專利名稱：用于檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(rpl)、先兆子癇(pe)和/或胎兒生長受限(fgr)的傾向 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷或檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrentpregnancy loss, RPL)、先兆子癇(preeclampsia, PE)和 / 或胎兒生長受限(fetal growthrestriction, FGR)的傾向的方法,所述方法包括檢查從預(yù)期生物學(xué)父親或生物學(xué)父親獲得的樣品中的人膜聯(lián)蛋白Α5 (ΑΝΧΑ5)啟動子，并檢測其中的核苷酸交換，其中存在(i)和/或
(ii)中定義的核苷酸交換就表明所述女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。本發(fā)明還涉及包含人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子的核酸序列，該啟動子包含本文所定義的特定核苷酸交換，可用于本文所公開的方法。本發(fā)明進一步涉及一種用于本文所公開的診斷方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
膜聯(lián)蛋白A5具有膜聯(lián)蛋白家族的基本特性，但它是一個可在細(xì)胞外發(fā)現(xiàn)的家族成員[I]。它可以通過各種機制抑制凝血[2，3]。特定組織中對ANXA5基因表達(dá)的調(diào)控大部分是未知的。膜聯(lián)蛋白A5大量且廣泛分布，主要是在腎臟、肝臟和胎盤中[4]。人ANXA5基因可生成幾個轉(zhuǎn)錄物，且有復(fù)雜的啟動子[5]。膜聯(lián)蛋白A5也被稱為胎盤抗凝蛋白。在抗磷脂抗體存在的情況下，已檢測到膜聯(lián)蛋白A5在胎盤滋養(yǎng)層絨毛中的表達(dá)降低[6]，這也已經(jīng)通過免疫組化在先兆子癇患者(PE)中得到了證實[7]。最近，我們觀察到能降低ANXA5基因啟動子活性的序列變化(M2單倍型)是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)的危險因素[8]。與正常對照相比，M2單倍型攜帶者胎盤中ANXA5mRNA的表達(dá)下降，而在患有產(chǎn)科并發(fā)癥(PE和胎兒生長受限，F(xiàn)GR)的女性中，其表達(dá)低于無妊娠并發(fā)癥的對照組[9]。針對M2在RPL和其他產(chǎn)科并發(fā)癥中所發(fā)揮的作用的最新研究證實了我們最初的發(fā)現(xiàn)，并披露妊娠相關(guān)高血壓障礙的風(fēng)險升高，以及早期胎兒損失事件的更高可能性[10]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種用于診斷女性患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的工具和方法。本發(fā)明論述了這種需求，并提供了用于診斷女性上述疾病的方法。必須指出，如本文所用，除非上下文明示，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”涵蓋其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，當(dāng)提及“一種試劑”，就包括一種或多種不同的這樣的試劑，而當(dāng)提及“該方法”，就包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的、可改良或可替換本文所描述方法的等效步驟及方法。除非另有說明，在一系列元素之前的術(shù)語“至少”應(yīng)理解為指代該系列中每一個元素。至少一個包括，例如，一個、兩個、三個、四個、五個或甚至更多。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識或僅利用常規(guī)實驗就能確定本文所描述的本發(fā)明特定實施方式的多個等效方式。本發(fā)明意圖包含這些等效方式。除非上下文另有規(guī)定，貫穿本說明書始終以及下文的權(quán)利要求中的詞語“包含”及其變型，如“含有”和“包含著”，應(yīng)理解為指代含有某個指定整體或步驟，或某些整體或步驟的集合，但不排除任何其他整體或步驟、或整體或步驟的集合。本說明書全篇引用了若干文獻。無論上文或下文，本文所引用的每篇文獻(包括所有專利、專利申請、科學(xué)出版物、制造商的說明書、說明書等)，均以整體引用的形式并入本文。這些均不能理解為承認(rèn)本發(fā)明由于在先發(fā)明而無權(quán)早于此類公開。