專利名稱：用于牛粒細胞集落刺激因子及其變體的制劑的制作方法
用于牛粒細胞集落刺激因子及其變體的制劑粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是生長激素超基因家族的成員。G-CSF刺激特定的骨髓前體細胞的增殖和它們分化為粒細胞。此外，G-CSF是中性粒細胞增殖和體內(nèi)成熟的有效刺激(Cohen 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1., 1987 ；84: 2484-2488 ;還參見 Heidari等人，Vet.Tmmol.1munopathol.2001 ;81:45-57)。G-CSF還能夠誘導(dǎo)體外成熟中性粒細胞的功能激活或者“引發(fā)” (ffeisbart, R.H.等人,Annals of Internal Medicine 1989 ；110:297-303)。G-CSF已被證明引發(fā)人粒細胞并且增加由趨化肽N-甲?；?甲硫氨酰基-亮氨?；?苯丙氨酸刺激的超氧化物釋放(S.Kitagawa,等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1987 ; 144:1143-1146 和 C.F.Nathan, Blood 1989 ;74:301-306)并且被證明激活人中性粒細胞IgA介導(dǎo)的吞噬作用(Weisbart，R.H.，等人，Nature 1988 ；332:647-649)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)G-CSF在治療其中中性粒細胞的增加將提供益處的適應(yīng)癥中是有用的。G-CSF單獨地或與其它化合物(例如其它細胞因子)結(jié)合也可用于培養(yǎng)中的細胞的生長或擴增，例如用于骨髓移植。重組人G-CSF (hG-CSF)的cDNA克隆和表達已被描述，并且重組hG_CSF顯示天然分子的大多數(shù)，即使不是全部的生物學(xué)特性。(Souza, L.等人，Science 232，61-65(1986))。cDNA和基因組DNA克隆的序列分析允許氣基酸序列的減除并且表明蛋白質(zhì)是具有30個氨基酸信號序列的204個氨基酸長。成熟蛋白質(zhì)是174個氨基酸長并且不具有潛在的N-連接糖基化位點但具有幾個用于O-連接糖基化的可能位點。包含hG-CSF的藥物制劑在本領(lǐng)域是已知的并且包括許多制劑。例如，hG-CSF的多種制劑描述在 Piedmonte 等人，Advanced Drug Delivery Reviews, 60: 50-58 (2008),Herman 等人，F(xiàn)ormulation, Characterization, and Stability of Protein Drugs,Rodney Pearlman 和 Y.John Wang 編輯，Plenum Press, New York (1996), Michaelis 等人的第5，919，757號美國專利和Sato等人的第6，908，610號美國專利中。通常，表面活性劑包含在hG-CSF制劑中并且可在潛在地不穩(wěn)定界面處保護hG-CSF免受加工過程中接觸的表面的影響并且免受其構(gòu)象穩(wěn)定性改變的影響。還描述了重組牛G-CSF (bG-CSF)的cDNA克隆和表達。例如，成熟bG_CSF的多核苷酸和多肽序列在第5，849，883號美國專利中提供，其還描述了克隆、分離和純化多肽及其類似物的方法。成熟bG-CSF的長度為174個氨基酸并且具有與hG-CSF的82%同源性。Heidari等人在上面描述了 bG_CSF的表達、純化和生物活性。向牛給予bG-CSF能提供治療益處。因此，包含bG-CSF的藥物制劑適用于利用其治療潛能。然而，根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法開發(fā)的bG-CSF藥物制劑導(dǎo)致不期望的產(chǎn)品性質(zhì)，例如bG-CSF多肽和/或制劑的聚集和不穩(wěn)定。
因此，亟需具有期望性質(zhì)如最小的產(chǎn)品聚集和不穩(wěn)定性質(zhì)的穩(wěn)定的bG-CSF藥物制劑。因此，本發(fā)明提供了具有bG-CSF多肽或其變體的穩(wěn)定的水性藥物制劑，其顯示期望的性質(zhì)并且還提供了相關(guān)優(yōu)點。本發(fā)明提供了包含bG-CSF多肽或其變體、緩沖物質(zhì)和賦形劑的穩(wěn)定的水性制劑，其中所述制劑基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。本發(fā)明還提供了使用所述制劑的凍干形式或粉末形式的方法以及制備所述制劑的方法。本發(fā)明的牛粒細胞集落刺激因子(“bG-CSF”)的穩(wěn)定的水性制劑包含bG-CSF多肽或其變體。如本文使用的，“牛G-CSF多肽”(或者稱為“bG-CSF多肽”、“牛G-CSF”或“ bG-CSF，，)及其變體應(yīng)包括具有CSF、bG-CSF類似物、bG-CSF突變體、改變糖基化的bG-CSF、PEG共軛bG-CSF、bG·-CSF亞型、bG-CSF模擬物、bG-CSF片段、混合bG-CSF蛋白質(zhì)、其融合蛋白質(zhì)、低聚物和多聚物、同系物、糖基化模型變體、變體、剪接變體和突變蛋白質(zhì)的至少一種生物活性的那些多肽和蛋白質(zhì)，不管相同的生物活性并且還不管其合成或制備方法，所述合成或制備方法包括但不限于通過顯微注射核酸分子進行的體外、體內(nèi)重組(不論從cDNA、基因組DNA、合成DNA或核酸的其它形式制備的)，合成、轉(zhuǎn)基因和基因激活方法。此夕卜，術(shù)語bG-CSF多肽或其變體包括包含一個或多個氨基酸替換、添加或刪除的bG-CSF多肽。參見第5，849，883號美國專利，例如牛G-CSF的類似物。長度為174個氨基酸的成熟bG-CSF多肽的序列如下:
TPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCA
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SQLHRFLELAYRGLRYLAEP。此外，具有初始甲硫氨酸氨基酸殘基的bG-CSF多肽如下: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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ASQLHRFLELAYRGLRYLAEP。bG-CSF中許多氨基酸位置的替換已被描述。包括但不限于調(diào)節(jié)藥物穩(wěn)定性、增加激動劑活性、增加蛋白酶抗性、轉(zhuǎn)化多肽成為拮抗劑等的那些替換被術(shù)語bG-CSF多肽或其變體所包括。術(shù)語bG-CSF多肽或其變體還包括糖基化bG-CSF，例如但不限于在任何氨基酸位置處的多肽糖基化、多肽的N-連接糖基化形式或多肽的O-連接糖基化形式。包含單一核苷酸變化的變體也被認為是bG-CSF多肽的生物活性變體。包含單一核苷酸變化的變體也被認為是bG-CSF的生物活性變體。此外，還包括剪接變體。術(shù)語bG-CSF多肽或其變體還包括任何一種或多種bG-CSF的bG-CSF異源二聚體、同源二聚體、異源多聚體或同源多聚體，或任何其它多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、聚合物、小分子、連接物、配體或通過化學(xué)方法連接的或表達為融合蛋白質(zhì)的其它任何類型的活性分子(參見例如，第6，261，550號；第6，166，183號；第6，204，247號；第6，261，550號；和第6，017，876號美國專利)以及包含例如特定刪除或其它改變?nèi)员３稚锘钚缘亩嚯念愃莆?參見例如，第6，261，550號；第6，004，548號；和第6，632，426號美國專利)。bG-CSF多肽及其變體例如在第12/507，237號美國專利申請(現(xiàn)在的第2010/0035812號美國專利申請公開)中進行描述，其通過應(yīng)用并入本文。在一些實施方案中，將一個或多個非天然編碼的氨基酸并入bG-CSF中的一個或多個下列位置:8、62、69、125、133、136及其任意組合(成熟bG-CSF多肽或具有初始甲硫氨酸氨基酸殘基的bG-CSF多肽中相應(yīng)的氨基酸)。在一些實施方案中，非天然編碼的氨基酸對乙?；奖彼?PAF)在下列位置中的一個被天然編碼的氨基酸取代:S8、S62、L69、G125、T133、A136及其任意組合(成熟bG-CSF多肽或具有初始甲硫氨酸氨基酸殘基的bG-CSF多肽中相應(yīng)的氨基酸)。