專利名稱：多肽的制作方法
技術領域：
本披露涉及對白蛋白具有結合親和力的一類工程化多肽。本披露還涉及利用這些和其他化合物與白蛋白在不背景下結合的新的方法和用途，其中一些對于治療包括人類的哺乳動物中的疾病具有重要性。
背景技術：
血清白蛋白 血清白蛋白是哺乳動物血清中最豐富的蛋白質(40g/l ;在人類中大約為O. 7mM),并且它的功能之一是結合多種分子，如脂質和膽紅素(彼得斯(Peters)，《蛋白質化學進展》(Advances in Protein Chemistry) 37:161，1985)。血清白蛋白無任何酶或免疫功能。此外，人血清白蛋白(HSA)是在許多天然以及治療性分子的內源性運輸和遞送中所涉及的一種天然載體(塞勒斯(Sellers)和科赫韋澤(Koch-Weser)，《白蛋白結構、功能以及用途》(AlbuminSructure, Function and Uses),編者羅森諾(Rosenoer)等人，培格曼(Pergamon),牛津(Oxford),第159頁，1977)。血清白蛋白的半衰期與動物的大小成正t匕，其中例如人血清白蛋白具有19天的半衰期，而兔血清白蛋白具有大約5天的半衰期(麥柯迪(McCurdy)等人，《實驗和臨床醫(yī)學雜志》(J Lab Clin Med) 143:115，2004)。HSA廣泛分布于身體各處，尤其在間質和血液隔室中，其中HSA主要與維持克分子滲透壓濃度有關。在結構上，白蛋白是包含三個同源結構域以及總共584或585個氨基酸的單鏈蛋白質(Dugaiczyk等人，《美國國家科學院院刊》(ProcNatl Acad Sci USA)79:71，1982)。白蛋白包含17個二硫鍵以及單個反應性巰基、位置34上的半胱氨酸，但缺乏N連接以及O連接的碳水化合物部分(彼得斯，1985，同前文獻；尼克爾森(Nicholson)等人，《英國麻醉學雜志》(Br J Anaesth) 85:599，2000)。與HSA融合或締合導致蛋白質的體內半衰期增加已經報道了使蛋白質與血清白蛋白抑或將允許與血清白蛋白的體內締合的肽或蛋白質直接共價偶聯(lián)的若干策略。后一方法的實例已經描述于例如W091/01743、W001/45746以及丹尼斯(Dennis)等人(《生物化學雜志》(J Biol Chem)277:35035-43，2002)中。第一個文獻尤其描述了從鏈球菌蛋白G (SpG)衍生的白蛋白結合肽或蛋白質用于增加其他蛋白質的半衰期的用途。這種觀念在于，使細菌衍生的白蛋白結合肽/蛋白質與一種治療上感興趣的肽/蛋白質融合，這種肽/蛋白質已經顯示出具有從血液中的快速消除。因此產生的融合蛋白與血清白蛋白在體內結合，并且受益于其更長的半衰期，增加了融合的在治療上感興趣的肽/蛋白質的凈半衰期。W001/45746和丹尼斯等人涉及同一概念，但在此，諸位作者利用相對較短的肽來結合血清白蛋白。這些肽選自一個噬菌體展示肽庫。在丹尼斯等人的文獻中，提及了早期研究中發(fā)現(xiàn)對鏈球菌蛋白G的白蛋白結合域與人補體受體I型的重組融合物的免疫應答的增強。作為US2004/0001827公開的美國專利申請(丹尼斯)還披露了包含肽配體的構建體的用途，這些構建體同樣通過噬菌體展示技術鑒定，其與血清白蛋白結合并且與生物活性化合物結合用于腫瘤靶向。細菌受體蛋白的白蛋白結合域
鏈球菌蛋白G (SpG)是一種雙功能受體，它存在于某些鏈球菌菌株的表面上，并且能夠與IgG和血清白蛋白兩者結合(布約克(Bj(Irck)等人，《分子免疫學》(Mol Immunol)24:1113, 1987)。其結構以若干結構上和功能上不同的結構域高度重復(格斯(Guss)等人，歐洲分子生物學雜志(EMBO J) 5:1567，1986)，更準確地說以三個Ig結合域和三個血清白蛋白結合域高度重復(奧爾松(Olsson)等人，《歐洲生物化學雜志》(EurJ Biochem)168:319,1987)。已經測定SpG中的三個血清白蛋白結合域之一的結構，顯示為一種三螺旋束折疊(Kraulis等人，《歐洲生物化學學會聯(lián)盟通訊》(FEBS Lett)378:190, 1996 ;約翰松(Johansson)等人，《生物化學雜志》(J. Biol. Chem. ) 277:8114-20，2002)。一個含 46個氨基酸的基序被定義為ABD (白蛋白結合域)并且后來也被命名為G148-GA3 (關于蛋白G相關性白蛋白結合的GA)。在例 如W009/016043中，披露了該含46個氨基酸的基序ABD的白蛋白結合變體。除了蛋白G中的白蛋白結合域之外也已經鑒定了其他細菌白蛋白結合域，其中一些在結構上與蛋白G的白蛋白結合域相似。含有這樣的白蛋白結合域的蛋白質的實例是PAB、PPL、MAG以及ZAG蛋白(羅扎克(Rozak)等人，《生物化學》(Biochemistry)45:3263-3271,2006)。已經例如由約翰松和同事進行了這樣的白蛋白結合域的結構和功能的研究并且加以報道(約翰松等人，《分子生物學雜志》(J Mol Biol)266:859-865, 1997)。此外，羅扎克等人已經報道了 G148-GA3的人工變異體的產生，這些人工變異體是就不同的種特異性和穩(wěn)定性而加以選擇并且研究的(羅扎克等人，《生物化學》，45:3263-3271，2006 )，而約翰松等人研發(fā)了對于人血清白蛋白的親和力有很大提高的G148-GA3的人工變異體(約翰松等人，《蛋白質工程設計與選擇》(Prot Eng Des Sel)21:515-27, 2008)。對于一些變異體來說，獲得一種更高的親和力是以熱穩(wěn)定性降低為代價的。除了上述含有三螺旋結構的蛋白質之外，還存在著其他的結合白蛋白的無關細菌蛋白。ABD和免疫作用最近，以實驗的方式鑒定出在鏈球菌蛋白G菌株148 (G148)的白蛋白結合區(qū)內的少數(shù)T細胞和B細胞表位(戈奇(Goetsch)等人，《臨床診斷實驗室免疫學》(Clin DiagnLab Immunol) 10:125-32，2003)。這項研究背后的諸位作者的興趣在于，利用在疫苗中的G148的T細胞表位，S卩，利用白蛋白結合區(qū)的固有免疫刺激特性。另外，戈奇等人在G148的序列中發(fā)現(xiàn)一個B細胞表位，即，被在免疫之后的抗體結合的一個區(qū)域。在用于人類給藥的藥物組合物中，免疫應答是所不希望的。因此，由于其上述免疫刺激特性，白蛋白結合域G148本身不適合用于這樣的組合物中。說明書在一個第一個方面，通過一種白蛋白結合多肽克服或減輕了現(xiàn)有技術的以上缺點和不足，這種白蛋白結合多肽包含選自以下的一個氨基酸序列i) LAX3AKX6X7AnX10 EldX14YGVSdf YKRLIXffiKAKTVEGVEALKX39X4(lILX43X44LP，其中彼此獨立地，X3 選自 E、S、Q 以及 C ;X6 選自 E、S 以及 C ;
X7 選自 A 和 S ;X1。選自 A、S 以及 R ;X14 選自 A、S、C 以及 K ;X26 選自 D 和 E ;X39 選自 D 和 E ;X40 選自 A 和 E ;X43 選自 A 和 K ;X44 選自 A、S 以及 E ； 位置45處的L存在或不存在；并且位置46處的P存在或不存在；以及ii)與i)中所定義的序列具有至少95% —致性的一個氨基酸序列。以上所定義的對于白蛋白具有結合親和力的序列相關多肽的類別是衍生自一種共同親本多肽序列，這種共同親本多肽序列折疊成一個三α螺旋束結構域。更確切地說，如上文所描述的這些多肽衍生自一種模型建立，這種模型建立是基于血清白蛋白與白蛋白結合域G148-GA3之間的一種復合物的結構(萊永(Lejon)等人，《生物化學雜志》279:42924-8, 2004)，以及對共同親本多肽序列的許多突變變異體的結合和結構特性的分析。以上所定義的氨基酸序列i)與親本多肽序列相比包含氨基酸置換，這導致預期折疊成一種幾乎完全相同的三螺旋束結構域的一類多肽。同時該親本多肽序列已經包含用于與白蛋白相互作用的一個結合表面，該結合表面是通過根據以上定義的一些置換而被修飾的。根據以上定義的置換提供了相比于親本多肽序列的改進的白蛋白結合能力。根據本披露的第一個方面的白蛋白結合多肽展現(xiàn)出一組特征，這組特征例如，使這些白蛋白結合多肽適合用作用于人類給藥的治療性分子的融合或結合伴侶。例如，與相關白蛋白結合多肽(如白蛋白結合域G148-GA3以及披露于W009/016043中的白蛋白結合多肽)相比較，根據本披露的白蛋白結合多肽展示以下六個特征中的至少五個與例如G148-GA3和其他細菌衍生的白蛋白結合域比較，這些多肽展示不同的表面。該差異可以降低或消除已經暴露于這樣的細菌蛋白的受試者(如一個人)體內的抗體反應的任何風險。這些多肽與例如G148-GA3和多種其他相關但不同的常見親本多肽序列的突變變異體相比包含更少的潛在T細胞表位，并且因此當向一個受試者(如一個人)給予時展示低免疫原性。當給予受試者(如一個人)時，這些多肽展示出更低的與循環(huán)抗體的反應性。因此，如在人類血清的一個試驗裝置中所測量的，通過在暴露于循環(huán)抗體的這些多肽的表面中(即，在不涉及與白蛋白的結合相互作用的多肽表面中)的氨基酸置換，相比于例如由G148-GA3引起的抗體交叉反應性，抗體交叉反應性被降低了。與例如已知天然存在的白蛋白結合多肽(如衍生自細菌蛋白的白蛋白結合域)相t匕，就更高的結合親和力(如通過Kd值所定義的)來說，以及就更慢的解離率(如通過I^ff值所定義的)來說，這些多肽具有高的白蛋白結合能力。與例如已知天然存在的白蛋白結合多肽(如衍生自細菌蛋白的白蛋白結合域)相t匕，這些多肽包含更少的與多肽的穩(wěn)定性問題相關的氨基酸殘基。因此，這些多肽不包含例如易于氧化的甲硫氨酸或色氨酸并且僅包含一個天冬酰胺。與前述白蛋白結合多肽(如在W009/016043中所披露的)相比，這些多肽具有更高的結構穩(wěn)定性(如通過55° C以上的熔點所定義的)。在一個實施方案中，根據第一個方面的白蛋白結合多肽展示所有以上列出的六個特征。在另一個實施方案中，當與白蛋白結合時，與例如前述白蛋白結合多肽(如在W009/016043中所披露的)比較，根據第一個方面的白蛋白結合多肽展示更親水的特征。當白蛋白結合多肽與白蛋白相互作用時，該多肽暴露于環(huán)境的表面包含更少的賦予表面疏水性的氨基酸殘基。如熟練的人員將認識到的，任何多肽的功能(如根據第一個方面的多肽的白蛋白 結合容量)取決于該多肽的三級結構。然而，有可能在不影響α螺旋多肽的結構的情況下改變其氨基酸序列(達維娜(Taverna)和戈德斯坦(Goldstein)，《分子生物學雜志》315(3) :479-84, 2002 ;何(抱)等人，《美國國家科學院院刊》105 (38) : 14412-17，2008)。因此，i)的修飾變異體(這些變異體使得產生的序列與屬于由i)所定義的類別的一個序列至少95%—致)也被該第一個方面所涵蓋。例如，有可能的是，屬于氨基酸殘基的某一官能團(例如疏水性、親水性、極性官能團，等等)的一個氨基酸殘基可以取代為來自相同官能團的另一個氣基酸殘基。如在本說明書和權利要求書中所使用的，術語“ 一致性百分比(％identitical*%identity)”是如下計算的。使用CLUSTAL W算法將查詢序列與目標序列進行比對(湯普森，J. D. (Thompson, J. D.)，希金斯，D. G. (Higgins, D. G.)以及吉布森，T. J. (Gibson, T.J.),《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，22:4673-4680 (1994))。在與比對序列中的最短序列相應的窗口上進行比較。比對序列中的最短序列在一些情況下可以是目標序列，如在此所披露的白蛋白結合多肽。在其他情況下，查詢序列可以構成比對序列中的最短序列。查詢序列可以例如由至少10個氨基酸殘基，如至少20個氨基酸殘基，如至少30個氨基酸殘基，如至少40個氨基酸殘基，例如45個氨基酸殘基組成。比較在各位置的氨基酸殘基，并且將查詢序列中具有目標序列中的相同一致性的位置的百分比報告為一致性百分比。在根據第一個方面的白蛋白結合多肽的一個實施方案中，X6是E。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X3是S。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X3是E。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X7是A。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X14是S。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X14是C。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，Xltl是A。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，Xltl是S。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X26是D。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X26是E。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X39是D。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X39是E。