在目前的工作中，我們旨在追蹤攜帶M2單倍型的胎盤中能引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險升高的ANXA5mRNA的等位基因特異性表達(dá)，以便直接證實M2在相關(guān)器官中的作用。與正常的等位基因相比，雜合子胎盤中的M2等位基因?qū)е翧NXA5mRNA水平平均降低42%。這些樣品中的蛋白水平顯示出相當(dāng)大的差異，無法用統(tǒng)計學(xué)解釋。ANXA5的M2等位基因可與雜合子胎盤中mRNA水平降低相關(guān)聯(lián)，并可導(dǎo)致更有限的膜聯(lián)蛋白A5水平(表達(dá)動力學(xué)降低)。N/N和N/M2胎盤樣品中的ANXA5蛋白水平如下測定。在N/M2樣品中評價30 μ g提取蛋白中的歸一化的蛋白水平并與N/N樣品相比較，其中上樣對照(α-微管蛋白)和膜聯(lián)蛋白Α5檢測(圖2c)。兩個樣品組(N/N與N/M2胎盤相比)的蛋白定量是不可能用統(tǒng)計學(xué)來解釋的，因為多數(shù)組內(nèi)差異處于檢測極限或高于檢測極限好幾級。在一項近期的工作中，Sifakis等人[16]闡述了正常妊娠和FGR妊娠中mRNA表達(dá)的顯著差異，而蛋白水平卻不存在此種差異，但是作者沒有對其樣本進行M2/ANXA5基因分型。由于內(nèi)源性表達(dá)不是胎盤樣品中ANXA5的唯一來源，當(dāng)評價蛋白水平時，異質(zhì)性的組織切片是需要考慮的關(guān)鍵。在胎盤微環(huán)境中時機和局部表達(dá)的重要性在很大程度上仍不清楚。由于M2啟動子等位基因的較低響應(yīng)性，F(xiàn)GR樣品中所記錄的降低兩倍的蛋白濃度范圍[16]可能反映表達(dá)擾動。在胎兒發(fā)育過程中，在增強的相對于更增強的抗凝血胎盤組織微環(huán)境中，可能潛在地需要更廣的表達(dá)動力學(xué)。 本研究遵守所有相關(guān)機構(gòu)的倫理準(zhǔn)則。獲得所有被檢查的受試者的知情同意書。同樣設(shè)想，從所有依據(jù)本發(fā)明的方法進行檢查的受試者(或其法定監(jiān)護人)均獲得了知情同意書。胎盤樣品中ANXA5等位基因的mRNA定量如下進行。用于擴增正常(N)和單倍型M2(M2)等位基因的特定ANXA5mRNA擴增格式采用最后一個核苷酸具有G/A變化的引物，這與M2單倍型中最后一個置換(76G>A[8])相對應(yīng)，且被所有檢測的ANXA5轉(zhuǎn)錄物共有(圖la)。用橋接外顯子I和外顯子2的寡核苷酸作為反向引物。在各自的退火溫度下，通過直接產(chǎn)物可視化(

圖1b)以及熔解曲線分析(圖1c)驗證了以這種格式進行的等位基因特異性擴增。N/M2雜合子胎盤中N等位基因的平均表達(dá)(圖2a)約為正常純合子胎盤中表達(dá)的0.4倍，其中在中間50%的觀測值中的最大值為0.52 (p=0.000，隨機檢驗)。這表明不存在NANXA5mRNA對減少的M2ANXA5mRNA進行的等位基因補償。接下來，通過對M2和N表達(dá)進行比較，驗證了雜合子胎盤中M2等位基因表達(dá)減少(圖2b)，其是正常等位基因水平的0.42，其中在四分位范圍中的最大值為0.46。這印證了之前測量M2啟動子活性的結(jié)果，即為正常等位基因的37%-42%[8]。統(tǒng)計學(xué)評價中排除了一個呈現(xiàn)出異常低的、為正常范圍內(nèi)N表達(dá)的0.0lN的M2表達(dá)的樣本。大大出乎我們意料的是，所有N/M2樣品中M2ANXA5mRNA減少，而與M2等位基因的來源無關(guān)(在一個不和諧的基因型樣品中M2源于母方，而在另一個樣品中源于父方)。意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)各自胚胎的生物學(xué)父親是ANXA5風(fēng)險單倍型M2的供體時，M2ANXA5mRNA也減少了。特別地，不能預(yù)測的是，這樣的M2單倍型已經(jīng)可以預(yù)測復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)。然而，本發(fā)明人證明這已經(jīng)是很明顯的情形，即這樣的風(fēng)險單倍型M2可預(yù)測女性受試者患有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)。因此，在檢測生物學(xué)母親之外，或替代檢測生物學(xué)母親，使得檢測生物學(xué)父親或胚胎本身成為可能。因此，為檢測女性受試者的傾向而必須分析的遺傳物質(zhì)的來源不再限制于生物學(xué)母親(即胚胎的生物學(xué)母親)，但是，鑒于本發(fā)明的貢獻，現(xiàn)在也延伸至胚胎的生物學(xué)父親，或甚至胚胎本身。上述對于風(fēng)險單倍型M2的研究結(jié)果也應(yīng)該適用于風(fēng)險單倍型M1，因為已表明風(fēng)險單倍型Ml也能預(yù)測復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)，但在較小的程度上——詳見W02006/053725以及。
