專利名稱：包含二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段的雙特異性抗體的制作方法
包含_硫鍵穩(wěn)定性Fv片段的雙特異性 /ι體本發(fā)明涉及三價、雙特異性抗體，生產(chǎn)它們的方法，含有所述抗體的藥物組合物以及它們的應用。
背景技術(shù)：
最近過去的幾年，開發(fā)了多種多樣的多特異性重組抗體形式，例如通過融合例如IgG抗體形式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價雙特異性抗體(參見，例如Coloma, M. J.,等人，Nature Biotech 15 (1997) 159-163 ;W02001/077342 ;和 Morrison，S.L. , Nature Biotech25(2007)1233-1234)。另外開發(fā)了若干能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的其他新的形式，其中不再保留抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM),例如二抗體、三抗體或四抗體、微抗體(minibody)、若干單鏈形式(scFv、Bis-scFv) (Holliger, P.，等人，Nature Biotech23(2005) 1126-1136 ；Fischer, N.，和 Leger, 0.，Pathobiology 74(2007)3-14 ；Shen,J.,等人，Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74 ；ffu, C.,等人，NatureBiotech.25(2007)1290-1297)。所有這些形式都使用接 頭來將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與另外的結(jié)合蛋白(例如scFv)融合或者融合例如兩個Fab片段或scFvs (Fischer, N.,和L6ger, 0.,Pathobiology 74(2007)3-14)。需要注意的是可能希望通過維持與天然發(fā)生的抗體的高度相似性來保留通過Fe受體結(jié)合而被介導的效應子功能，例如補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在US6，897，044中報道了制備生物活性抗體二聚體的方法。在US7，129，330中報道了具有至少四個通過肽接頭而彼此連接的可變結(jié)構(gòu)域的多價Fv抗體構(gòu)建體。在US2005/0079170中報道了二聚和多聚抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。在US6，511，663中報道了三價或四價單特異性抗原結(jié)合蛋白，其包括通過連接結(jié)構(gòu)彼此共價結(jié)合的三個或四個Fab片段，該蛋白并不是天然免疫球蛋白。在W02006/020258中，報道了能夠有效地在原核和真核細胞中表達并且可用于治療和診斷方法的四價雙特異性抗體。在US2005/0163782中報道了在包含兩種類型的多肽二聚體的混合物中將通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體與不通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體分離或優(yōu)選合成通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。在US5，959，083中報道了雙特異性四價受體。在W02001/077342中報道了具有三個或更多個功能抗原結(jié)合位點的改造的抗體。在W02007/109254中報道了由穩(wěn)定的scFv組成或包含穩(wěn)定的scFv的穩(wěn)定的結(jié)合分子。在W02007/024715中，報道了雙可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白作為改造的多價和多特異
性結(jié)合蛋白。W02011/034605涉及使用卷曲螺旋和/或tether構(gòu)建的改造的蛋白復合物以及制造、使用和純化此種復合物，如含有多特異性抗體或其他多特異性Fe的復合物的方法。發(fā)明概沭本發(fā)明涉及雙特異性抗體，其包含a)特異性地結(jié)合第一抗原并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體；b)特異性地結(jié)合第二抗原的Fv片段，所述Fv片段包含VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域，其中兩個結(jié)構(gòu)域通過二硫橋相連，并且其中只有VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域之一通過肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈融合。在一個實施方式中，根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體的特征在于，所述雙特異性抗體是三價的并且或者MH2結(jié)構(gòu)域或者VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈融合。在一個實施方式中，根據(jù)權(quán)利要求2的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的C-端。在一個實施方式中，根據(jù)權(quán)利要求2的雙特異性抗體的特征在于，所述雙特異性抗體是三價的并且VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，所述雙特異性抗體是三價的并且VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的C-端。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的C-端，或VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，所述雙特異性抗體是三價的并且或者VH2結(jié)構(gòu)域或者VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈融合。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的三價雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的C-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的三價雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過在下述位置之間引入的二硫橋(disulfide bridge)連接i) VH2結(jié)構(gòu)域位置44和VL2結(jié)構(gòu)域位置100，ii)VH2結(jié)構(gòu)域位置105和VL2結(jié)構(gòu)域位置43，或iii)VH2結(jié)構(gòu)域位置101和VL2結(jié)構(gòu)域位置100。
(根據(jù)kabat 編號)在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過在VH2結(jié)構(gòu)域位置44和VL2結(jié)構(gòu)域位置100之間引入的二硫橋連接。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，完整抗體的重鏈的第一 CH3結(jié)構(gòu)域和完整抗體的第二 CH3結(jié)構(gòu)域各在抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面中包含改變的界面處相遇；其中i)在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中，氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生突起(protuberance),所述突起可定位在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中，和ii)在另一條重鏈的 CH3結(jié)構(gòu)域中，氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生腔，在第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突起是可定位在所述腔內(nèi)的。本發(fā)明的一個方面是制備本發(fā)明的雙特異性抗體的方法，包括步驟A)在哺乳動物細胞中表達編碼雙特異性抗體的核酸，所述雙特異性抗體包含a)特異性地結(jié)合第一抗原并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體；b)特異性地結(jié)合第二抗原的包括VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的Fv片段，其中兩個結(jié)構(gòu)域都通過二硫橋連接，和其中Fv片段通過VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的N-端經(jīng)由第一和第二肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的兩重鏈的C-端融合，或通過VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的C-端經(jīng)由第一和第二肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的一條重鏈和一條輕鏈兩者的N-端融合，其特征在于一個接頭包括可被弗林蛋白酶切割的蛋白酶切割位點，而另一接頭不包括蛋白酶切割位點；B)從所述細胞或細胞培養(yǎng)物上清中回收所述抗體。本發(fā)明的另一方面是制備本發(fā)明的三價雙特異性抗體的方法，包括步驟A)在哺乳動物細胞中表達編碼雙特異性抗體的核酸，所述雙特異性抗體包括a)特異性地結(jié)合第一抗原并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體；b)特異性地結(jié)合第二抗原的包括VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的Fv片段，其中兩個結(jié)構(gòu)域都通過二硫橋連接，和其中所述Fv片段通過VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的N-端經(jīng)由第一和第二肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的兩重鏈的C-端融合，或通過VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的C-端經(jīng)由第一和第二肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的N-端融合，
其特征在于—個接頭包括可被Prescission蛋白酶切割的蛋白酶切割位點，而另一接頭不包括蛋白酶切割位點；B)從所述細胞或細胞培養(yǎng)物上清中回收所述抗體。在一個實施方式中，所述方法的特征在于可被弗林蛋白酶切割的蛋白酶切割位點是 SEQ ID NO : 13 或 SEQ ID NO :14。在一個實施方式中，所述方法的特征在于可被Prescission蛋白酶切割的蛋白酶切割位點是SEQ ID NO 15o在一個實施方式中，所述方法的特征在于哺乳動物細胞，在一個實施方式中，CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、ΗΕΚ293細胞、COS細胞、PER. C6細胞，在另一個實施方式中，HEK293細胞或CHO細胞。本發(fā)明的一個方面是通過這種重組方法獲得的抗體。本發(fā)明的一個方面是包括本發(fā)明的雙特異性抗體的藥物組合物。本發(fā)明的一個方面是用于治療癌癥的本發(fā)明的雙特異性抗體。本發(fā)明的一個方面是本發(fā)明的雙特異性抗體在制造用于治療癌癥的藥物中的應用。本發(fā)明還提供治療罹 患如，例如癌癥或炎癥的疾病的患者的方法，包括向被診斷為具有此種疾病(并因此需要此種療法)的患者施用有效量的本發(fā)明的抗體。該抗體優(yōu)選以藥物組合物被施用。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體一方面由于它們結(jié)合不同的抗原而顯示出如生物活性的有價值的特性。結(jié)合第二抗原的被二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段由于高靈活性而顯示出優(yōu)異的結(jié)合特性(因為它僅通過一個肽接頭融合至全長抗體)并且與接頭長度完全無關(guān)。另一方面，由于它們的穩(wěn)定性、低聚集和藥物代謝動力學及生物學特性，它們適于生產(chǎn)和藥物配制。由于它們的Ig核心，它們?nèi)耘f保留著如ADCC和CDC的天然抗體的特性。


圖1不具有CH4結(jié)構(gòu)域的全長抗體的示意性結(jié)構(gòu)，所述全長抗體特異性地結(jié)合第一抗原1，所述全長抗體以典型的順序具有兩對包含可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈和輕鏈。圖2a_c根據(jù)本發(fā)明的三價、雙特異性抗體的示意性表示，所述抗體包括全長抗體(在CH3結(jié)構(gòu)域中具有任選的突起進入孔修飾)，所述全長抗體特異性地結(jié)合第一抗原I并且特異性地結(jié)合第二抗原2的二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段通過該二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段的VH2或VL2的N-端與所述全長抗體的C-端融合圖2d示例性地示意表示用于圖2a所示的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的中間物圖3a_b示意性地表示根據(jù)本發(fā)明的三價、雙特異性抗體，包括全長抗體(在CH3結(jié)構(gòu)域中具有任選的突起進入孔修飾)，所述全長抗體特異性地結(jié)合第一抗原I并且特異性地結(jié)合第二抗原2的二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段通過該二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段的VH2或VL2的C-端與所述全長抗體的N-端進行融合圖3c示例性地示意表示用于圖3a所示的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的中間物
