專利名稱：可活化的雙特異性抗體的制作方法
可活化的雙特異性抗體本發(fā)明 涉及雙特異性抗體，其中對(duì)兩種抗原之一的結(jié)合親和力降低并且所述抗體可通過(guò)腫瘤或炎癥組織/疾病特異性蛋白酶(例如，腫瘤或炎癥特異性蛋白酶)來(lái)活化；以及所述雙特異性抗體的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的改造蛋白，例如雙-或多特異性抗體是本領(lǐng)域已知的。此種多特異性結(jié)合蛋白能夠使用細(xì)胞融合、化學(xué)綴合或重組DNA技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。最近過(guò)去的幾年，開(kāi)發(fā)了多種多樣的重組雙特異性抗體形式，并且描述于，例如 Coloma，M. J.，等人，Nature Biotech. 15 (1997) 159-163 ;TO2001/077342 ;W02001/090192 ；Carter, P. J.，Immunol. Methods. 248(2001)7-15 ；Marvin, J. S.，等人，Acta Pharmacol Sin. 26 (2005) 649-658 ；Marvin, J. S.,等人，Curr. Opin. Drug Discov.Devel. 9(2006) 184-193 ；Morrison, S.L., Nature Biotechnology25(2007) 1233-1234 ；Mueller, D.,等人，Current Opinion in Molecular Therapeutics9(2007)319-326 ；Fischer, N.,等人，Pathobiology74(2007) 3-14 ；W02007/095338 ；W02007/109254 ；W02007/024715 ；EP2050764 ;和 W02009/018386。Gerspach, J.,等人，Cancer Tmmunol Immunother55 (2006) 1590-1600 涉及通過(guò)尿激酶型纖溶酶激活物(uPA)介導(dǎo)的蛋白水解加工在細(xì)胞表面處的TNF前藥的靶標(biāo)選擇性活化。Joshua, M .,和 Donaldson, J.M·,等人，CancerBiology&Therapy8 (2009) 2145-2150涉及掩蔽治療性抗體的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)以限制脫靶(off-target)作用。W02009/021754涉及單和多特異性抗體以及使用方法。W02010/065882涉及改造的多價(jià)和多特異性結(jié)合蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明的一方面是雙特異性抗體，包括a)結(jié)合第一抗原并包括VH1結(jié)構(gòu)域和VL1結(jié)構(gòu)域的第一抗體，和b)結(jié)合第二抗原的第二抗體其中VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一肽接頭而N-端融合第二抗體，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二肽接頭而N-端融合第二抗體，和其特征在于一個(gè)接頭包括組織-或疾病-特異性蛋白酶切割位點(diǎn)，并且另一接頭不包括蛋白酶切割位點(diǎn)；和相比于蛋白酶切割位點(diǎn)被切割的相應(yīng)雙特異性抗體，所述雙特異性抗體與第一抗原的結(jié)合親和力降低5倍或更多。本發(fā)明的一方面是雙特異性抗體，包括a)結(jié)合第一抗原并包括VH1結(jié)構(gòu)域和VL1結(jié)構(gòu)域的第一抗體，和b)結(jié)合第二抗原的第二抗體其中VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一肽接頭而N-端融合第二抗體，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二肽接頭而N-端融合第二抗體，和其特征在于一個(gè)接頭包括腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶切割位點(diǎn)，并且另一接頭不包括蛋白酶切割位點(diǎn)；和相比于蛋白酶切割位點(diǎn)被切割的相應(yīng)雙特異性抗體，所述雙特異性抗體與第一抗原的結(jié)合親和力降低5倍或更多。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于第二抗體是完整抗體；和VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一肽接頭而N-端融合第二抗體的第一重鏈的C-端，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二肽接頭而N-端融合第二抗體的第二重鏈的C-端。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于從C-到N-端包含下列多肽鏈a)- 一條 VH1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈；-兩條CL-VL2 鏈-一條 VL1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙 特異性抗體的特征還在于從C-到N-端包括下列多肽鏈- 一條 VH1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈-兩條CL-VL2 鏈-一條 VL1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈。優(yōu)選地，此種雙特異性抗體的特征還在于完整抗體的重鏈的第一 CH3結(jié)構(gòu)域和完整抗體的第二 CH3結(jié)構(gòu)域各自在下述界面相遇，所述界面包含在抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面中的改變；其中i)在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中，氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生突出(protuberance),所述突出可定位在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中，和ii)在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中，氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生腔，其中第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突出可定位在所述腔內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于第二抗體是Fv片段；和VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體Fv片段的第一鏈的C-端，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體Fv片段的第二鏈的C-端。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于第一抗體是完整抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于從C-到N-端包括下列多肽鏈a)-兩條 CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-VH2 鏈