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_S8pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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TNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLV ASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中單一對乙酰基苯丙氨酸(pAF)替換在位置S8處進行。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_S62pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙?；奖彼?pAF)替換在位置S62處進行。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-L69pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙?；奖彼?pAF)替換在位置L69處進行。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_G125pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙酰基苯丙氨酸(pAF)替換在位置G125處進行。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_T133pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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ASQLHRFLELAYRGLRYLAEP其中單一對乙?；奖彼?pAF)替換在位置T133處進行。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_A136pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙?；奖彼?pAF)替換在位置A136處進行。本發(fā)明的制劑能包含與連接物、聚合物或生物活性分子連接的bG-CSF多肽或其變體。連接物、聚合物和生物活性分子在第12/507,237號美國專利申請(現(xiàn)在的第2010/0035812號美國專利申請公開)中進行描述。本文使用的術(shù)語“連接基團(linkage)”或“連接物”是指通常由于化學(xué)反應(yīng)而形成并且通常為共價連接的基團或鍵。水解穩(wěn)定的連接基團是指連接基團在水中基本上穩(wěn)定并且在有效的PH值下不與水反應(yīng)，其包括但不限于在生理學(xué)條件下不與水反應(yīng)達延長的時間段，可能甚至是無限期的。水解不穩(wěn)定或可降解的連接基團是指連接基團在水中或在包括例如血液的水性溶液中是可降解的。酶不穩(wěn)定或可降解的連接基團是指連接基團可被一種或多種酶降解。如本領(lǐng)域所理解的，PEG和相關(guān)聚合物可在聚合物骨架中包括可降解的連接基團或在聚合物骨架和聚合物分子的一個或多個末端官能團之間的連接物基團中包括可降解的連接基團。例如，通過PEG甲酸或活性PEG甲酸與生物活性劑上的醇基團反應(yīng)形成的酯連接基團通常在生理學(xué)條件下水解以釋放試劑。其它水解可降解的連接基`團`包括但不限于碳酸酯連接基團；由胺和醛的反應(yīng)產(chǎn)生的亞胺連接基團；通過使醇與磷酸鹽基團反應(yīng)形成的磷酸酯連接基團；為酰肼和醛的反應(yīng)產(chǎn)物的腙連接基團；為醛和醇的反應(yīng)產(chǎn)物的縮醛連接基團；為甲酸和醇的反應(yīng)產(chǎn)物的原酸酯連接基團；包括但不限于在聚合物如PEG的末端通過胺基團和肽的羧基形成的肽連接基團；以及包括但不限于在聚合物的末端通過亞磷酰胺基團和寡核苷酸的5’羥基形成的寡核苷酸連接基團。在一些實施方案中，bG-CSF多肽或其變體與水溶性聚合物連接。如本文使用的，術(shù)語“水溶性聚合物”是指溶于水性溶劑的任何聚合物。水溶性聚合物與bG-CSF多肽或其變體的連接能產(chǎn)生改變，其包括但不限于增加或調(diào)節(jié)血清半衰期、相對于未改進形式增加或調(diào)節(jié)治療半衰期、調(diào)節(jié)免疫原性、調(diào)節(jié)物理結(jié)合特性如聚集和多聚體形成、改變受體結(jié)合、改變與一種或多種結(jié)合伴侶的結(jié)合以及改變受體二聚或多聚。水溶性聚合物可能具有或可能不具有其自身的生物活性并且可被用作用于連接bG-CSF與其它物質(zhì)的連接物，其包括但不限于一種或多種bG-CSF多肽或其變體，或者一種或多種生物活性分子。合適的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單Cl-ClO烷氧基或芳氧基衍生物(在第5，252，714號美國專利中描述)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基醇、聚氨基酸、二乙烯基醚馬來酸酐、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、包括硫酸葡聚糖的葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包括但不限于甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亞烷基二醇及其衍生物、聚亞烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬酰胺等或其混合物。這類水溶性聚合物的實例包括但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。WO 03/074087和WO 03/074088描述了蛋白質(zhì)或小分子與羥基烷基淀粉(HAS)的結(jié)合。羥基烷基淀粉的實例包括但不限于羥基乙基淀粉。羥基烷基淀粉和另一分子的結(jié)合，例如，可包含HAS的末端醛基團和其它分子的反應(yīng)基團之間的共價連接基團。在一些實施方案中，水溶性聚合物為聚(乙二醇)部分。在一些實施方案中，聚(乙二醇)部分具有約0.1 kDa至約100 kDa的分子量。在另一實施方案中，水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa的分子量。在一些實施方案中，水溶性聚合物具有約10 kDa至約30 kDa的分子量。在另一實施方案中，水溶性聚合物具有約15 kDa至約25 kDa的分子量。在另一實施方案中，水溶性聚合物具有約20 kDa的分子量。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解基于所述部分的規(guī)格和多分散性具有“約20 kDa”的分子量的水溶性聚合物包括約15%的分子量的可變性(即，約17 kDa至約23 kDa)。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_S8pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙?；奖彼?pAF)替換在位置S8處進行并且與聚(乙二醇)部分連接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有約20 kDa的分子量，則在該實施方案中的bG-CSF多肽或其變體能被認為是“bG-CSF-S8pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分與在位置S8處進行的pAF替換連接。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_S62pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC AAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCL
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其中單一對乙酰基苯丙氨酸(pAF)替換在位置S62處進行并且與聚(乙二醇)部分連接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有約20 kDa的分子量，則在該實施方案中的bG-CSF多肽或其變體能被認為是“bG-CSF-S62pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分與在位置S62處進行的pAF替換連接。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_L69pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙?；奖彼?pAF)替換在位置L69處進行并且與聚(乙二醇)部分連接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有約20 kDa的分子量，則在該實施方案中的bG-CSF多肽或其變體能被認為是“bG-CSF-L69pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分與在位置L69處進行的pAF替換連接。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_G125pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙?；奖彼?pAF)替換在位置G125處進行并且與聚(乙二醇)部分連接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有約20 kDa的分子量，則在該實施方案中的bG-CSF多肽或其變體能被認為是“bG-CSF-G125pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分與在位置G125處進行的pAF替換連接。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_T133pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙酰基苯丙氨酸(pAF)替換在位置T133處進行并且與聚(乙二醇)部分連接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有約20 kDa的分子量，則在該實施方案中的bG-CSF多肽或其變體能被認為是“bG-CSF-T133pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分與在位置T133處進行的pAF替換連接。在一個實施方案中，bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF_A136pAF，其具有下列序列: MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLC
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其中單一對乙?；奖彼?pAF)替換在位置A136處進行并且與聚(乙二醇)部分連接。例如，如果聚(乙二醇)部分具有約20 kDa的分子量，則在該實施方案中的bG-CSF多肽或其變體能被認為是“bG-CSF-A136pAF-20K PEG”，表明20 kDa聚(乙二醇)部分與在位置A136處進行的pAF替換連接。如本文使用的，在包含bG-CSF多肽或其變體的制劑的上下文中術(shù)語“穩(wěn)定性”和“穩(wěn)定的”是指在給定的制造、準(zhǔn)備、運輸和儲存條件下，bG-CSF多肽或其變體的熱和化學(xué)解折疊、聚集、降解、變性、斷裂或不穩(wěn)定。本發(fā)明“穩(wěn)定的”制劑保持結(jié)構(gòu)完整，其導(dǎo)致生物活性的保留，期望在給定的制造、準(zhǔn)備、運輸和儲存條件下為大于80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%。能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文進一步描述的方法由聚集、去聚乙二醇化、降解、變性或斷裂的程度評價制劑的穩(wěn)定性。如本文使用的，包含bG-CSF多肽或其變體的制劑的上下文中的術(shù)語“水性”是指水、一種或多種水溶性有機溶劑或其混合物。以其常規(guī)意義在本文使用的術(shù)語“有機溶劑”是指液體有機化合物，通常為液體形式的單體有機材料，優(yōu)選為相對無粘性的液體，其分子結(jié)構(gòu)包含氫原子、碳原子和任選其它原子，并且其能夠溶解固體、氣體或液體。本發(fā)明的藥物制劑可包含藥物可接受的載體。藥物可接受的載體部分地通過被給予的特定組合物以及通過用于給予組合物的特定方法決定(參見例如，Remington’ sPharmaceutical Sciences,第17版，1985))。合適的藥物可接受的載體包括但不限于緩沖物質(zhì)和賦形劑，例如包含鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或其組合的那些。合適的載體能為包含琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、組氨酸、咪唑、醋酸鹽、碳酸氫鹽和其它有機酸的緩沖物質(zhì)。合適的載體能為賦形劑，其包含多元糖醇，氨基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等，有機糖或糖醇如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α - 一硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即，<10殘基)；蛋白質(zhì)如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮；單糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如蜜三糖和多糖如葡聚糖。根據(jù)本發(fā)明，檸檬酸鹽、組氨酸、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽或其組合能用作緩沖物質(zhì)。在一些實施方案中，在穩(wěn)定的水性制劑中檸檬酸鹽或琥珀酸鹽用作緩沖物質(zhì)。在一些實施方案中，緩沖物質(zhì)具有約10 mM至約50 mM的摩爾濃度。在一個實施方案中，緩沖物質(zhì)具有約30 mM的摩爾濃度。緩沖物質(zhì)能以相應(yīng)游離酸的形式或以堿、堿土或銨鹽的形式存在。此外，制劑還能包含常見藥物輔助物質(zhì)。在制備液體藥物制劑過程中添加各種輔助物質(zhì)的順序或者添加活性物質(zhì)的順序很大程度上獨立于根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的儲存中的穩(wěn)定效應(yīng)并且由本領(lǐng)域技術(shù)人員自 由裁定。根據(jù)本發(fā)明，氯化鈉、海藻糖、山梨醇、精氨酸或其組合能用作賦形劑。在一個實施方案中，賦形劑為精氨酸。在一些實施方案中，精氨酸具有約100 mM至約500 mM的摩爾濃度。在其它實施方案中，精氨酸具有約200至約300 mM的摩爾濃度。在一些實施方案中，精氨酸具有約250 mM的摩爾濃度。通常，蛋白質(zhì)的藥物制劑包含表面活性劑。表面活性劑的內(nèi)含物可在潛在不穩(wěn)定界面處保護蛋白質(zhì)免受加工過程中接觸的表面的影響并且免受其熱力學(xué)構(gòu)象穩(wěn)定性改變的影響。表面活性劑是本領(lǐng)域熟知的，例如聚山梨醇酯表面活性劑。聚山梨醇酯表面活性劑的一個實例為聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯，還稱為商標(biāo)名Tween 20 。然而，包含痕量水平的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯的bG-CSF制劑的研究表明在25°C下孵育5天后聚集體增加高至3.2% (如由尺寸排阻色譜(SEC)測定的)。因此，本發(fā)明的制劑基本上不含表面活性劑、聚山梨醇酯表面活性劑和/或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。如本文使用的，術(shù)語“基本上不含”表面活性劑、聚山梨醇酯表面活性劑和/或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯是指包含小于0.033%、小于0.001%、小于0.0005%、小于