如W02006/053725和[8]中已公開，人ANXA5啟動子中可檢測到的風(fēng)險單倍型M2的特征在于以下四個核苷酸交換:(I)與SEQ ID N0.2的核苷酸186對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳，(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，和(4)與SEQ ID N0.2的核苷酸276對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳。W02006/053725和[8]中還公開了人ANXA5啟動子中可檢測到的風(fēng)險單倍型Ml的特征在于以下兩個核苷酸交換:(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，
(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃。本文中所使用的、并于圖3中所示的SEQ ID N0.2與W02006/053725中公開的SEQID N0.2 相對應(yīng)。所述 SEQ ID N0.2 示出了 Carcedo (2001)，Biochem.J.356，571-579 所公開的ANXA5啟動子的結(jié)構(gòu)。用于確定和/或檢測這些風(fēng)險單倍型的工具和方法是眾所周知的(參見如W02006/053725和[8])，本文將對此另行詳細(xì)披露。本發(fā)明的一個實施方式涉及用于診斷或檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的方法，所述方法包括:(a)檢查從預(yù)期生物學(xué)父親或生物學(xué)父親獲得的樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子，以檢測下述的核苷酸交換:(i)(I)與SEQ ID N0.2的核苷酸186對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳，(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，和(4)與SEQ ID N0.2的核苷酸276對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳 ；或(ii)(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，和(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，(b)確定是否存在(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換，其中存在(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)的傾向；以及其中存在(i)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。將會理解，本文所描述的實施方式的上下文中，文中所述的“生物學(xué)父親”使女性受試者懷孕。因此，本文所用的術(shù)語“生物學(xué)父親”是指本文所定義的女性受試者所懷的人胚胎的生物學(xué)父親。在一些實施方式中，女性受試者已經(jīng)懷孕，因此是生物學(xué)母親一在其他實施方式中，女性受試者尚未懷孕，因此是預(yù)期生物學(xué)母親。因此，術(shù)語“預(yù)期生物學(xué)父親”是指尚未使女性受試者懷孕的人男性受試者，但預(yù)期所述人男性受試者將使人女性受試者懷孕。在此期間，女性受試者也是“預(yù)期”生物學(xué)母親。一旦所述人男性受試者使女性受試者懷孕，則“預(yù)期生物學(xué)父親”成為“生物學(xué)父親”，而“預(yù)期生物學(xué)母親”成為“生物學(xué)母親”。如上文所述，本發(fā)明是基于以下令人驚奇的發(fā)現(xiàn):不論M2等位基的來源，所有N/M2樣品中的M2ANXA5mRNA均減少，即表明，可以通過檢測從生物學(xué)父親或預(yù)期生物學(xué)父親獲得的樣品的方式來檢測懷孕或未孕的女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。因此，本發(fā)明的方法包括預(yù)期生物學(xué)父親尚未使女性受試者懷孕的情形，即女性和/或預(yù)期生物學(xué)母親以及預(yù)期生物學(xué)父親計劃在懷孕前檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。這包括，例如，計劃生孩子的夫婦或計劃懷孕的女性，無論是自然受孕還是體外授精。