專利名稱：經(jīng)修飾松弛素多肽及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及任選地被至少一種非天然編碼氨基酸修飾的松弛素多肽。
背景技術：
成熟人松弛素是一種大約6000道爾頓的激素肽，已知其負責重塑分娩前的產(chǎn)道，因而促進產(chǎn)程。這種蛋白質(zhì)似乎調(diào)節(jié)靶器官中的結締組織的重建以在懷孕和分娩期間獲得所需的器官結構的變化。參見，Hisaw, F.L.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,23:661-663 (1926) ；Schwabe,C.等，Biochem.Biophys.Res.Comm., 75:503_570 (1977) ； James,R.等，Nature, 267:544-546(1977)。Sherwood, D.在 The Physiology of Reproduction,Chapterl6, " Relaxin " , Knobi I, E.和 Neill, J.等(編)，(Raven Press Ltd., NewYork)，第585-673頁(1988)中簡要地論述了松弛素。松弛素的循環(huán)水平在整個9個月的孕期升高并在分娩后迅速下降。雖然松弛素主要是孕期激素，但它已在未懷孕女性和男性中被檢測到。Bryant-Greenwood, G.D., Endocrine Reviews,3:62-90(1982)和 Weiss, G., Ann.Rev.Physiol.,46:43-52 (1984)，并且最近被發(fā)現(xiàn)可用于治療心力衰竭。心力衰竭被定義為心臟泵不能根據(jù)需要移動血液來供給身體組織的代謝需求。泵送能力的下降最經(jīng)常由心肌組織的損失或損害引起。結果，心室排空受到抑制，這導致心室充盈壓力和心室壁應力增加，并導致心輸出量減少。作為對心輸出量減少的生理反應，許多神經(jīng)內(nèi)分泌反射被激活，這導致全身血管收縮、心臟交感神經(jīng)刺激和體液潴留。雖然這些反射反應往往最初提高心輸出量，但是從長期來看它們是有害的。由此產(chǎn)生的外周阻力的增大會增加對心臟的后負荷，并且血容量的增大進一步增加心室充盈壓力。這些變化與心臟的交感神經(jīng)刺激的增強一起導致對剩余功能心肌的進一步的經(jīng)常失代償性的需求。

充血性心力衰竭是許多心血管病癥的共同終點，并在心臟無法充分灌注外周組織時產(chǎn)生。根據(jù)最新估計，在美國有大約400萬人被診斷為患有這種疾病，并且這些病例的 50% 以上在診斷的 5 年內(nèi)是致命的[Taylor, M.D.等，Annual Reports, Med.Chem.22,85-94(1987)]。當前治療包括充血性心力衰竭在內(nèi)的心力衰竭的方法集中于在不對心肌產(chǎn)生不適當?shù)囊蟮那闆r下增加心輸出量。為了達到這些目的，利尿劑、血管擴張劑和正性肌力藥(inotropic agent)的各種組合被用于降低血容量、降低外周阻力，以及增加心臟收縮力。因此，當前的療法依賴于平衡多種藥物的影響來實現(xiàn)各個患者的臨床需要，并且受到所使用的藥物的不利反應的困擾。例如，利尿劑降低鉀和鎂的血漿濃度并且增加接受洋地黃的患者的心律失常的發(fā)生率。利尿劑可經(jīng)由容量不足(volume depletion)增強硝酸鹽的循環(huán)影響，并導致心臟充盈壓力、心輸出量和全身動脈壓力下降。α腎上腺素能拮抗劑可導致全身動脈壓力的顯著下降，其損害冠脈灌注。血管緊張素轉換酶抑制劑對動脈壓力可以有類似的影響，并且另外導致血漿中鉀的濃度過度增加。
導致正性肌力的藥物如洋地黃和β腎上腺素能拮抗劑有可能引起心律失常。另夕卜，洋地黃具有狹窄的治療指數(shù)，并且兒茶酚胺類似物由于受體下調(diào)而都傾向于迅速失去其有效性。因此，需要這樣的治療劑，其導致動脈和靜脈血管舒張及心臟收縮力的生理上的綜合反應，而沒有目前所用的治療劑的缺點。已從包括豬、鼠類、馬、鯊、虎、大鼠、角鯊和人在內(nèi)的各種物種純化出松弛素，其顯示出與胰島素和胰島素樣生長因子至少在一級結構和二級結構上有同源性，但物種之間的同源性可以是相當?shù)偷?。在人中，發(fā)現(xiàn)松弛素在孕期的黃體(CL)中最豐富。然而，腦中的特定核具有松弛素受體并且其它核含有松弛素的信使RNA。具有攜帶松弛素受體的細胞的數(shù)個核在下丘腦區(qū)域中被發(fā)現(xiàn)。已鑒定出兩種人基因形式，(Hl)和(Η2)。Hudson, P.等，Nature, 301:628-631(1983) ；Hudson, P.等，The EMBO Journal, 3:2333-2339(1984);和美國專利第4，758，516號和第4，871，670號。已發(fā)現(xiàn)該基因形式中僅一種(H2)在CL中被轉錄。是否(Hl)形式在另一個組織部位被表達，或者它是否代表假基因，這還不清楚。當測試合成的人松弛素(H2)和某些人松弛素類似物的生物活性時，該測試發(fā)現(xiàn)生物活性所必需的松弛素核以及不影響生物活性的針對蛋氨酸的某些氨基酸取代。Johnston等,見Peptides:Structure and Function,Proc.Ninth American Peptide Symposium,Deber, C.M.等(編)(Pierce Chem.C0.1985)。制備松弛素的方法還描述于美國專利第4，835，251號和共同待決的美國專利申請第 07/908，766 (PCT US90/02085)號和第 08/080，354 (PCT US94/0699)號中。在心血管治療和在神經(jīng)退行性疾病治療中使用松弛素的方法描述于美國專利第5，166，191號和美國專利申請第07/902，637 (PCT US92/06927)號中。人松弛素的某些制劑描述于核準的美國專利申請第08/050，745號中。重組人松弛素(H2) 當前處于硬皮病患者的I期人臨床試驗中。硬皮病是涉及組織重新形成(reformation)中的不平衡的疾病，其導致膠原的過量產(chǎn)生，并最終導致皮膚(和受累器官)的腫脹和硬化。目前，遞送松弛素的治療需要重復的長時間輸注。發(fā)明概述本發(fā)明提供了任選地被至少一種非天然編碼氨基酸修飾的松弛素多肽。本說明書將提供一些實施方案，但是應理解，這些實施方案是為了說明本發(fā)明，而不能被解讀為限制由權利要求書限定的本發(fā)明范圍。在本發(fā)明的另一方面，具有至少一種非天然編碼氨基酸的松弛素多肽與至少一種水溶性聚合物連接。在一方面，本發(fā)明涉及通過施用治療有效量的松弛素來促進需要它的哺乳動物的血管新生的方法。在另一個實施方案中，松弛素以足以維持至少約lng/ml的血漿濃度的量施用。在進一步實施方案中，松弛素多肽是人松弛素(hR2)。本發(fā)明提供了用有效量的包含松弛素受體激動劑的制劑治療動脈順應性降低的個體的方法。在優(yōu)選的實施方案中，松弛素受體激動劑是重組人松弛素，例如，人H2松弛素。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供了增加受試者的動脈順應性的方法，其中所述方法包括測量所述受試者的總動脈順應性；相對于健康受試者的總動脈順應性確定所述受試者的所述總動脈順應性是否降低；以及向所述受試者施用包含松弛素的藥物制劑以增加所述受試者的動脈順應性。在一個實施方案中，可以使用面積法根據(jù)主動脈壓力波形的舒張衰減來測量總動脈順應性。在另一個實施方案中，總動脈順應性可以計算為每搏輸出量與脈沖壓力的比率，其中每搏輸出量被定義為心輸出量與心率的比率。在相關的實施方案中，可以測量受試者的局部動脈順應性或區(qū)域動脈順應性，所述測量與總動脈順應性測量一并進行或者作為總動脈順應性測量的替代，并且如果局部或區(qū)域動脈順應性相對于對處于類似狀況的健康個體預期的局部或區(qū)域動脈順應性降低，則可以施用松弛素以增加該個體的動脈順應性。