圖3d_e示意性地表示根據(jù)本發(fā)明的三價、雙特異性抗體，包括全長抗體(在CH3結(jié)構(gòu)域中具有任選的突起進入孔修飾)，所述全長抗體特異性地結(jié)合第一抗原I并且特異性地結(jié)合第二抗原2的二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段通過該二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段的VH2或VL2的C-端與所述全長抗體的N-端進行融合圖4 :根據(jù)本發(fā)明的三價雙特異性抗體衍生物的組成a)根據(jù)本發(fā)明的三價雙特異性抗體衍生物的部分(modular)組成b) Fv片段的直接組裝c)通過具有帶蛋白酶切割位點的第二接頭的中間物的改善的組裝，該中間物將在表達期間/或表達后被切割以得到根據(jù)本發(fā)明的雙特異抗體d)具有識別序列的連接物-肽，用于在靶細胞(通過弗林蛋白酶)或在體外(通過Prescission蛋白酶)的蛋白水解加工,所述加工用于在c)下的中間物方法。圖5 :含dsFv的雙特異性抗體衍生物的表達和純化(a)蛋白制品在Prote in-A和SEC純化后的還原SDS Page圖6 :蛋白酶切割前降低的結(jié)合親和力雙特異性抗體衍生物在蛋白酶切割前后的還原SDS-Page。(a)含有Prescission切割位點的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體被生成為具有降低的結(jié)合親和力并且在暴露于Prescission蛋白酶時變?yōu)榛罨摹?b)含有弗林蛋白酶切割位點的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體被生成為具有降低的結(jié)合親和力并且隨后在暴露于弗林蛋白酶時變?yōu)榛罨?。圖7 :限制性和未受限的三價Her3-CMet雙特異性抗體與活細胞的結(jié)合。在左欄中示出二價未受限的Her3_部分對表達Her3的cMet陰性T47D細胞的結(jié)合。在右欄中示出不同的限制性cMet-部分對于Her3-陰性的表達cMet的A549細胞的結(jié)合。對于限制性部分，觀察到較差的結(jié)合，而通過特異性蛋白酶的釋放造成對細胞的完全結(jié)合和在細胞上積累。圖8 :在細胞信號傳導測定中，三價Her3_cMet實體的抑制功能性(a)檢測磷酸化的Her3的Western印跡證明未受限的Her3_實體對信號傳導的干擾。(b)檢測磷酸化的ACT的ELISA證明未受限的cMet-實體對HGF/c-Met信號傳導的有效干擾，而限制形式的同一分子具有較低的活性。圖9 :對Her3-cMet-3C_FSl的還原SDS PAGE分析顯示存在通過弗林蛋白酶加工而產(chǎn)生的產(chǎn)物(52kD，12kD)。圖10示意性地表示其他的單-和雙特異性抗體。下欄示出根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體，其在被弗林蛋白酶(左)加工前和在被弗林蛋白酶(右)的過程中加工后，結(jié)合不同的靶標抗原。圖11 :雙特異性的經(jīng)弗林蛋白酶加工過的含dsFv的抗體衍生物VEGFR_Dig_6C_FSl和⑶22_Dig_6C_FSl的表達和純化。示出了大小排阻圖譜，這證明純化的蛋白質(zhì)制品的均質(zhì)性和聚集體在純化的蛋白質(zhì)制品中的幾乎完全不存在。圖12 :在Protein-A和SEC純化后對蛋白質(zhì)制品的非還原和還原SDSPage證明在對純化后的雙特異性抗體衍生物加工后的均質(zhì)性和正確組成。
圖13 :在Protein-A和SEC純化后對蛋白質(zhì)制品的質(zhì)譜分析證明在對純化后的雙特異性抗體衍生物⑶22-Dig和VEGFR-Dig加工后的均質(zhì)性和正確組成(完整的過程中弗林蛋白酶加工)。圖14 :通過表面等離振子共振對根據(jù)本發(fā)明的其他雙特異性抗體的結(jié)合分析。上欄對于Biacore分析，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體和對照抗體都被抗-Fe抗體捕獲到芯片并且暴露于可溶形式的細胞表面上的靶標抗原(=靶標I)。通過標準技術(shù)從結(jié)合曲線計算結(jié)合率和去除率。下欄通過LeY-Dig雙特異性抗體的表面等離振子共振的結(jié)合分析證明同時結(jié)合靶標I和靶標2特異性。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體被抗-Fe抗體捕獲到芯片，暴露于可溶形式的靶標I抗原(第一結(jié)合曲線)并且此后暴露于靶標2抗原。在第一結(jié)合曲線的“上部”出現(xiàn)源自第二抗原的曲線證明了兩種抗原同時結(jié)合到該雙特異性抗體。圖15 :通過表面等離振子共振對根據(jù)本發(fā)明的其他被弗林蛋白酶加工過的雙特異性抗體⑶22-Dig的結(jié)合分析。上欄對于Biacore分析，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體和對照抗體都被固定化的靶標I抗原CD22捕獲到芯片，并且隨后暴露于作為靶標2抗原的Dig-siRNA。通過標準技術(shù)從結(jié)合曲線計算結(jié)合率和去除率。下欄通過⑶22-Dig雙特異性抗體的表面等離振子共振的結(jié)合分析證明同時結(jié)合靶標I和靶標2特異性。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體通過CD22結(jié)合被捕獲到芯片。在第一結(jié)合曲線的“上部”出現(xiàn)源自第二抗原的曲線證明了兩種抗原同時結(jié)合到該雙特異性抗體。圖16 :根據(jù)本發(fā)明的另外的雙特異性抗體與活細胞的結(jié)合。對于FACS分析，首先將根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體與靶標細胞孵育并隨后與或者抗_huCkappa(以檢測雙特異性抗體)或者與地高辛配基化的熒光團(以檢測第二結(jié)合實體的功能性)孵育。由此，可以同時評估兩種特異性的結(jié)合功能性。只在雙特異性結(jié)合細胞(針對靶標I的功能性)并且此后捕獲Dig-有效荷載(針對靶標2的功能性)時才檢測細胞相關(guān)的信號。在相同的實驗設定下，不識別細胞表面靶標的雙特異性不會(如預期地)產(chǎn)生顯著的細胞相關(guān)信號。

發(fā)明詳細說明本發(fā)明涉及雙特異性抗體，包括a)特異性地結(jié)合第一抗原并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體；b)特異性地結(jié)合第二抗原的Fv片段，所述Fv片段包含VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域，其中兩個結(jié)構(gòu)域通過二硫橋相連，和其中只有VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域之一通過肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈融合。(并且VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域中的另一個不通過肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈融合)。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的C-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的C-端。
在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的C-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈的C-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的C-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的C-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈的C-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的C-端；和CHl結(jié)構(gòu)域N-端融合至C-端VH2結(jié)構(gòu)域并且CL結(jié)構(gòu)域N-端融合至C-端VL2結(jié)構(gòu)域(參見，例如圖2c)。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接 頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，
VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，a)雙特異性抗體是三價的并且b)或者VH2結(jié)構(gòu)域或者VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈融合。在一個實施方式中，此種三價雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的C-端。在一個實施方式中，此種三價雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈的N-端。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過在下述位置之間引入的二硫橋連接i)VH2結(jié)構(gòu)域位置44和VL2結(jié)構(gòu)域位置100，

ii)VH2結(jié)構(gòu)域位置105和VL2結(jié)構(gòu)域位置43，或iii) VH2結(jié)構(gòu)域位置101和VL2結(jié)構(gòu)域位置100 (總是根據(jù)Kabat的EU索引編號)。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過在VH2結(jié)構(gòu)域位置44和VL2結(jié)構(gòu)域位置100之間引入的二硫橋連接(總是根據(jù)Kabat的EU索引編號)。為了穩(wěn)定而引入非天然的二硫橋的技術(shù)描述于，例如W094/029350，US5, 747，654，Rajagopal，V.,等人，Prot. Engin. 10 (1997) 1453-1459 ；Reiter, Y.，等人，Nature Biotechnology 14(1996) 1239-1245 ；Reiter ；Y.,等人，ProteinEngineering ；8 (1995) 1323-1331 ；Webber, K. 0.,等人，Molecular Immunology32(1995)249-258 ；Reiter, Y.，等人，Immunity 2(1995)281-287 ；Reiter, Y.，等人，JBC269(1994) 18327-18331 ;Reiter，Y.，等人，Inter. J. of Cancer 58 (1994) 142-149 或Reiter, Y. , Cancer Res. 54 (1994) 2714-2718。在一個實施方式中，在 b)和 c)下，多肽的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選的二硫鍵是在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100之間。在一個實施方式中，在b)和c)下，多肽的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選的二硫鍵是在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43之間(總是按照Kabat的EU索引編號)。在一個實施方式中，優(yōu)選在單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間是沒有所述任選的二硫鍵穩(wěn)定的三價、雙特異抗體。術(shù)語"全長抗體"意指由兩條"全長抗體重鏈"和兩條"全長抗體輕鏈"組成的抗體(見圖1)。"全長抗體重鏈"是這樣的多肽，其在N-端到C-端方向上由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)、抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域I (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)(HR)、抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3 (CH3)組成，縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;并且在IgE亞類的抗體的情形中，任選地還包括抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域4(CH4)。優(yōu)選地"全長抗體重鏈"是在^端到0端方向上由￥!1、011、冊、012和013組成的多肽。"全長抗體輕鏈"是在N-端到C-端方向上由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成的多肽，縮寫為VL-CL。所述抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)可以是K (kappa)或λ (lambda)。兩條全長抗體鏈通過在CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的多肽間二硫鍵和全長抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的多肽間二硫鍵連接在一起。典型的全長抗體的實例是天然抗體如IgG(例如，IgGl和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE)。根據(jù)本發(fā)明的全長抗體可以來自單一物種，例如人，或者它們可以是嵌合的或人源化的抗體。根據(jù)本發(fā)明的全長抗體包含分別由VH和VL對形成的兩個抗原結(jié)合位點，這兩個抗原結(jié)合位點都特異性地結(jié)合相同的抗原。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C-端意指在所述重鏈或輕鏈的C-端的最后一個氨基酸。