-兩條CL-VL1-肽接頭-VL2-鏈；或b)-兩條 CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-VL2 鏈-兩條CL-VL1-肽接頭-VH2鏈在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過(guò)二硫橋穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于第二抗體是Fab片段；和VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體Fab片段的第一鏈的C-端，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體Fab片段的第二鏈的C-端。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于第一抗體是完整抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于從C-到N-端包括下列多肽鏈a)-兩條 CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-CH1-VH2 鏈-兩條CL-VL1-肽接頭-CL-VL2-鏈；或b)-兩條 CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-CL-VL2 鏈-兩條CL-VL1-肽接頭-CHl-VH2-鏈在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征在于第一抗體是Fy片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于從C-到N-端包括下列多肽 鏈a)- 一條 VH1-肽接頭-CH1-VH2 鏈-一條VL1-肽接頭-CL-VL2 鏈；或b)- 一條 VH1-肽接頭-CL-VL2 鏈-一條 VL1-肽接頭-CHl-VH2 鏈優(yōu)選地，相比于蛋白酶切割位點(diǎn)被切割的相應(yīng)雙特異性抗體，所述雙特異性抗體與第一抗原的結(jié)合親和力降低10倍或更多。本發(fā)明提供編碼根據(jù)本發(fā)明抗體的核酸。本發(fā)明還提供含有根據(jù)本發(fā)明核酸的表達(dá)載體(其能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸)，以及含有此種用于重組產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明抗體的載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括包含根據(jù)本發(fā)明載體的原核或真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明重組抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸以及從所述細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清中回收所述抗體。本發(fā)明還包括通過(guò)此種重組方法獲得的抗體。本發(fā)明還提供治療罹患癌癥或炎癥的患者的方法，包括向被診斷為患有此種疾病(并因此需要此種療法)的患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體。所述抗體優(yōu)選以藥物組合物被施用。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體具有有價(jià)值的特性，例如同時(shí)或者更特異性地靶向例如癌細(xì)胞，所述癌細(xì)胞分泌或表達(dá)腫瘤-特異性蛋白酶(相比于不分泌或不表達(dá)腫瘤-特異性蛋白酶或較少分泌或較少表達(dá)腫瘤-特異性蛋白酶的正常細(xì)胞/組織或癌細(xì)胞)。它們可以同時(shí)干擾分開(kāi)的腫瘤的靶標(biāo)或途徑以及分泌或表達(dá)腫瘤-特異性蛋白酶的炎癥區(qū)域。因此，它們介導(dǎo)例如此種表型在癌癥或炎性疾病中的更好的抑制。此外，完全活性(未受限)抗體的全身給藥的潛在毒性或副作用可以通過(guò)在理想的作用位點(diǎn)施用限制性(失活)抗體隨后對(duì)這一抗體進(jìn)行位點(diǎn)-特異性活化來(lái)預(yù)防。


圖1 :在腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶切割前(圖1a)和后(圖1b)，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的一般性圖解圖2a_f :根據(jù)本發(fā)明的不同雙特異性抗體的示意性表示圖3 :三價(jià)、雙特異性抗體衍生物的組成(a)含有二硫鍵穩(wěn)定性Fv的結(jié)合實(shí)體的部分組成；(b)具有用于在靶細(xì)胞上或體外蛋白水解加工的識(shí)別序列的連接物-肽。產(chǎn)生一條以上的連接物序列用于MMP切割。MMP連接物的第二和第三變體帶有序列(GGGGS)2-GGPLGMLSQ(GGGGS)2 和(GGGGS)2-GGPLGIAGQS(GGGGS)2。圖4 :三價(jià)雙特異性的含dsFv的抗體衍生物的表達(dá)和純化(a)蛋白制品在Protein-A和SEC純化后的還原SDS Page`
(b)在其連接物中具有MMP2/9位點(diǎn)的三價(jià)雙特異性的含有dsFv抗體Her3/MetSS_KHSS_M2的示例性SEC圖譜證明沒(méi)有聚集物的高度純化的單體組成。圖5 :在蛋白酶切割前的降低的結(jié)合親和力在蛋白酶切割前后的雙特異性抗體衍生物的還原SDS-Page。(a)將含有Prescission切割位點(diǎn)的根據(jù)本發(fā)明雙特異性抗體(Her3/MetSS_KHSS_PreSci)產(chǎn)生為具有降低的結(jié)合親和力以及在暴露于Prescission蛋白酶時(shí)變?yōu)榛罨摹?b)將含有 MMP2/9 (Her3/MetSS_KHSS_M2)或 uPA 切割位點(diǎn)(Her3/MetSS_KHSS_U)的根據(jù)本發(fā)明雙特異性抗體產(chǎn)生為具有降低的結(jié)合親和力以及在暴露于MMP2/9或uPA時(shí)隨后變?yōu)榛罨摹D6 限制性和未受限的三價(jià)Her3-CMet雙特異性抗體與活細(xì)胞的結(jié)合(Her3/MetSS_KHSS_PreSci, Her3/MetSS_KHSS_M2)。在左欄中示出二價(jià)未受限的Her3_部分對(duì)表達(dá)Her3的cMet陰性T47D細(xì)胞的結(jié)合。在右欄中示出不同的限制性cMet-部分對(duì)于Her3-陰性的表達(dá)cMet的A549細(xì)胞的結(jié)合。對(duì)于限制性部分，觀察到較差的結(jié)合，而通過(guò)特異性蛋白酶的釋放造成對(duì)細(xì)胞的完全結(jié)合和在細(xì)胞上積累。圖 7 :在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)測(cè)定中，(Her3/MetSS_KHSS_PreSci，Her3/MetSS_KHSS_M2,Her3/MetSS_KHSS_U的)根據(jù)本發(fā)明的三價(jià)Her3-CMet分子的抑制功能性(a)檢測(cè)磷酸化的_Her3的Western Blot證明未受限的Her3_實(shí)體對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的干擾。(b)檢測(cè)磷酸化的-AKT的ELISA證明未受限的cMet-實(shí)體對(duì)HGF/c-Met信號(hào)傳導(dǎo)的有效干擾，而限制形式的相同分子具有較低的活性。