在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X4tl是A。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X43是A。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X44是A。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，X44是S。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，在位置45處存在L殘基。在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，在位置46處存在P殘 基。 在根據這個方面的白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，在位置46處不存在P殘基。在另一個實施方案中，根據這個方面的白蛋白結合多肽的限制條件為X7既不是L、E，也不是D。可以制備根據第一個方面的白蛋白結合多肽，以便通過用例如一個半胱氨酸或一個賴氨酸置換表面暴露的氨基酸殘基而與一種適合的結合伴侶相結合。這些置換可以引入到該多肽的N末端螺旋(即螺旋一)中，螺旋一為當白蛋白結合多肽與血清白蛋白結合時位于離該血清白蛋白最遠的螺旋。因此，可以使用i)中所定義的序列的位置X14處的一個賴氨酸殘基來實現(xiàn)定點結合。此外，當通過化學肽合成來制造該分子時，這可能是有利的，因為可以利用所述賴氨酸的ε-氨基的正交保護。此外，可以將一個半胱氨酸殘基引入到氨基酸序列中以實現(xiàn)定點結合。例如，可以將半胱氨酸殘基引入到符合以上定義的位置χ3、χ6和/或X14中的任何一處。一個結合伴侶與一個賴氨酸的ε胺或一個半胱氨酸的硫基偶聯(lián)代表兩種化學上不同的替代方案，從而使用氨基酸序列i)內的一個氨基酸殘基獲得定點結合。如熟練的人員所理解的，存在著制備用于結合的一個氨基酸序列的其他化學替代方案，并且這些方案本身也在本披露的范圍內。這樣的化學方法的一個實例是點擊樣化學反應(click-likechemistry),如由班(Ban)等人提出的通過引入一個酪氨酸來實現(xiàn)的(《美國化學會志》(JAmChem Soc) 132:1523-5，2009)。如在本說明書中所使用的，術語“白蛋白結合”和“對白蛋白的結合親和力”是指一個多肽的一種特性，這種特性可以例如通過使用表面等離子共振技術(如在Biacore儀器中)來測試。例如，如在以下實例中所述的，可以在一個實驗中測試白蛋白結合親和力，其中白蛋白或其一個片段被固定在該儀器的一個傳感器芯片上，并且使含有將要被測試的多肽的樣品在該芯片上方經過?？商娲?，將要被測試的多肽被固定在該儀器的一個傳感器芯片上，并且使含有白蛋白或其一個片段的一個樣品在該芯片上方經過。在這點上，白蛋白可以是來自一個哺乳動物的血清白蛋白，如人血清白蛋白。然后，熟練的人員可以解釋通過這樣的實驗所獲得的結果來建立該多肽對于白蛋白的結合親和力的至少一個定性量度。如果一個定量量度是所希望的，例如用來確定針對相互作用的一個Kd值，還可以使用表面等離子共振法。例如,可以在Biacore2000儀器(通用電氣醫(yī)療集團(GEHealthcare))中確定結合值。將白蛋白適當?shù)毓潭ㄔ谠摐y量儀器的一個傳感器芯片上，并且通過連續(xù)稀釋來制備有待測定親和力的多肽的樣品并且將其注入。然后，可以根據由使用例如由儀器制造商(通用電氣醫(yī)療集團)提供的BIA評估4.1軟件的1:1蘭米爾結合模型(Langmuirbindingmodel)的結果來計算Kd值。在一個實施方案中，根據這個方面的白蛋白結合多肽與白蛋白結合，使得該相互作用的Iw值為至多δΧΙΟ 如至多5 X KT6s'如上文所描述的，如由氨基酸序列i)所定義的白蛋白結合多肽衍生自折疊成一個三α螺旋束結構域的一種共同親本多肽序列。在一個實施方案中，這種親本多肽序列的三螺旋結構域形成來自鏈球菌(Streptococcus)菌株G148的蛋白G的一部分,尤其結構域GA3。在另一個實施方案中，白蛋白結合多肽的氨基酸序列是選自SEQ IDN0:1_144以及·SEQ ID NO: 164-203中的任何一個，如選自SEQ IDNO: 1-144中的任何一個。更確切地說，該氨基酸序列是選自 SEQ IDNO:4-5,SEQ ID NO:7-8,SEQ ID NO: 10-1KSEQ ID NO: 13-14,SEQIDN0:16-17、SEQ ID NO:19-20、SEQ ID NO:22-23、SEQ ID NO:25-26、SEQID NO:28-29、SEQID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50,SEQ ID NO: 164-170 以及SEQ IDN0:192-203。因此，該氨基酸序列可以選自 SEQ ID NO:4-5,SEQ IDNO:7-8, SEQ ID NO:10-11、SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:16-17、SEQ IDN0:19-20、SEQ ID NO:22-23、SEQ ID NO:25-26、SEQ ID NO:28-29、SEQID NO:31-32、SEQ ID NO:34-35、SEQ ID NO: 37-38、SEQ ID NO:41-42 以及 SEQ ID NO:49-50。在一個實施方案中，根據這個方面的白蛋白結合多肽進一步包含位于i)中所定義的序列的N末端和/或C末端的一個或多個另外的氨基酸殘基。這些另外的氨基酸殘基可以在增強多肽對白蛋白的結合以及改進折疊的白蛋白結合域的構象穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用，但同樣可以良好地用于其他目的，例如有關于該多肽的生產、純化、體內或體外穩(wěn)定化、偶聯(lián)、標記或檢測中的一者或多者，以及其任何組合。這樣的另外的氨基酸殘基可以包含為化學偶聯(lián)目的而添加的一個或多個氨基酸殘基，例如添加到色譜樹脂中以獲得一種親和基質，或添加到一個螯合部分中以便與一種射電金屬絡合。因此，在一個實施方案中，直接在氨基酸序列i)的N末端或C末端的α螺旋之前或之后的氨基酸可能影響構象穩(wěn)定性?？梢源偈垢倪M構象穩(wěn)定性的一個氨基酸殘基的一個實例為位于如上文所定義的氨基酸序列i)的N末端的一個絲氨酸殘基。在一些情況下，該N末端絲氨酸殘基可以通過涉及在絲氨酸側鏈的Y氧與谷氨酸殘基的多肽主鏈NH之間的氫鍵鍵合來形成一種標準S-X-X-E封端盒。這種N末端封端可以促進構成根據本披露第一個方面的白蛋白結合多肽的三螺旋結構域的第一 α螺旋的穩(wěn)定化。因此，在一個實施方案中，這些另外的氨基酸包含在多肽的N末端的至少一個絲氨酸殘基。換句話說，該氨基酸序列前面是一個或多個絲氨酸殘基。在白蛋白結合多肽的另一個實施方案中，這些另外的氨基酸包含在該多肽的N末端的一個甘氨酸殘基。應當理解的是，氨基酸序列i)前面可以是一個、兩個、三個、四個或任何適合數(shù)目的氨基酸殘基。因此，該氨基酸序列的前面可以是單個絲氨酸殘基、單個甘氨酸殘基或這兩者的組合(如一個甘氨酸-絲氨酸(GS)組合或一個甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸(GSS)組合)。包含在N末端的另外的氨基殘基的白蛋白結合多肽的實例展示于SEQ ID NO: 145-163(如SEQ ID NO: 145-148以及SEQ ID NO: 162-163)中。在又另一個實施方案中，這些另外的氨基酸殘基在如由序列i)所定義的多肽的N末端包含一個谷氨酸。同樣，可以利用C末端封端來改進構成白蛋白結合多肽的三螺旋結構域的第三α螺旋的穩(wěn)定性。當存在于i)中所定義的氨基酸序列的C末端時，一個脯氨酸殘基可以至少部分地作為一個封端殘基起作用。在這種情況下，在C末端的脯氨酸殘基之后的一個賴氨酸殘基可以促使白蛋白結合多肽的第三螺旋進一步穩(wěn)定化，這是通過賴氨酸殘基的ε氨基與位于多肽主鏈中的賴氨酸之前兩個和三個殘基處的氨基酸的羰基(例如當L45與Ρ46兩者都存在時，在i)中所定義的氨基酸序列的亮氨酸和丙氨酸殘基的羰基)之間的氫鍵鍵合來實現(xiàn)的。因此，在一個實施方案中，這些另外的氨基酸包含在該多肽的C末端的一個賴氨酸殘基。如上文所論述的，這些另外的氨基酸可能與該白蛋白結合多肽的生產有關。具體來說，當根據其中存在P46的一個實施方案的白蛋白結合多肽是通過化學肽合成來生產時，在C末端脯氨酸之后的一個或多個 任選的氨基酸殘基可以提供多種優(yōu)點。這樣的另外的氨基酸殘基可以例如防止形成所不希望的物質，如在合成的二肽階段的二酮哌嗪。這樣的氨基酸殘基的一個實例是甘氨酸。因此，在一個實施方案中，這些另外的氨基酸包含在該多肽的C末端的一個甘氨酸殘基，如上文所考慮的，這個甘氨酸殘基直接在脯氨酸殘基之后，或在一個另外的賴氨酸和/或甘氨酸殘基之后?？商娲兀嚯纳a可以受益于氨基酸序列i)的C末端脯氨酸殘基(當存在時)的酰胺化。在這種情況下，C末端脯氨酸包含在羧基碳處的一個另外的胺基。在此處所述的多肽(特別是那些在C末端處以脯氨酸或已知在肽合成過程中用來外消旋的其他氨基酸終止的多肽)的一個實施方案中，以上提及的向C末端添加一個甘氨酸或使脯氨酸(當存在時)酰胺化也可以對抗C末端氨基酸殘基的外消旋化的潛在問題。如果以此方式酰胺化的多肽預期通過重組手段而不是通過化學合成來生產，可以通過本領域中已知的若干方法(例如通過使用酰胺化PAM酶)來進行C末端氨基酸的酰胺化。在C末端包含多個另外的氨基酸殘基的多種白蛋白結合多肽的多項實例展示于SEQ ID NO: 145-152，如SEQ ID N0:148_150中。熟練的人員知曉用于完成C末端修飾的多種方法，例如通過不同類型的用于肽合成的預制基質。在另一個實施方案中，這些另外的氨基酸殘基包含在該多肽的N末端和/或C末端的一個半胱氨酸殘基。這樣的半胱氨酸殘基可以直接在如i)中所定義的氨基酸序列之前和/或之后或可以在如上文所描述的任何其他另外的氨基酸殘基之前和/或之后。