b)中的多肽的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和c)中的多肽的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的N-端意指在VH或VL結(jié)構(gòu)域的N-端的最后一個氨基酸。如本文 使用的術(shù)語“Fv片段”指特異性地結(jié)合抗原的抗體的VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域，兩結(jié)構(gòu)域一起形成Fv片段。本發(fā)明雙特異性抗體內(nèi)的結(jié)合第二抗原的Fv片段包括在兩個結(jié)構(gòu)域VH2和VL2之間的(鏈間)二硫橋，即，結(jié)構(gòu)域VH2和結(jié)構(gòu)域VL2都通過非天然的二硫橋來連接用于穩(wěn)定，該二硫橋是通過描述于，例如W094/029350，US5, 747，654，Rajagopal，V.，等人，Prot. Engin. 10 (1997) 1453-1459 ；Reiter, Y.，等人，Nature Biotechnology14(1996) 1239-1245 ;Reiter ;Υ·，等人，Protein Engineering ；8 (1995) 1323-1331 ；Webber, K. 0.,等人:Mo I ecu Iar Immunology 32 (1995) 249-258 ；Reiter, Y.,等人，Immunity2 (1995) 281-287 ；Reiter, Y.，等人，JBC 269 (1994) 18327-18331 ；Reiter, Y.，等人，Inter.J. of Cancer 58 (1994) 142-149 或 Reiter，Y.，Cancer Res. 54 (1994) 2714-2718 中的技術(shù)被引入的。本發(fā)明雙特異性抗體內(nèi)的結(jié)合第二抗原的Fv片段的VH2和VL2結(jié)構(gòu)域并不是通過肽接頭彼此連接(即，VH2和VL2不形成單鏈Fv片段)。因此，術(shù)語“特異性結(jié)合第二抗原的包括VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的Fv片段，其中兩結(jié)構(gòu)域都通過二硫橋連接”指這樣的Fv片段，其中兩結(jié)構(gòu)域都通過二硫橋作為在兩結(jié)構(gòu)域之間的唯一共價鍵來連接并且不通過其它的共價鍵而連接(例如在單鏈Fv片段時，通過肽接頭)。Fv片段的結(jié)構(gòu)域VH2和VL2可以源自全長抗體或者其他技術(shù)如，例如噬菌體展示。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是三價雙特異性抗體并且Fv片段(結(jié)合第二抗原)融合到結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈。如在本申請中使用的術(shù)語“價”指在抗體分子中存在特定數(shù)量的結(jié)合位點。例如，根據(jù)本發(fā)明的天然抗體或者全長抗體具有兩個結(jié)合位點并且是二價的。如此，術(shù)語“三價”指在抗體分子中存在三個結(jié)合位點。如本文使用的術(shù)語“三價，三特異性”抗體指具有三個抗原結(jié)合位點，每個都結(jié)合另一抗原(或抗原的另一表位)的抗體。本發(fā)明的抗體具有三個至四個結(jié)合位點，即，是三價或四價(優(yōu)選三價)并且是雙特異性的?？贵w特異性指抗體對于抗原特定表位的選擇性識別。例如，天然抗體是單特異性的。雙特異性的抗體是具有兩種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。當抗體具有一種以上的特異性時，所識別的表位可與單個抗原或與一個以上的抗原締合。如本文使用的術(shù)語“單特異性”抗體意指具有一個或多個結(jié)合位點，每個結(jié)合位點結(jié)合相同抗原的相同表位的抗體。根據(jù)本發(fā)明的典型三價雙特異性抗體示出于，例如圖2a和2b、3d和3c。對于根據(jù)本發(fā)明的三價、雙特異性抗體，在CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)增強兩條不同重鏈的異二聚化的修飾(參見圖2a和2b、3d和3c)是尤其有用的。因此，對于此種三價、雙特異性抗體，所述根據(jù)本發(fā)明的全長抗體的CH3結(jié)構(gòu)域可以通過“突起到孔”技術(shù)而改變，該技術(shù)以若干實例詳細描述于例如W096/027011，Ridgway，J. B.,等人，Protein Eng 9 (1996) 617-621 ^PMerchant, A. Μ.,等人，Nat Biotechnol16(1998)677-681。在這一方法中，兩CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面改變以增加含有這兩個CH3結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個CH3結(jié)構(gòu)域中的一個可以是“突起”，而另一個是“孔”。二硫橋的引入進一步穩(wěn)定了異二聚體(Merchant, A. Μ.,等人,NatureBiotech 16(1998)677-681 ；Atwell, S.，等人，J. Mol. Biol. 270(1997)26-35)并增加產(chǎn)量。因此，在本發(fā)明的一個方面，所述三價、雙特異性抗體進一步的特征在于全長抗體的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和全長抗體的另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各在包括抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面的界面處相遇；其中所述界面被改變以促進二價雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，使得在所述二價、雙特異抗體內(nèi)，在與另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面相遇的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面中，氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替代，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生突起，所述突起可定位于另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中，和

b)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，使得在所述三價、雙特異抗體內(nèi)，在與第一 CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面相遇的該第二CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替代，由此在第二CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生腔，其中第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突起可定位于所述腔中。優(yōu)選地，所述具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。優(yōu)選地，所述具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸⑴、繳氨酸(V)。在本發(fā)明的一個方面，將兩個CH3結(jié)構(gòu)域進一步通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結(jié)構(gòu)域的相應位置的氨基酸以便可以形成在兩CH3結(jié)構(gòu)域之間的二硫橋來改變。在優(yōu)選的實施方式中，所述三價、雙特異性包括在"突起鏈(knobs chain)"的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變，和在"孔鏈(hole chain)"的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S、L368A、Y407V突變。還可以使用另外的在CH3結(jié)構(gòu)域之間的鏈間二硫橋(Merchant, A.M.,等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681)，例如通過在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中引入Y349C突變，在"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中引入E356C突變或S354C突變來進行。因此，在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述三價、雙特異性抗體包括在兩個CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C、T366W突變，在該兩個CH3結(jié)構(gòu)域的另一個中的E356C、T366S、L368A、Y407V突變，或所述三價、雙特異性抗體包括在兩個CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C、T366W突變，在該兩個CH3結(jié)構(gòu)域的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變(在一個CH3結(jié)構(gòu)域中的另外的Y349C突變和在另一個CH3結(jié)構(gòu)域中的另外的E356C或S354C突變，形成鏈間二硫橋)(編號總是根據(jù)Kabat的EU索引進行)。然而還可以替代地或另外地使用如由EP1870459A1所述的其它突起到孔中技術(shù)。關(guān)于所述三價、雙特異性抗體的優(yōu)選實例是在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變(編號總是根據(jù)Kabat的EU索引進行)。在另一優(yōu)選的實施方式中，所述三價、雙特異性抗體包括在“突起鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和在“孔鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S、L368A、Y407V突變以及另外地，在“突起鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔鏈”中的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。在另一優(yōu)選的實施方式中，所述三價、雙特異性抗體包括在兩個CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C、T366W突變和在兩個CH3結(jié)構(gòu)域的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變或者所述三價、雙特異性抗體包括在兩個CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C、T366W突變和在兩個CH3結(jié)構(gòu)域的另一個中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變以及另外的在“突起鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔鏈”中的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。本發(fā)明的雙特異性抗體包括不同的抗原結(jié)合位點。本發(fā)明的全長抗體包括兩個相同的特異性地結(jié)合第一抗原的抗原結(jié)合位點，以及二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域VH2和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域VL2 —起形成特異性地結(jié)合第二抗原的一個抗原結(jié)合位點。如本文所述，術(shù)語"結(jié)合位點"或"抗原結(jié)合位點"意指各個抗原實際上所特異性結(jié)合的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性 抗體的區(qū)域。在全長抗體中的或在Fv片段中的抗原結(jié)合位點各自是由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)組成的對所形成。特異性地結(jié)合于所要抗原的抗原結(jié)合位點可以源自a)針對抗原的己知抗體或b)通過使用抗原蛋白或核酸或核酸或其片段等的從頭免疫方法或通過噬菌體展示獲得的新抗體或抗體片段。本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點包含六個互補性決定區(qū)(CDRs)，其在不同程度上有助于結(jié)合位點對于抗原的親和力。存在三種重鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶Rs (⑶RH1XDRH2和⑶RH3)和三種輕鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶Rs (⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3)。⑶R和框架區(qū)(FRs)的程度通過與氨基酸序列的匯編數(shù)據(jù)庫進行比較來確定，所述數(shù)據(jù)庫中已根據(jù)序列之間的可變性而定義了所述區(qū)域。抗體特異性指抗體對于抗原的特定表位的選擇性識別。天然抗體，例如是單特異性的。根據(jù)本發(fā)明所述的"雙特異性抗體"是具有兩種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。如果抗體具有一種以上的特異性，所識別的表位可以與單抗原或一種以上的抗原締合。如本文使用，術(shù)語"單特異性"抗體意指具有一個或多個各自結(jié)合于相同抗原的相同表位的結(jié)合位點的抗體。如在本申請使用的術(shù)語"價"意指結(jié)合位點在抗體分子上存在的具體數(shù)量。例如，天然抗體或根據(jù)本發(fā)明的全長抗體具有兩個結(jié)合位點并且是二價的。如此，術(shù)語"三價"意指在抗體分子中存在三個結(jié)合位點。如此，術(shù)語"四價"意指在抗體分子中存在四個結(jié)合位點。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是三價或四價的。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是三價的。本發(fā)明的全長抗體包括一個或多個免疫球蛋白種類的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白種類包括IgG, IgM, IgA、IgD和IgE同種型，并且在IgG和IgA的情形中，包括它們的亞型。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的全長抗體具有IgG型抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。