圖8 :四價(jià)雙特異性抗體衍生物的組成(Tv_Erb_LeY_SS_M)(a)含有二硫鍵穩(wěn)定性Fv的結(jié)合實(shí)體的部分組成(b)具有用于在靶細(xì)胞上或體外蛋白水解加工的識(shí)別序列的連接物-肽。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的一方面是雙特異性抗體，包括a)結(jié)合第一抗原并包括VH1結(jié)構(gòu)域和VL1結(jié)構(gòu)域的第一抗體，和b)結(jié)合第二抗原的第二抗體其中VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一肽接頭而N-端融合第二抗體，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二肽接頭而N-端融合第二抗體，和其特征在于一個(gè)接頭包括腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶切割位點(diǎn)，并且另一接頭不包括蛋白酶切割位點(diǎn)；和相比于蛋白酶切割位點(diǎn)被切割的相應(yīng)雙特異性抗體，所述雙特異性抗體(蛋白酶切割位點(diǎn)未被切割)與第一抗原的結(jié)合親和力降低5倍或更多。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體 的特征在于它們?cè)诘鞍酌盖懈钗稽c(diǎn)被切割后保留它們的雙特異性(即它們結(jié)合第一抗原和第二抗原的能力)。術(shù)語(yǔ)“抗體”包含各種形式的抗體，包括但不限于完整抗體、抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體以及進(jìn)一步遺傳改造的抗體，只要保留了根據(jù)本發(fā)明的特征特性?！翱贵w片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選其可變結(jié)構(gòu)域，或至少其抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w片段的實(shí)例包括Fv片段、Fab片段、雙抗體和單鏈抗體分子。此外，抗體片段包括具有Vh結(jié)構(gòu)域(即能夠與Vl結(jié)構(gòu)域一起組裝為功能抗原結(jié)合位點(diǎn))的特征或具有\(zhòng)結(jié)構(gòu)域(即能夠與Vh結(jié)構(gòu)域一起組裝為功能抗原結(jié)合位點(diǎn))的特征并由此提供該特性的多肽。術(shù)語(yǔ)"完整抗體"意指由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的抗體。"完整抗體重鏈"是這樣的多肽，其在N-端到C-端方向上由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)、抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域I (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)(HR)、抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)組成，縮寫(xiě)為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;并且在IgE亞類的抗體的情形中，任選地還包括抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域4 (CH4)。優(yōu)選地"完整抗體重鏈"是在N-端到C-端方向上由VH、CHl、HR、CH2和CH3組成的多肽。"完整抗體輕鏈"是在N-端到C-端方向上由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成的多肽，縮寫(xiě)為VL-CL。所述抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)可以是K (kappa)或λ (lambda)。完整抗體鏈通過(guò)在CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間(即輕鏈和重鏈之間)的多肽間二硫鍵和完整抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的多肽間二硫鍵連接在一起。典型的完整抗體的實(shí)例是天然抗體如IgG(例如，IgGl和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE)。根據(jù)本發(fā)明的完整抗體可以來(lái)自單一物種，例如人，或者它們可以是嵌合的或人源化的抗體。根據(jù)本發(fā)明的完整抗體包含分別由VH和VL對(duì)形成的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，這兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)都特異性地結(jié)合相同的抗原。所述完整抗體的重鏈或輕鏈的C-端意指在所述重鏈或輕鏈的C-端的最后一個(gè)氨基酸。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“鏈”指多肽鏈(例如，VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、抗體重鏈、抗體輕鏈、CHl-VH片段等)。如本文使用，"可變結(jié)構(gòu)域"(輕鏈(VL)可變結(jié)構(gòu)域，重鏈(VH)的可變結(jié)構(gòu)域)意指直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈對(duì)?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)框架(FR)區(qū)，所述框架區(qū)的序列是普遍保守的，其通過(guò)3個(gè)"高變區(qū)"(或互補(bǔ)性決定區(qū)，⑶Rs)相連接。框架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象且⑶R可以形成連接β_折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過(guò)框架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)并與來(lái)自另一條鏈的CDR —起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力方面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個(gè)目的。例如，術(shù)語(yǔ)VH1結(jié)構(gòu)域指第一抗體結(jié)合第一(I)抗原的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，和術(shù)語(yǔ)VL1結(jié)構(gòu)域指所述第一抗體結(jié)合所述第一抗原的相應(yīng)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)(HVR)"或"抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點(diǎn)"指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來(lái)自"互補(bǔ)性決定區(qū)"或"CDRs"的氨基酸殘基。"框架"或"FR"區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。各條鏈上的⑶R通過(guò)此種框架氨基酸分開(kāi)。特別地，重鏈的⑶R3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。