包含在該多肽鏈的N末端和/或C末端的一個半胱氨酸殘基的白蛋白結合多肽的實例展示于SEQ ID NO: 149-150 (C末端)和SEQ ID NO: 151-152 (N末端)中。通過向該多肽鏈中添加半胱氨酸殘基，可以獲得用于定點結合白蛋白結合多肽的硫基?？商娲兀梢杂门c引入一個半胱氨酸殘基類似的一種方式將一個硒半胱氨酸殘基引入到該多肽鏈的C末端，以有助于位點特異性結合(程(Cheng)等人，《自然實驗手冊》(Nat Prot) 1: 2，2006)。在一個實施方案中，該白蛋白結合多肽包含不超過兩個半胱氨酸殘基。在另一個實施方案中，該白蛋白結合多肽包含不超過一個半胱氨酸殘基。在另一個實施方案中，該白蛋白結合多肽的另外的氨基酸殘基包含用于該多肽的純化或檢測的一個“標簽”，如一個六聚組氨酰基(His6)標簽，或一個“myc”(“c_Myc”)標簽或一個“FLAG”標簽，這種標簽可以與對該標簽具有特異性的抗體相互作用和/或待用于純化。熟練的人員知曉其他的替代方案。在又另一個實施方案中，根據這個方面的白蛋白結合多肽與人血清白蛋白結合。在其他實施方案中，白蛋白結合多肽與來自除了人類之外的其他種類的白蛋白(如來自小鼠、大鼠、狗以及食蟹猴的白蛋白)結合。上文所論述的“另外的氨基酸殘基”也可以構成具有任何所希望的功能(如與第一白蛋白結合域相同的結合功能，或另外的結合功能，或治療功能，或酶促功能，或熒光功能，或其功能的混合)的一個或多個多肽結構域。因此，在另一個相關方面中提供了一種融合蛋白或結合物，該融合蛋白或結合物包含 i) 一個第一部分，該第一部分由一個如在此所述的根據第一個方面的白蛋白結合多肽組成；以及ii) 一個第二部分，該第二部分由具有一種所希望的生物活性的一個多肽組成。包含一個根據本披露第一個方面的白蛋白結合多肽以及一個第二部分的一種融 合蛋白或結合物與該第二部分本身的體內半衰期相比可以增加該第二部分的體外和/或體內半衰期。結果，當向受試者(如人類受試者)給予一種根據這個方面的融合蛋白或結合物時，體內暴露于該第二部分可以增加，這可以導致該第二部分的生物活性效能與在單獨給予該第二部分時的體內暴露的效能相比有所改進。所希望的生物活性可以例如是一種治療活性、一種結合活性或一種酶促活性。當所希望的生物活性是一種治療活性時，顯示這種活性的第二部分可以是一種治療活性多肽。治療活性多肽的非限制性實例是生物分子，如選自下組的分子，該組由以下各項組成人內源酶、激素、生長因子、趨化因子、細胞因子以及淋巴因子、以及非人類生物活性蛋白，如選自下組的蛋白質，該組由以下各項組成細菌毒素(例如假單胞菌外毒素以及葡萄球菌和鏈球菌超抗原)、酶(例如核糖核酸酶和內酰胺酶)以及活化蛋白(例如鏈激酶)。可以證明對與白蛋白結合多肽融合或結合有用的治療活性生物分子的非限制性實例選自下組，該組由以下各項組成IL_2、GLP-1、BNP (Alb-β -鈉尿肽)、IL-1-RA (白細胞介素-1受體拮抗劑)、KGF (角質細胞生長因子)、Stemgen 、生長激素(gh)、g-csf、ctla-4、肌肉生成抑制素、因子VI1、因子VIII以及因子IX。腫瘤組織的有泄漏缺陷的(leaky defective)血管使其血管結構(內皮屏障)能透過大分子，而在健康組織的血管中僅僅小分子可以通過該內皮屏障。同樣，在類風濕性關節(jié)炎患者的發(fā)炎的關節(jié)中，血-關節(jié)屏障對白蛋白的滲透性顯著增加。因此，根據這個方面的融合蛋白或結合物有可能滲透在腫瘤組織中的血管以及在發(fā)炎的關節(jié)中的血-關節(jié)屏障。當該第二部分的所述所希望的生物活性是一種結合活性時，所述第二部分可以是能夠與目標分子選擇性相互作用的一種結合多肽。這樣的結合多肽可以例如選自下組，該組由以下各項組成抗體以及其實質上保留抗體結合活性的片段和結構域；微體、maxybody、高親合性多聚體以及其他小的二硫鍵結合的蛋白質；以及衍生自一種骨架的結合蛋白，其選自下組，該組由以下各項組成葡萄球菌A蛋白及其結構域、其他三螺旋結構域、脂質運載蛋白、錨蛋白重復結構域、纖維素結合域、Y晶型、綠色熒光蛋白、人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4、蛋白酶抑制劑(如庫尼茲結構域)、PDZ結構域、SH3結構域、肽適體、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纖連蛋白III型結構域、轉鐵蛋白、鋅指以及芋螺毒素。在一些實施方案中，用于結合所述目標結合多肽的目標分子可以選自下組，該組由以下各項組成阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease)的淀粉樣β (Αβ )肽；其他疾病相關淀粉樣肽；毒素，如細菌毒素和蛇毒；凝血因子，如血管性血友病因子；白細胞介素，如IL-13 ;肌肉生成抑制素；促炎因子，如TNF-α、TNF-α受體、IL-1、IL-8以及IL-23 ;補體因子，如C3和C5 ;超敏反應介質，如組胺和IgE ;腫瘤相關抗原，如⑶19、⑶20、⑶22、⑶30、CD33、CD40、CD52、CD70、cMet、HERl、HER2、HER3、HER4、CAIX (碳酸酐酶 IX)、CEA、IL-2 受體、MUCl、PSMA, TAG-72 ;以及其他生物分子，如G-CSF、GM-CSF、生長激素(GH)、胰島素以及生長抑素。如熟練的人員所理解的，根據第一個方面的白蛋白結合多肽可以在融合蛋白中或作為任何其他部分的結合伴侶是有用的。因此，以上治療活性多肽、結合多肽以及目標分子的清單不應當理解為以任何方式的限制。在根據本披露的融合蛋白或結合物一個實施方案中，該第二部分經由添加到該白蛋白結合多肽的N末端或C末端的一個賴氨酸或半胱氨酸殘基或經由在該白蛋白結合多肽內的一個位置處(如選自X3、X6以及X14的一個位置處)的一個賴氨酸或半胱氨酸殘基而與該白蛋白結合多肽結合。如果該結合位點是在該白蛋白結合多肽的氨基酸序列i)內的一 個位點(如在位置X14處的一個半胱氨酸)，為了實現(xiàn)與該第二部分結合的目的，不需要將另外的氨基酸添加到該白蛋白結合多肽中。而且如由i)所定義的在該多肽鏈內的一個結合位點可以保護該多肽(尤其是接近于該結合位點的多肽部分)不受交叉反應抗體的影響。在不希望受理論約束的情況下，當該結合物經由該白蛋白結合多肽與體內(即位于血清白蛋白的結合口袋中)血清白蛋白結合時，結合在例如構成該白蛋白結合多肽的三螺旋結構域的螺旋一之內的一個位置的第二部分可能遠離該白蛋白結合多肽結合到其上的血清白蛋白。另外，在該白蛋白結合多肽內的一個結合位點可以損害以別的方式衍生自該多肽的這個部分的肽部分到T細胞的呈遞，這是由于例如對抗原呈遞細胞的加工的作用、潛在肽在MCH II類分子的肽結合槽中的配合的損害、以及可供T細胞受體使用的肽表面的重塑(由于結合部分伸出)。因此，在該結合位點附近的結合物部分的免疫原性預期在結合之后會變得進一步降低。由于本披露的白蛋白結合多肽與血清白蛋白之間的高親和力，包含這樣一種白蛋白結合多肽的一種結合物或融合蛋白可以被視為與血清白蛋白的一種間接復合物。因此，根據本披露的結合物或融合蛋白為時常使用的利用具有血清白蛋白的直接結合物或融合物的方法提供了一種替代方案。這樣的具有血清白蛋白的直接結合物時常是不均勻的，無論使用何種方法進行偶聯(lián)。當一個特定分子經由一個賴氨酸殘基的一個氨基與血清白蛋白偶聯(lián)時，可以靶向血清白蛋白分子表面上的大量賴氨酸中的任何一個，這個賴氨酸提供一個隨機結合位點和一種隨機產物。雖然經由人血清白蛋白中的單一不成對的半胱氨酸偶聯(lián)(在34位置處，彼得斯，1985，同前文獻)的巰基似乎提供了一種獲得直接結合物的替代方法，但是這樣的方法時常產生一種不均勻的產物。在可商購的(人類)血清白蛋白中，僅20%-60%的分子展示游離硫基，而其余部分被硫基化合物(如半胱氨酸、高半胱氨酸或谷胱甘肽)封閉。相比之下，可以用位點特異性方式來進行與根據本披露的白蛋白結合多肽的三螺旋結構域的結合。如上文所論述的，這可以通過偶聯(lián)到一個或多個半胱氨酸、一個硒半胱氨酸或一個指定賴氨酸上(在合成期間受正交保護)來完成。根據本披露的這個方面，具有所希望的生物活性的該第二部分可以與該白蛋白結合多肽的三螺旋結構域結合或作為一種具有該第二部分的融合蛋白而生產。以下給出根據本披露的結合物的一個非限制性實例。胰高血糖素樣肽I (GLP-1)或其衍生物是一種小的多肽，這種多肽可以適合地作為具有該白蛋白結合多肽的結合物中的一個第二部分而存在。可以在如上文所描述的多肽序列的任一位置中進行GLP-1與該白蛋白結合多肽的結合。像這樣，可以在一種非生物過程中生產該結合物，并且與GLP-1本身的效能相比，該結合物預期展示出顯著提高的效能。結合可以采用小的多肽或蛋白質，如GLP-1，或用更大的多肽或蛋白質。根據本披露的結合物可以典型地包含一種非氨基酸間隔部分，如聚乙二醇(PEG)0其他多肽或蛋白質可以與處于融合蛋白形式的白蛋白結合多肽的氨基酸序列相組合。此外，這樣一種融合蛋白可以在第一與第二部分之間包含一個或多個間隔氨基酸殘基。如上文所描述的，根據第一個方面的白蛋白結合多肽結合來自若干種類(包括小 鼠、大鼠、狗以及食蟹猴)的血清白蛋白。因此，根據本披露的融合蛋白或結合物可以有助于增強不僅在人類受試者而且動物模型中的第二部分的生物效應。已經生產了作為具有人血清白蛋白的直接融合物的許多內源性蛋白質，這樣的蛋白質的實例包括G-CSF、GH、干擾素、⑶4、IL-2、胰島素、胰高血糖素、GLP-1、抗體Fab片段以及蛋白酶抑制劑(像庫尼茲結構域衍生蛋白)。然而，可以在動物模型中不完全評估這樣的直接融合物。這是由于以下事實人血清白蛋白例如在通常使用的動物模型(小鼠和大鼠)中不適當?shù)嘏c內源性Fe新生受體(FcRn)相互作用，并且這種相互作用是促成血清白蛋白的長循環(huán)時間的重要因素。如上文所描述的，根據本披露的結合物或融合蛋白可以在血清白蛋白存在下與白蛋白組合并且作為一種具有白蛋白的間接融合物起作用。這使得包含根據第一個方面的白蛋白結合多肽的結合物或融合蛋白在臨床前模型種類中是有用的，條件是在所選擇的種類中該第二部分是生物學活性的。在一個實施方案中，在此提供了包含由具有一種另外的所希望的生物活性的多肽組成的一個另外的部分的融合蛋白或結合物，這種另外的所希望的生物活性可以與該第二部分的所希望的生物活性相同或不同。這樣的融合蛋白或結合物的一個特定實例包含如上文定義為第二部分的治療活性多肽以及如上文定義為一個另外的部分的結合多肽。關于以上對與根據第一個方面的白蛋白結合多肽結合的融合蛋白或結合物的描述，應當注意的是，作出第一、第二以及另外的部分的指定是為了清楚的原因，以便在一方面區(qū)分根據本披露的白蛋白結合多肽或多肽，而在另一方面區(qū)分展示其他功能的部分。這些指定并不旨在是指在融合蛋白或結合物的多肽鏈中的不同結構域的實際順序。因此，例如，所述第一部分可以未加限制地出現(xiàn)在融合蛋白或結合物的N末端、中間或C末端。在一個相關方面，提供了進一步包含有機分子(如一種細胞毒性劑)的如在本披露中所定義的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物。與根據第一個方面的白蛋白結合多肽融合或結合或與根據第二個方面的融合蛋白或結合物組合的細胞毒性劑的非限制性實例選自刺孢霉素、奧莉絲汀(auristatin)、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素(ecteinascidin)、格爾德霉素(geldanamycin)、氨甲喋呤以及其衍生物以及其組合。先前已經作出用直接白蛋白結合物治療不同的失調的嘗試。這樣的直接白蛋白結合物已經例如與多柔比星一起用于癌癥中(克拉茲(Kratz)等人，《藥物化學雜志》(J Med Chem)45:5523-33，2002)，并且與氨甲喋呤一起用于類風濕性關節(jié)炎中(溫德爾(Wunder)等人，《免疫學雜志》(J Immunol) 170:4793-4801,2003)。應當理解的是，白蛋白結合多肽，其自身或作為融合蛋白或結合物中的一個部分，通過其高白蛋白結合能力提供了分析白蛋白復合物的間接手段，并且因此可以提供與以上提及的這些嘗試相比的一種替代治療方法。此外，以上方面涵蓋了多種多肽，其中根據第一個方面的白蛋白結合多肽或如根據第二個方面的融合蛋白或結合物中所包含的白蛋白結合多肽已經具備一種標記基團，如一種選自下組的標記物，該組由以下各項組成熒光染料和金屬、發(fā)色染料、化學發(fā)光化合物以及生物發(fā)光蛋白、酶、放射性核素以及顆粒，例如用于檢測多肽的目的。具體來說，本披露涵蓋了由如在此所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物與一種放射性核素(如一種放射性金屬)的放射性螯合物組成的一種放射性標記多肽。