如在本文使用，術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"指單一氨基酸組成的抗體分子制品。術(shù)語"嵌合抗體"指一種抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)，以及源自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，所述抗體通常通過重組DNA技術(shù)進行制備。優(yōu)選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明涵蓋的"嵌合抗體"的其它優(yōu)選形式是那些，其中恒定區(qū)己經(jīng)相比初始抗體的恒定區(qū)而被修飾或改變以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR)結(jié)合。也將這種嵌合抗體稱作"類別轉(zhuǎn)換抗體"。嵌合抗體是被表達的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，該基因包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。生產(chǎn)嵌合抗體的方法包括在本領(lǐng)域公知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如，Morrison, S. L.,等人，Proc. Natl. Acad Sc1.USA 81 (1984)6851-6855 和 US5, 202，238 和 US5, 204，244。術(shù)語"人源化抗體"指這樣的抗體，其中的框架或"互補性決定區(qū)"(OTR)己經(jīng)被修飾為包括與親本免疫球蛋白相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在一個優(yōu)選實施方式中，將鼠⑶R移植到人抗體的框架區(qū)以制備"人源化抗體"。參見例如，Riechmann，L.，等人，Nature 332(1988)323-327 ;和 Neuberger，M.S.，等人，Nature 314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDRs對應于識別以上指出的關(guān)于嵌合抗體的抗原的那些代表性序列。本發(fā)明涵蓋的"人源化抗體"的其它形式是那些，其中恒定區(qū)己經(jīng)相比于初始抗體的恒定區(qū)而另外被修飾或改變以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR)結(jié)合。如在本文使用，術(shù)語"人抗體"意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk, Μ. A.,和van de ffinkel,J. G. , Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。人抗體還可以在轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動物在免疫時能夠在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的條件下產(chǎn)生人抗體的全部所有組成成分或選定部分(selection)。在此種種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列將導致在抗原攻擊時產(chǎn)生 人抗體(參見例如Jakobovits，A.，等人，Proc. Natl.Acad. Sc1.USA 90(1993)2551-2555 Jakobovits, A.，等人，Nature 362(1993)255-258 ；Briiggemann, M.,等人，Year Immunol. 7 (1993) 33-40) 人抗體還可以在卩遼菌體展示文庫中產(chǎn)生(Hoogenboom, H. R.，和 Winter, G. J.，Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等人，J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole, S. P. C.，等人，和 Boerner, P.，等人，的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體(Cole, S. P. C.，等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss, (1985) 77-96)和 Boerner, P.，等人，J.1mmunol. 147 (1991) 86-95)。如己經(jīng)對根據(jù)本發(fā)明的嵌合和人源化抗體所提及的，如在本文中使用的術(shù)語"人抗體"還包括這樣的抗體，其在恒定區(qū)內(nèi)被修飾以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合，例如通過"類別轉(zhuǎn)換"即改變或突變Fe部分(例如自IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4 突變)。如在本文使用，術(shù)語"重組人抗體"意欲包括通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，諸如分離自宿主細胞，諸如HEK293細胞和CHO或CHO細胞的抗體或分離自針對人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的動物(例如小鼠)的抗體，或利用轉(zhuǎn)染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體。這種重組人抗體具有處于重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的重組人抗體己經(jīng)經(jīng)歷了體內(nèi)體細胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是盡管源自并涉及人種系VH和VL序列，但在體內(nèi)可能不天然存在于人抗體種系所有組成成分中的序列。如本文使用，"可變結(jié)構(gòu)域"(輕鏈(VL)可變結(jié)構(gòu)域，重鏈(VH)的可變區(qū))意指直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對輕鏈和重鏈對?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且每個結(jié)構(gòu)域包括4個框架(FR)區(qū)，所述框架區(qū)的序列是普遍保守的，其通過3個"高變區(qū)"(或互補性決定區(qū)，⑶Rs)相連接?？蚣軈^(qū)采用β-折疊構(gòu)象且⑶R可以形成連接β_折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過框架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)并與來自另一條鏈的CDR —起形成抗原結(jié)合位點?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力方面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個目的。用于本文時，術(shù)語"高變區(qū)"或"抗體的抗原結(jié)合部分"指負責抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自"互補性決定區(qū)"或"⑶Rs"的氨基酸殘基。"框架"或"FR"區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各條鏈上的CDR通過此種框架氨基酸分開。特別地，重鏈的CDR3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。按照Kabat，Ε· A.,等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))的標準定義確定 CDR 和FR區(qū)域。如在本文使用，術(shù)語"結(jié)合"或"特異性結(jié)合"指在體外測定法中，優(yōu)選地在用純化的野生型抗原的等離振子共振測定(BIAcore,GE-HealthcareUppsala,瑞典)中，抗體與抗原的表位的結(jié)合。結(jié)合的親和力由術(shù)語ka (來自抗體/抗原復合物的抗體的締合的速率常數(shù))、kD (解離常數(shù))和KD(kD/ka)定義。結(jié)合或特異性結(jié)合意為ICT8M或更低，例如10_8M到10_13M，優(yōu)選10_9M到10_13M的結(jié)合親和力(Kd)。因此，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體以10_8M或更低，例如10_8M到10_13M，優(yōu)選10_9M到10_13M的結(jié)合親和力(Kd)特異性結(jié)合于對其具有特異性的每種抗原。術(shù)語"表位"包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定簇。在某些實施方式中，表位決定簇包括分子的化學活性表面基團，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，以及在某些實施方式中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特定的電荷特性。表位是被抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。在某些實施方式中，當抗體在蛋白和/或大分子的復合體混合物中優(yōu)先識別其靶抗原時，將該抗體稱為與抗原特異性結(jié)合。如在本文中使用的用于根據(jù)本發(fā)明的抗體的術(shù)語“肽接頭”指具有氨基酸序列的肽，所述肽優(yōu)選地是合成來源的。將根據(jù)本發(fā)明的這些肽連接物用于將結(jié)合第二抗原的二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段與全長抗體的重鏈C-端或N-端融合從而形成根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體。優(yōu)選地，所述肽接頭是具有長度為至少5個氨基酸的氨基酸序列的肽，優(yōu)選地長度為10至100個氨基酸，更 優(yōu)選地長度為25至50個氨基酸。在一個實施方式中，所述肽接頭是例如，(GxS)η或(GxS)nGm,其中G =甘氨酸，S =絲氨酸,并且(x = 3, η = 3、4、5或6,并且 m = 0、1、2 或 3)或(X = 4,η = 2、3、4、5 或 6,并且 m = 0、1、2 或 3),優(yōu)選地，x = 4 且 η=2、3、4、5或6，并且m = O。在一個實施方式中，在根據(jù)本發(fā)明的抗體內(nèi)使用的“肽接頭”不包括蛋白酶切割位點。肽接頭的每個末端綴合一條多肽鏈(例如，VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、抗體重鏈、抗體輕鏈、CHl-VH鏈等)。如下面所述的用于中間物抗體(其在表達期間或在表達后被加工成根據(jù)本發(fā)明的抗體)的術(shù)語“肽接頭”指具有氨基酸序列的肽，所述肽例如是合成來源的。優(yōu)選地，下面的所述肽接頭是具有至少5個氨基酸長度的氨基酸序列的肽，優(yōu)選地具有5至100個氨基酸長度，更優(yōu)選地具有10至50個氨基酸長度。肽接頭的每個末端綴合一條多肽鏈(例如，VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、抗體重鏈、抗體輕鏈、CHl-VH鏈等)。在所述中間物雙特異性抗體中的肽接頭之一不包括蛋白酶切割位點并且與如上所述的根據(jù)本發(fā)明的最終雙特異性抗體的肽接頭相同。在一個實施方式中，所述沒有蛋白酶切割位點的肽接頭是例如(GxS)n或(GxS)nGm,其中G =甘氨酸，S =絲氨酸,并且(x =