按照 Kabat,等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5 版，Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda,MD (1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義確定⑶R和FR區(qū)域。如在本文使用，術(shù)語(yǔ)"結(jié)合"或"其結(jié)合"指在體外測(cè)定法中，優(yōu)選地在用純化的野生型抗原的等離振子共振測(cè)定(BIAcore, GE-Healthcare Uppsala,瑞典)中，抗體與抗原的表位的結(jié)合。結(jié)合親和力由Kd ( = kD/ka)值定義。Ka是來(lái)自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的締合的速率常數(shù)，kD是解離常數(shù)?？贵w特異性指抗體對(duì)于抗原的特定表位的選擇性識(shí)別。天然抗體，例如是單特異性的。雙特異性抗體是具有兩種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。如果抗體具有一種以上的特異性，所識(shí)別的表位可以與單抗原或一種以上的抗原締合。如本文使用，術(shù)語(yǔ)"單特異性"抗體意指具有一個(gè)或多個(gè)分別結(jié)合于相同抗原的相同表位的結(jié)合位點(diǎn)的抗體。如在本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)"價(jià)"意指結(jié)合位點(diǎn)在抗體分子上存在的具體數(shù)量。例如，天然抗體或根據(jù)本發(fā)明的完整抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)并且是二價(jià)的。如此，術(shù)語(yǔ)"三價(jià)"意指在抗體分子中存在三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)?！胺蛛x的”抗體是被從其天然環(huán)境的組分中分離的抗體。在一些實(shí)施方式中，如通過(guò)例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細(xì)管電泳)或色譜(例如離子交換或反相HPLC)測(cè)定，抗體被純化至高于95%或99%純度。對(duì)于評(píng)估抗體純度的方法的綜述，參見(jiàn)，例如 Flatman, S.，等人，J. Chromatogr. B848 (2007) 79-87?！胺蛛x的”核酸指從其天然環(huán)境的組分中被分離出來(lái)的核酸分子。分離的核酸包括包含在通常含有核酸分子的細(xì)胞中的核酸分子，但是該核酸分子存在于染色體外或在不同于其天然染色體位置的 染色體位置處。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指獲自基本上均一的抗體群體的抗體，即包括個(gè)體抗體群體是相同的和/或結(jié)合相同表位，只是除了可能的變體抗體，例如含有天然發(fā)生的突變或在生產(chǎn)單克隆抗體制品時(shí)產(chǎn)生，這樣的變體通常以小量存在。與通常包括針對(duì)于不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品不同，單克隆抗體制品的各單克隆抗體針對(duì)于抗原上的單個(gè)決定簇。因此，修飾“單克隆”表示抗體的特性為獲自基本上均一的抗體群體，而不被認(rèn)為需要通過(guò)任何特殊方法生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明待使用的單克隆抗體可通過(guò)多種技術(shù)來(lái)制造，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法以及利用含有所有或部分的人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，此類方法和其他用于制造單克隆抗體的示例性方法描述于此。術(shù)語(yǔ)“嵌合”抗體指一種抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈源自特定來(lái)源或物種，而其余的重鏈和/或輕鏈源自不同的來(lái)源或物種?！叭嗽椿笨贵w指包括來(lái)自非人HVRs的氨基酸殘基和來(lái)自人FRs的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方式中，人源化抗體將包括至少一種以及通常兩種可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中所有或者基本上所有的HVRs (例如CDRs)對(duì)應(yīng)于那些非人抗體，并且所有或者基本上所有的FRs對(duì)應(yīng)于那些人抗體。人源化抗體任選地可包括至少一部分源自人抗體的抗體恒定區(qū)?？贵w，例如非人抗體的“人源化形式”，指經(jīng)歷人源化的抗體。抗體的“類別”指被其重鏈所擁有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。有五種主要的抗體類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且這些中的一些可以被進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGp IgG2, IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同免疫球蛋白類別的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α、6、ε、Y和μ?！叭丝贵w”是這樣一種抗體，其擁有對(duì)應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生的抗體或源自利用人抗體所有組成成分或其他人抗體編碼序列衍生自非人來(lái)源的氨基酸序列。這一人抗體的定義尤其排除了包括非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?！癋v片段”是由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)組成的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)`本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于第二抗體是完整抗體；以及VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體的第一重鏈的C-端，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體的第二重鏈的C-端。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于從C-到N-端包括下列多肽鏈-一條 VH1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈-兩條CL-VL2 鏈-一條 VL1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈(也參見(jiàn)圖2a的示例性方案)為了提高所述雜二聚雙特異抗體的產(chǎn)量，完整抗體的CH3結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)“突起到孔”技術(shù)而改變，該技術(shù)以若干實(shí)例詳細(xì)描述于例如W096/027011，Ridgway, J. B.