0.0003%或小于0.0001%的表面活性劑、聚山梨醇酯表面活性劑和/或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯的制劑。本發(fā)明的制劑基本上不含表面活性劑、聚山梨醇酯表面活性劑和/或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯以實現(xiàn)具有期望性質(zhì)的穩(wěn)定的制劑，所述期望性質(zhì)例如最小的廣品聚集和最小的不穩(wěn)定以及在應(yīng)用時減少的去聚乙~■醇化。本文使用的術(shù)語“生物活性分子”是指可影響與有機體相關(guān)的生物系統(tǒng)、通路、分子或相互作用的任何物理或生物化學(xué)性質(zhì)的任何物質(zhì)，所述有機體包括但不限于病毒、細菌、噬菌體、轉(zhuǎn)位子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物和人。特別地，如本文使用的，生物活性分子包括但不限于意圖用于診斷、治愈、緩解、治療或預(yù)防人或其它動物的疾病的任何物質(zhì)，或者另外增強人或動物的身體健康或心理健康的任何物質(zhì)。生物活性分子的實例包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、酶、小分子藥物、疫苗、免疫原、硬藥、軟藥、碳水化合物、無機原子或分子、染料、脂質(zhì)、核苷、放射性核素、寡核苷酸、類毒素、毒素、原核細胞和真核細胞、病毒、多糖、核酸以及其得自或衍生自病毒、細菌、昆蟲、動物或任何其它細胞或細胞類型、脂質(zhì)體、微粒和膠束的部分。本發(fā)明的藥物制劑包括除了 bG-CSF多肽或其變體之外還任選包含一種或多種其它活性成分的那些。如本文使用的，術(shù)語“活性成分”或“治療成分”是指治療活性化合物及其任何前藥，和所述化合物和前藥的藥物可接受的鹽、水合物和溶劑化物。其它活性成分可與bG-CSF多肽或其變體組合并可單獨地或在相同的藥物制劑中給予?；谑褂胋G-CSF的治療，待給予的其它活性成分的量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。本發(fā)明的藥物制劑包括除了 bG-CSF多肽或其變體之外還任選包含一種或多種其它非活性成分的那些。如本 文使用的，術(shù)語“非活性成分”是指治療非活性化合物及其任何前藥，和所述化合物和前藥的藥物可接受的鹽、水合物和溶劑化物。其它非活性成分可與bG-CSF多肽或其變體組合并可單獨地或在相同的藥物制劑中給予?；谑褂胋G-CSF的治療，待給予的其它非活性成分的量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。穩(wěn)定的水性制劑中bG-CSF多肽或其變體的量足以實現(xiàn)治療作用。如本文使用的，術(shù)語“治療有效量”是指對動物產(chǎn)生期望益處的量并且包括治療和預(yù)防給藥二者。所述量因人而異并且依賴許多因素，包括患者的整體身體狀況和待治療的疾病狀態(tài)的根本原因。用于治療的bG-CSF多肽或其變體的量提供可接受的變化率并在有益水平下保持期望的反應(yīng)。本組合物的治療有效量可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員使用公共可利用的物質(zhì)和步驟容易地確定。例如，bG-CSF多肽或其變體的量能以約0.5至約12克/升，優(yōu)選約5克/升的量存在于制劑中。根據(jù)本發(fā)明，能在各個pH值下配制bG-CSF多肽或其變體的穩(wěn)定的水性制劑。在一些實施方案中，穩(wěn)定的水性制劑能具有約5.7至約6.6的pH值。在一個實施方案中，穩(wěn)定的水性制劑具有約6.0至約6.3的pH。通過添加堿如堿性氫氧化物、堿土氫氧化物和氫氧化銨調(diào)整制劑的期望的PH值。氫氧化鈉優(yōu)選用于pH調(diào)節(jié)。通過添加堿性溶液能基本上實現(xiàn)期望的PH值的調(diào)節(jié)。通常，能使用強堿與弱酸的鹽，例如醋酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀或碳酸鈉。如果輔助物質(zhì)的藥物溶液具有堿性PH值，則通過使用酸滴定來調(diào)整直至達到4-5或7-8的期望的pH范圍?？紤]生理學(xué)耐受的無機酸或有機酸作為酸，例如鹽酸、磷酸、醋酸、檸檬酸或具有酸性pH值的物質(zhì)的常規(guī)溶液。在該方面，一些示例性物質(zhì)為強酸與弱堿的鹽，例如磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀。如在下面實施例中顯示的，本發(fā)明的bG-CSF制劑在壓力貯存條件下和在加速貯存條件下顯示bG-CSF多肽或其變體的期望低的聚集體濃度。如本文使用的，在25°C下將制劑樣品孵育5天后評價壓力貯存條件。如本文使用的，在40°C下將制劑樣品孵育I天后評價加速貯存條件。為了本發(fā)明的目的，還能在其它各個溫度和持續(xù)時間下評價貯存條件。例如，能在25°C下將制劑樣品孵育28天后或在40°C下將制劑樣品孵育3天后評價貯存條件。在壓力貯存條件和加速貯存條件之后分析bG-CSF多肽或其變體的聚集體濃度。在一些實施方案中，本發(fā)明的bG-CSF制劑在壓力貯存條件下具有小于約2.1% (重量/重量百分比)的bG-CSF多肽或其變體的聚集體濃度。在其它實施方案中，本發(fā)明的bG-CSF制劑在壓力貯存條件下具有小于約L 5% (重量/重量百分比)的bG-CSF多肽或其變體的聚集體濃度。在一些實施方案中，本發(fā)明的bG-CSF制劑在加速貯存條件下具有小于約1.5%(重量/重量百分比)的bG-CSF多肽或其變體的聚集體濃度。在其它實施方案中，本發(fā)明的bG-CSF制劑在壓力貯存條件下具有小于約L 5% (重量/重量百分比)的bG-CSF多肽或其變體的聚集體濃度。此外，強制攪拌研究或凍融研究能用于評價本發(fā)明制劑的穩(wěn)定性性質(zhì)。例如，強制攪拌研究能由使用磁力攪拌器在設(shè)定速度如60 rpm下在玻璃燒杯中混合制劑樣品組成。攪拌能發(fā)生確定的時間，例如兩小時以確定制劑樣品的特性。凍融循環(huán)能由在約_75°C下將制劑樣品冷凍I小時并在室溫下融化約I小時直至觀察到?jīng)]有冰組成。此外，如在下面實施例中顯示的，在壓力貯存條件下和在加速貯存條件下本發(fā)明的bG-CSF制劑能顯示bG-CSF多肽或其變體的期望的不穩(wěn)定和/或去聚乙二醇化性質(zhì)。如本文使用的，術(shù)語“去聚乙二醇化”是指與bG-CSF多肽或其變體結(jié)合的聚乙二醇化部分的連接穩(wěn)定性，即這種聚乙二醇化部分隨時間推移是否保持與多肽結(jié)合，例如在水性溶液中貯存期間，或它們是否傾向于分離，例如由于酯鍵水解。在一些實施方案中，能使用檸檬酸鹽作為緩沖物質(zhì)并使用精氨酸作為賦形劑配制bG-CSF多肽或其變體的穩(wěn)定的水性制劑。在一個實施方案中，能使用檸檬酸一水合物(Fisher, C/6200/60或等同物)作為緩沖物質(zhì)并使用L-精氨酸(Sigma，A8094或等同物)作為賦形劑制備水性制劑。能通過將1.6克土 0.1克的檸檬酸一水合物和10.9克土 0.1克的L-精氨酸添加至200 mL的優(yōu)質(zhì)水制備水性制劑。此后，能使用鹽酸將pH調(diào)整至6.0土 0.1并能使用優(yōu)質(zhì)水將混合物稀釋至250 mL。生成的制劑能包含30 mM檸檬酸鹽、250mM精氨酸和bG-CSF多肽或其變體，pH為6.0。通過常規(guī)凍干法本發(fā)明的水性制劑能用于制備凍干粉或粉末。通過將凍干粉溶于水中或其它水性溶液中再次獲得本發(fā)明的制劑。還稱為冷凍-干燥法的術(shù)語“凍干法”是用于呈遞蛋白質(zhì)通常使用的技術(shù)，其用于從感興趣的蛋白質(zhì)制劑中去除水。凍干法是待干燥的物質(zhì)首先通過其被冷凍然后在真空環(huán)境中通過升華去除冰或冷凍溶劑的方法。可在預(yù)-凍干的制劑中包含賦形劑以增強冷凍-干燥過程期間的穩(wěn)定性和/或提高貯存時凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性。例如，參見Pikal, M.Biopharm.3(9)26-30 (1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3):285-291 (1991)。藥物成分的噴霧干燥也是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的。例如，參見Broadhead,J.等人，“The Spray Drying of Pharmaceuticals，，在 Drug Dev.1nd.Pharm, 18 (11 和12),1169-1206 (1992)中。除了小分子藥物外，已經(jīng)被噴霧干燥的多種生物材料包括:酶、血清、血漿、微生物和酵母。噴霧干燥是有用的技術(shù) 因為它能在一步過程中將液體藥物制劑轉(zhuǎn)化為細小、無塵或聚結(jié)的粉末?；A(chǔ)技術(shù)包括下列四步:a)霧化給料溶液成為霧狀物；b)霧狀物-空氣接觸；c)干燥霧狀物；和d)從干燥空氣中分離干燥的產(chǎn)物。例如，第6，235，710號和第6，001, 800號美國專利描述了通過噴霧干燥制備重組紅細胞生成素。使用包含bG-CSF多肽或其變體的制劑的方法也被本發(fā)明包括。bG-CSF具有多種生物活性，包括但不限于與其受體結(jié)合、導(dǎo)致其受體二聚、刺激中性粒細胞產(chǎn)生和刺激細胞增殖和分化。