3,η = 3、4、5 或 6,并且 m = 0、1、2 或 3)或(x = 4, η = 2、3、4、5 或 6,并且 m = 0、1、2 或3),優(yōu)選地，X = 4 且 η = 2、3、4、5 或 6,并且 m = O。如下所述的中間物抗體的另一肽接頭包括蛋白酶切割位點，例如，該位點在表達期間(例如通過弗林蛋白酶)或在表達(/和純化)后是可切割的。通常，在肽接頭內(nèi)的蛋白酶切割位點是被蛋白酶切割的氨基酸序列或基序。用于不同蛋白酶的天然或人工的蛋白酶切割位點描述于，例如 Database，Vol. 2009, Article ID bap015, doi 10. 1093/database/bap015 以及所參考的 MEROPS 妝數(shù)據(jù)庫(http: //merops. sanger. ac. uk/)。弗林蛋白酶特異的蛋白酶切割位點是 例如，QSSRHRRAL(SEQ ID NO. 13的弗林蛋白酶特異的蛋白酶切割位點變體1-FS1)，或LSHRSKRSL(SEQ ID NO. 14的弗林蛋白酶特異的蛋白酶切割位點變體2-FS2)。Prescission特異的蛋白酶切割位點是例如，QSSRHRRAL(SEQ ID NO. 15的Prescission特異的蛋白酶切割位點)LEVLFQGP。弗林蛋白酶是在人類中由FURIN基因編碼的蛋白并且屬于內(nèi)肽酶(Endopeptidases :絲氨酸蛋白酶/絲氨酸內(nèi)肽酶(EC3. 4. 21))。將其命名為弗林蛋白酶是因為它是在被稱作FES的癌基因的上游區(qū)域。該基因別稱作FUR (FES Upstream Region)并因此將該蛋白稱為弗林蛋白酶(furin)。弗林蛋白酶也被稱作PACE(￡aired basic Aminoacid Cleaving Enzyme)。由這一基因編碼的蛋白是屬于枯草桿菌蛋白酶-樣前蛋白轉(zhuǎn)變酶家族的塵。這一家族的成員是將潛在的前體蛋白加工成它們的生物學活性產(chǎn)物的前蛋白轉(zhuǎn)變酶。這一編碼蛋白是鈣依賴性絲氨酸內(nèi)切蛋白酶，該內(nèi)切蛋白酶可以在它們配對的堿性氨基酸加工位點處有效地切割前體蛋白。其底物中的一些是甲狀旁腺激素原，轉(zhuǎn)化生長因王3 -1前體，白蛋白原(proalbumin),前-β -分泌酶,膜型1_基質(zhì)金屬蛋白酶,前-神經(jīng)生長因子的β亞基以及von Willebrand因子。弗林蛋白酶-樣前蛋白轉(zhuǎn)變酶涉及RGMc (也稱作血幼素(Hemojuvelin))的加工，該RGMc是參與被稱作青少年血色病的嚴重的鐵過載疾病的基因。Ganz和Rotwein小組都證實了弗林蛋白酶-樣前蛋白轉(zhuǎn)變酶(PPC)負責在保守的多堿基RNRR位點處，50kDa HJV向帶有截短的C00H-末端的40kDa蛋白的轉(zhuǎn)換。這表明產(chǎn)生可溶形式的HJV/血幼素(s-血幼素)的潛在機制，該HJV/血幼素(s-血幼素)在嚙齒類動物和人類的血液中被發(fā)現(xiàn)。弗林蛋白酶存在于胞吞小泡和分泌小泡中，在反式高爾基體網(wǎng)絡中以及在一些情形下，在許多哺乳動物的細胞(例如HEK293，CH0)表面上。其識別位點通常含有基序RXK/RR，該基序RXK/RR存在于多種分泌前體蛋白中，例如前-TGF β I或前-van Willebrand因子。因此,選擇這些識別序列用來產(chǎn)生含有連接物序列的兩個弗林蛋白酶位點(SEQ ID NO :13的弗林蛋白酶特異性蛋白酶切割位點變體1-FSl JPSEQ IDNO 14的弗林蛋白酶特異性蛋白酶切割位點變體2-FS2)。Prescission Protease (GE Healthcare Catalogue No. 27-0843-01)是遺傳改造的融合蛋白，由人鼻病毒3C蛋白酶和GST組成。這一蛋白酶被特異設計為通過允許同時進行GST融合蛋白的蛋白酶固定化和切割來促進除去該蛋白酶，該GST融合蛋白是從pGEX-6P載體 pGEX-6P-l、pGEX-6P-2 和 pGEX_6P_3 產(chǎn)生的；參見 pGEX Vectors (GST Gene FusionSystem)。Prescission Protease 特異性地在 LeuGluValLeuPheGln/GlyPro 識別序列的Gln 和 Gly 殘基之間進行切割(Walker，P. A.，等人 BI0/TECHN0L0GY 12，(1994)601-605 ；Cordingley, M. G.等人 J. Biol. Chem. 265，(1990)9062-9065)。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有有價值的特征如生物學或藥學活性，藥物代謝動力學性質(zhì)。它們可以例如用于諸如癌癥的疾病的治療。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于特異性地結(jié)合ErbB3 和 c-Met。如在本申請中使用，術(shù)語"恒定區(qū)"意指除了可變區(qū)之外的抗體的結(jié)構(gòu)域的總合。恒定區(qū)不直接參與抗原的結(jié)合，但是顯示多種效應子功能。取決于抗體重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，將抗體分為下述類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且這些中的一些可以被進一步分為亞類如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、IgAl和IgA2。對應于不同種類的抗體的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。可以在所有5種抗體種類中發(fā)現(xiàn)的輕鏈恒定區(qū)(CL)被稱為 K (kappa)和 λ (lambda)。如本申請所使用，術(shù)語"源自人來源的恒定區(qū)"意指亞類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的人抗體的恒定重鏈區(qū)和/或恒定輕鏈K或λ區(qū)域。這樣的恒定區(qū)是現(xiàn)有技術(shù)中公知的并且例如由Kabat, E. A.，描述(參見，例如Johnson, G.，和ffu, T. T.，Nucleic Acids Res. 28(2000) 214-218 ；Kabat, E. A.,等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA72(1975)2785-2788)。當IgG4亞類的抗體顯示出減少的Fe受體(FcYRIIIa)結(jié)合時，其它IgG亞類的抗體顯示出強烈的結(jié)合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297 (失去Fe糖類)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434 和His435是這樣的殘基，其如果改變的話，還提供減少的Fe受體結(jié)合(Shields，R. L.，等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ；Lund, J.，等人，F(xiàn)ASEB J. 9(1995) 115-119 ；Morgan,A.，等人，Immunology 86(1995)319-324 ；EP0307434)。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抗體與IgGl抗體比較具有減少的FcR結(jié)合，并且全長親本抗體涉及IgG4亞類的FcR結(jié)合或具有S228、L234、L235和/或D265中突變的IgGl或IgG2亞類的FcR結(jié)合，和/或包含PVA236突變。在一個實施方式中，在全長親本抗體中的突變是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一個實施方式中，在全長親本抗體中的突變在IgG4中是S228P，在IgGl中是L234A和L235A?？贵w的恒定區(qū)直接涉及ADCC (抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用)和CDC (補體依賴的細胞毒性)。補體激活(CDC)由補體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的恒定區(qū)結(jié)合而起始。Clq與抗體的結(jié)合由在所謂的結(jié)合位點的限定的蛋白-蛋白相互作用所引起。這樣的恒定區(qū)結(jié)合位點是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并且例如由Lukas, T. J.,等人，J.1mmunol. 127 (1981) 2555-2560 ；Brunhouse, R.和 Cebra, J. J.，Mol.1mmunol. 16(1979)907-917 ；Burton, D. R.,等人，Nature 288(1980)338-344 ；Thommesen, J. E.,等人，Mol.1mmunol. 37 (2000) 995-1004 ；Idusogie, E. E.,等人，J.1mmunol. 164 (2000) 4178-4184 ；Hezareh, M.，等人，J. Virol. 75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, A.,等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;和 EP0307434 所描述。所述恒定區(qū)結(jié)合位點例如特征在于氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 (根據(jù) Kabat的EU索引編號)。術(shù)語"抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)"指在存在效應細胞時，由根據(jù)本發(fā)明的抗體裂解人靶細胞。ADCC優(yōu)選地通過用根據(jù)本發(fā)明的抗體在存在效應細胞時處理表達抗原的細胞的制備物進行測量，所述效應細胞如新鮮分離的PBMC或來自血沉棕黃層的純化的效應細胞，如單核細胞或天然殺傷(NK)細胞或永久生長的NK細胞系。術(shù)語"補體依賴性細胞毒性(⑶C)"指由補體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的Fe部分結(jié)合而起始的過程。Clq與抗體的結(jié)合由在所謂的結(jié)合位點的限定的蛋白-蛋白相互作用所引起。這些Fe部分結(jié)合位點是現(xiàn)有技術(shù)已知的(見上)。這些Fe部分結(jié)合位點例如特征在于氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 (根據(jù) Kabat的EU索引編號)。亞類IgGl、IgG2和IgG3的抗體通常顯示包括Clq和C3結(jié)合的補體激活，而IgG4不激活補體系統(tǒng)并且不結(jié)合Clq和/或C3。單克隆抗體 的細胞介導的效應子功能可以通過改造它們的寡糖組分而得以增強，如在 Umana，P.，等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 和 US6, 602，684 中所述。IgGl型抗體是最常用的治療性抗體，其是在每個CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297具有保守的N-連接的糖基化位點的糖蛋白。與Asn297附著的兩個復合雙觸角寡糖嵌入在CH2結(jié)構(gòu)域之間，形成了與多肽骨架的廣泛接觸，并且它們的存在對于抗體介導效應子功能諸如抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely，Μ. . R.，等人，Glycobiology 5(1995)813-822 ；Jefferis, R.，等人，Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76 ；Wright, A.，和 Morrison, S. L.，TrendsBiotechnol. 15 (1997) 26-32)。Umana, P.，等人 Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 和W099/154342顯示，β (1，4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III (" Gn Till")，一種催化平分型(bisected)寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中的過量表達，顯著增加了抗體的體外ADCC活性。在Asn297糖類的組成上的改變或其消除也影響Fe Y R和Clq的結(jié)合(Umana,P.,等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ；Davies, J.,等人，Bioteehnol.Bioeng. 74 (2001) 288-294 ；Mimura, Y.,等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547 ；Radaev, S.，等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483 ；Shields, R. L.，等人，J. Biol.Chem. 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R. L.，等人，J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 ；Simmons, L. C.，等人，J.1mmunol. Methods263 (2002) 133-147)。增強單克隆抗體的細胞介導的效應子功能的方法例如在W02005/044859、W02004/065540, W02007/031875, Umana, P.，等人，Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180、W099/154342、W02005/018572, W02006/116260, W02006/114700, W02004/065540、W02005/011735, W02005/027966, W01997/028267, US2006/0134709, US2005/0054048,US2005/0152894、W02003/035835 和 TO2000/061739 中或者例如在 Niwa，R.，等人，J.1mmunol. Methods 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa, T.,等人，J. Biol.Chem. 278(2003)3466-3473 ；W003/055993 和 US2005/0249722 中進行報道。
在本發(fā)明的一個實施方式中，雙特異性抗體在Asn297被糖鏈糖基化(如果其包含IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類的Fe部分，優(yōu)選地IgGl或IgG3亞類的Fe部分)，由此在所述糖鏈中的巖藻糖的量是65%或更低(根據(jù)Kabat的編號)。在另一個實施方式中，巖藻糖在所述糖鏈中的量在5%和65%之間，優(yōu)選在20%和40%之間。在替代的實施方式中，在Asn297的巖藻糖的量是Fe區(qū)域的寡糖的0%。根據(jù)本發(fā)明的"Asn297"意為在Fe區(qū)域的約位置297定位的氨基酸天冬酰胺?；诳贵w的微小序列變化，Asn297也可以定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超過±3個氨基酸)，即在位置294和300之間。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的糖基化的抗體IgG亞類是人IgGl亞類的，具有突變L234A和L235A的人IgGl亞類的，或IgG3亞類的。在另一個實施方案中，在所述糖鏈中N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)的量是I %或更低和/或N-端α-1，3-半乳糖的量是I %或更低。糖鏈優(yōu)選地顯示出與在CHO細胞中重組表達的抗體的Asn297連接的N-連接的聚糖的特征。術(shù)語"糖鏈顯示出與在CHO細胞中重組表達的抗體的Asn297連接的N-連接的聚糖的特征"指在根據(jù)本發(fā)明的全長親本抗體的Asn297的糖鏈具有與在未修飾的CHO細胞中表達的相同抗體,例如如在W02006/103100中報道的那些抗體相同的結(jié)構(gòu)和糖殘基序列，除了巖藻糖殘基之外。如在本申請中使用，術(shù)語"NGNA"意指糖殘基N-羥乙酰神經(jīng)氨酸。