在標記白蛋白結合多肽包含根據本披露第一個方面的一種白蛋白結合多肽以及一個標記的實施方案中，該標記多肽可以例如用于間接標記血清白蛋白。由于標記多肽與血清白蛋白之間的強締合作用，該標記多肽可以用于例如研究血管滲透性和血池(bloodpool)。在其他實施方案中，該標記白蛋白結合多肽是作為同樣包含具有所希望的生物活性的一個第二部分的融合蛋白或結合物中的一個部分而存在。該標記在一些情況下可以僅僅與該白蛋白結合多肽偶聯(lián)，而在一些情況下與該白蛋白結合多肽和該結合物或融合蛋白的第二部分偶聯(lián)。當參考一種標記多肽時，這應當理解為參考如在此所述的多肽的所有方面，包括包含一種白蛋白結合多肽和一個第二部分以及任選地另外的部分的融合蛋白和結合物。因此，一種標記多肽可以僅含有該白蛋白結合多肽和例如一種治療性放射性核素，這種治療性放射性核素可以與該白蛋白結合多肽螯合或共價偶聯(lián)，或含有該白蛋白結合多肽、一種治療性放射性核素以及具有所希望的生物活性(如治療效果)的一個第二部分(如一個小分子)。在白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物經放射性標記的實施方案中，這樣的放射性標記多肽可以包含一種放射性核素。大多數(shù)放射性核素具有金屬性質并且多種金屬典型地不能與蛋白質和肽中存在的元素形成穩(wěn)定的共價鍵。由于這個原因，用放射性金屬標記蛋白質和肽是在使用多種螯合劑(即多齒配體)的情況下進行的，這些螯合劑與金屬離子形成非共價化合物，稱為螯合物。在白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的一種實施方案中，與一種放射性核素結合是通過提供一種螯合環(huán)境來實現(xiàn)的，通過這種螯合環(huán)境該放射性核素可以與多肽配合、螯合或復合。螯合劑的一個實例是聚氨基聚羧酸酯型螯合劑。這樣的聚氨基聚羧酸酯螯合劑中的兩類是著名的大環(huán)和非環(huán)螯合劑。在一個實施方案中，該白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物包含由通過半胱氨酸殘基的一個硫基或賴氨酸殘基的一個ε胺基與白蛋白結合多肽結合的一種聚氨基聚羧酸酯螯合劑提供的螯合環(huán)境。對于銦、鎵、釔、鉍、放射性錒系元素(radioactinide)以及放射性鑭系元素(radiolanthanide)的放射性同位素來說,最常使用的大環(huán)螯合劑為DOTA (1,4,7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸)的不同衍生物。在一個實施方案中，白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的螯合環(huán)境是由DOTA或其衍生物提供的。更確切地說，例如如實例5中所述，通過使DOTA衍生物1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三-乙酸-10-馬來酰亞胺乙基乙酰胺(馬來酰亞胺單酰胺-D0TA)與例如白蛋白結合多肽的一個硫基反應而產生由本披露所涵蓋的一組螯合多肽。高動力學惰性(即金屬從DOTA的緩慢解離速率)有利于放射性核素的穩(wěn)定連接。然而，由于締合速率緩慢，對于標記需要高溫。由于這個原因，DOTA衍生物廣泛用于標記短肽，如本披露的白蛋白結合多肽，這種短肽在標記反應所需的溫度下孵育后展示出結合功能性。最常使用的非環(huán)聚氨基聚羧酸酯螯合劑是DTPA (二乙烯三胺五乙酸)的不同衍生物。因此，具有由二乙烯三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合環(huán)境的多肽也被本披露所涵蓋。已經發(fā)現(xiàn)DTPA的主鏈修飾的半剛性變異體(sem1-rigid variant)由于用例如Zevaiml^ 9°Y標記提供了充分的穩(wěn)定性。雖然非環(huán)螯合劑與大環(huán)螯合劑相比惰性更小，并且因此穩(wěn)定性更低，但是其標記甚至在環(huán)境溫度下也是足夠快的。為了這個原因，非環(huán)螯合劑可以用于標記根據本披露的融合蛋白或結合物。用于使聚氨基聚羧酸酯螯合劑與目標蛋 白和肽偶聯(lián)的詳細方案已經由庫柏(Cooper)等人(《自然實驗手冊》1:314-7，2006)以及索松伯斯基(Sosabowski)和馬瑟(Mather)(《自然實驗手冊》1:972-6，2006)公開。與一種聚氨基聚羧酸酯螯合劑偶聯(lián)的根據在此所述的這些方面的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物可以用于提供一種放射性標記多肽，這種放射性標記多肽由與螯合劑偶聯(lián)的白蛋白結合多肽融合蛋白或結合物與一種放射性核素的放射螯合物組成，這種放射性核素適合用于醫(yī)學顯像，其選自下組，該組由以下各項組成61Cu、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、n°nIn、mIn、44SC以及86Y,或這種放射性核素適合用于治療，這種放射性核素選自下組，該組由以下各項組成:225Ac、212B1、213B1、67Cu、166H0、177Lu、212Pb、149Pm、153Sm、227Th 以及 9°Y，其中該放射性核素與白蛋白結合多肽經由一種螯合劑而復合。在其實施方案中，該多肽也可以用非金屬放射性同位素使用所謂的間接標記進行放射性標記。因此，用例如18F、76Br、不同的碘同位素以及211At標記時，使用中間“連接分子”進行標記。這樣的連接子分子應當含有兩個功能部分，一個提供快速并且有效的放射性標記，而另一個實現(xiàn)與蛋白質的快速并且有效的偶聯(lián)，例如與一個獨特半胱氨酸(如在白蛋白結合多肽的位置X14處)的胺基或優(yōu)選地硫基偶聯(lián)。例如，一個馬來酰亞胺基與硫基反應形成一個穩(wěn)定的硫醚鍵?！斑B接分子”可以首先與放射性標記反應，并且隨后與蛋白質的巰基或硒代巰基(selenothiol group)反應。在另一個方面，提供了編碼如在此所述的白蛋白結合多肽或融合蛋白的一種多核苷酸。同樣，涵蓋了生產如上文所描述的白蛋白結合多肽或融合蛋白的一種方法，包括表達多核苷酸、包含這種多核苷酸的表達載體以及包含這種表達載體的宿主細胞。本披露的白蛋白結合多肽可以可替代地使用具有受保護的反應性側鏈的氨基酸和/或氨基酸衍生物通過非生物肽合成來生產，這種非生物肽合成包括使氨基酸和/或氨基酸衍生物逐步偶聯(lián)，形成具有受保護的反應性側鏈的根據第一個方面的一種多肽，從該多肽的反應性側鏈中去除保護基團，并且使該多肽在水溶液中折疊。因此，使用生理氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸)和預保護的氨基酸衍生物在溶液中或在一種有機溶劑中的固體載體上順序地構建多肽序列。在固體載體上的肽合成的一個特定實例描述于實例5中。當構建好一個完整的多肽序列時，去除保護基團并且允許該多肽在水溶液中折疊。根據本披露的每種多肽在不添加因子并且因此自發(fā)地折疊的情況下可逆地折疊成一種三螺旋束結構域。可以通過一種方法來生產根據第二個方面的結合物，這種方法包括根據以上所描述的任何方法(如通過非生物肽合成)生產一種白蛋白結合多肽，并且使所生產的白蛋白結合多肽與如結合第二個方面所定義的一個第二和/或另外的部分相結合。而且，在融合蛋白或結合物的一個實施方案中，提供了如在此所定義的融合蛋白或結合物用于治療，例如用作一種藥劑。這樣一種融合蛋白或結合物可以展示比本身具有所希望的生物活性的多肽的體內半衰期更長的體內半衰期。而且，與向哺乳動物給予本身具有所希望的生物活性的多肽后引出的免疫應答相比，向哺乳動物(如人類)給予該融合蛋白或結合物后可能不引出免疫應答或引出較低的免疫應答。可替代地講，這提供了用于降低具有所希望的生物活性的多肽的免疫原性的一種方法，這種方法是通過使這樣的多肽與根據在此所披露的方面的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物融合或結合。另外，這可能增強第二部分的生物活性。
在另一個實施方案中，提供了根據本披露的融合蛋白或結合物，用于診斷，例如用作一種診斷劑。同樣，本披露涉及使用上述白蛋白結合多肽的不同方面，以及用于治療、診斷以及檢測的不同方法，其中該多肽由于其結合特征和其他特征是有用的。當在以下對這些用途和方法的說明中提及“白蛋白結合多肽”時，這一術語旨在涵蓋單獨的白蛋白結合多肽，以及所有基于上文所描述的這種多肽的那些分子，這些分子例如與作為融合蛋白或結合物中的一個部分的白蛋白結合多肽結合，和/或與一種標記物、一種螯合劑、一種治療劑和/或診斷劑結合，和/或具備另外的氨基酸殘基作為一個標簽或用于其他目的。如上文所解釋的，這樣的融合蛋白、衍生物等等形成本披露的一部分。另一組方面涉及提供多種新的手段，用于通過使一種難溶的化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物結合使其在水溶液中的溶解度增加。難溶的化合物與白蛋白結合多肽(單獨地或作為融合蛋白或結合物中的一個部分而結合)的作為結果產生的復合物能夠與白蛋白體內或體外締合，這種締合使其在水溶液中的溶解度增加。因此，在這個另外的方面的一個實施方案中，提供了一種組合物，這種組合物包含一種化合物，這種化合物本身具有不超過100μ g/ml的在水中的溶解度；與以下物質偶聯(lián)如在此所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，其中這種化合物與這種白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物是共價偶聯(lián)的。在一個實施方案中，該化合物本身具有不超過10 μ g/ml的溶解度。在又另一個實施方案中，所述溶解度不超過I μ g/ml。在一些實施方案中，該化合物可以是一種藥物活性的化合物，例如一種細胞毒性齊U。細胞毒性劑的非限制性實例為選自以下的那些細胞毒性劑刺孢霉素、奧莉絲汀、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素、格爾德霉素以及其衍生物以及其組合?？商娲兀毎拘詣┛梢詾橥ㄟ^有機合成制成而不是衍生自天然存在的化合物的一種合成化學毒素。除了難溶的化合物以及白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物之外，根據本披露的這個方面的組合物在一些實施方案中還可以包含對于臨床相關目標具有親和力的一種結合多肽。這種結合多肽適當?shù)夭煌诎椎鞍捉Y合多肽，并且可以與發(fā)明的組合物的其他組分非共價或共價偶聯(lián)。