，等人，Protein Eng9 (1996) 617-621 jPMerchant，A. Μ·，等人，Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681 在這一方法中，兩CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面改變以增加含有這兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)可以是“突起”，而另一個(gè)是“孔”。二硫橋的引入進(jìn)一步穩(wěn)定了異二聚體(Merchant, A. M.,等人，NatureBiotechl6 (1998) 677-681 ；Atwell, S.，等人，J. Mol. Biol. 270(1997)26-35)并增加產(chǎn)量。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述雙特異性抗體的特征還在于完整抗體的重鏈的第一 CH3結(jié)構(gòu)域和完整抗體的第二 CH3結(jié)構(gòu)域各在下述界面處相遇，該界面包括了抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面中的改變；其中i)在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中，氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生突出(“突起”)，所述突出可定位在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中，和ii)在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中，氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生腔(“孔”)，其中第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突出可定位在所述腔內(nèi)。換句話說(shuō)，完整抗體的重鏈的第一 CH3結(jié)構(gòu)域和完整抗體的第二 CH3結(jié)構(gòu)域各在下述界面處相遇，該界面包括了抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面；其中改變所述界面以促進(jìn)雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于i)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，使得在所述雙特異抗體內(nèi)，在與另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面相遇的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面中，氨基酸殘基被具有更大側(cè) 鏈體積的氨基酸殘基替代，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生突出(“突起”)，所述突出可定位于另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中，和ii)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，使得在所述雙特異抗體內(nèi)，在與第一 CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面相遇的該第二 CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替代，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生腔(“孔”)，其中第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突出可定位在所述腔內(nèi)。優(yōu)選地，所述具有更大側(cè)鏈體積(“突起”)的氨基酸殘基選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴和色氨酸(W)。優(yōu)選地，所述具有更小側(cè)鏈體積(“孔”)的氨基酸殘基選自丙氨酸(A)、絲氨酸
(S)、蘇氨酸⑴和纈氨酸(V)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域都進(jìn)一步通過(guò)在每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的位置處引入半胱氨酸(C)殘基來(lái)改變以便可以形成在CH3結(jié)構(gòu)域之間的二硫橋。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體包括在"突起鏈(knobs chain)"的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變，和在"孔鏈(hole chain)"的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S、L368A、Y407V突變。還可以使用另外的在CH3結(jié)構(gòu)域之間的鏈間二硫橋(Merchant，A. Μ.，等人，Nature Biotechl6 (1998) 677-681)，例如通過(guò)在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中引入Y349C突變，在"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中引入E356C突變或S354C突變來(lái)進(jìn)行。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體包括在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C、T366W突變，在該兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中的E356C、T366S、L368A、Y407V突變，或所述雙特異性抗體包括在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C、T366W突變，在該兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變(在一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的另外的Y349C突變和在另一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的另外的E356C或S354C突變，形成鏈間二硫橋)(編號(hào)總是根據(jù)Kabat的EU索引進(jìn)行)。然而還可以替代地或另外地使用如由EP I 870 459A1所述的其它突起到孔中技術(shù)。