本發(fā)明的方法還包括女性受試者已經(jīng)懷孕的情況。在這種情況下，可能仍然會想要檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向，無論是通過檢測生物學(xué)父親樣品的方式和/或通過檢測這樣的胚胎的胚胎樣品的方式(例如，通過絨毛膜活檢或羊膜穿刺術(shù)的方式都能獲得胚胎來源的樣品)。此外，還可設(shè)想檢測(預(yù)期)生物學(xué)母親，但不限于此。假設(shè)受精是在體外進行，即提高體外受精的方式，還設(shè)想在將體外受精胚胎植入所述女性受試者之前，分析從體外受精胚胎的桑椹胚期之前或期間獲得的單細(xì)胞樣品?！吧ｉ┡咂?”是指人胚胎形成的16細(xì)胞階段?！吧ｉ┡咂谥盎蚱陂g”是指，還可設(shè)想在16細(xì)胞期之前，例如在人胚胎形成的6-8細(xì)胞期的期間獲得單個細(xì)胞。體外受精(in vitro fertilisation, IVF)是一個眾所周知的過程,通過此過程精子在子宮外(在體外)使卵細(xì)胞受精。也可以設(shè)想，預(yù)期通過精子捐獻者懷孕的女性采用本發(fā)明的方法，以便在用各自精子捐獻者樣品對各自女性受試者進行體外受精之前，通過檢測各自精子捐獻者樣品的方式來檢測她們患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。因此，本發(fā)明，特別是本發(fā)明的方法，還包括用于選擇非風(fēng)險單倍型Ml或M2攜帶者的精子捐獻者的分層方法(stratification method)。因而,通過本發(fā)明的方法,可以檢測并繼而選擇在所有可能性的情況下都不會導(dǎo)致各自的女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的精子捐獻者。這些分層方法在當(dāng)母親的母系樣品已被檢測為非風(fēng)險單倍型Ml或M2攜帶者時特別有意義，因為在這種情況下，檢測預(yù)期生物學(xué)父親(例如精子捐獻者)是否為所述風(fēng)險單倍型攜帶者是非常重要的。如果是這樣的話，則選擇不同的精子捐獻者，優(yōu)選也不是風(fēng)險單倍型Ml或M2攜帶者的精子捐獻者，是合乎情理的。同樣地，在生物學(xué)母親(或預(yù)期生物學(xué)母親)不是風(fēng)險單倍型Ml或M2攜帶者(在母系樣品中檢測到)的情況下，檢測預(yù)期生物學(xué)父親或生物學(xué)父親是合理的，并特別在本發(fā)明的實施方式中提出。本發(fā)明首次證明，在所有N/M2樣品中M2風(fēng)險單倍型mRNA減少，無論風(fēng)險單倍型等位基因的來源，即母親和父親均可導(dǎo)致女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。因此，即使這樣的女性受試者是非風(fēng)險單倍型攜帶者(在母系樣品中檢測到)，生物學(xué)父親和/或預(yù)期生物學(xué)父親仍然可以導(dǎo)致上述傾向，因而也應(yīng)進行檢測。倘若胚胎的生物學(xué)父親或胚胎的生物學(xué)母親是風(fēng)險單倍型的雜合子攜帶者，也可以檢測所述胚胎的樣品(如本文所述的絨毛膜活檢樣品或單細(xì)胞樣品)，以檢測它是否是風(fēng)險單倍型攜帶者(例如在體外受精的情況下)。倘若生物學(xué)父親或生物學(xué)母親是風(fēng)險單倍型的純合子攜帶者，照此看來就無需檢測胚胎，因為風(fēng)險單倍型Ml或M2的雜合出現(xiàn)已表明各自女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。倘若生物學(xué)父親是不明的或未知的，而女性受試者(在這種情況下是生物學(xué)母親)又是非Ml或M2風(fēng)險單倍型攜帶者，可能還是想檢測各自女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向——在這種情況下，可設(shè)想檢測源于胚胎的樣品(如絨毛膜活檢和/或羊膜穿刺樣品一然而，將會被理解，優(yōu)選不要純粹是因為女性受試者想要檢測其患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向，而獲得胚胎樣品——而要設(shè)想只有當(dāng)手邊已有出于其他原因而獲得的源于胚胎的樣品時，才對所述樣品進行檢測)。本文所述的女性受試者、生物學(xué)父親和/或預(yù)期生物學(xué)父親優(yōu)選為歐亞人。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent pregnancy loss, RPL)的典型特征是發(fā)生兩次或更多次的終止于胎兒流產(chǎn)的妊娠。所述兩次或更多次的妊娠是連續(xù)或間歇發(fā)生地，優(yōu)選連續(xù)發(fā)生。先兆子癇 (pre-eclampsia, PE)是懷孕期間出現(xiàn)高血壓(妊娠高血壓)的醫(yī)學(xué)病癥。