人IgGl或IgG3在Asn297發(fā)生糖基化，如核心巖藻糖基化的雙觸角復合寡糖糖基化，末端為多至兩個Gal殘基。IgGl或IgG3亞類的人恒定重鏈區(qū)由Kabat，E. A.，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版。Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991),以及由 Briiggemann, M.，等人，J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361 ；Love, T. ff.，等人，Methods Enzymo1. 178(1989)515-527中詳細報道。根據(jù)末端Gal殘基的量，將這些結(jié)構(gòu)稱為G0，Gl(a-1，6-或a_l，3_)或G2聚糖殘基(Raju, T. S.，Bioprocess Int.1 (2003) 44-53)。抗體 Fe 部分的 CHO 型糖基化例如由 Routier，F(xiàn).H. ,Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 描述。在未進行糖修飾的 CHO 宿主細胞中重組表達的抗體通常在Asn297進行巖藻糖基化，量為至少85 %。全長親本抗體的修飾的寡糖可以是雜合的或復合的。優(yōu)選地，所述平分型、還原/未巖藻糖基化的寡糖是雜合的。在另一個實施方式中，所述平分型、還原/未巖藻糖基化的寡糖是復合的。根據(jù)本發(fā)明"巖藻糖的量"意為與在Asn297附著的所有糖結(jié)構(gòu)的總和(例如，復合、雜合和高甘露糖結(jié)構(gòu))相比的在Asn297的糖鏈中所述糖的量，所述糖的量通過MALD1-T0F質(zhì)譜測量并且計算為平均值(參見，例如W02008/077546)。巖藻糖的相對量是在N-糖苷酶F處理的樣品中由MALD1-T0F鑒定的包含巖藻糖的結(jié)構(gòu)相對于所有糖結(jié)構(gòu)(例如，分別為復合、雜合和低聚和高甘露糖結(jié)構(gòu))的百分比。根據(jù)本發(fā)明的抗體由重組方法產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的一個方面是編碼根據(jù)本發(fā)明抗體的核酸，并且另一個方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明抗體的核酸的細胞。用于重組生產(chǎn)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的并且包括在原核細胞和真核細胞中的蛋白表達，以及隨后的抗體分離和通常純化為藥學可接受純度。對于將前述抗體在宿主細胞中的表達，將編碼各個修飾的輕鏈和重鏈的核酸通過標準方法插入表達載體中。在適合的原核或真核宿主細胞如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER. C6細胞、酵母或大腸桿菌細胞中進行表達，并且將所述抗體從細胞(上清液或裂解后的細胞)中回收。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞，選自例如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER. C6細胞，優(yōu)選地HEK293細胞或CHO細胞。用于重組生產(chǎn)抗體的一般方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如在 Makrides，S. C.，Protein Expr· Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse, S.,等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J. , Mol.Biotechnol. 16(2000) 151-160 ；Werner, R. G. ,Drug Res. 48 (1998) 870-880 的綜述文章中描述。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體適當?shù)貜呐囵B(yǎng)基中通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法分離，所述純化方法如，例如蛋白A瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法。編碼單克隆抗體的DNA和RNA容易地使用常規(guī)方法進行分離和測序。雜交瘤細胞可以充當DNA和RNA的來源。一旦被分離，可以將DNA插入表達載體中，所述表達載體接著被轉(zhuǎn)染到本不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞如HEK293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞中，從而在宿主細胞中獲得重組單克隆抗體的合成。所述雙特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)通過將適合的核苷酸變化引入到抗體DNA中，或通過核苷酸合成進行制備。然而，這樣的修飾可以僅在例如如上述的非常有限的范圍內(nèi)進行。例如，修飾不改變上述抗體特征如IgG同種型和抗原結(jié)合，但是可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白穩(wěn)定性或有利于純化。如在本申請中使用，術(shù)語"宿主細胞"意指可以被改造以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的抗體的任何種類的細胞體系。在一個實施方式中，將HEK293細胞和CHO細胞用作宿主細胞。如在本文中使用，表述"細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"可交替使用，且全部這些名稱都包括后代。因此，措詞"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化的細胞"包括原代受試細胞和由其來源的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)。還應理解由于有意或無意的突變，所有的后代的DNA內(nèi)容可能并不精確一致。包括在最初轉(zhuǎn)化的細胞中篩選的具有相同功能或生物學活性的變異后代。在NSO細胞中的表達記 載在，例如，Barnes, L. Μ.,等人，Cytotechnology32(2000) 109-123 ；Barnes, L.M.，等人，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。瞬時表達記載在，例如，Durocher, Y.,等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆記載在 Orlandi, R.，等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.,等人，Proc. Natl. Acad. Sc1.USA 89 (1992) 4285-4289 ;和 Norderhaug, L.，等人，J.1mmunol.Methods 204(1997)77-87 中。優(yōu)選的瞬時表達系統(tǒng)(HEK 293)記載在 Schlaeger，E. -J.，和Christensen,K.的Cytotechnology 30(1999)71-83和Schlaeger,E.-J.的J.1mmunol.Methods 194 (1996) 191-199 中。適合用于原核生物的控制序列，例如包括啟動子，任選地操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子、增強子和多腺苷酸化信號。當核酸被置于與另一條核酸序列具有功能性關(guān)系的位置時，該核酸為“有效連接的”。例如，前序列或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA為有效連接的，當前者作為參與多肽的分泌的前蛋白表達時；啟動子或增強子與編碼序列為有效連接的，如果前者影響序列的轉(zhuǎn)錄；或核糖體結(jié)合位點與編碼序列為有效連接的，如果前者被置于的位置能促進翻譯。一般的，“有效連接的”意為連接的DNA序列為相鄰的，在分泌前導序列的情況下為相鄰的且符合讀框的。但是增強子不需要為相鄰的。使用合適的限制性位點的連接來實現(xiàn)連接。如果這樣的位點不存在，則依照常規(guī)做法使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。通過標準技術(shù),包括堿/SDS處理、CsCl顯帶法(CsCl banding)、柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)，進行抗體的純化從而消除細胞組分或其它污染物，例如其它細胞核酸或蛋白。參見Ausubel, F等人編輯，Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987) 不同的方法是充分建立的并且廣泛用于蛋白純化，如用微生物蛋白進行的親和層析法(例如，蛋白A或蛋白G親和層析法)，離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式的交換)、親硫吸附(例如，用β -巰基乙醇和其它SH配體)、疏水相互作用或芳香吸附層析法(例如用苯基瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂或間氨基苯基硼酸)，金屬螯合親和層析法(例如用Ni (II)-和Cu (II)-親和力材料)、大小排阻層析法和電泳方法(如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vi jayalakshmi,M. A. , Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。本發(fā)明的一個方面是包括根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個方面是根據(jù)本發(fā)明的抗體在制造藥物組合物中的應用。本發(fā)明的另一個方面是用于制造包括根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物的方法。在另一個方面中，本發(fā)明提供包括與藥物載體一起配制的根據(jù)本發(fā)明的抗體的組合物，例如藥物組合物。本發(fā)明的一個實施方案是本發(fā)明的三價雙特異性抗體，用于治療癌癥。本發(fā)明的另一方面是所述藥物組合物，用于治療癌癥。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的雙抗體在制造用于治療癌癥的藥物中的應用。本發(fā)明的另一個方面是通過向需要此類治療的患者施用根據(jù)本發(fā)明的抗體以治療罹患癌癥的患者的方法。如此處所使用的，“藥用載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、和生理上相容的類似物。優(yōu)選地，載體適用于靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、腸胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如通過注射或輸注)。本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域公知的多種方法施用。熟練技術(shù)人員應當理解，施用的途徑和/或模式將根據(jù)想要的結(jié)果而變化。為了以某種施用途徑施用本發(fā)明的化合物，可能必須使用物質(zhì)包被化合物、或?qū)⑺鑫镔|(zhì)和化合物共同施用以避免其失活。例如可在合適的載體中對受試者施用化合物，所述載體例如脂質(zhì)體或稀釋劑?？伤幱玫南♂寗┌}水和水性緩沖溶液。藥用載體包括無菌水溶液或分散體，和用于臨時配制無菌可注射用的溶液或分散體的無菌粉末。這些用于藥用活性物質(zhì)的介質(zhì)和活性劑的用途為本領(lǐng)域公知的。如本文所用的短語“腸胃外給藥”和“經(jīng)腸胃外給藥”，表示不同于腸和局部給藥的給藥方式，通常是通過注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。如在本文中使用，術(shù)語癌癥指增生性疾病，如淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer) >結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌 、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、夕卜陰癌、霍奇金病、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎孟癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、脊柱軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細胞瘤、星形細胞瘤、施萬細胞瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀上皮細胞癌、垂體腺瘤和Ewings肉瘤，包括上述癌癥任何的難治性形式，或一種或多種上述癌癥的組合。這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過前述滅菌操作，以及通過納入多種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，均可以確保防止微生物的存在。還可能期望在組合物中納入等滲劑，如糖、氯化鈉等。另夕卜，可注射藥物形式的延遲吸收可以通過納入延遲吸收的活性劑如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)。