粒細胞集落刺激因子和bG-CSF的一些生物活性的實例在上文和第6，676，947號；第 6, 579, 525 號；第 6, 531, 121 號；第 6, 521, 245 號；第 6, 489, 293 號；第 6, 368, 854 號；第 6，316，254 號；第 6，268，336 號；第 6，239，109 號；第 6，165，283 號；第 5，986，047 號；第5，830，851號；第5，043，156號；和第5，773，569號美國專利中進行描述。本發(fā)明的包含b-GCSF多肽或其變體的制劑用于治療或預(yù)防多種病癥?！邦A(yù)防”是指降低受體遭受或發(fā)展本文描述的任何病理學(xué)疾病狀態(tài)的可能性并且包括預(yù)防性給藥。術(shù)語“預(yù)防”特別適用于易患特定病理學(xué)疾病狀態(tài)的患者?！爸委煛笔侵附閷?dǎo)疾病或疾病狀態(tài)并預(yù)防、逆轉(zhuǎn)疾病的臨床效果，或者減輕其進一步發(fā)展或改善與所述疾病或疾病狀態(tài)相關(guān)的癥狀。G-CSF產(chǎn)物的給藥導(dǎo)致白細胞形成。因此，本發(fā)明的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑的給藥可用于預(yù)防處于感染風(fēng)險中的動物的感染。可將本發(fā)明的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑給予患有感染的動物。可使用本發(fā)明的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑治療的感染包括但不限于乳腺炎和船運熱。能將本發(fā)明的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑給予動物，例如，在分娩前兩周至一天并且任選地能在分娩當(dāng)天或直至分娩后一周給予另外的給藥。在一些實施方案中，給予本發(fā)明的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑的動物為母牛并且將分娩稱為“產(chǎn)犢”。在一個實施方案中，本發(fā)明的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑可給予圍產(chǎn)期奶牛用于預(yù)防乳腺炎。根據(jù)本發(fā)明，可通過適用于蛋白質(zhì)或多肽的任何常規(guī)途徑給予包含bG-CSF多肽或其變體的制劑，包括但不限于腸胃外給藥，例如注射，其包括但不限于皮下注射或靜脈內(nèi)注射或注射或輸注的任何其它形式。能通過許多途徑給予包含bG-CSF多肽或其變體的制齊U，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、透皮、皮下、局部、舌下、血管內(nèi)、乳房內(nèi)或直腸途徑。還能通過脂質(zhì)體給予包含bG -CSF多肽或其變體的制劑。這種給藥途徑和合適的制劑通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。還能將單獨的或結(jié)合其它合適組分的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑制成通過吸入給予的氣霧劑(即，它們能為“霧狀的”)。能將氣霧劑放入加壓可接受的推進劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等。適用于腸胃外給藥(例如通過關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑)的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑包括水性和非水性的等滲無菌注射溶液(其能包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與目標(biāo)受體的血液等滲的溶質(zhì))，以及水性和非水性無菌懸浮液(其能包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑)。能以單一劑量或多劑量密封容器(如安瓿和小瓶)形式提供包含bG-CSF多肽或其變體的制劑。還能以注射器(如預(yù)充式注射器)形式提供包含bG-CSF多肽或其變體的制劑。腸胃外給藥和靜脈內(nèi)給藥是本發(fā)明制劑的可能的給藥方法。特別地，已經(jīng)用于天然氨基酸同系物治療的給藥途徑(包括但不限于通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFNs、白介素、抗體、FGFs和/或任何其它藥物遞送的蛋白質(zhì)的那些)連同目前使用的制劑提供了可能的給藥途徑以及本發(fā)明的包含bG-CSF多肽或其變體的制劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的制劑包含含量為約0.5至約12克/升的bG-CSF多肽或其變體。在本發(fā)明的上下文中給予動物的劑量隨時間足以在動物中具有有益的治療反應(yīng)，或者依賴應(yīng)用具有其它合適的活性。通過特定載體或制劑的功效和使用的非天然氨基酸多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期和動物的疾病狀態(tài)以及待治療的動物的體重或表面積來確定劑量。還通過在特定動物中伴隨特定載體、制劑等的給藥的任何不利副作用的存在、性質(zhì)和程度確定劑量大小。在本發(fā)明的上下文中給予動物的劑量隨時間應(yīng)足以在受試者中引起有益反應(yīng)。通常，每次給藥腸胃外給予的本發(fā)明的bG-CSF多肽或其變體的總藥物有效量為約0.01 μ g/kg/天至約100 μ g/kg或約0.05 mg/kg至約I mg/kg的動物體重,盡管這受制于治療判斷?；蛘撸看谓o藥腸胃外給予的本發(fā)明的bG-CSF多肽或其變體的藥物有效量為約I mg至約25 mg或約5 mg至約20 mg。例如,每次給藥腸胃外給予的本發(fā)明的bG-CSF多肽或其變體的藥物有效量能為約14 mg。給藥頻率也受制于治療判斷?？梢詥我粍┝炕蛞远鄤┝坑媱澋囊徊糠纸o予動物藥物有效量的bG-CSF多肽或其變體。例如，可以其中計劃為至少兩個劑量方案的多劑量計劃給予bG-CSF多肽或其變體。在一個實施方案中，多劑量計劃為兩個劑量方案。在一個實·施方案中，多劑量計劃包括在動物分娩之前約I天至約14天給予動物第一個劑量并在在動物分娩后約4天至約7天給予動物第二個劑量。在另一實施方案中，多劑量計劃包括在動物分娩之前約7天給予動物第一個劑量并在在動物分娩當(dāng)天給予動物第二個劑量。還包括下列實施方案:
1.穩(wěn)定的水性制劑，其包含bG-CSF多肽或其變體、緩沖物質(zhì)和賦形劑，其中所述制劑基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。2.如項I所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與連接物、聚合物或生物活性分子連接。3.如項I或2所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與水溶性聚合物連接。4.如項3所述的制劑，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。5.如項3或4所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100 kDa的分子量。6.如項3至5中任一項所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa的分子量。7.如項3至6中任一項所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約20 kDa的分子量。8.如項I至7中任一項所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20K PEG。9.如項I至8中任一項所述的制劑，其中bG-CSF多肽或其變體以約0.5至約12
克/升的量存在。10.如項I至9中任一項所述的制劑，其中bG-CSF多肽或其變體以約5克/升的
量存在。11.如項I至10中任一項所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)為檸檬酸鹽、組氨酸、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽或其組合。