在進一步的實施方案中，接受松弛素的受試者罹患以下病癥中的一種或多種:動脈粥樣硬化、I型糖尿病、2型糖尿病、冠狀動脈疾病、硬皮病、中風、舒張功能異常、家族性高膽固醇血癥、單純收縮期高血壓、原發(fā)性高血壓、繼發(fā)性高血壓、左心室肥大、與長期吸煙有關的動脈硬化、與肥胖有關的動脈硬化、與年齡有關的動脈硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、先兆子癇，和高膽固醇血癥。在相關的實施方案中，本發(fā)明提供了增加圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女以及有罹患前述病癥之一的風險的個體的動脈順應性的方法。在本發(fā)明的另外的實施方案中，松弛素的施用使動脈順應性相對于在施用之前測得的動脈順應性增加了至少10^^15^^20%或更高。在又一個進一步實施方案中，本發(fā)明提供了對動脈順應性降低的個體進行的松弛素的施用，所述施用以預定速率進行以便維持0.5ng/ml至80ng/ml的松弛素血清濃度。在一個實施方案中，松弛素是具有一種非天然編碼氨基酸的重組人松弛素。在又一個實施方案中，松弛素是具有一種以上的非天然編碼氨基酸的松弛素。在本發(fā)明的又一個實施方案中，松弛素具有與水溶性聚合物連接的非天然編碼氨基酸。在相關的實施方案中，松弛素可以以可注射制劑形式、作為緩釋制劑，或以持續(xù)輸注形式每日施用。在另一方面，本發(fā)明涉及通過施用治療有效量的松弛素來治療感染或缺血性傷口。在特別優(yōu)選的實施方案中，感染或缺血性傷口是這樣的感染或缺血性傷口，其中的損傷由循環(huán)不良引起的氧氣缺 乏造成。在本發(fā)明的又一個方面，提供了使用本發(fā)明松弛素多肽制造用于治療感染或缺血性傷口的藥劑，或制造用于促進血管新生的藥劑的用途。在另一個方面，本發(fā)明涉及骨退行性關節(jié)功能異常的治療，并且在另一個方面，骨退行性關節(jié)功能異常的治療包括用hR2與一種或多種佐劑一并治療，所述佐劑包括但不限于葡萄糖胺。在另一個方面，本發(fā)明涉及阿爾茨海默氏病(alzheimer’s disease)的治療，并且在另一個方面，阿爾茨海默氏病的治療包括用hR2與一種或多種佐劑一并治療，所述佐劑包括但不限于雌激素。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)哺乳動物的生殖生理的方法，其包括向哺乳動物施用治療有效量的本文組合物。本發(fā)明進一步提供了治療血管緊張素-1I (AngII)-介導的血管收縮的方法。這些方法一般包括施用包含有效逆轉、抑制或減輕AngII的血管收縮影響的量的松弛素的制劑。本發(fā)明進一步提供了治療內(nèi)皮素-1 (ET-1)-介導的血管收縮的方法。這些方法一般包括施用包含有效逆轉、抑制或減輕ET-1的血管收縮影響的量的松弛素的制劑。在一些實施方案中，該方法包括通過向個體施用松弛素來增強血管中的細胞中的內(nèi)皮素B型受體活化。本發(fā)明進一步提供了治療缺血性病狀的方法，該方法一般包括施用包含有效刺激或促進血管新生和/或血管舒張，從而治療缺血性病狀的量的松弛素的制劑。該方法可用于治療多種缺血性病狀。在一些實施方案中，提供了治療由心肌梗塞引起的缺血性病狀的方法。在其它實施方案中，提供了治療與傷口關聯(lián)的缺血性病狀的方法。因而，本發(fā)明進一步提供了促進傷口愈合的方法。本發(fā)明進一步提供了刺激血管新生和/或血管舒張細胞因子表達的方法，其一般包括施用包含有效舒張血管和/或刺激或促進血管新生細胞因子生成的量的松弛素的制齊U。在一些實施方案中，該方法用于刺激堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和/或血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的表達。此類方法可用于治療可通過增加患病部位處或附近的血流量來治療的多種多樣的疾病。本發(fā)明進一步提供了增加腎血管舒張和超過濾的方法，該方法一般包括施用包含一定量的松弛素的制劑。這些方法可用于治療多種腎病理。因此，本發(fā)明進一步提供了治療與血管收縮有關的腎病理的方法。本發(fā)明進一步提供了降低肺性高血壓的方法，該方法一般包括施用包含一定量的松弛素的制劑。在分別轉讓給Connetics Corporation和BAS Medical, Inc.的專利，美國專利第6，211，147號和第6，780，836號中公開了使用松弛素促進血管新生的方法，這兩篇美國專利都以引用的方式并入本文。在轉讓給Genentech, Inc.的專利,第5，759，807號專利中公開了從松弛素原原核生產(chǎn)松弛素的工藝，該專利以引用的方式并入本文。Yue的美國專利6，251，863公開了治療骨退行性關節(jié)功能異常的方法和治療阿爾茨海默氏病的方法，所述方法通過施用針對所述病狀中的每種病狀分別進一步包含葡萄糖胺硫酸鹽和雌激素的松弛素藥劑來實現(xiàn)，并且這篇專利的說明書也以引用的方式完整地并入本文。在一些實施方案中，松弛素多肽包含一種或多種翻譯后修飾。在一些實施方案中，松弛素多肽與連接子、聚合物，或生物活性分子連接。在一些實施方案中，松弛素多肽與雙官能聚合物、雙官能連接子，或至少一種另外的松弛素多肽連接。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實施方案中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸經(jīng)由連接子與水溶性聚合物連接，或者與水溶性聚合物鍵合。在一些實施方案中，該聚(乙二醇)分子是雙官能聚合物。在一些實施方案中，該雙官能聚合物與第二多肽連接。在一些實施方案中，該第二多肽是松弛素多肽。在一些實施方案中，松弛素多肽包含至少兩種與水溶性聚合物連接的氨基酸，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施方案中，至少一種氨基酸是非天然編碼氨基酸。在一些實施方案中，松弛素多肽包含至少兩種與水溶性聚合物連接的氨基酸，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施方案中，至少一種氨基酸是非天然編碼氨基酸。在一些實施方案 中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置的一個或多個位置處摻入到任何松弛素或松弛素原多肽、松弛素類似物、松弛素原、松弛素A鏈、松弛素B鏈AlalAsp松弛素，或松弛素多肽中:A鏈中的位置I ( S卩，在N-端)之前、位置1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25(即，在蛋白質(zhì)的羧基端處)，及其任何組合(SEQ ID NO:4)和/或B鏈中的位置1(即，在N-端)之前、位置1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 (SEQ ID NO:5或在SEQ ID NO:6中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置的一個或多個位置處摻入到任何松弛素或松弛素原多肽中:A鏈中的位置 1(即，在 N-端)之前、位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54(即，在蛋白質(zhì)的羧基端)，以及它們的任何組合(SEQID NO:1或在SEQ ID NO:2或3中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置的一個或多個位置處摻入到松弛素中:位置1(即在N-端)之前、位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、