關(guān)于所述雙特異性抗體的優(yōu)選實(shí)例是在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ;K370E突變和在"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變(編號(hào)總是根據(jù)Kabat的EU索引進(jìn)行)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體包括在“突起鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和在“孔鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S、L368A、Y407V突變以及另外地，在“突起鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔鏈”中的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體包括在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C、T366W突變和在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變或者所述雙特異性抗體包括在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C、T366W突變和在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中的S354C、T366S、L368A、Y407V突變以及另外的在“突起鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ；K370E突變和在“孔鏈”中的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ；E357K突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突出包括引入的精氨酸(R)殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突出包括引入的苯丙氨酸(F)殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突出包括引入的酪氨酸(Y)殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突出包括引入的色氨酸(W)殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腔通過(guò)引入的丙氨酸(A)殘基來(lái)形成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腔通過(guò)引入的絲氨酸(S)殘基來(lái)形成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腔通過(guò)引入的蘇氨酸(T)殘基來(lái)形成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腔通過(guò)引入的纈氨酸(V)殘基來(lái)形成。優(yōu)選地，此種雙特異性抗體的特征在于VH1結(jié)構(gòu)域和VL1結(jié)構(gòu)域`a)通過(guò)二硫橋；和/或b)通過(guò)CHl結(jié)構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域(使得VH1和VL1結(jié)構(gòu)域是Fab片段的部分)而穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于從C-到N-端包括下列多肽鏈-一條 CHl-VH1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈-兩條CL-VL2 鏈-一條 CL-VL1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈(也參見(jiàn)圖2b的示例性方案)在本發(fā)明的一個(gè)方面，在根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體中，Vtf/VL1結(jié)構(gòu)域或VH2/VL2結(jié)構(gòu)域(如果存在)可以被二硫化物穩(wěn)定，(優(yōu)選當(dāng)沒(méi)有CHl和CL結(jié)構(gòu)域在其各自的C-端融合時(shí))。此種Vtf/VL1結(jié)構(gòu)域或VH2/VL2結(jié)構(gòu)域的二硫化物穩(wěn)定是通過(guò)在Vtf/VL1或VH2/VL2可變結(jié)構(gòu)域之間引入二硫鍵而實(shí)現(xiàn)的并且描述于，例如，在例如 W094/029350，US5, 747，654，Rajagopal，V.，等人，Prot. Engin.(1997) 1453-1459 ；Reiter, Y.，等人，Nature BiotechnologyH (1996) 1239-1245 ；Reiter,Y·，等人，Protein Engineerings(1995) 1323-1331 ；ffebber, Κ.0.,等人，MolecularImmunology32(1995)249-258 ；Reiter. Y.,等人，Immunity 2(1995)281-287 ;Reiter，Y.,等人，JBC269 (1994) 18327-18331 ；Reiter, Y.,等人，International Journal ofCancer58(1994) 142-149 ;或 Reiter, Y.，Cancer Research54(1994)2714-2718。在二硫鍵穩(wěn)定性Fv的一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的抗體中包括的Fv的可變結(jié)構(gòu)域(Vtf/VL1或VH2/VL2)之間的二硫鍵對(duì)于每個(gè)Fv獨(dú)立地選自i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置101至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100。在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的抗體中包括的Fv的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵是在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，根 據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于第二抗體是Fv片段；以及VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體Fv片段的第一鏈的C-端，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體的Fv片段的第二鏈的C-端。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于第一抗體是完整抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于從C-到N-端包括下列多肽鏈a)-兩條 CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-VH2 鏈-兩條CL-VL1-肽接頭-VL2-鏈；或b)-兩條 CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-VL2 鏈-兩條CL-VL1-肽接頭-VH2鏈(也參見(jiàn)圖2c的示例性方案) 在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過(guò)二硫橋穩(wěn)定。“Fab片段”由兩條多肽鏈組成，第一鏈由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體恒定結(jié)構(gòu)域I (CHl)組成，而第二鏈由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成(分別從N到C-端方向)。