12.如項I至11中任一項所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)為檸檬酸鹽或琥珀酸鹽。13.如項I至12中任一項所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)為檸檬酸鹽。14.如項I至12中任一項所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)為琥珀酸鹽。15.如項I至14中任一項所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)具有約10 mM至約50mM的摩爾濃度。16.如項I至15中任一項所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)具有約30 mM的摩爾濃度。17.如項I至16中任一項所述的制劑，其中所述賦形劑為氯化鈉、海藻糖、山梨
醇、精氨酸或其組合。18.如項I至17中任一項所述的制劑，其中所述賦形劑為精氨酸。19.如項18所述的制劑，其中精氨酸具有約100 mM至約500 mM的摩爾濃度。20.如項18或19所述的制劑，其中精氨酸具有約200至約300 mM的摩爾濃度。21.如項18至20中任一項所述的制劑，其中精氨酸具有約250 mM的摩爾濃度。
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22.如項I至21中任一項所述的制劑，其中所述制劑具有約5.7至約6.6的pH。23.如項I至22中任一項所述的制劑，其中所述制劑具有約6.0至約6.3的pH。24.如項I至23中任一項所述的制劑，其中在壓力貯存條件下在五天孵育期后所述制劑具有小于約2.1% wt/wt%的bG-CSF多肽或其變體的平均聚集體濃度。25.如項I至24中任一項所述的制劑，其中在加速貯存條件下在一天孵育期后所述制劑具有小于約1.5% wt/wt%的bG-CSF多肽或其變體的平均聚集體濃度。26.如項I至25中任一項所述的制劑，其任選包含一種或多種其它治療成分。27.項I至26中任一項所述的制劑的凍干粉或粉末。28.水溶液，其通過將項27所述的凍干粉或粉末溶于水制備。29.用于制備項I至26中任一項所述的制劑的方法，其包括形成包含bG_CSF多肽或其變體、緩沖物質(zhì)和賦形劑的穩(wěn)定的水溶液，其中所述制劑基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。30.治療患有由bG-CSF調(diào)節(jié)的病癥的動物的方法，其包括給予所述動物治療有效量的項I至26中任一項所述的制劑。31.如項30所述的方法，其中所述病癥為感染。32.如項31所述的方法，其中所述感染為乳腺炎并且其中所述動物為圍產(chǎn)期奶牛。33.穩(wěn)定的水性制劑，其包含bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子。34.如項33所述的制劑，其中所述制劑基本上不含聚山梨醇酯表面活性劑。35.如項33或34所述的制劑，其中所述bG_CSF多肽或其變體與連接物、聚合物或生物活性分子連接。36.如項33至35中任一項所述的制劑，其中所述bG_CSF多肽或其變體與水溶性聚合物連接。37.如項36所述的制劑，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
38.如項36或37所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100kDa的分子量。39.如項36至38中任一項所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa的分子量。40.如項36至39中任一項所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約20 kDa的
分子量。41.如項34至40中任一項所述的制劑，其中所述聚山梨醇酯表面活性劑為單月桂酸鈉的聚氧乙烯衍生物。42.如項34至41中任一項所述的制劑，其中所述聚山梨醇酯表面活性劑為聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。43.如項33至42中任一項所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20K PEG。44.如項43所述的制劑，其中bG-CSF-T133pAF_20K PEG以約0.5至約12克/升的量存在，所述檸檬酸鹽緩沖液具有約30 mM的摩爾濃度，精氨酸具有約250 mM的摩爾濃度并且其中所述制劑具有約6.0的pH值。45.如項43或44所述的制劑，其中在25°C下的28天孵育期后所述制劑具有小于約 1.6% wt/wt% 的 bG-CSF-T133pAF-20K PEG 的平均聚集體濃度。46.如項43至45中任一項所述的制劑，其中在40°C下的3天孵育期后所述制劑具有小于約2.8% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。47.如項43至46中任一項所述的制劑，其中在強制攪拌研究后所述制劑具有約1.6% wt/wt%*更少的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。48.如項43至47中任一項所述的制劑，其中在五個凍融循環(huán)后所述制劑具有小于約1.6% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。49.如項33至48中任一項所述的制劑，其中所述用于精氨酸的抗衡離子為氯離子或硫酸根離子。50.如項33至49中任一項所述的制劑，其任選包含一種或多種其它治療成分。51.項33至50中任一項所述的制劑的凍干粉或粉末。52.水溶液，其通過將項51所述的凍干粉或粉末溶于水制備。53.用于制備項33至50中任一項所述的制劑的方法，其包括形成包含bG_CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子的穩(wěn)定的水溶液。54.如項53所述的方法，其中所述制劑基本上不含聚山梨醇酯表面活性劑。55.如項53或54所述的方法，其中所述bG_CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20K PEG。56.治療患有由bG-CSF調(diào)節(jié)的病癥的動物的方法，其包括給予所述動物治療有效量的項33至50中任一項所述的制劑。
57.如項56所述的方法，其中所述病癥為感染。58.如項57所述的方法，其中所述感染為乳腺炎并且其中所述動物為圍產(chǎn)期奶牛。59.穩(wěn)定的水性制劑，其基本上由bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子組成。60.如項59所述的制劑，其中所述制劑基本上不含表面活性劑。61.如項59或60所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與連接物、聚合物或生物活性分子連接。62.如項59至61中任一項所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與水溶性聚合物連接。63.如項62所述的制劑，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。64.如項62或63所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100kDa的分子量。65.如項62至64中任一項所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kD的分子量。66.如項62至65中任一項所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約20 kDa的
分子量。67.如項60至66中任一項所述的制劑，其中所述表面活性劑為聚山梨醇酯表面活性劑。68.如項60至67中任一項所述的制劑，其中所述表面活性劑為單月桂酸鈉的聚氧乙烯衍生物。69.如項60至68中任一項所述的制劑，其中所述表面活性劑為聚氧乙烯(20)山
梨糖醇酐單月桂酸酯。70.如項59至69中任一項所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20K PEG。71.如項70所述的制劑，其中bG-CSF-T133pAF-20K PEG以約0.5至約12克/升的量存在，所述檸檬酸鹽緩沖液具有約30 mM的摩爾濃度，精氨酸具有約250 mM的摩爾濃度并且其中所述制劑具有約6.0的pH值。72.如項70或71所述的制劑，其中在25°C下的28天孵育期后所述制劑具有小于約 1.6% wt/wt% 的 bG-CSF-T133pAF-20K PEG 的平均聚集體濃度。73.如項70至72中任一項所述的制劑，其中在40°C下的3天孵育期后所述制劑具有小于約2.8% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。74.如項70至73中任一項所述的制劑，其中在強制攪拌研究后所述制劑具有約1.6% wt/wt%*更少的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。75.如項70至74中任一項所述的制劑，其中在五個凍融循環(huán)后所述制劑具有小于約1.6% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。76.如項59至75中任一項所述的制劑，其中所述用于精氨酸的抗衡離子為氯離子或硫酸根離子。