79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89( S卩，在 SEQ ID NO:3 的蛋白質(zhì)的羧基端)。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在A鏈中的氨基酸位置I (SEQ ID NO:4)處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在A鏈中的氨基酸位置5 (SEQ ID NO:4)處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在B鏈中的氨基酸位置7 (SEQ ID NO:5或SEQID NO:6)處摻入。在一 些實施方案中，非天然編碼氨基酸在A鏈中的氨基酸位置2 (SEQ IDNO:4)處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在A鏈中的氨基酸位置13(SEQ IDN0:4)處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在B鏈中的氨基酸位置5(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在A鏈中的氨基酸位置18處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在B鏈中的氨基酸位置5處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在B鏈中的氨基酸位置28處摻入。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個位置處摻入到松弛素多肽中:A鏈中的氨基酸位置 1、2、5、13、18(SEQ ID NO:4，或在 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或其它已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個位置處摻入到松弛素多肽中:A鏈中的氨基酸位置1、2、5、13(SEQ IDNO:4或在SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其它已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個位置處摻入到松弛素多肽中:A鏈中的氨基酸位置1、2、5(SEQ ID NO: 4或在SEQ ID NO:USEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:3或其它已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個位置處摻入到松弛素多肽中:A鏈中的氨基酸位置
2或 5 (SEQ ID NO:4 或在 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或其它已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個位置處摻入到松弛素多肽中:B鏈中的氨基酸位置5或7(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或在SEQ ID N0:l、2或3中的相應氨基酸位置)處。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在B鏈中的位置7 (SEQID NO:5或SEQ ID NO:6，或在SEQ ID NO:1、2或3中的相應氨基酸位置)處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在B鏈中的位置5 (SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或在SEQID NO:1、2或3中的相應氨基酸位置)處摻入。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸在B鏈中的位置7(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或在SEQ ID NO:1、2或3中的相應氨基酸位置)處摻入。在一個實施方案中，非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個位置處摻入到松弛素多肽中:A鏈中的氨基酸位置1、5、2、13、18(SEQ ID NO:4或在SEQ ID N0.1、2、3中的相應氨基酸位置)，B鏈中的氨基酸位置7、5 (SEQ ID NO:5或6，或在SEQ ID N0:l、2、3中的相應氨基酸位置)。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個位置處摻入到松弛素多肽中:A鏈中的氨基酸位置1、5、2、13、18(SEQ ID NO:4，或在SEQ IDN0.1、2、3中的相應氨基酸位置)、B鏈中的氨基酸位置7、5 (SEQ ID NO:5或6，或在SEQ IDNO:1、2、3中的相應氨基酸位置)。在一些實施方案中，在這些位置中的一個或多個位置處的非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，包括但不限于以下位置:A鏈中的位置1(S卩，在N-端)之前、位置1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25( SP，在蛋白質(zhì)的羧基端)，及其任何組合(SEQ ID NO:4或在已知松弛素序列中的相應氨基酸)，和/或B鏈中的位置 I (即，在 N-端)之前、位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30(SEQ ID NO:5或6或者在已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，在這些位置中的一個或多個位置處的非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，包括但不限于:A鏈中的位置1、2、5、13、18(SEQ ID NO:1或在已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些·實施方案中，在這些位置中的一個或多個位置處的非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，包括但不限于:A鏈中的位置1、2、5(SEQ ID NO:1或在已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，在這些位置中的一個或多個位置處的非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，包括但不限于:A鏈中的位置2、5(SEQ ID N0:1或在已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，在這些位置中的一個或多個位置處的非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，包括但不限于:A鏈中的位置2、5、13、18(SEQID NO:1或在已知松弛素序列中的相應氨基酸)。在一些實施方案中，在這些位置中的一個或多個位置處的非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，包括但不限于:B鏈中的位置5、7 (SEQ ID NO:5或6或者在SEQ ID NO: 1、2、3中的相應氨基酸位置)。在一些實施方案中，在B鏈中的位置5(SEQ ID NO:5或6或者在SEQ ID NO:1、2、3中的相應氨基酸位置)處的非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實施方案中，在B鏈中的位置7 (SEQ IDNO:5或6或者在SEQ ID NO:1、2、3中的相應氨基酸位置)處的非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個或多個位置處摻入到任何松弛素或松弛素原多肽中:B鏈位置5、7 (SEQ ID NO:5或6或者在SEQ IDNO:1、2、3中的相應氨基酸位置)和A鏈位置1、5、2、13、18(SEQ ID NO:4或者在SEQ ID NO:1、2、3中的相應氨基酸位置)。