無論所選的施用路徑如何，可以以適宜水合物形式使用的本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法配制為可藥用劑型。根據(jù)本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可有變動，以獲得有效量的活性成分，從而對于特定的患者、組合物和給藥方式實現(xiàn)期望的治療反應，而對患者沒有毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥代動力學因素，包括所采用的本發(fā)明特定組合物的活性、給藥路徑、給藥時間、所采用特定化合物的排泄速率、治療持續(xù)時間、與所采用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、病情、總體健康和既往病史、以及醫(yī)學領(lǐng)域眾所周知的類似因素。組合物必需是無菌和流動的，其程度使得組合物可以通過注射器遞送。除了水之夕卜，載體優(yōu)選地是等滲緩沖鹽溶液。例如，可以通過使用包衣如卵磷脂，分散劑的情況下通過維持所需的顆粒大小，通過使用表面活性劑，來維持適當?shù)牧鲃有?。在許多情況下，優(yōu)選地在組合物中納入等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化鈉。如在本文使用，術(shù)語" 細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"可交替使用，且全部這些名稱都包括子代。因此，措詞"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化的細胞"包括原代受試細胞和由其來源的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應理解歸因于有意或無意的突變，所有的子代的DNA內(nèi)容可能不精確一致。包括在最初轉(zhuǎn)化的細胞中篩選的具有相同功能或生物學活性的變異子代。在意指不同名稱時，通過上下文其將是清楚的。如本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化，，指將載體/核酸轉(zhuǎn)移到宿主細胞中的過程。如果將沒有強大的細胞壁屏障的細胞用作宿主細胞，那么例如，通過如Graham, F. L.,和van derEb, A. J.，Virology 52 (1973) 456-467所述的磷酸鈣沉淀法來進行轉(zhuǎn)染。然而，也可使用其他用于將DNA導入細胞中的方法，例如通過核注射或通過原生質(zhì)體融合。如果使用原核細胞或含有實質(zhì)細胞壁結(jié)構(gòu)的細胞，例如，一種轉(zhuǎn)染方法是如Cohen，S.N，等人，PNAS69 (1972) 2110-2114所述的使用氯化鈣的鈣處理。如本文使用，“表達”指將核酸轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程和/或隨后將轉(zhuǎn)錄的mRNA (也稱作轉(zhuǎn)錄本)翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄本和編碼的多肽統(tǒng)稱為基因產(chǎn)物。如果多核苷酸是源自基因組DNA，那么在真核細胞中的表達可包括mRNA的剪接?！拜d體”是核酸分子，特別是自主復制的，其將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細胞中和/或在宿主細胞之間轉(zhuǎn)移。該術(shù)語包括主要用作將DNA或RNA插入細胞(例如染色體整合)的載體、主要用作復制DNA或RNA的復制載體、和用作DNA或RNA轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的表達載體。還包括提供一種以上所述功能的載體。“表達載體”是多核苷酸，其在被引入到適當?shù)乃拗骷毎麜r，能夠被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽。“表達體系”通常指包括能夠用作產(chǎn)生理想的表達產(chǎn)物的表達載體的適當?shù)乃拗骷毎?。提供下面的實施例、序列表和附圖幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實范圍在所附的權(quán)利要求書中給出。應理解的是可以在不背離本發(fā)明精神的情況下對提出的方法進行修改。氨基酸序列描述SEQ ID NO lHer3/MetSS_KHSS_FSl-HCl(SS_KnobsHCl_VHcMet)SEQ ID NO2Her3/MetSS_KHSS_FSl-HC2(SS_HolesHC2_VLcMet_FSl)SEQ ID NO :3Her3/MetSS_KHSS_FSl_LC(Her3 克隆 29_K01_LC)SEQ ID NO 4Her3/MetSS_KHSS_FS2-HCl(SS_KnobsHCl_VHcMet)SEQ ID NO 5Her3/M etSS_KHSS_FS2-HC2(SS_HolesHC2_VLcMet_FS2)SEQ ID NO :6Her3/MetSS_KHSS_FS2_LC (Her3 克隆 29_K01_LC)SEQ ID NO 7Her3/MetSS_KHSS_PreSc1-HCl(SS_KnobsHCl_VHcMet)SEQ ID NO 8Her3/MetSS_KHSS_PreSc1-HC2(SS_HolesHC2_VLcMet_PreSci)SEQ ID NO :9Her3/MetSS_KHSS_PreSci_LC (Her3 克隆 29_K01_LC)SEQ ID NO 10Her3/MetSS-3C-FSl-HCl(SS_KnobsHCl_VHcMet)SEQ ID NO llHer3/MetSS-3C-FSl-HC2(SS_HolesHC2_VLcMet_FSl)SEQ ID NO : 12Her3/MetSS-3C-FSl_LC (Her3 克隆 29_K01_LC)SEQ ID NO 13弗林蛋白酶特異性蛋白酶切割位點變體1-FS1SEQ ID NO 14弗林蛋白酶特異性蛋白酶切割位點變體2-FS2SEQ ID NO :15Prescission特異性蛋白酶切割位點實驗方法
實施例重組DNA技術(shù)將標準方法用于操作DNA,如在 Sambrook, J.，等人，Molecular cloning Alaboratory manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork, 1989中所述。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書來使用分子生物學試劑。DNA和蛋白質(zhì)序列分析以及序列數(shù)據(jù)管理在Kabat，E.A.等人，(1991)，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH出版號91-3242中提供關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息。根據(jù) EU 編號(Ede lman, G. M.，等人，PNAS63 (1969) 78-85 ;Kabat，E. A.，等人，(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 片反，NIH 出片反號91-3242)對抗體鏈的氨基酸進行編號 使用 GCG' s (Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)軟件包 10. 2 版本和 Infomax' s Vector NTI Advance suite 版本 8. 0 來用于序列產(chǎn)生、作圖、分析、注釋和舉例說明。DNA 測序
DNA序列通過在 sequiServe (Vaterstetten,德國)和 Geneart AG (Regensburg,德國)進行的雙鏈測序來確定?；蚝铣尚枰幕騾^(qū)段由GeneartAG (Regensburg,德國)從合成的寡核苷酸和PCR產(chǎn)物通過自動的基因合成進行制備。將側(cè)翼為單一限制性內(nèi)切核酸酶切割位點的基因區(qū)段克隆到pGA18(ampR)質(zhì)粒中。從轉(zhuǎn)化的細菌純化質(zhì)粒DNA，并且通過UV光譜法測定濃度。通過DNA測序證實亞克隆的基因片段的DNA序列。適當時或者必要時，使用5’-BamHI和3’_XbaI限制性位點。設計所有的構(gòu)建體具有編碼前導肽的5'末端DNA序列，所述前導肽靶向蛋白用于在真核細胞中分泌。表達質(zhì)粒的構(gòu)建將Roche表達載體用于構(gòu)建編碼所有的重鏈VH/或VL融合蛋白和輕鏈蛋白的表達質(zhì)粒。所述載體由下述元件構(gòu)成-作為選擇標記的潮霉素抗性基因，-EB 病毒(Epstein-Barr virus, (EBV))的復制起點，oriP,-載體pUC18的復制起點,其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復制，-β -內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性，-來自人巨細胞病毒(HCMV)的即時早期增強子和啟動子，-人1-免疫球蛋白多腺苷酸化("polyK")信號序列，和-獨特的BamHI和XbaI限制性位點。如所描述的，通過基因合成制備免疫球蛋白融合基因并將該融合基因克隆到pGA18 (ampR)質(zhì)粒中。將帶有合成的DNA區(qū)段和Roche表達載體的pG18 (ampR)質(zhì)粒用BamHI和XbaI限制性酶(Roche Molecular Biochemicals)消化并進行瓊脂糖凝膠電泳。然后將純化的重鏈和輕鏈編碼DNA區(qū)段連接到分離的Roche表達載體BamHI/Xbal片段，產(chǎn)生最終的表達載體。將最終的表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細胞中，分離表達質(zhì)粒DNA(Miniprep)并進行限制性酶分析和DNA測序。將正確的克隆在150ml LB-Amp培養(yǎng)基中生長，再次分離質(zhì)粒DNA(Maxipr印)并通過DNA測序確認序列完整性。免疫球蛋白變體在HEK293細胞中的瞬時表達根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用FreeStyle 293 Expression System(Invitrogen,美國)通過人胚腎293-F細胞的瞬時轉(zhuǎn)染來表達重組免疫球蛋白變體。簡言之，將懸液FreeStyle 293-F細胞在Freestyle 293表達培養(yǎng)基中，在37°C /8% CO2進行培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)染當天將細胞以1-2χ106活細胞/ml的密度接種在新鮮的培養(yǎng)基中。使用325 μ I的293fectin (Invitrogen，德國)和250μ g以1:1摩爾比率的重鏈和輕鏈質(zhì)粒DNA在
Optl-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen，美國)中制備DNA-293fectinTM復合物，最終轉(zhuǎn)染體
積為 250ml。使用 325μ I 的 293fectin (Invitrogen，德國)和 250μ g 以1:1 : 2 摩爾比
率的"突起進入孔"重鏈I和2和輕鏈質(zhì)粒DNA在Opt1-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen,
美國)中制備"突起進入孔"DNA-293fectin復合物，最終轉(zhuǎn)染體積為250ml。在轉(zhuǎn)染后7天，通過在14000g離心30 分鐘并通過無菌濾器(O. 22 μ m)過濾收集包含抗體的細胞培養(yǎng)物上清液。將上清液貯存在-20°C直到純化。
雙特異性抗體和對照抗體的純化通過使用Protein A-Sepharose (GE Healthcare,瑞典)的親和層析法和Superdex200大小排阻層析法，將雙特異性抗體和對照抗體從細胞培養(yǎng)物上清液中純化出來。簡言之，將無菌過濾的細胞培養(yǎng)物上清液施加到HiTrapProteinA HP(5ml)柱上，所述柱用 PBS 緩沖液(IOmM Na2HPO4, ImM KH2PO4,137mM NaCl 和 2. 7mM KCl，pH7. 4)平衡。將未結(jié)合的蛋白用平衡緩沖液洗出。將抗體和抗體變體用O.1M檸檬酸鹽緩沖液，pH2. 8洗脫，并將包含蛋白的級分用O.1ml IM Tris,pH8. 5中和。接著,合并洗脫的蛋白級分,用Amicon超離心濾器裝置(MWCO 30K, Millipore)將其濃縮到3ml的體積，并負載到用20mM組氨酸，140mMNaCl,pH 6· O平衡的 Superdex200HiLoad 120ml 16/60凝膠過濾柱(GE Healthcare,瑞典)上。將具有低于5%的高分子量聚集體的包含純化的雙特異性抗體和對照抗體的級分合并并以1. Omg/ml的等分試樣忙存在_80°C。純化蛋白的分析使用基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數(shù)，通過測量280nm的光密度(OD)來測定純化的蛋白樣品的蛋白濃度。通過在存在和不存在還原劑(5mMl，4-二硫蘇糖醇)進行SDS-PAGE，并用考馬斯亮藍染色來分析雙特異性抗體和對照抗體的純度和分子質(zhì)量。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用]VuPAGE Pre-Cast凝膠系統(tǒng)(Invitrogen,美國)(4-20 %Tris-甘氨酸凝膠)。在25°C，使用在200mM KH2PO4, 250mM KC1，pH7. O運行緩沖液中的Superdex200分析大小排阻柱(GE Healthcare,瑞典)，通過高效SEC分析雙特異性抗體和對照抗體樣品的聚集體含量。將25 μ g蛋白以O. 5ml/min的流速注入柱中，并在50分鐘內(nèi)等度洗脫。對于穩(wěn)定性分析，將lmg/ml濃度的純化蛋白在4°C和40°C溫育7天，接著通過高效SEC評估。在通過用肽-N-糖苷酶F(Roche MolecularBiochemicals)酶促處理去除N-聚糖之后,通過NanoElectrospray Q-TOF質(zhì)譜來證實還原的雙特異性抗體輕鏈和重鏈的氨基酸骨架的完整性。

