可溶性組合物，其中所述Crry(SEQIDNO:4)的生物活性片段選自小鼠Crry蛋白的SCR1-5(SEQ ID NO:4的氨基酸41-400)以及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:4的氨基酸41-405)。
14.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含人⑶59(SEQIDNO:3)或其生物活性片段。
15.如權(quán)利要求13所述的可溶性組合物，其中所述人⑶59(SEQID NO: 3)的生物活性片段包含缺乏GPI錨的人CD59的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:3的氨基酸26-101)。
16.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含小鼠⑶59亞型A(SEQID NO:6)或其生物活性片段。
17.如權(quán)利要求15所述的可溶性組合物，其中所述小鼠⑶59亞型A(SEQID NO:6)的生物活性片段包含缺乏GPI錨的小鼠CD59亞型A的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:6的氨基酸24-95)。
18.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含小鼠⑶59亞型B(SEQID NO:7)或其生物活性片段。
19.如權(quán)利要求17所述的可溶性組合物，其中所述小鼠⑶59亞型B(SEQID NO:7)的生物活性片段包含缺乏GPI錨的小鼠CD59亞型B的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:7的氨基酸24-103)。
20.如權(quán)利要求3所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含人CRl(SEQ IDNO:9)或其生物活性片段。
21.如權(quán)利要求19所述的可溶性組合物，其中所述人CRl(SEQID NO: 9)的生物活性片段選自 SCR1-3(SEQ ID NO:9 的氨基酸 42-234)、SCR1-4(SEQ ID NO:9 的氨基酸 42-295)、SCR1-10 (SEQ IDNO: 9 的氨基酸 42-684)、SCR8-10 (SEQ ID NO:9 的氨基酸491-684)，SCR8-11 (SEQ ID NO:9 的氨基酸 491-745)、SCR15-17 (SEQ ID NO:9 的氨基酸941-1134)、SCR15-18 (SEQ ID NO:9 的氨基酸 941-1195)以及 SCR22-28 (SEQ ID NO:9 的氨基酸 1394-1842)。
22.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含人H因子(SEQIDNO:5)或其生物活性片段。
23.如權(quán)利要求21所述的可溶性組合物，其中所述人H因子(SEQIDNO: 5)的生物活性片段選自 SCR1-4(SEQ ID NO:5 的氨基酸 21-262)、SCR1-5(SEQ ID NO: 5 的氨基酸 21-320)、SCR1-8 (SEQ IDNO:5 的氨基酸 21-507)和 SCR1_18(SEQ ID NO: 5 的氨基酸 21-1104)。
24.如權(quán)利要求4所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體抑制劑包含小鼠H因子(SEQIDNO:8)或其生物活性片段。
25.如權(quán)利要求23所述的可溶性組合物，其中所述小鼠H因子(SEQID NO:8)的生物活性片段選自SCR1-4(SEQ ID NO:8的氨基酸19-264)、SC R1_5(SEQ ID NO:8的氨基酸 19-322)、SCR1-8 (SEQ IDNO: 8 的氨基酸 19-507)和 SC R1_18(SEQ ID NO:8 的氨基酸19-1109)。
26.如權(quán)利要求1所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分包含補(bǔ)體活化劑或其生物活性片段。
27.如權(quán)利要求25所述的可溶性組合物，其中所述補(bǔ)體活化劑或其生物活性片段選自人IgG1^A IgG1Fc結(jié)構(gòu)域、人IgM> A IgM Fe結(jié)構(gòu)域、小鼠IgG3、小鼠IgG3Fc結(jié)構(gòu)域、小鼠IgM、小鼠IgM Fe結(jié)構(gòu)域和眼鏡蛇毒因子(CVF)。
28.如權(quán)利要求1所述的可溶性組合物，其中所述構(gòu)建體與其中CR2或其生物活性片段不含有任何氨基酸取代的構(gòu)建體相比，顯示出對EBV-gp350或IFNa降低的結(jié)合親和力。
29.如權(quán)利要求27所述的可溶性組合物，其中所述構(gòu)建體與其中CR2或其生物活性片段不含有任何氨基酸取代的構(gòu)建體相比，顯示出對EBV-gp350降低的結(jié)合親和力。
30.如權(quán)利要求28所述的可溶性組合物，其中所述CR2或其生物活性片段含有選自Nil, R36, K41, Y64和K67的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸取代。
31.如權(quán)利要求27所述的可溶性組合物，其中所述構(gòu)建體與其中CR2或其生物活性片段不含有任何氨基酸取代的構(gòu)建體相比，顯示出對IFNa降低的結(jié)合親和力。
32.如權(quán)利要求30述的可溶性組合物，其中所述CR2或其片段含有選自S42和K50的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸取代。
33.制備構(gòu)建體的方法，所述構(gòu)建體選擇性結(jié)合一種或多種C3蛋白水解片段，但不選擇性結(jié)合EBV gp350或IFNa，其中所述方法包括 (a)使所述構(gòu)建體的補(bǔ)體受體2(CR2)部分中來自附1，1 36，1(41八64和1(67的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變；以及(b)使所述構(gòu)建體的補(bǔ)體受體2(CR2)部分中來自S42和K50的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變， 其中所述構(gòu)建體包含 (i)包含SEQID NO:1的CR2蛋白或其生物活性片段的補(bǔ)體受體2(CR2)部分，其中所述CR2部分含有CR2蛋白的至少前兩個(gè)N-末端SCR結(jié)構(gòu)域；以及 (ii)補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑部分。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述構(gòu)建體的補(bǔ)體受體2(CR2)部分中的一個(gè)或多個(gè)突變是向氨基酸丙氨酸的突變。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述方法還包括使所述構(gòu)建體的補(bǔ)體受體2(CR2)部分中選自R13, Y16, A22, R28, S32, K48, K57, Y68, R83, G84和R89的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。
36.降低權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體的CR2部分對EBV-gp350的結(jié)合親和力的方法，其包括使選自Nil，R36, K41, Y64和K67的至少一個(gè)氨基酸殘基突變。
37.降低權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體的CR2部分對IFNa的結(jié)合親和力的方法，其包括使選自S42和K50的至少一個(gè)氨基酸殘基突變。
全文摘要
本文提供了涉及能夠選擇性遞送補(bǔ)體活性調(diào)節(jié)劑的可溶性蛋白的組合物和方法。通過對組合物的對應(yīng)于CR2的至少前兩個(gè)N-末端SCR結(jié)構(gòu)域的靶向蛋白部分中的特定氨基酸進(jìn)行選擇性突變，來實(shí)現(xiàn)這些調(diào)節(jié)劑的靶向遞送。取決于引入靶向部分中的突變的特定組合，補(bǔ)體活性調(diào)節(jié)劑可以被選擇性遞送至CR2特定配體的需要補(bǔ)體系統(tǒng)活化或抑制的部位。
文檔編號(hào)C07K14/705GK103038252SQ201180032024
公開日2013年4月10日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者詹姆士·闊娃克斯, 喬納森·P·漢納, V·邁克爾·霍勒斯 申請人:科羅拉多大學(xué)董事會(huì),法人團(tuán)體