在一些實施方案中，一種或多種非天然編碼氨基酸在以下位置中的一個或多個位置處摻入到任何松弛素或松弛素原多肽中:B鏈位置5、7(SEQ ID NO:5或6或者在SEQ ID N0:l、2、3中的相應氨基酸位置)和A鏈位置1、5、2、13、18(SEQ IDNO:4或者在SEQ ID NO:1、2、3中的相應氨基酸位置)，并且非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。本發(fā)明方法可用來促進血管新生、促進血管舒張、促進非降壓性血管舒張(non-hypotensive vasodilation)、治療高血壓,包括但不限于腎性高血壓、肺性高血壓，和心臟高血壓(美國專利第6，723，702號；和第6，780，836號，它們都據(jù)此以引用的方式完整地并入本文)，公開了松弛素類似物的晶體的形成和用途。制劑在本發(fā)明的廣泛實踐中，還考慮到制劑可含有松弛素、松弛素二聚體、松弛素類似物、?；沙谒?，或?；沙谒仡愃莆镏械膬煞N或更多種的混合物，其中所述混合物的至少一種組分含有非天然編碼氨基酸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，含有松弛素、松弛素類似物、?；沙谒?，或?；沙谒仡愃莆镏械膬煞N或更多種的混合物(其中所述混合物的至少一種組分含有非天然編碼氨基酸)的制劑還包括至少一種與至少一種非天然編碼氨基酸連接的水溶性聚合物。本發(fā)明還包括異質(zhì)混合物，其中通過本發(fā)明中所公開的方法制備松弛素多肽和松弛素類似物，并然后將它們混合以便可向有需要的患者施用制劑，所述制劑含有例如25%的在聚乙二醇化的B鏈的位置28處含有非天然編碼氨基酸的松弛素多肽；25%的在B鏈的位置10處含有非天然編碼氨基酸的松弛素多肽，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物偶聯(lián)；和50%的松弛素多肽，其中非天然編碼氨基酸存在于松弛素B鏈的位置31 (SEQ IDNO:2;或者SEQ ID NO:4、6、8、10或12)處。不同百分比量的松弛素多肽變異體的所有不同混合物都包括在序列中的不同位置處，其中所述松弛素多肽包括具有不同尺寸的PEG的變種(1)，或(2)PEG。這旨在作為實例，而決不應視為限制可用本發(fā)明獲得的制劑，并且對于本領域技術人員將是明顯的。在另外的實施方案中，引入到制劑混合物中的松弛素多肽變異體將根據(jù)其不同解離時間(dissociation time)來進行選擇，以便該制劑可為有需要的患者提供緩釋松弛素。本發(fā)明制劑可以包括胰高血糖素。包括吸入用制劑在內(nèi)的本發(fā)明其它實施方案在本發(fā)明的另外的實施方案中，可以使用本文所公開的技術來生產(chǎn)藥動學和藥效學性質(zhì)增強的松弛素類似物，所述松弛素類似物供患者經(jīng)由施用于肺來使用，導致松弛素的血液水平增高，增高的血液水平在施用后持續(xù)至少6小時，并且更通常至少8、10、12、14、18,24小時或更長時間。本發(fā)明的另一個實施方案慮及適合于設計成作為吸入劑施用給患者的治療性制劑的松弛素類似物的有利混合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，天然松弛素分子中的以下位點可以被非天然編碼氨基酸取代，并且任選地進一步通過共價連接水溶性聚合物如PEG來修飾:A與B鏈的2個C端、Arg22B、HislOB, His5A、Glu4A、Glul7A、Glul3B,和 Glu21B。除了天然松弛素外，本發(fā)明還提供了具有取代或插入到信號序列中的一種或多種非天然編碼氨基酸的非天然松弛素多肽和松弛素類似物，所述非天然編碼氨基酸還可提供用于摻入一種或多種水溶性聚合物如PEG的位點。本發(fā)明的這個實施方案尤其可用于在松弛素分子中引入另外的定制聚乙二醇化位點，例如以便形成對酶促降解的抗性增強的PEG-松弛素。此種方法在具有活性、穩(wěn)定性、溶解性和藥理學性質(zhì)之間的所需平衡的最佳松弛素綴合物的設計方面提供了較大靈活性?？稍谒沙谒胤肿又械脑S多位置處進行突變，即通過位點特異性誘變進行。用于本發(fā)明的PEG可具有多種結構:線性、叉狀、支化、啞鈴狀等等。通常，用適合于偶聯(lián)松弛素分子上的所需一個或多個位點的合適活化基團使PEG活化?；罨疨EG將在末端具有用于與松弛素反應的反應性基團。代表性活化PEG衍生物和使這些試劑與諸如松弛素的藥物綴合的方法是本領域已知的，并且進一步描述于Zalipsky, S.等，"Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols)for Modificationof Polypeptides" , Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and BiomedicalApplications, J.M.Harris, Plenus Press, New York(1992),及 Advanced Drug Reviews,16:157-182(1995)中。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，綴合物的PEG部分不存在一個或多個有效地顯著改變聚合物或聚合物-松弛素綴合物的水溶解性的親脂性基團。那就是說，該聚合物或本發(fā)明綴合物的非松弛素部分可以含有被認為親脂性高于親水性的原子的基團(例如具有約2至8-12個碳原子的碳鏈)，然而，如果這樣的一個或多個基團的存在不能有效地顯著改變聚合物或綴合物的親水性，那么本發(fā)明綴合物中可含有此種部分。也就是說，通過松弛素、松弛素多肽和松弛素類似物的位點特異性突變，本發(fā)明的松弛素綴合物自身可展現(xiàn)出親水性，而不是親脂性或兩親性。在其中可存在親脂性部分的本發(fā)明某些實施方案中，所述部分優(yōu)選不被定位在PEG鏈的末端。用于本發(fā)明綴合物的支化PEG包括國際專利公布W096/21469中描述的那些PEG，所述專利公布的內(nèi)容明確地以引用的方式完整地并入本文。一般地，支化PEG可用式R(PEG-OH).sub.η表示，其中R表示中心“核心”分子并且.sub.η表示臂的數(shù)目。支化PEG具有中心核心，2個或更多個“PEG”臂從所述中心核心伸出。在支化構型中，支化聚合物核心具有用于與松弛素連接的單個反應性位點。用于本發(fā)明的支化PEG通常將包含少于4個PEG臂，并且更優(yōu)選將包含少于3個PEG臂。支化PEG提供的優(yōu)點是:其具有與其線性PEG對應物相比與更大且更致密的聚合物云狀物偶聯(lián)的單個反應性位點。一種特定類型的支化PEG可表示為(MeO -PEG-).sub.p R—X，其中p等于2或3，R為連接有2或3個PEG臂的中心核心結構如賴氨酸或甘油，并且X表示任何被活化或可被活化用于與松弛素偶聯(lián)的合適官能團。一種特別優(yōu)選的支化PEG為具有結構mPEG2-賴氨酸-琥珀酰亞胺的mPEG2-NHS(Shearwater Corporation, Alabama)。在又一種支化結構中，“側鏈PEG”具有沿PEG主鏈被定位而不是被定位在PEG鏈末端的用于偶聯(lián)蛋白質(zhì)的反應性基團。從PEG主鏈伸出以與松弛素偶聯(lián)的反應性基團可以相同或不同。側鏈PEG結構可能是有用的，但是一般是次優(yōu)選的，特別是對于吸入用組合物而H?；蛘?，PEG-松弛素綴合物的PEG部分可以具有叉狀結構，其具有位于聚合物鏈的一端的支化部分，和兩個(或2的任何倍數(shù)個)與所述支化部分連接的游離反應性基團以與松弛素連接。示例性叉狀PEG描述于國際專利公布第W099/45964號中，所述專利公布的內(nèi)容明確地以引用的方式并入本文。