77.如項59至76中任一項所述的制劑，其任選包含一種或多種其它治療成分。78.項59至77中任一項所述的制劑的凍干粉或粉末。
79.水溶液，其通過將項78所述的凍干粉或粉末溶于水制備。
80.用于制備項59至77中任一項所述的制劑的方法，其包括形成基本上由bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子組成的穩(wěn)定的水溶液。
81.如項80所述的方法，其中所述制劑基本上不含表面活性劑。82.如項80或81所述的方法，其中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20K PEG。83.治療患有由bG-CSF調(diào)節(jié)的病癥的動物的方法，其包括給予所述動物治療有效量的項59至77中任一項所述的制劑。84.如項83所述的方法，其中所述病癥為感染。85.如項84所述的方法，其中所述感染為乳腺炎并且其中所述動物為圍產(chǎn)期奶牛。86.穩(wěn)定的水性制劑，其基本上由bG-CSF-T133pAF_20K PEG、檸檬酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子組成，其中所述檸檬酸鹽緩沖液具有約30 mM的摩爾濃度，其中精氨酸具有約250 mM的摩爾濃度。實施例1
緩沖液和賦形劑篩選研究
能使用多種緩沖液和賦形劑(氯化鈉、海藻糖和精氨酸)篩選在背景中不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯的bGCSF-T133-20K PEG制劑以評價產(chǎn)物穩(wěn)定性。所有透析緩沖液的目標(biāo)pH為pH 6.0ο為了比較，能制備在pH 6.0下包含10 mM磷酸鹽、180 mM甘露醇和60 mM海藻糖的制劑。能在存在和不存在氧氣的條件下評價制劑對蛋白質(zhì)聚集和去聚乙二醇化的影響。能通過在2-8°C下透析I mL的bGCSF-T133-20K PEG進入各個制劑制備樣品。能在歸一化蛋白質(zhì)濃度至5 mg/mL之前測定透析樣品的蛋白質(zhì)濃度。在透析和濃度歸一化后，能將約3 X I mL的透析后并稀釋的混合物填充至5 mL玻璃瓶中。能測試一組樣品以提供初始條件。在測試前能將第二組在25°C/60%RH下儲存5天。能在凍干室中將第三組樣品脫氣，在惰性環(huán)境(氮氣)下封閉，然后在測試前在25°C/60%RH下儲存5天。如果在5天后通過SEC測定的聚集體水平 2.0%，則能將脫氣和未脫氣樣品二者在40°C下孵育一天。在孵育五天后，能測定各個樣品的蛋白質(zhì)濃度。表I顯示蛋白質(zhì)濃度。表1.來自緩沖液和賦形劑篩選研究的蛋白質(zhì)濃度
權(quán)利要求
1.定的水性制劑，其包含bG-CSF多肽或其變體、緩沖物質(zhì)和賦形劑，其中所述制劑基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。
2.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與連接物、聚合物或生物活性分子連接。
3.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與水溶性聚合物連接。
4.按權(quán)利要求3所述的制劑，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
5.按權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100 kDa的分子量。
6.按權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa的分子量。
7.按權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約20kDa的分子量。
8.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20KPEG。
9.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中 bG-CSF多肽或其變體以約0.5至約12克/升的量存在。
10.按權(quán)利要求9所述的制劑，其中bG-CSF多肽或其變體以約5克/升的量存在。
11.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)為檸檬酸鹽、組氨酸、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽或其組合。
12.按權(quán)利要求11所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)為檸檬酸鹽或琥珀酸鹽。
13.按權(quán)利要求12所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)為檸檬酸鹽。
14.按權(quán)利要求12所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)為琥珀酸鹽。
15.按權(quán)利要求12所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)具有約10mM至約50 mM的摩爾濃度。
16.按權(quán)利要求15所述的制劑，其中所述緩沖物質(zhì)具有約30mM的摩爾濃度。
17.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述賦形劑為氯化鈉、海藻糖、山梨醇、精氨酸或其組合。
18.按權(quán)利要求17所述的制劑，其中所述賦形劑為精氨酸。
19.按權(quán)利要求18所述的制劑，其中精氨酸具有約100mM至約500 mM的摩爾濃度。
20.按權(quán)利要求19所述的制劑，其中精氨酸具有約200至約300mM的摩爾濃度。
21.按權(quán)利要求20所述的制劑，其中精氨酸具有約250mM的摩爾濃度。
22.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述制劑具有約5.7至約6.6的pH。
23.按權(quán)利要求22所述的制劑，其中所述制劑具有約6.0至約6.3的pH。
24.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中在壓力貯存條件下在五天孵育期后所述制劑具有小于約2.1% wt/wt%的bG-CSF多肽或其變體的平均聚集體濃度。
25.按權(quán)利要求1所述的制劑，其中在加速貯存條件下在一天孵育期后所述制劑具有小于約1.5% wt/wt%的bG-CSF多肽或其變體的平均聚集體濃度。
26.按權(quán)利要求1所述的制劑，其任選包含一種或多種其它治療成分。
27.權(quán)利要求1所述的制劑的凍干粉或粉末。
28.溶液，其通過將權(quán)利要求27所述的凍干粉或粉末溶于水制備。
29.關(guān)于制備權(quán)利要求1所述的制劑的方法，其包括形成包含bG-CSF多肽或其變體、緩沖物質(zhì)和賦形劑的穩(wěn)定的水溶液，其中所述制劑基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。
30.療患有由bG-CSF調(diào)節(jié)的病癥的動物的方法，其包括給予所述動物治療有效量的權(quán)利要求1所述的制劑。
31.按權(quán)利要求30所述的方法，其中所述病癥為感染。
32.按權(quán)利要求31所述的方法，其中所述感染為乳腺炎并且其中所述動物為圍產(chǎn)期奶牛。
33.定的水性制劑，其包含bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子。
34.按權(quán)利要求33所述的制劑，其中所述制劑基本上不含聚山梨醇酯表面活性劑。
35.按權(quán)利要求33所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與連接物、聚合物或生物活性分子連接。
36.按權(quán)利要求33所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與水溶性聚合物連接。