作為非限制性實例，對于臨床相關目標具有親和力的結合多肽可以選自下組，該組由以下各項組成抗體以及其實質上保留抗體結合活性的片段和結構域；微體、maxybodies、高親合性多聚體以及其他小的二硫鍵結合的蛋白質；以及衍生自選自下組的一種骨架的結合蛋白，該組由以下各項組成葡萄球菌A蛋白以及其結構域、其他三螺旋結構域、脂質運載蛋白、錨蛋白重復結構域、纖維素結合域、Y晶型、綠色熒光蛋白、人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4、蛋白酶抑制劑(如庫尼茲結構域)、PDZ結構域、SH3結構域、肽適體、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纖連蛋白III型結構域、轉鐵蛋白、鋅指以及芋螺毒素。根據本披露以上方面的組合物具有通過提供于白蛋白結合多肽(單獨地或以存在·于融合蛋白或結合物中的形式)的組合物中而與白蛋白體內或體外締合的能力。在某些情況下，形成組合物與一個活有機體外部的白蛋白的一種復合物(即將外源性白蛋白添加到組合物中)可能是有益的?？梢詫⑦@樣的組合物凍干，從而提供適合于在環(huán)境溫度下儲存的一種制劑。因此，本披露還提供了如上文所定義的一種組合物，這種組合物進一步包含白蛋白，如人血清白蛋白。在該化合物為一種治療活性化合物的情況下，本披露還提供了根據以上方面的組合物以便用作一種藥劑，即，用于治療。適當?shù)?，提供了一種白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物并且任選地白蛋白不會有害地影響活性化合物的治療效果，因此發(fā)明的組合物在指定化合物本身的那些治療性或預防性背景下將是有用的。在另一個實施方案中，提供了根據以上方面的組合物，以便用作一種診斷劑，SP，用于診斷。本披露的一個相關方面提供了制備如上文剛剛描述的組合物的一種方法。該方法包括提供一種化合物，這種化合物本身具有不超過100μ g/ml的在水中的溶解度；以及使該化合物與根據如在此所述的方面的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物共價偶聯(lián)，從而形成包含該化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的共價復合物的一種組合物。在白蛋白包括于該組合物中的本披露的實施方案中，該方法可以包括使該化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的所述復合物與白蛋白混合的另外的步驟，從而形成一種組合物，這種組合物包含i)化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的共價復合物與ii)白蛋白的非共價復合物。這種非共價復合物中的兩種組分的相對比例可以例如是1:1，使得難溶的化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的一個復合物單元與一個白蛋白分子締合。在一個實施方案中，該方法另外包括將該非共價復合物凍干，從而獲得一種凍干組合物。在另一個緊密相關的方面，本披露提供了增加一化合物的水溶性的方法，該方法包括提供一種化合物，這種化合物本身具有不超過100 μ g/ml的在水中的溶解度；使該化合物與根據如在此所述的方面的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物共價偶聯(lián)，從而形成化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的一種共價復合物；以及將化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的所述復合物與白蛋白在促進白蛋白結合多肽與白蛋白非共價締合的條件下混合；從而所述復合物中的該化合物在水中的溶解度比這種化合物本身在水中的溶解
度更大。在有關一種難溶的化合物的溶解度的這些方法方面中，不同組分的任選特征如結合剛剛在之前的組合物方面所描述。
雖然已經參考不同的示例性實施方案描述了本發(fā)明，本領域的普通技術人員應當理解的是，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下可以作出不同的改變并且多種要素可以由多種等效物代替。另外，在不脫離本發(fā)明的基本范圍的情況下，可以做出許多修改以使特定的情況或分子適應本發(fā)明的傳授內容。因此，預期本發(fā)明不受限于為進行本發(fā)明而考慮的任何具體實施方案，而是本發(fā)明將包括落入所附權利要求書范圍內的所有實施方案。MM

圖1是以下實例的氨基酸序列表本披露的多種白蛋白結合多肽(SEQIDNO: 1-152, SEQ ID NO: 155-203)，由一個N末端甘氨酸殘基擴展的來自鏈球菌菌株G148的蛋白G的GA3結構域(SEQ ID NO: 153)，以及先前由約翰松等人所描述的衍生自G148-GA3的一種白蛋白結合多肽(同前文獻，SEQ ID N0:154)。圖2顯示了在Biacore儀器中進行的結合分析的結果，用于研究白蛋白結合多肽PEP07912CSEQ ID NO: 157)與人血清白蛋白的結合。在具有955個RU的固定人血清白蛋白的一個表面上注射三種不同濃度的純化蛋白(40nM，粗灰色線；10nM，黑色線；以及2. 5nM，灰色線)。圖3A-C顯示了通過ELISA進行結合分析的結果，用于研究白蛋白結合多肽PEP07913 (SEQ ID NO: 153)、PEP06923 (SEQ ID NO: 154)、PEP07271 (SEQ ID NO: 155)、PEP07912 (SEQ ID NO: 157)、PEP07554 (SEQ ID NO: 156)、PEP07914 (SEQ ID NO: 158)、PEP07968 (D0TA 結合的 PEP07911，SEQ ID NO: 159)以及 PEP07844 (SEQ ID N0:161)與存在于126位個體的正常人血清中的IgG分子的結合，其中A)顯示了平均OD值，B)顯示了陰性血清(定義為0D〈0. 15)的百分比，并且C)顯示了陽性血清(定義為0D>1. O)的百分比。圖4A-B是顯示了對純化的以化學方式生產的白蛋白結合多肽PEP07834 (SEQ IDNO: 160)的分析的色譜圖，其中A)顯示了 220nm處的吸收信號，已扣除空白，并且B)顯示了280nm處的吸收信號，已扣除空白。在兩種波長處均出現(xiàn)兩個峰。圖5A-B是顯示對在圖4A)和B)中所鑒定的兩個峰的質譜分析的光譜圖。A)是第一峰，即PEP07834 (SEQ ID NO: 160)的單體的光譜圖，而B)是PEP07834的二聚體的光譜圖。圖6A-C是顯示在CD3+CD4+T細胞增殖分析中的白蛋白結合多肽PEP07913(SEQ IDN0:153)、PEP07912 (SEQ ID NO: 157)、PEP07914 (SEQID NO: 158)以及 PEP07968 (DOTA 結合的PEP07911，SEQ ID NO: 159)的免疫原性評定的圖。A)顯示了在一個具有52位白種人供體的同期組群中與重組人白蛋白相比對白蛋白結合多肽作出反應的個體的數(shù)目。B)顯示了與含有重組人白蛋白的陰性對照相比的PEP07913、PEP07912、PEP07914以及PEP07968的平均刺激指數(shù)(SI)。C)顯示了與緩沖劑對照相比的對研究中的所有蛋白質作出反應的個體的數(shù)目。圖7A-C顯示了在Biacore儀器中進行的結合分析的結果，用于研究白蛋白結合多肽 A)PEP07986 (SEQ ID NO: 163)、B) PEP08296 (D0TA 結合的 PEP08185，SEQ ID NO: 148)以及C)PEP06923 (SEQ ID NO: 154)與來自不同種類的白蛋白的結合。所示的傳感圖相應于在固定有來自以下種類的白蛋白的表面上以40nM的濃度注射的蛋白質人類(1130RU )，細灰色線；食蟹猴(1046RU)，粗灰色線；大鼠(831RU)，粗淺灰色線；狗(1053RU)，細黑色線；以及小鼠(858RU)，粗黑色線。圖8顯示了 ZX_PP013 (空心圓)、Zy-PPO 13 (空心正方形)以及Zneg_PP013 (實心三角形)在五倍摩爾過量的HSA存在下對細胞因子誘導的TF-1細胞增殖的抑制作用。圖9顯示了通過PEP07986 (SEQ ID NO: 163)的Biacore分析獲得的最大結合反應，PEP07986在2mg/ml的濃度下按指示儲存在4° C、25° C或40° C下持續(xù)一周、兩周、 一個月以及三個月，以IOnM的濃度注射于固定的HSA (704RU)上。顯示了時間為O時的未處理樣品作為參考。圖10顯示了在Biacore儀器中進行的結合分析的結果，用于研究白蛋白結合多肽PEP08296 (D0TA結合的PEP08185，SEQ ID NO: 148)在熱處理之前和之后與人血清白蛋白的結合。在具有724RU的固定人血清白蛋白的一個表面上注射兩種濃度的PEP08296(0. 8nM，灰色線；4nM，黑色線)。實線表示熱處理之前而陰影線表示在90° C下熱處理10分鐘之后。圖1lA-B 顯示了 PEP08296 (D0TA 結合的 PEP08185，SEQ ID NO: 148)在熱處理之前和在90° C下熱處理12min之后的兩種⑶光譜的疊加。A)在PBS (pH 7. 2)中孵育樣品。B)在PBS (pH 4.0)中孵育樣品。圖12顯示了 68Ga_PEP08296在一個健康大鼠中的全身分布的最大強度投影(MIP)圖像，在靜脈內注射(尾靜脈)后立即采集數(shù)據，持續(xù)1. 5h后求和。容易地描繪出在主要血管(例如頸靜脈(長箭頭)和股動脈(短箭頭))、心臟(H)、肝臟(L)、脾臟(S)、腎臟(K)以及膀胱(B)中的循環(huán)放射性。圖13顯示了以42mg/ml的濃度注射的PEP07986 (SEQ ID NO: 163)的凝膠過濾色譜圖，黑色實線。包括以5mg/ml的濃度注射的卵白蛋白(Mw43kDa)的色譜圖用于比較,灰色虛線，證實了 PEP07986的峰不是一種聚集體，將預期聚集體在與卵白蛋白相比更早的一個時間點洗脫的空隙體積中。現(xiàn)在，將進一步通過對據此所進行的實驗的非限制性說明來展示本發(fā)明。除非另有規(guī)定，自始至終使用了常規(guī)的化學和分子生物學方法。SM實例1:白蛋白結合多肽的克隆、表達、純化以及表征在這個實例中，將以下十種不同的白蛋白結合多肽克隆、純化以及特征化PEP07913 (SEQ ID NO: 153)、PEP07912 (SEQ ID NO: 156)、PEP07914 (SEQ ID NO: 158)、PEP07968 (DOTA 結合的 PEP07911，SEQ ID NO: 159)、PEP06923 (SEQ ID NO: 154)、PEP07271(SEQ ID N0:155)、PEP07554 (SEQID NO:156)、PEP07844 (SEQ ID NO:161)、PEP07986 (SEQID NO: 163)以及 PEP08296 (DOTA 結合的 PEP08185，SEQ ID NO: 148)，其氨基酸序列在圖1和所附的序列表中列出。