叉狀聚乙二醇可任選地包括位于聚合物鏈的另一端的烷基或“ R”基團。更具體來說，根據(jù)本發(fā)明的叉狀PEG-松弛素綴合物具有式:R-PEG-L (Y-松弛素)n，其中R為烷基，L為水解穩(wěn)定的支化點，并且Y為提供叉狀聚合物與松弛素的化學連接的連接基團，并且η為2的倍數(shù)。L可表示單個“核心”基團，如“一CH--”，或者可包含較長的原子鏈。示例性L基團包括賴氨酸、甘油、季戊四醇，或山梨糖醇。通常，支化部分內(nèi)的特定支化原子是碳。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，叉狀PEG與松弛素分子的鍵(Y)是水解穩(wěn)定的。在優(yōu)選的實施方案中，η為2。在與松弛素上的反應性位點綴合之前的合適的Y部分包括但不限于活性酯、活性碳酸酯、醛、異氰酸酯、異硫氰酸酯、環(huán)氧化物、醇、馬來酰亞胺、乙烯砜、酰肼、二硫代吡啶，和碘乙酰胺。合適的活化基團的選擇將視松弛素分子上的預期連接位點而定，并且可易于由本領域的技術人員確定。所產(chǎn)生的PEG-松弛素綴合物中的相應Y基團是由活化叉狀聚合物與松弛素上的合適反應性位點反應所產(chǎn)生的Y基團。此種最終鍵(final linkage)的特定特性對于本領域技術人員將是明顯的。例如，如果反應性叉狀PEG含有活化酯，如琥珀酰亞胺或馬來酰亞胺酯，那么經(jīng)由松弛素上的胺位點綴合將導致形成相應酰胺鍵。這些特定叉狀聚合物特別吸引人，因為它們提供松弛素與PEG的摩爾比為
2: I或更大的綴合物。此類綴合物不太可能阻斷松弛素受體位點，同時仍提供用于保護松弛素免受例如由松弛素降解酶所致的酶促降解的設計方面的靈活性。在相關的實施方案中，叉狀PEG-松弛素綴合物可以用于本發(fā)明中，并由式R-[PEG-L(Y-松弛素)2] η表示。在這種情況下，R表示連接有至少一種PEG- 二 -松弛素綴合物的非天然編碼氨基酸。具體來說，根據(jù)本發(fā)明這個方面的優(yōu)選叉狀聚合物是其中η選自由1、2、3、4、5和6組成的組的那些聚合物。在替代實施方案中，介于松弛素、松弛素多肽或松弛素類似物中的非天然氨基酸與聚合物分支點之間的化學鍵是可降解的(即水解不穩(wěn)定)?；蛘?，一個或多個可降解鍵可以包含在聚合物骨架中，從而允許在活體內(nèi)產(chǎn)生PEG鏈比最初施用的綴合物中的PEG鏈小的PEG-松弛素綴合物。例如，可以施用大且相對惰性的綴合物(即連接有一個或多個高分子量PEG鏈，例如一個或多個分子量超過約10，000的PEG鏈，其中該綴合物基本上不具有生物活性)，其隨后在肺中或在血流中水解從而產(chǎn)生具有最初存在的PEG鏈的一部分的生物活性綴合物。在水解可降解鍵在活體內(nèi)裂解后，游離松弛素(視可降解鍵的位置而定)或連接有小聚乙烯標簽的松弛素然后被釋放并且更容易通過肺被吸收和/或在血液中循環(huán)。

在本發(fā)明這個實施方案的一個特征中，在施用后，完整聚合物-綴合物在水解之前被最低限度地降解，使得可裂解鍵的水解有效地控制活性松弛素進入血流的緩慢釋放速率，這與松弛素在釋放到全身循環(huán)中之前的酶促降解相反。合適的生理學上可裂解的鍵包括但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、縮醛，和縮酮。此類綴合物應具有生理學上可裂解的鍵，其在儲存后和施用后是穩(wěn)定的。例如，PEG-可裂解鍵-松弛素綴合物在被制造成最終藥物組合物后、在溶解于合適的遞送媒介物(如果使用)中后，以及在施用(不論什么途徑)后應當維持它的完整性。因而，在本發(fā)明的另一個實施方案中，將一種或多種非天然編碼氨基酸摻入到單鏈松弛素或單鏈松弛素類似物中。在一些實施方案中，本發(fā)明多肽在信號序列中包含一個或多個非天然編碼氨基酸取代、添加或缺失。在一些實施方案中，本發(fā)明多肽在松弛素或本說明書中所公開的任何松弛素類似物或多肽的信號序列中包含一個或多個非天然編碼氨基酸取代、添加或缺失。在一些實施方案中，本發(fā)明多肽在信號序列中包含一個或多個天然編碼氨基酸取代、添加或缺失，以及在松弛素或本說明書中所公開的任何松弛素類似物或多肽的信號序列中包含一個或多個非天然編碼氨基酸取代、添加或缺失。在一些實施方案中，將一種或多種非天然氨基酸摻入到松弛素或本說明書中所公開的任何松弛素類似物或多肽的前導序列或信號序列中。在一些實施方案中，松弛素多肽包含調(diào)節(jié)松弛素多肽對松弛素多肽受體或結合搭配物的親和力的取代、添加或缺失，所述松弛素多肽受體或結合搭配物包括但不限于蛋白質(zhì)、多肽、小分子或核酸。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素的穩(wěn)定性相比，所述取代、添加或缺失增加松弛素多肽的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性和/或溶解性可以使用本領域普通技術人員已知的許多不同測定法來測量。此類測定法包括但不限于SE-HPLC和RP-HPLC。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素的免疫原性相比，所述取代、添加或缺失調(diào)節(jié)松弛素多肽的免疫原性。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素的血清半衰期或循環(huán)時間相比，所述取代、添加或缺失調(diào)節(jié)松弛素多肽的血清半衰期或循環(huán)時間。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素的水溶解性相比，所述取代、添加或缺失增加松弛素多肽的水溶解性。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素的溶解性相比，所述取代、添加或缺失增大宿主細胞中所產(chǎn)生的松弛素多肽的溶解性。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素的表達或合成相比，所述取代、添加或缺失增加松弛素多肽在宿主細胞中的表達或增加活體外合成。包含這種經(jīng)取代松弛素多肽保留了激動劑活性，并且保留或提高了在宿主細胞中的表達水平。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素的蛋白酶抗性相比，所述取代、添加或缺失增大松弛素多肽的蛋白酶抗性。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與松弛素受體在與無取代、添加或缺失的相應松弛素多肽相互作用后的信號轉導活性相比，所述取代、添加或缺失調(diào)節(jié)松弛素受體的所述信號轉導活性。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素多肽與另一種分子如受體的結合相比，所述取代、添加或缺失調(diào)節(jié)松弛素多肽與所述另一種分子的結合。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相 應松弛素多肽的抗病毒活性相比，所述取代、添加或缺失調(diào)節(jié)松弛素多肽的抗病毒活性。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素多肽的葡萄糖代謝活性相比，所述取代、添加或缺失增強松弛素多肽的葡萄糖代謝活性。在一些實施方案中，松弛素多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應松弛素與藥物防腐劑(例如間甲酚、苯酚、芐醇)的相容性相比，所述取代、添加或缺失增大松弛素多肽與所述藥物防腐劑的相容性。這種增大的相容性將使得能夠制備在儲存期間維持蛋白質(zhì)的生理化學性質(zhì)和生物活性的防腐藥物制劑。在一些實施方案中，用一種或多種非天然氨基酸產(chǎn)生一個或多個工程改造鍵。分子內(nèi)鍵可以用許多方式產(chǎn)生，包括但不限于在合適的條件下蛋白質(zhì)中的兩種氨基酸之間的反應(兩種氨基酸之一或二者可為非天然氨基酸)；在合適的條件下與兩種氨基酸(其中每一種氨基酸均可以為天然編碼或非天然編碼氨基酸)、與連接子、聚合物或其它分子的反應；等。在一些實施方案中，松弛素多肽中的一個或多個氨基酸取代可以利用一種或多種天然存在的氨基酸或非天然編碼氨基酸進行。在一些實施方案中，松弛素多肽中的氨基酸取代可以利用天然存在的氨基酸或非天然編碼氨基酸進行，但是至少一個取代是利用非天然編碼氨基酸進行。在一些實施方案中，松弛素多肽中的一個或多個氨基酸取代可以利用一種或多種天然存在的氨基酸進行，并且另外，至少一個取代是利用非天然編碼氨基酸進行。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙?；毖趸?、肼基、酰肼基、氨基脲基(semicarbazide)、疊氮基,或炔基。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實施方案中，非天然編碼氨基酸具有以下結構:
權利要求
1.一種松弛素多肽，其包含一種或多種非天然編碼氨基酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一種或多種翻譯后修飾。
3.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述多肽與連接子、聚合物，或生物活性分子連接。
4.根據(jù)權利要求3所述的松弛素類似物多肽，其中所述多肽與水溶性聚合物連接。
5.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述多肽與雙官能聚合物、雙官能連接子，或至少一種另外的松弛素多肽連接。
6.根據(jù)權利要求5所述的松弛素多肽，其中所述雙官能連接子或聚合物與第二多肽連接。
7.根據(jù)權利要求6所述的松弛素多肽，其中所述第二多肽是松弛素多肽。
8.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
9.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物與所述松弛素多肽中存在的非天然編碼氨基酸連接。
10.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下位置處的殘基組成的組的位置處被取代:位置I (即，在N-端)之前、位置1、2、3、4、5、6、7、8、·9·、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、·34、·35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 (即，在所述蛋白質(zhì)的羧基端)，及其任何組合(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQ ID NO:2或3中的相應氨基酸)。
11.根據(jù)權利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的組的位置處被取代:SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2和3中的相應氨基酸的1、2、·5、13、18、29、31、52及其任何組合。
12.根據(jù)權利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下組成的組的位置處被取代:SEQ ID N0:4或在SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3中的相應氨基酸的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25(即，在所述蛋白質(zhì)的羧基端)及其任何組合。
13.根據(jù)權利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下組成的組的位置處被取代:SEQ ID N0:4或在SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3中的相應氨基酸的2、5、18及其任何組合。
14.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下組成的組的位置處被取代:SEQ ID NO:5 或在 SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:6中的相應氨基酸的5、7、18、28及其任何組合。
15.根據(jù)權利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在位置1(SEQIDNO:1，或者SEQ ID NO:2或3的相應氨基酸)處被取代。
16.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下位置處的殘基組成的組的位置處被取代:位置I (即，在N-端)之前、位置1、2、3、4、5、6、7、8、·9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、·34、·35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 (即，在所述蛋白質(zhì)的羧基端)，及其任何組合(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQ ID NO:2或3中的相應氨基酸)。
17.根據(jù)權利要求16所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的組的位置處被取代:SEQ ID NO:1或在SEQ ID N0:2或3中的相應氨基酸的殘基1、2、5、13、18、29、31、52，及其任何組合。
18.根據(jù)權利要求16所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的組的位置處被取代:殘基1、2、5、13、18、29，及其任何組合(SEQ ID NO:1或在SEQID N0:2或3中的相應氨基酸)。
19.根據(jù)權利要求16所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的組的位置處被取代:殘基1、25及其任何組合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID N0:2或3中的相應氨基酸)。
20.根據(jù)權利要求16所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在位置1(SEQIDNO:1，或者SEQ ID NO:2或3的相應氨基酸)處被取代。
21.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在位置1、2、5、13、18、25、29、31、52 (SEQ ID NO:1，或者SEQ ID NO: 2的相應氨基酸)處被取代。
22.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一個或多個調(diào)節(jié)所述松弛素多肽對松弛素受體的親和性的氨基酸取代、添加或缺失。
23.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一個或多個增加所述松弛素多肽的穩(wěn)定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
24.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一個或多個增加所述松弛素多肽在重組宿主細胞中的表達或所述松弛素多肽的活體外合成的氨基酸取代、添加或缺失。``