37.按權(quán)利要求36所述的制劑，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
38.按權(quán)利要求37所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100 kDa的分子量。
39.按權(quán)利要求37所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa的分子量。
40.按權(quán)利要求37所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約20kDa的分子量。
41.按權(quán)利要求34所述的制劑，其中所述聚山梨醇酯表面活性劑為單月桂酸鈉的聚氧乙烯衍生物。
42.按權(quán)利要求34所述的制劑，其中所述聚山梨醇酯表面活性劑為聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。
43.按權(quán)利要求33所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20KPEG。
44.按權(quán)利要求43所述的制劑，其中bG-CSF-T133pAF-20KPEG以約0.5至約12克/升的量存在，所述檸檬酸鹽緩沖液具有約30 mM的摩爾濃度，精氨酸具有約250 mM的摩爾濃度并且其中所述制劑具有約6.0的pH值。
45.按權(quán)利要求43所述的制劑，其中在25°C下的28天孵育期后所述制劑具有小于約1.6% wt/wt% 的 bG-CSF-T133pAF-20K PEG 的平均聚集體濃度。
46.按權(quán)利要求43所述的制劑，其中在40°C下的3天孵育期后所述制劑具有小于約2.8% wt/wt% 的 bG-CSF-T133pAF-20K PEG 的平均聚集體濃度。
47.按權(quán)利要求43所述的制劑，其中在強制攪拌研究后所述制劑具有約1.6%wt/wt%或更少的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。
48.按權(quán)利要求43所述的制劑，其中在五個凍融循環(huán)后所述制劑具有小于約1.6% wt/wt%的bG-CSF-T133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。
49.按權(quán)利要求33所述的制劑，其中所述用于精氨酸的抗衡離子為氯離子或硫酸根離子。
50.按權(quán)利要求33所述的制劑，其任選包含一種或多種其它治療成分。
51.權(quán)利要求33所述的制劑的凍干粉或粉末。
52.溶液，其通過將權(quán)利要求51所述的凍干粉或粉末溶于水制備。
53.關(guān)于制備權(quán)利要求33所述的制劑的方法，其包括形成包含bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子的穩(wěn)定的水溶液。
54.按權(quán)利要求53所述的方法，其中所述制劑基本上不含聚山梨醇酯表面活性劑。
55.按權(quán)利要求53所述的方法，其 中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20KPEG。
56.療患有由bG-CSF調(diào)節(jié)的病癥的動物的方法，其包括給予所述動物治療有效量的權(quán)利要求33所述的制劑。
57.按權(quán)利要求56所述的方法，其中所述病癥為感染。
58.按權(quán)利要求57所述的方法，其中所述感染為乳腺炎并且其中所述動物為圍產(chǎn)期奶牛。
59.定的水性制劑，其基本上由bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子組成。
60.按權(quán)利要求59所述的制劑，其中所述制劑基本上不含表面活性劑。
61.按權(quán)利要求59所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與連接物、聚合物或生物活性分子連接。
62.按權(quán)利要求59所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體與水溶性聚合物連接。
63.按權(quán)利要求62所述的制劑，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
64.按權(quán)利要求63所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100 kDa的分子量。
65.按權(quán)利要求63所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kD的分子量。
66.按權(quán)利要求63所述的制劑，其中所述水溶性聚合物具有約20kDa的分子量。
67.按權(quán)利要求60所述的制劑，其中所述表面活性劑為聚山梨醇酯表面活性劑。
68.按權(quán)利要求67所述的制劑，其中所述表面活性劑為單月桂酸鈉的聚氧乙烯衍生物。
69.按權(quán)利要求68所述的制劑，其中所述表面活性劑為聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。
70.按權(quán)利要求59所述的制劑，其中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF_20KPEG。
71.按權(quán)利要求70所述的制劑，其中bG-CSF-T133pAF-20K PEG以約0.5至約12克/升的量存在，所述檸檬酸鹽緩沖液具有約30 mM的摩爾濃度，精氨酸具有約250 mM的摩爾濃度并且其中所述制劑具有約6.0的pH值。
72.按權(quán)利要求70所述的制劑，其中在25°C下的28天孵育期后所述制劑具有小于約·1.6% wt/wt% 的 bG-CSF-T 133pAF-20K PEG 的平均聚集體濃度。
73.按權(quán)利要求70所述的制劑，其中在40°C下的3天孵育期后所述制劑具有小于約·2.8% wt/wt% 的 bG-CSF-T 133pAF-20K PEG 的平均聚集體濃度。
74.按權(quán)利要求70所述的制劑，其中在強制攪拌研究后所述制劑具有約1.6%wt/wt%或更少的bG-CSF-T 133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。
75.按權(quán)利要求70所述的制劑，其中在五個凍融循環(huán)后所述制劑具有小于約1.6% wt/wt%的bG-CSF-T 133pAF-20K PEG的平均聚集體濃度。
76.按權(quán)利要求70所述的制劑，其中所述用于精氨酸的抗衡離子為氯離子或硫酸根離子。
77.按權(quán)利要求59所述的制劑，其任選包含一種或多種其它治療成分。
78.權(quán)利要求59所述的制劑的凍干粉或粉末。
79.溶液，其通過將權(quán)利要求78所述的凍干粉或粉末溶于水制備。
80.關(guān)于制備權(quán)利要求59所述的制劑的方法，其包括形成基本上由bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子組成的穩(wěn)定的水溶液。
81.按權(quán)利要求80所述的 方法，其中所述制劑基本上不含表面活性劑。
82.按權(quán)利要求80所述的方法，其中所述bG-CSF多肽或其變體為bG-CSF-T133pAF-20KPEG。
83.療患有由bG-CSF調(diào)節(jié)的病癥的動物的方法，其包括給予所述動物治療有效量的權(quán)利要求59所述的制劑。
84.按權(quán)利要求83所述的方法，其中所述病癥為感染。
85.按權(quán)利要求84所述的方法，其中所述感染為乳腺炎并且其中所述動物為圍產(chǎn)期奶牛。
86.定的水性制劑，其基本上由bG-CSF-T133pAF-20KPEG、檸檬酸鹽緩沖液、精氨酸和任選用于精氨酸的抗衡離子組成，其中所述檸檬酸鹽緩沖液具有約30 mM的摩爾濃度，其中精氨酸具有約250 mM的摩爾濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含bG-CSF多肽或其變體、緩沖物質(zhì)和賦形劑的穩(wěn)定的水性制劑，其中所述制劑基本上不含聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯。本發(fā)明還提供了使用所述制劑的凍干形式或粉末形式的方法以及制備所述制劑的方法。
文檔編號C07K14/535GK103096916SQ201180045228
公開日2013年5月8日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月23日
發(fā)明者J.達瓦尼諾, C.N.哈, A.V.克羅茨 申請人:伊萊利利公司