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于第二抗體是Fab片段；以及VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體Fab片段的第一鏈的C-端，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體的Fab片段的第二鏈的C-端。因此VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的C-端，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體的CL結(jié)構(gòu)域的C-端；或VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體的CL結(jié)構(gòu)域的C-端，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體的CH結(jié)構(gòu)域的C-端。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于第一抗體是完整抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于從C-到N-端包括下列多肽鏈a)-兩條 CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-CH1-VH2 鏈
-兩條CL-VL1-肽接頭-CL-VL2-鏈；或b)-兩條 CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-CL-VL2 鏈-兩條CL-VL1-肽接頭-CHl-VH2-鏈(也參見(jiàn)圖2d的示例性方案)在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征在于第一抗體是Fv片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，此種雙特異性抗體的特征還在于從C-到N-端包括下列多肽鏈 a)- 一條 VH1-肽接頭-CHl-VH2 鏈-一條VL1-肽接頭-CL-VL2 鏈；或b)- 一條 VH1-肽接頭-CL-VL2 鏈-一條 VL1-肽接頭-CHl-VH2 鏈(也參見(jiàn)圖2e的示例性方案)如本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“肽接頭 ”指具有氨基酸序列的肽，例如合成來(lái)源的。優(yōu)選地，下面的所述肽接頭是具有長(zhǎng)度為至少5個(gè)氨基酸的氨基酸序列的肽，優(yōu)選地長(zhǎng)度為5至100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地長(zhǎng)度為10至50個(gè)氨基酸。取決于不同抗原或不同表位，接頭長(zhǎng)度可以變化以便在蛋白酶切割前，相比于蛋白酶切割位點(diǎn)被切割的相應(yīng)的雙特異性抗體，第一的結(jié)合親和力降低5倍或更多(在一個(gè)實(shí)施方式中，10倍或更多，在一個(gè)實(shí)施方式中，20倍或更多)。在一個(gè)實(shí)施方式中，相比于蛋白酶切割位點(diǎn)被切割的相應(yīng)的雙特異性抗體，該雙特異性抗體與第一抗原的結(jié)合親和力降低5倍和1000倍之間(優(yōu)選10倍和1000倍之間，優(yōu)選10倍和500倍之間)。肽接頭的每個(gè)末端綴合一條多肽鏈(例如，VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、抗體重鏈、抗體輕鏈、CHl-VH鏈等)。在根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體中的肽接頭之一不包括蛋白酶切割位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述沒(méi)有蛋白酶切割位點(diǎn)的肽接頭是例如(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S =絲氨酸,并且(X = 3, η = 3、4、5 或 6,并且 m = 0、l、2 或 3)或(x = 4,n = 2、3、4、5 或6,并且 m = 0、1、2 或 3),優(yōu)選地，X = 4 且 η = 2、3、4、5 或 6,并且 m = O。在根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體中的另一肽接頭包括腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶切割位點(diǎn)。通常，在肽接頭內(nèi)的蛋白酶切割位點(diǎn)是被蛋白酶切割的氨基酸序列或基序。用于不同蛋白酶的天然或人工的蛋白酶切割位點(diǎn)描述于，例如Database,Vol. 2009,Article IDbap015, doi 10. 1093/database/bap015 以及所參考的 MEROPS 妝數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //meroDs.sanger. ac. uk/)。如本文使用的“腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶切割位點(diǎn)”指被腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶(或肽酶)切割的氨基酸序列或基序。術(shù)語(yǔ)“腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶”指在(例如腫瘤組織的)腫瘤區(qū)或炎癥區(qū)的表達(dá)水平比在(例如相應(yīng)正常組織的)無(wú)腫瘤-或無(wú)炎癥-區(qū)的各表達(dá)水平高。典型的腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶描述于，例如表I以及(表I中所示的)相應(yīng)的文獻(xiàn)中如本文使用的術(shù)語(yǔ)蛋白酶或肽酶是可互換的。C =癌癥；1 =炎癥表1:腫瘤-和/或炎癥-特異性蛋白酶
權(quán)利要求
1.雙特異性抗體，其包含 a)結(jié)合第一抗原并包括VH1結(jié)構(gòu)域和VL1結(jié)構(gòu)域的第一抗體，和 b)結(jié)合第二抗原的第二抗體， 其中VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一肽接頭而N-端融合第二抗體，并且VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二肽接頭而N-端融合第二抗體，和 其特征在于一個(gè)接頭包括腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶切割位點(diǎn)，并且另一接頭不包括蛋白酶切割位點(diǎn)；和 相比于蛋白酶切割位點(diǎn)被切割的相應(yīng)雙特異性抗體，所述雙特異性抗體與第一抗原的結(jié)合親和力降低5倍或更多。