25.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一個或多個增加所述松弛素多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
26.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸對不能另外與所述多肽中的20種常見氨基酸中的任一種反應的連接子、聚合物或生物活性分子具有反應性。
27.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、餅基、酸餅基、氣基服基、置氣基或塊基。
28.根據(jù)權利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基。
29.根據(jù)權利要求28所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結構:
30.根據(jù)權利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基。
31.根據(jù)權利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含酰肼基。
32.根據(jù)權利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含肼基。
33.根據(jù)權利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。
34.根據(jù)權利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。
35.根據(jù)權利要求34所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結構:
36.根據(jù)權利要求27所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔基。
37.根據(jù)權利要求36所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結構:
38.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于約0.1kDa與約IOOkDa之間的分子量。
39.根據(jù)權利要求38所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于約0.1kDa與約50kDa之間的分子量。
40.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其是通過使包含含羰基的氨基酸的松弛素多肽與包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反應來制備。
41.根據(jù)權利要求40所述的松弛素多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基是通過酰胺鍵與所述水溶性聚合物連接。
42.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其是通過使包含羰基的水溶性聚合物與包含含有氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然編碼氨基酸的多肽反應來制備。
43.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其是通過使包含含炔的氨基酸的松弛素多肽與包含疊氮部分的水溶性聚合物反應來制備。
44.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其是通過使包含含疊氮基的氨基酸的松弛素多肽與包含炔部分的水溶性聚合物反應來制備。
45.根據(jù)權利要求27所述的松弛素多肽，其中所述疊氮基或炔基是通過酰胺鍵與水溶性聚合物連接。
46.根據(jù)權利要求4所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物是支化或多臂聚合物。
47.根據(jù)權利要求46所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物的每個分支具有介于約IkDa與約IOOkDa之間的分子量。
48.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述多肽為松弛素拮抗劑。
49.根據(jù)權利要求48所述的松弛素多肽，其中所述多肽包含一種或多種翻譯后修飾、連接子、聚合物或生物活性分子。
50.根據(jù)權利要求49所述的松弛素多肽，其中所述聚合物包含選自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)組成的組的部分。
51.根據(jù)權利要求48所述的松弛素多肽，其中所述多肽阻止所述松弛素受體的活化。
52.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含糖部分。
53.根據(jù)權利要求3所述的松弛素多肽，其中所述連接子、聚合物或生物活性分子是經(jīng)由糖部分與所述多肽連接。
54.一種分離核酸，其包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 12或編碼SEQ ID ΝΟ:1或2或3的多核苷酸序列雜合的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一個選擇密碼子。
55.根據(jù)權利要求54所述的分離核酸，其中所述選擇密碼子選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子和四堿基密碼子組成的組。
56.一種制備根據(jù)權利要求3所述的松弛素多肽的方法，所述方法包括使包含非天然編碼氨基酸的分離松弛素多肽與包含與所述非天然編碼氨基酸反應的部分的連接子、聚合物或生物活性分子接觸。
57.根據(jù)權利要求56所述的方法，其中所述聚合物包含選自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)組成的組的部分。
58.根據(jù)權利要求56所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、餅基、氣基服基、置氣基或塊基。
59.根據(jù)權利要求56所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基部分，并且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
60.根據(jù)權利要求59所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通過酰胺鍵與所述連接子、聚合物或生物活性分子連接。
61.根據(jù)權利要求56所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔部分，并且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含疊氮部分。
62.根據(jù)權利要求56所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含疊氮部分，并且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
63.根據(jù)權利要求58所述的方法，其中所述疊氮部分或炔部分通過酰胺鍵與連接子、聚合物或生物活性分子連接。
64.根據(jù)權利要求57所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于約0.1kDa與約IOOkDa之間的平均分子量。
65.根據(jù)權利要求57所述的方法，其中所述(聚乙二醇)部分是支化或多臂聚合物。