實施例1本發(fā)明雙特異性抗體的設計在首次嘗試時，基于結(jié)合第一抗原的全長抗體來產(chǎn)生衍生物，該抗體攜帶一個另外的Fv作為對于第二抗原特異的第二結(jié)合部分(moiety)(參見圖2a)。在VHCys44和VLCyslOO參照之間引入鏈間二硫化物。參見第17-18頁A_M。dsFv的VHCys44與全長抗體的第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域融合，相應的VLCyslOO部分(module)與全長抗體的第二重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域融合。前面示出了通過細菌包涵體重折疊或周質(zhì)分泌，可以以合理的產(chǎn)量從單獨表達的部分組裝 dsFvs(W094/029350，US5, 747，654，Rajagopal, V.，等人，Prot. Engin. 10(1997) 1453-1459 ；Reiter, Y.,等人，Nature Biotechnology14(1996) 1239-1245 ;Reiter ;Υ·，等人，Protein Engineering ；8 (1995) 1323-1331 ；Webber, K. 0.,等人JVIol ecu Iar Immunology 32 (1995) 249-258 ；Reiter, Y.,等人,Immunity2 (1995) 281-287 ；Reiter, Y.，等人，JBC 269 (1994) 18327-18331 ；Reiter, Y.，等人，Inter.J. of Cancer 58(1994) 142-149 ；Reiter, Y. , Cancer Res. 54(1994)2714-2718).在哺乳動物分泌系統(tǒng)中生產(chǎn)無接頭dsFvs的一個瓶頸可能是在沒有伴侶幫助下，VH和VL結(jié)構(gòu)域的無效組裝dsFv組分不含有被BIP識別的恒定區(qū)域。(參見圖4b)。為了克服這一局限，進行了通過中間物來組裝VH和VL結(jié)構(gòu)域(圖4c)。因此，將dsFv的一個組分(VH或VL)通過連接物肽與一條H-鏈的C-端連接，而相應的另一組分通過另一連接物肽與第二 H-鏈的C-端相連，然而，該另一連接物肽含有一個或多個蛋白酶切割位點，該位點能夠在細胞表達期間被切割(例如通過弗林蛋白酶)或者能夠在體外純化后被切割。中間物雙特異性抗體的實例示出于圖2d(對于抗體如圖2a所示)。這一方法的基本原理是H-鏈的有效二聚化將dsFv組分帶到一起并促進其雜二聚化。為了降低含有2個VH和2個VL部分的分子非生產(chǎn)性的組裝，將互補的突起-進入-孔突變設在IgG的H-鏈中。這些突變是由Merchant, A. Μ.,等人，Nat Biotechnol16(1998)677-681 和 Ridgway, J. B.，等人，Protein Eng 9 (1996) 617-621 提出的以推動不同H-鏈的雜二聚化并且在一條H-鏈中由T366W突變組成而在相應的另一鏈中由T366S、L368A和Y407V突變組成。本發(fā)明的用于產(chǎn)生含dsFv的雙特異物的設計在與VHCys44融合的CH3結(jié)構(gòu)域上具有“突起(knobs)，，并將互補的“孔(holes) ”引入到帶有VLCyslOO的H-鏈中。雜二聚dsFv的兩個組分都系留(tether)到CH3。這一將VH和VL的N-端與大體積CH3結(jié)構(gòu)域的同時結(jié)合并不影響Fv的結(jié)構(gòu)。然而，由于CDR區(qū)指向CH3定位的方向，因此取決于(例如取決于接頭長度或者各抗原結(jié)構(gòu))，會限制針對抗原的可接近性。此外，在兩個連接點的系留只為Fv留下非常有限的自由度來轉(zhuǎn)動或者挨著CH3移動。由于此，抗原需要在CH3和Fv之間擠壓。這可能影響對于抗原的可接近性并降低親和力，確實針對于雙特異抗體的雙連接dsFv部分觀察到了這些(參見表2的SPR數(shù)據(jù)。由于空間位阻，與抗原可接近性問題一致，親和力測定揭示了對于雙系留的dsFv的結(jié)合率(on-rate)的顯著降低。然而，F(xiàn)v的結(jié)構(gòu)整體性似乎未受影響，因為一旦抗原結(jié)合，去除率(off-rate)與未修飾的抗體的去除率相同。用于結(jié)合雙特異性抗體的IgG-樣可接近臂(預期其具有全親和力)以及用于另外的雙系留dsFv的親和力值在表2中列出。由于雙-系留后的空間位阻，使用術(shù)語“限制的或降低的結(jié)合模式”用于`具有降低的結(jié)合率的dsFv部分。示例性地，基于下面的中間物抗體序列，可以通過切割在表達并純化后被加工的一個接頭，來重組表達根據(jù)本發(fā)明的表達抗體，所述抗體僅通過二硫鍵穩(wěn)定性Fv片段的一個結(jié)構(gòu)域與全長抗體連接(也參見圖2和下面的實驗說明)
雙特異性中間物抗體沒有蛋白酶切具有蛋白酶切割輕鏈(2x)
割位點的重鏈位點的重鏈構(gòu)建 構(gòu)建體體
Her3/MetSS_KHSS_PreSciSEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9
(蛋白酶位點切割=Prescission切
割位點)_
示例性地，基于下面的中間物抗體序列，可以通過切割在表達期間被加工的一個接頭，來重組表達根據(jù)本發(fā)明的抗體，所述抗體僅通過二硫鍵穩(wěn)定性FV片段的一個結(jié)構(gòu)域與全長抗體連接(也參見圖2和下面的實驗說明)
權(quán)利要求
1.雙特異性抗體，其包含 a)特異性地結(jié)合第一抗原并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體； b)特異性地結(jié)合第二抗原的Fv片段，所述Fv片段包含VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域，其中兩個結(jié)構(gòu)域通過二硫橋相連，并且 其中只有VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域是通過肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈融合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其特征在于所述雙特異性抗體是三價的并且 或者VH2結(jié)構(gòu)域或者VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈融合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的雙特異性抗體，其特征在于， VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的C-端。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的雙特異性抗體，其特征在于， VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的N-端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其特征在于，VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭N-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的C-端。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其特征在于， VH2結(jié)構(gòu)域或VL2結(jié)構(gòu)域通過肽接頭C-端融合至特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈的N-端。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的雙特異性抗體，其特征在于， VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過在下述位置之間引入的二硫橋連接 i)VH2結(jié)構(gòu)域位置44和VL2結(jié)構(gòu)域位置100， ii)VH2結(jié)構(gòu)域位置105和VL2結(jié)構(gòu)域位置43，或 iii)VH2結(jié)構(gòu)域位置101和VL2結(jié)構(gòu)域位置100。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6的雙特異性抗體，其特征在于， VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過在VH2結(jié)構(gòu)域位置44和VL2結(jié)構(gòu)域位置100之間引入的二硫橋連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的雙特異性抗體，其特征在于， 完整抗體的重鏈的第一 CH3結(jié)構(gòu)域和完整抗體的第二 CH3結(jié)構(gòu)域各在包括了抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面中的改變的界面處相遇； 其中i)在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中， 氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生突起，所述突起可定位在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中， 和 )在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中， 氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生腔，其中在第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突起是可定位在所述腔內(nèi)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的雙特異性抗體，其特征在于，所述具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)，并且所述具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和纈氨酸(V)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的雙特異性抗體，其特征在于， 兩個CH3結(jié)構(gòu)域都進一步通過在每個CH3結(jié)構(gòu)域的位置引入半胱氨酸(C)殘基來進行改變以便能形成在CH3結(jié)構(gòu)域之間的二硫橋。
12.制備根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的雙特異性抗體的方法，包括步驟 A)在哺乳動物細胞中表達編碼雙特異性抗體的核酸，所述雙特異性抗體包括 a)特異性地結(jié)合第一抗原并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體； b)特異性地結(jié)合第二抗原的包括VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的Fv片段，其中兩個結(jié)構(gòu)域通過二硫橋連接，和 其中Fv片段通過VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的N-端經(jīng)由第一和第二肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的兩重鏈的C-端融合，或 通過VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的C-端經(jīng)由第一和第二肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的一條重鏈和一條輕鏈兩者的N-端融合， 其特征在于， 一個接頭包括可被弗林蛋白酶切割的蛋白酶切割位點，而另一接頭不包括蛋白酶切割位點； B)從所述細胞或細胞培養(yǎng)物上清中回收所述抗體。
13.制備根據(jù)權(quán)利要求2-4和7-11中任一項的三價、雙特異性抗體的方法，其包括步驟 A)在哺乳動物細胞中表達編碼雙特異性抗體的核酸，所述雙特異性抗體包括 a)特異性地結(jié)合第一抗原并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體； b)特異性地結(jié)合第二抗原的包括VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的Fv片段，其中兩個結(jié)構(gòu)域通過二硫橋連接，和 其中所述Fv片段 通過VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的N-端經(jīng)由第一和第二肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的兩重鏈的C-端融合，或 通過VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域的C-端經(jīng)由第一和第二肽接頭與特異性地結(jié)合第一抗原的全長抗體的兩重鏈的N-端融合， 其特征在于 一個接頭包括可被Prescission蛋白酶切割的蛋白酶切割位點，而另一接頭不包括蛋白酶切割位點； B)從所述細胞或細胞培養(yǎng)物上清中回收所述抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其特征在于，可被弗林蛋白酶切割的蛋白酶切割位點是 SEQ ID NO : 13 或 SEQ ID NO :14。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其特征在于， 可被Prescission蛋白酶切割的蛋白酶切割位點是SEQ ID N0:15。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中任一項的方法,其特征在于， 所述哺乳動物細胞是CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER. C6細胞。
17.抗體，其通過根據(jù)權(quán)利要求12-16中任一項的方法獲得。
18.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的雙特異性抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙特異性抗體，生產(chǎn)它們的方法，含有所述抗體的藥物組合物以及它們的應用。
文檔編號C07K16/32GK103068846SQ201180040675
公開日2013年4月24日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者U·布林克曼, A·哈斯, S·麥茨, J·M·尚策 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司