材料和方法白蛋白結合多肽變異體的克隆用適當?shù)墓押塑账崾褂枚c突變誘變在G148-GA3中產生突變，從而獲得所希望的白蛋白結合多肽變異體。用引物通過PCR擴增基因片段，在白蛋白結合多肽變異體之前添加特異性核酸內切酶位點以及一個N末端MGSS序列。將這些片段用NdeI和NotI切割、純化，然后連接到受相同的酶的限制的一種克隆載體上，該克隆載體為質粒PAY02556 (含有來自pBR322的復制起點、卡那霉素抗性基因以及T7啟動子，用于表達感興趣的基因))。將連接體轉化到多個電感受態(tài)的大腸桿菌TOPlO細胞中。將轉化的細胞涂布在補充有50 μ g/ml卡那霉素的TBAB板(30g/l胰蛋白示血瓊脂基質)上，隨后在37° C下孵育過夜。根據制造商的方案進行使用，使用PCR篩選集落，并且使用生物素化寡核苷酸和Terminatorv3.1循環(huán)測序試劑盒(應用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems))對擴增片段進行測序。使用Magnatrix 8000 (NorDiag AB)通過與包被有磁性鏈霉親和素的珠粒結合來純化測序反應物，并且在ABI丨iRlSM 3100基因分析儀(PE應用生物系統(tǒng)(PE Applied Biosystems))上分析。將所有白蛋白結合多肽變異體亞克隆為單體，并且由表達載體編碼的多種結構為MGSS-[PP###]，其中PP###相應于構成白蛋白結合多肽序列的氨基酸殘基。另外，用多引物通過PCR將G148-GA3、PP007(SEQID NO:7)、PP013(SEQ ID NO: 13)以及PP037 (SEQ ID N0:37)的基因片段擴增，在構成白蛋白結合多肽序列的氨基酸殘基之前添加特異性核酸內切酶位點以及一個六聚組氨酸(hexahistidin)序列、一個TEV蛋白酶位點以及一個甘氨酸殘基。多肽 PEP07913 (SEQ ID NO: 153)、PEP07912 (SEQ ID NO: 157)、PEP07914 (SEQ ID NO: 158)以及 PEP07968 (SEQ ID NO: 159)相應于添加了甘氨酸殘基的白蛋白結合多肽 G148-GA3、PP007 (SEQ ID N0:7)、PP013 (SEQ ID NO: 13)以及 PP037 (SEQID N0:37)。將這些片段用XbaI和NotI切割、純化，然后與受相同的酶的限制的一種克隆載體連接，該克隆載體為質體PAY02512 (含有來自PBR322的復制起點、卡那霉素抗性基因以及T7啟動子，用于表達感興趣的基因?？寺∥稽c的前面是編碼一種含有一個六聚組氨酸標簽的肽的序列，隨后為TEV蛋白酶的切割位點)，其受相同的酶的限制。如上文所描述進行連接、轉化以及序列測定。將四個白蛋白結合多肽變異體G148-GA3、PP007、PPO13以及PP037亞克隆為單體，并且由表達載體編碼的構建體為MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP###]。通過使用寡核苷酸的定點誘變將編碼MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG- [PPO13]的表達載體進一步修飾，導致在構成白蛋白結合多肽序列的氨基酸殘基之前插入一個絲氨酸殘基，從而獲得構建體MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS- [PP013]。將這個構建體通過如下方式進一步修飾1)定點誘變以用一個半胱氨酸殘基替換位置14 (PP013內)處的絲氨酸殘基，產生MGS SHHHHHHLQS SGVDLGTENLYFQGS_[PP049]，以及2)在C末端添加一個甘氨酸殘基，產生MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049]-G。通過使用引物的PCR擴增完成在C末端添加甘氨酸，這些引物包括編碼甘氨酸殘基和多個特異性核酸內切酶位點的核苷酸。將該片段用XbaI和NotI切割、純化，然后與受相同的酶的限制的一種克隆載體連接，該克隆載體為質體PAY02641 (含有來自PBR322的復制起點、卡那霉素抗性基因以及T7啟動子，用于表達感興趣的基因。如上文所描述進行連接、轉化以及序列測定。蛋白表達
在大腸桿菌BL21 (DE3)中表達白蛋白結合多肽變異體，這種大腸桿菌具有一個N末端MGSS延伸或一個N末端His6標簽，隨后為一個TEV蛋白酶識別位點和一個甘氨酸殘基。使用每個白蛋白結合多肽變異體的一個集落在4ml TSB+YE介質中接種，TSB+YE介質補充有達到濃度為50 μ g/ml的卡那霉素。使培養(yǎng)物在37° C下生長大約5小時。在多個并聯(lián)的生物反應器(格里塔系統(tǒng)(Greta system), Belach Bioteknik AB),使用3ml的每種培養(yǎng)物，接種在800ml的補充有達到濃度為50 μ g/ml的卡那霉素的TSB+YE中。在37° C下進行培養(yǎng)，具有每分鐘800ml的通氣以及以保持溶解氧含量水平大于30%的攪拌曲線(agitation profile)，直到2個達到0D600，隨后添加IPTG，達到最終濃度為O. 5mM。培養(yǎng)持續(xù)五小時，其后將培養(yǎng)物冷卻到10° C，停止通氣并且使攪拌速度降低到300rpm。通過離心(15600Xg，4° C，20分鐘)收獲細胞沉淀物并且在-20° C下儲存直到進行純化。具有一個His6_tag和一個TEV-蛋白酶位點的白蛋白結合多肽變異體的純化 將含有帶可溶性六聚組氨酸標簽的多肽PEP07913 (SEQ ID NO: 153)、PEP07912(SEQ ID N0:156)、PEP07914 (SEQ ID NO:158)、PEP07968 (SEQID NO:159)、PEP07986 (SEQID NO 163)以及 PEP08185 (seq id NO 148)的冷凍細胞沉淀在添加 iooou Benzonase (1. 01654. 001，默克公司(Merck))的情況下懸浮于35ml結合緩沖液(20mM磷酸鈉，O. 5MNaCl, 20mM咪唑，pH 7. 4)中，并且通過超聲作用進行破碎。對于每種多肽，通過離心(lh，37000Xg，4° C)使超聲處理的懸浮液變澄清，并且將上清液加載到His GraviTrap 柱(11-0033-99，通用電氣醫(yī)療集團)上。將該柱子用IOml洗滌緩沖液(20mM磷酸鈉，O. 5MNaCl，60mM咪唑，pH 7. 4)洗滌，然后用3ml洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，O. 5M NaCl，0.5M咪唑，pH 7. 4)洗脫多肽。使用PD-10脫鹽柱(17-0851-01，通用電氣醫(yī)療集團)，將緩沖液換成一種切割緩沖液(50mM Tris-HCl, 150mMNaCl, pH 8)。通過測量280nm下的吸光度測定多肽產物的量，然后添加DTT，達到最終濃度為5mM。將帶His6標簽的TEV蛋白酶以相對于多肽產物1:10的質量比添加到切割緩沖液中。在4° C下，在緩慢混合下進行切割過夜。將咪唑添加到切割混合物中，直到濃度為20mM，然后將混合物加載到His GraviTrap 柱(11-0033-99，通用電氣醫(yī)療集團)上，以便去除切割的His6標簽、帶His6標簽的TEV蛋白酶以及帶His6標簽的未切割產物。對于每種變異體，使流過的含有白蛋白結合多肽變異體的物質如下通過反相色譜(RPC)進一步純化。將流過的部分加載到事先用RPCA緩沖液(O. 1%TFA水溶液)平衡的ImlResource 15RPC柱(通用電氣醫(yī)療集團)上。在用10個柱體積(CV)RPC A緩沖液洗滌柱子后，將結合的多肽用10個CV以內的RPC B緩沖液(O. 1%TFA乙腈溶液)以0%_50%的線性梯度進行洗脫。流速為2ml/min并且監(jiān)測在280nm下的吸光度。將含有白蛋白結合多肽變異體的部分通過SDS-PAGE分析來鑒定并且匯集。將RPC純化白蛋白結合多肽變異體通過在填充在一個》(16柱(通用電氣醫(yī)療集團)中的120ml Superdex 75 (通用電氣醫(yī)療集團)上凝膠過濾而進一步純化。運行緩沖液為lxPBS，并且流速為2ml/min。將含有純白蛋白結合多肽變異體的部分匯集并且濃縮到大約1.3mg/ml。最后,根據制造商的建議,通過使用Iml的AffinityPak Detox1-Gel內毒素去除凝膠柱(Pierce，產品號20344)將濃縮物從痕量的剩余內毒素中純化。使白蛋白結合多肽變異體PEP07911和PEP08185與Mal-DOTA結合，然后如下進行RPC純化步驟。使用一次性ro-10脫鹽柱(通用電氣醫(yī)療集團)將來自IMAC-FT純化步驟的流過的部分的緩沖液換成O. 2M NaAc (pH 5.5)。以5倍摩爾過量添加馬來酰亞胺基-單-酰胺-DOTA (大環(huán)，目錄號B-272)，并且在30° C下在連續(xù)振蕩下孵育60分鐘。產生的多肽對應地表示PEP07968和PEP08296。不含His6標簽的白蛋白結合多肽變異體的純化將含有可溶性白蛋白結合多肽變異體PEP06923 (SEQ ID NO: 154)、PEP07271(SEQ ID NO: 155), PEP07554 (SEQ ID NO: 156)以及 PEP07844 (SEQ ID N0:161)的冷凍細胞沉淀懸浮在20mM Tris-HCl (pH 8)中，并且用超聲作用破碎。對于每種多肽變異體，通過離心(30min，32000Xg，4° C)將超聲處理的懸浮液變澄清，并且將上清液加載到HSA-Sepharose 柱(通用電氣醫(yī)療集團)上。在用 TST 緩沖液(25mM Tris-HCl, ImMEDTA, 200mMNaCl，O. 05% 吐溫(Tween) 20，pH 8. 0)之后，用 5mM N H4Ac (pH 5. 5)洗滌，將結合的白蛋白結合多肽變異體用O. 5M HAc (pH 3.2)洗脫。將白蛋白結合多肽變異體如下通過反相色譜(RPC)進一步純化。對于每種變異體，將來自HSA親和力純化步驟的洗脫物加載到事先用RPC A緩沖液(O. 1%TFA水溶液)平衡的Iml Resource 15RPC柱(通用電氣醫(yī)療集團)上。在用10個CV的RPC A緩沖液洗滌柱子后，將結合的多肽用10個CV以內的RPC B緩沖液(O. 1%TFA乙腈溶液)以0%_50%的線性梯度進行洗脫。流速為2ml/min并且監(jiān)測在280nm下的吸光度。將含有純白蛋白結合多肽變異體的部分通過SDS-PAGE分析鑒定并且匯集。最后，使用一次性PD-10脫鹽柱(通用電氣醫(yī)療集團)將緩沖液換成 IxPBS (2. 68mM KCl，137mM NaCl，1. 47mM KH2PO4,8.1mM Na2HPO4, ρΗ7· 4)。純化的白蛋白結合多肽變異體的表征通過使用一臺NaaoDlOp ND-1000分光光度計測量在280nm下的吸光度來評估濃度。用SDS-PAGE和LC-MS進一步分析這些蛋白質。為了 SDS-PAGE分析，將大約10 μ g的每種白蛋白結合多肽變異體與NuPAGE LDS樣品緩沖液(茵維特羅根(Invitrogen))混合,在70° C下孵育15min,并且加載到NuPAGE4%-12%Bis-Tris凝膠(茵維特羅根)上。使這些凝膠在一個XCell II SureLock電泳槽(諾維克斯(Novex))中用NuPAGE MES SDS運行緩沖液(茵維特羅根)進行電泳，使用Sharp預染色標準品(茵維特羅根)作為分子量標記并且使用PhastGel BlueR (通用電氣醫(yī)療集團)進行染色。為了鑒定白蛋白結合多肽變異體的一致性，使用裝備有AP1-ESI和單個四組分質量分析儀的一個Agilent 1100LC/MSD系統(tǒng)進行LC/MS分析。將大約10 μ g的每種純化白蛋白結合多肽變異體加載到Zorbax 300SB-C8窄孔柱(2.1 X 150_，3. 5 μ m，安捷倫技術公司(Agilent Technologies))上，流速為 O. 5ml/min。在 O. 5ml/min 下使用溶液 B 以 10%-70%的線性梯度將多肽洗脫15min。在30° C下進行分離。監(jiān)測離子信號以及280nm和220nm下的吸光度。通過MS確定純化的白蛋白結合多肽變異體的分子量。結果如由SDS-PAGE分析評估的，白蛋白結合多肽變異體的表達水平是每克細胞沉淀10-30mg 產物。對于所有變異體，如通過SDS-PAGE分析所測定，純度超過95%，并且LC/MS分析驗證了正確的分子量。在純化之后，針對十種白蛋白結合多肽變異體中每一個獲得了 Img與8mg之間的純多肽。