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其特征在于 第二抗體是完整抗體；和 VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體的第一重鏈的C-端，并且 VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體的第二重鏈的C-端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的雙特異性抗體，其特征在于從C-到N-端包括下列多肽鏈 -一條 VH1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈 -兩條CL-VL2鏈 -一條 VL1-肽接頭-CH3-CH2-CH1-VH2 鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的雙特異性抗體，其特征在于 完整抗體的重鏈的第一 CH3結(jié)構(gòu)域和完整抗體的第二 CH3結(jié)構(gòu)域各自在下述界面相遇，所述界面包含在抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面中的改變； 其中i)在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中， 氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生突出，所述突出可定位在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中， 和 )在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中， 氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基所替代，由此在第二 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生腔，其中第一 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的突出可定位在所述腔內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的雙特異性抗體，其特征在于 所述具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)，并且所述具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和纈氨酸(V)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的雙特異性抗體，其特征在于 兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域都進(jìn)一步通過(guò)在每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的位置引入半胱氨酸(C)殘基來(lái)進(jìn)行改變以便能形成在CH3結(jié)構(gòu)域之間的二硫橋。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的雙特異性抗體，其特征在于 VH1結(jié)構(gòu)域和VL1結(jié)構(gòu)域 a)通過(guò)二硫橋；和/或 b)通過(guò)CHl結(jié)構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域而穩(wěn)定。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其特征在于第二抗體是Fv片段；以及 VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體Fv片段的第一鏈的C-端，并且 VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體的Fv片段的第二鏈的C-端。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的雙特異性抗體，其特征在于第一抗體是完整抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的雙特異性抗體，其特征在于從C-到N-端包括下列多肽鏈 a)-兩條CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-VH2 鏈 -兩條CL-VL1-肽接頭-VL2-鏈；或 b)-兩條CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-VL2 鏈 -兩條CL-VL1-肽接頭-VH2鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10的雙特異性抗體，其特征在于 VH2結(jié)構(gòu)域和VL2結(jié)構(gòu)域通過(guò)二硫橋穩(wěn)定。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其特征在于 第二抗體是Fab片段；以及 VH1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第一接頭而N-端融合第二抗體Fab片段的第一鏈的C-端，并且 VL1結(jié)構(gòu)域通過(guò)第二接頭而N-端融合第二抗體的Fab片段的第二鏈的C-端。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的雙特異性抗體，其特征在于 第一抗體是完整抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的雙特異性抗體，其特征在于從C-到N-端包括下列多肽鏈 a)-兩條CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-CHl-VH2 鏈 -兩條CL-VL1-肽接頭-CL-VL2-鏈；或 b)-兩條CH3-CH2-CH1-VH1-肽接頭-CL-VL2 鏈 -兩條CL-VL1-肽接頭-CHl-VH2-鏈。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的雙特異性抗體，其特征在于 第一抗體是Fv片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的雙特異性抗體，其特征在于從C-到N-端包括下列多肽鏈 a)-一條 VH1-肽接頭-CHl-VH2 鏈 -一條VL1-肽接頭-CL-VL2鏈；或 b)-一條VH1-肽接頭-CL-VL2鏈 -一條VL1-肽接頭-CHl-VH2鏈。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其特征在于 相比于蛋白酶切割位點(diǎn)被切割的相應(yīng)雙特異性抗體，所述雙特異性抗體與第一抗原的結(jié)合親和力降低10倍或更多。
18.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體，其用于治療癌癥。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體，其用于治療炎癥。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體在制造用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體在制造用于治療炎癥的藥物中的應(yīng)用。
23.治療罹患癌癥的患者的方法，所述方法通過(guò)向需要此類治療的患者施用根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體。
24.治療罹患炎癥的患者的方法，所述方法通過(guò)向需要此類治療的患者施用根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙特異性抗體，其中對(duì)兩種抗原之一的結(jié)合親和力降低并且可通過(guò)腫瘤-或炎癥-特異性蛋白酶來(lái)活化；以及此類雙特異性抗體的制備和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/00GK103068847SQ201180040716
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者U·布林克曼, R·克羅斯代爾, S·麥茨, J·M·尚策, C·蘇斯特曼, P·烏馬納 申請(qǐng)人:羅切格利卡特公司