66.一種組合物，其包含根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽和藥學上可接受的載體。
67.根據(jù)權利要求66所述的組合物，其中所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
68.一種治療患有由松弛素調(diào)節(jié)的病癥的患者的方法，其包括向所述患者施用治療有效量的根據(jù)權利要求66所述的組合物。
69.—種細胞，其包含根據(jù)權利要求54所述的核酸。
70.根據(jù)權利要求69所述的細胞，其中所述細胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
71.一種制備包含非天然編碼氨基酸的松弛素多肽的方法，所述方法包括在允許所述包含非天然編碼氨基酸的松弛素多肽表達的條件下培養(yǎng)包含一種或多種包含選擇密碼子的編碼松弛素多肽的多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的細胞；以及純化所述松弛素多肽。
72.—種調(diào)節(jié)松弛素多肽的血清半衰期或循環(huán)時間的方法，所述方法包括用一種或多種非天然編碼氨基酸取代所述松弛素多肽中的任何一種或多種天然存在氨基酸。
73.一種由具有SEQ ID NO: 12中所示的序列或編碼SEQ ID NO: 1、2或3所示的多肽的多核苷酸編碼的松弛素多肽，其中所述多核苷酸包含選擇密碼子，并且其中所述多肽包含至少一種非天然編碼氨基酸。
74.根據(jù)權利要求73所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與連接子、聚合物、水溶性聚合物，或生物活性分子連接。
75.根據(jù)權利要求74所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
76.根據(jù)權利要求73所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由在以下位置處的殘基組成的組的位置處被取代:位置I (即，在N端)之前、位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 (即，在所述蛋白質(zhì)的羧基端)及其任何組合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2中的相應氨基酸)。
77.根據(jù)權利要求76所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的組的位置處被取代:SEQ ID NO:1或在SEQIDN0:2或3中的相應氨基酸的殘基1、2、5、13、18、29、31、52 及其任何組合。
78.根據(jù)權利要求76所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的組的位置處被取代:殘基2、5、13、18、29、31、52及其任何組合(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:2中的相應氨基酸)。
79.根據(jù)權利要求76所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的組的位置處被取代:殘基1、2、5、13、18及其任何組合(SEQ ID N0:1或在SEQ IDN0:2或3中的相應氨基酸)。
80.根據(jù)權利要求76所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在位置1(SEQIDNO:1或在SEQ ID NO:2或3中的相應氨基酸)處被取代。
81.根據(jù)權利要求73所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在位置2(SEQIDNO:1或在SEQ ID NO:2或3中的相應氨基酸)處被取代。
82.根據(jù)權利要求73所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酸餅基、餅基、氣基服基、置氣基或塊基。
83.根據(jù)權利要求75所述的松弛素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于約0.1kDa與約IOOkDa之間的分子量。
84.根據(jù)權利要求75所述的松弛素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分是支化或多臂聚合物。
85.根據(jù)權利要求84所述的松弛素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于約IkDa與約IOOkDa之間的分子量。
86.—種組合物，其包含根據(jù)權利要求73所述的松弛素多肽和藥學上可接受的載體。
87.一種松弛素多肽，其包含一個或多個增加所述松弛素多肽在重組宿主細胞中的表達的氨基酸取代、添加或缺失。
88.一種松弛素多肽，其包含通過共價鍵在單一氨基酸處與所述松弛素多肽連接的水溶性聚合物。
89.根據(jù)權利要求88所述的松弛素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
90.根據(jù)權利要求88所述的松弛素多肽，其中所述與所述水溶性聚合物共價連接的氨基酸是非天然編碼氨基酸。
91.根據(jù)權利要求10所述的松弛素多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與聚(乙二醇)分子連接。
92.一種松弛素多肽，其包含至少一種連接子、聚合物或生物活性分子，其中所述連接子、聚合物或生物活性分子通過經(jīng)核糖體摻入到所述多肽中的非天然編碼氨基酸的官能團與所述多肽連接。
93.根據(jù)權利要求92所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽經(jīng)單聚乙二醇化。
94.一種松弛素多肽，其包含與一種或多種非天然編碼氨基酸連接的連接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然編碼氨基酸經(jīng)核糖體摻入到所述多肽中的預選位點處。
95.根據(jù)權利要求94所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一種所述連接子、聚合物或生物活性分子。
96.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一個或多個調(diào)節(jié)施用所述多肽后患者的血管新生的氨基酸取代、添加或缺失。
97.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一個或多個調(diào)節(jié)所述松弛素多肽的血清半衰期或循環(huán)時間的氨基酸取代、添加或缺失。
98.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含一個或多個調(diào)節(jié)施用所述多肽后患者的血管收縮的氨基酸取代、添加或缺失。
99.根據(jù)權利要求1所述的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽也包含天然編碼氨基酸取代。
全文摘要
本發(fā)明提供了經(jīng)修飾松弛素多肽及其用途。
文檔編號C07K1/107GK103201285SQ201180050176
公開日2013年7月10日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權日2010年8月17日
發(fā)明者V.克拉伊諾夫, N.克努森, A.赫維特, K.德蒂奧斯, J.平克斯塔夫, L.蘇利文 申請人:阿姆布?？怂构煞萦邢薰?br>