實例2 白蛋白結合多肽的親和力測定在這個實例中，使用Biacore儀器表征在實例I中合成或表達并且純化的PEP06923 (SEQ ID NO: 154)、PEP07271 (SEQ ID NO: 155)、PEP07844 (SEQ ID NO: 161)、PEP07912 (SEQ ID NO: 157)、PEP07913 (SEQ IDN0:153)、PEP07914 (SEQ ID NO: 158)以及PEP07968 (D0TA結合的PEP07911，SEQ ID NO: 159)對人血清白蛋白(HSA)的親和力。PEP07913相應于添加了一個N末端甘氨酸殘基的G148-GA3的氨基酸序列，而PEP07271、PEP07844、PEP07912、PEP07914以及PEP07968相應于添加有不同的N末端氨基酸的白蛋白結合多肽 PPOOl (SEQ ID N0:1)、PP043 (SEQ ID N0:43)、PP007 (SEQ ID N0:7)、PP013(SEQ ID NO: 13)以及 PP037 (SEQ ID NO:37)。材料和方法
根據制造商的建議，用HSA (AlbuCuHH,諾維信(Novozymes))在 Biacore2000 儀器(通用電氣醫(yī)療集團)上進行生物傳感器分析，HSA是通過胺偶聯(lián)到CM-5芯片(研究級；通用電氣醫(yī)療集團)表面的羧化右旋糖酐層上而固定。將芯片的表面I活化和去活化，并且用作多次注射之間的一個參比池(空白表面)，而表面2包含被固定到731個共振單位(RU)上的HSA，并且表面4包含被固定到955個RU上的HSA。將純化白蛋白結合多肽變異體在運行緩沖液HBS-EP (通用電氣醫(yī)療集團)中稀釋到2. 5nM、10nM以及40nM，并且以50μ I/min的恒定流速注射5分鐘，隨后注射HBS-EP 60分鐘。用25 μ I HCl (IOmM)注射一次使這些表面再生。在兩組中進行親和力測量；在第一組中，注射HBS-EP、PEP06923、PEP07271、PEP07912、PEP07913、PEP07914 以及 PEP07968 (芯片表面 2)，而在第二組中，注射 HBS-EP、PEP06923、PEP07844、PEP07912 以及 PEP07914 (芯片表面 4)。在每組中注射 PEP06923 兩次作為對照。用BIA評估軟件(通用電氣醫(yī)療集團)分析結果。將空白表面的曲線從配體表面的曲線上扣除。結果Biacore 2000儀器具有技術限制，妨礙很高親和力的測量。因此，Biacore研究的目的不是測定白蛋白結合多肽變異體對HAS的親和力的精確動力學參數(shù)。然而，這些結果提供了對這些多肽對于白蛋白的相對親和力的定量估計。在扣除參考表面和緩沖液注射之后，使用BIA評估軟件在對質量轉移進行校正并且以RUmax組作為局部參數(shù)的情況下，將多條曲線與1:1 (蘭米爾)結合模型擬合。在圖2中顯示了多條曲線。評估相對KD、ka (kon)以及kd (I^ff)值并且呈現(xiàn)于下表中。表1:白蛋白結合多肽對HSA的動力學參數(shù)(ka、kd以及KD)，第I組
—Ikn (Ms-1)Ikri (s-1) |Kn (M)
PEP079135. 7xl059. 3xlCT4 ~ 1.6xlCT9 —
PEP06923(1) 2.9xl072.9xl0~5 _9.9xl0_13 —
PEP06923(2) 2.6xl072.8xl0~5 ~1.1xlO-12 —
PEP072713.9xl062.9xl0~5 ~ 7. 5xl0~12 —
PEP079124.6xl062.8xl0~5 ~6.2xl0~12 —
PEP079143. 5xl062. 5xl0~5 ~ 7.2xl0~12 —
PEP07968|3. OxlO6\2. 7xlCT5 \9. OxlCT12 —
表2:白蛋白結合多肽對HSA的動力學參數(shù)(ka、kd以及KD)，第2組
權利要求
1.一種白蛋白結合多肽，包含選自以下的一個氨基酸序列i) LAX3AKX6X7AnX10 Eldxi4YGVSdf YKRLIXffiKAKTVEGVEALKX39X4(lILX43X44LP其中彼此獨立地X3選自E、S、Q以及C ; X6選自E、S以及C ; X7選自A和S ; Xltl選自A、S以及R ; X14選自A、S、C以及K; Xffi選自D和E ; X39選自D和E ; X4tl選自A和E ; X43選自A和K ; X44選自A、S以及E ; 位置45處的L存在或不存在；并且 位置46處的P存在或不存在； 以及 )與i)中所定義的序列具有至少95%—致性的一個氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的白蛋白結合多肽，其中X6是E。
3.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X3是S。
4.根據權利要求1至2中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X3是E。
5.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X7是八。
6.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X14是S。
7.根據權利要求1至5中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X14是C。
8.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中Xltl是A。
9.根據權利要求1至7中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中Xltl為是S。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X26是D。
11.根據權利要求1至9中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X26是E。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X39是0。
13.根據權利要求1至11中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X39是E。
14.根據權利要求1至13中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X40是A。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X43是八。
16.根據權利要求1至15中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X44是八。
17.根據權利要求1至15中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中X44是S。
18.根據權利要求1至17中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中位置45處的L存在。
19.根據權利要求1至18中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中位置46處的P存在。
20.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽，該白蛋白結合多肽與白蛋白結合，使得該相互作用的Uf值為至多5 X KT5s'
21.根據權利要求20所述的白蛋白結合多肽，該白蛋白結合多肽與白蛋白結合，使得該相互作用的Iw值為至多5 X KT6S'
22.根據權利要求1所述的白蛋白結合多肽，其氨基酸序列是選自SEQID N0:l-144以及SEQ ID NO: 164-203中的任何一個。
23.根據權利要求22所述的白蛋白結合多肽，其氨基酸序列是選自SEQID NO:4-5,SEQID NO:7-8,SEQ ID NO:10-1KSEQ ID NO:13-14,SEQ ID NO:16-17,SEQ ID NO:19-20,SEQID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35,SEQ ID NO:37-38、SEQ ID NO:41-42、SEQ ID NO:49-50、SEQ ID NO: 164-170 以及 SEQ IDNO: 192-203中的任何一個。
24.根據權利要求22所述的白蛋白結合多肽，其氨基酸序列是選自SEQID NO: 1-144中的任何一個。
25.根據權利要求24所述的白蛋白結合多肽，其氨基酸序列是選自SEQID NO:4-5,SEQID NO:7-8,SEQ ID NO:10-1KSEQ ID NO:13-14,SEQ ID NO:16-17,SEQ ID NO:19-20,SEQID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35,SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 以及 SEQ ID NO:49-50 中的任何一個。
26.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽，進一步包含位于i)中所定義的該序列的N末端和/或C末端處的一個或多個另外的氨基酸殘基。
27.根據權利要求26所述的白蛋白結合多肽，其中這些另外的氨基酸包含在該多肽的N末端的至少一個絲氨酸殘基。
28.根據權利要求26至27中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中這些另外的氨基酸包含在該多肽的N末端的一個甘氨酸殘基。
29.根據權利要求26至28中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中這些另外的氨基酸包含在該多肽的N末端的一個半胱氨酸殘基。
30.根據權利要求26至29中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中這些另外的氨基酸包含在該多肽的C末端處的一個賴氨酸殘基。
31.根據權利要求26至30中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中這些另外的氨基酸包含在該多肽的C末端處的一個甘氨酸殘基。
32.根據權利要求26至31中任一項所述的白蛋白結合多肽，其中這些另外的氨基酸包含在該多肽的C末端處的一個半胱氨酸殘基。
33.根據權利要求26至32中任一項所述的白蛋白結合多肽，其氨基酸序列是選自SEQID NO: 145-150 以及 SEQ ID NO: 162-163 中的任何一個。
34.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽，包含不超過兩個半胱氨酸殘基。
35.根據權利要求34所述的白蛋白結合多肽，包含不超過一個半胱氨酸殘基。
36.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽，該白蛋白結合多肽與人血清白蛋白結合。
37.一種融合蛋白或結合物，包含 i) 一個第一部分，由根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽組成；以及 ) 一個第二部分，由具有一種所希望的生物活性的一種多肽組成。
38.根據權利要求37所述的融合蛋白或結合物，其中具有一種所希望的生物活性的該第二部分是一種治療活性多肽。
39.根據權利要求38所述的融合蛋白或結合物，其中具有一種所希望的生物活性的該第二部分是選自下組，該組由以下各項組成人內源酶、激素、生長因子、趨化因子、細胞因子以及淋巴因子。
40.根據權利要求39所述的融合蛋白或結合物，其中該第二部分是選自下組，該組由以下各項組成IL_2、GLP-U BNP、IL-l-RA、KGF、Sfcmgen__「(_:、GH、G-CSF, CTLA-4、肌肉生成抑制素、因子VI1、因子VIII以及因子IX。
41.根據權利要求38所述的融合蛋白或結合物，其中具有一種所希望的生物活性的該第二部分是一種非人類生物活性蛋白，其選自下組，該組由以下各項組成細菌毒素類、酶類以及活化蛋白類。
42.根據權利要求37所述的融合蛋白或結合物，其中具有一種所希望的生物活性的該第二部分是能夠與一個目標分子選擇性相互作用的一種結合多肽。
43.根據權利要求42所述的融合蛋白或結合物，其中該結合多肽是選自下組，該組由以下各項組成抗體以及其實質上保留抗體結合活性的片段和結構域；微體、maxybodies、高親合性多聚體(avimer)以及其他小的二硫鍵結合的蛋白質；以及衍生自一種骨架的結合蛋白，其選自下組，該組由以下各項組成葡萄球菌A蛋白及其結構域、其他三螺旋結構域、脂質運載蛋白、錨蛋白重復結構域、纖維素結合域、Y晶型、綠色熒光蛋白、人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4、蛋白酶抑制劑(如庫尼茲(Kunitz)結構域)、PDZ結構域、SH3結構域、肽適體、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纖連蛋白III型結構域、轉鐵蛋白、鋅指以及芋螺毒素。
44.根據權利要求43所述的融合蛋白或結合物，其中所述目標分子是選自下組，該組由以下各項組成阿爾茨海默病的Αβ肽；其他疾病相關淀粉樣肽；毒素，如細菌毒素和蛇毒；凝血因子，如血管性血友病因子；白細胞介素，如IL-13 ;肌肉生成抑制素；促炎因子，如TNF-a、TNF-a受體、IL_1、IL_23以及IL-8 ;補體因子，如C3和C5 ;超敏反應介質，如組胺和 IgE ;腫瘤相關抗原，如 CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD52、CD70、cMet、HERl、HER2、HER3、HER4、CAIX、CEA、IL-2 受體、MUCl、PSMA, TAG-72，以及其他生物學分子，如 G-CSF、GM-CSF、GH、胰島素以及生長抑素。
45.根據權利要求37至44中任一項所述的融合蛋白或結合物，包含一個另外的部分，該另外的部分由具有另外的、所希望的生物活性的一種多肽組成，該另外的所希望的生物活性可以與該第二部分的生物活性相同或不同。
46.根據權利要求45所述的融合蛋白或結合物，其中該第二部分如權利要求38至41中任一項所定義，并且該另外的部分如權利要求42至44中任一項所定義。
47.根據權利要求37至46中任一項所述的結合物，其中該第二部分是經由在該多肽的位置X14處存在的任何半胱氨酸殘基的硫基與根據權利要求1至36中任一項所述的白蛋白結合多肽結合。
48.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，進一步包含一種細胞毒性劑。
49.根據權利要求48所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，其中該細胞毒性劑是選自刺孢霉素、奧莉絲汀(auristatin)、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素、格爾德霉素、氨甲喋呤以及它們的衍生物，以及其組合。
50.根據以上權利要求中任一項所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，進一步包含一種標記。
51.根據權利要求50所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，其中所述標記是選自下組，該組由以下各項組成熒光染料和金屬、發(fā)色染料、化學發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性核素以及顆粒。
52.根據權利要求51所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，包含由一種聚氨基聚羧酸酯螯合劑提供的一種螯合環(huán)境(chelating environment),這種聚氨基聚羧酸酯螯合劑經由一個半胱氨酸殘基的一個硫基或一個賴氨酸殘基的一個胺基與該白蛋白結合多肽結合。
53.根據權利要求52所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，其中該聚氨基聚羧酸酯螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸或其衍生物。
54.根據權利要求53所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，其中該1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸衍生物是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4，7-三-乙酸-10-馬來酰亞胺乙基乙酰胺。
55.根據權利要求52所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，其中該聚氨基聚羧酸酯螯合劑是二乙烯三胺五乙酸或其衍生物。
56.一種編碼根據權利要求1至46中任一項所述的白蛋白結合多肽或融合蛋白的多核苷酸。
57.—種生產根據權利要求1至45中任一項所述的多肽的方法,包括表達根據權利要求56所述的多核苷酸。
58.—種表達載體,包含根據權利要求56所述的多核苷酸。
59.—種宿主細胞，包含根據權利要求58所述的表達載體。
60.一種制造根據權利要求1至36中任一項所述的多肽的方法，該方法是使用具有受保護的反應性側鏈的氨基酸和/或氨基酸衍生物通過非生物學肽合成來實現(xiàn)，該非生物學肽合成包括 使這些氨基酸和/或這些氨基酸衍生物逐步偶聯(lián)，形成具有受保護的反應性側鏈的根據權利要求1至36中任一項所述的多肽， 從該多肽的這些反應性側鏈去除保護基團，以及 使該多肽在水溶液中折疊。
61.—種生產根據權利要求37至48中任一項所述的結合物的方法，包括 通過根據權利要求60所述的方法生產一種白蛋白結合多肽，以及 使所生產的白蛋白結合多肽與如權利要求38至48中任一項所定義的第二部分和/或另外的部分結合。
62.根據權利要求37至55中任一項所述的融合蛋白或結合物，用作一種藥劑。
63.根據權利要求62所述的融合蛋白或結合物，與向哺乳動物給予本身具有一種所希望的生物活性的該多肽后引出的免疫應答相比，在向該哺乳動物給予該融合蛋白或結合物后不引出或引出降低的免疫應答。
64.根據權利要求37至55中任一項所述的融合蛋白或結合物，用于診斷。
65.一種組合物，包含一種化合物，這種化合物本身具有不超過ΙΟΟμ g/ml的在水中的溶解度；與以下物質偶聯(lián) 根據權利要求1至47中任一項所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物，其中該化合物與該白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物是共價偶聯(lián)的。
66.根據權利要求65所述的組合物，其中所述溶解度不超過10μ g/ml。
67.根據權利要求66所述的組合物，其中所述溶解度不超過Iμ g/ml。
68.根據權利要求65至67中任一項所述的組合物，其中所述化合物是一種藥物活性化合物。
69.根據權利要求68所述的組合物，其中所述藥物活性化合物是一種細胞毒性劑。
70.根據權利要求69所述的組合物，其中所述細胞毒性劑如權利要求49中所定義。
71.根據權利要求69所述的組合物，其中所述細胞毒性劑是一種合成化學毒素(chemotoxin),而不是衍生自一種天然存在的化合物。
72.根據權利要求65至71中任一項所述的組合物，進一步包含對于臨床相關目標具有結合親和力的一種結合多肽。
73.根據權利要求72所述的組合物，其中所述結合多肽如權利要求43中所定義。
74.根據權利要求65至73中任一項所述的組合物，進一步包含人血清白蛋白。
75.根據權利要求65至74中任一項所述的組合物，用作一種藥劑。
76.根據權利要求65至74中任一項所述的組合物，用于診斷。
77.一種制備根據權利要求65至76中任一項所述的組合物的方法，包括 a)提供一種化合物，這種化合物本身具有不超過ΙΟΟμg/ml在水中的溶解度；以及 b)使該化合物與根據權利要求1至47中任一項所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物共價偶聯(lián)，從而形成一種組合物，該組合物包含化合物與一種白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的一種共價復合物。
78.根據權利要求77所述的方法，進一步包括c)將化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的所述復合物與白蛋白混合，從而形成一種組合物，該組合物包含i)化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的共價復合物與ii)白蛋白的一種非共價復合物。
79.根據權利要求78所述的方法，進一步包括將包含該非共價復合物的所述組合物凍干，獲得一種凍干組合物。
80.一種增加化合物的水溶性的方法，包括 提供一種化合物，這種化合物本身具有不超過ΙΟΟμ g/ml的在水中的溶解度； 使該化合物與根據權利要求1至47中任一項所述的白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物共價偶聯(lián)，從而形成化合物與白蛋白結合多肽的一種共價復合物；以及 將化合物與白蛋白結合多肽、融合蛋白或結合物的所述復合物與白蛋白在促進該白蛋白結合多肽與人血清白蛋白的非共價締合的條件下混合； 由此在所述復合物中的該化合物在水中的溶解度比該化合物本身在水中的溶解度大。
81.根據權利要求80所述的方法，其中所述溶解度如權利要求66至67中任一項所定義。
82.根據權利要求80到81中任一項所述的方法，其中所述化合物如權利要求68至71中任一項所定義。
83.根據權利要求80至82中任一項所述的方法，其中所述復合物進一步包含對于臨床相關目標具有結合親和力的一種多肽。
84.根據權利要求83所述的方法，其中所述結合多肽如權利要求43中所定義。
全文摘要
本披露涉及對白蛋白具有結合親和力的一類工程化多肽。本披露還涉及利用這些和其他化合物與白蛋白在不同環(huán)境中的結合的新的方法和用途，其中一些對于治療或診斷包括人類的哺乳動物中的疾病具有重要性。
文檔編號C07K14/43GK103003296SQ201180033097
公開日2013年3月27日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權日2010年7月9日
發(fā)明者卡羅琳·?？瞬祭? L·亞伯拉罕森 申請人:阿菲博迪公司