胎兒生長受限(或胎兒發(fā)育遲緩)是胎兒沒有適當(dāng)?shù)厣L的病癥。當(dāng)，例如，宮高比預(yù)計少3cm以上時，可為疑似FGR?？梢栽O(shè)想，在本發(fā)明的方法中，所述從預(yù)期生物學(xué)父親和/或生物學(xué)父親獲得的樣品為血液樣品、精子樣品、組織樣品或細(xì)胞樣品。將理解，只要各自樣品含有允許檢測/診斷本發(fā)明方法的受試者的遺傳物質(zhì)，任何生物樣品都是合適的。這種樣品可以通過活檢如針刺活檢、外科手術(shù)活檢，通過任何種類的涂片技術(shù)，例如通過使用頰粘膜拭子等，或其他方法獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚知道其他手段和方法，從而使他或她能夠從人受試者獲得含有遺傳物質(zhì)的樣品。將理解，本發(fā)明的生物樣品是非母系起源的?！胺悄赶怠笔侵笜悠凡话蚧旧喜话瑥谋景l(fā)明所述(預(yù)期)生物學(xué)母親(女性受試者)獲得的遺傳物質(zhì)的污染。“基本上不”由此意指，如果從本發(fā)明所述(預(yù)期)生物學(xué)母親(女性受試者)的遺傳物質(zhì)的污染不妨礙對非母系起源樣品進行可靠的風(fēng)險單倍型檢測，則這種污染就是可以接受的。本領(lǐng)
域技術(shù)人員清楚知道如何避免或規(guī)避這種污染-相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)在例如“General standards
and guidelines for prenatal testing are available from the American College ofMedical Genetics (2006 年版的 Standards and guidelines for clinical geneticslaboratories), http://www.acmg.net/Pages/ACMG_Activities/stds-2002/g.htm” 中總結(jié)。然而母系樣品不排除從本發(fā)明的女性受試者獲得的樣品——例如，絨毛膜活檢或羊膜穿刺樣品是從女性受試者獲得的，但是倘若它不包括相對數(shù)量的來自各自女性受試者的細(xì)胞(遺傳物質(zhì))，它就是非母系樣品。“遺傳物質(zhì)”包括可以從本發(fā)明的生物學(xué)樣品獲得的、并允許通過標(biāo)準(zhǔn)核酸檢測技術(shù)進行風(fēng)險單倍型Ml或M2檢測的所有種類的核酸序列。特別地，非母系樣品是胎兒來源或父系來源的樣品——將理解，作為父系樣品供體的各自“父親”是文中所述的(預(yù)期)生物學(xué)父親，而“胚胎”(胎兒樣品的供體)是女性受試者體內(nèi)的胚月臺。因此，本文所用的“母系樣品”是指其排他性地反映女性受試者的基因型的樣品。例如，從女性受試者獲得的血液是母系樣品，而通過絨毛膜活檢或羊膜穿刺或其他等等獲得的樣品不是母系樣品(或是非母系來源的樣品)。如W02006/053725中記載，在由于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)而檢查不同的遺傳性血栓基因缺陷的女性中，在膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)基因中令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了 ANXA5 (BamHI)啟動子區(qū)域的一個遺傳變體。這種變體由四種核苷酸置換組成，這些都作為單倍型遺傳。這四種變化對膜聯(lián)蛋白A5啟動子的活 性是很重要的，并導(dǎo)致基因表達(dá)減少。如本文所定義，與此特別相關(guān)的是四個點突變，其特征為“-19G變?yōu)锳”，“ IA變?yōu)镃”，“27T變?yōu)镃”和“76G變?yōu)锳”，其中“G”表示鳥嘌呤，“C”表示胞嘧啶，“A”表示腺嘌呤，“T”表示胸腺嘧啶。本文所述的突變/置換的位置“_19”、“1”、“27”和“76”與示出了 ANXA5核心啟動子結(jié)構(gòu)的附圖4中所給出的序列編號相關(guān)。該編號特別與基因的第一轉(zhuǎn)錄起始位點(tspl，以“+I ”表示)相關(guān)。然而，相應(yīng)的置換/突變還被定義為與表示ANXA5啟動子的特定序列相關(guān)，并特別在 SEQ ID N0.2 (Carcedo (2001)，Biochem.J.356，571-579 中公開的 ANXA5 啟動子結(jié)構(gòu))中示出。所述SEQ ID NO:2在本文的圖3中示出。此外，本文所示的SEQ ID N0.2還與以整體并入本文的W02006/053725所示的SEQID N0.2相符。可用于替代性地確定人ANXA5啟動子中核苷酸位置的其他序列在所引用的W02006/053725中已有描述，特別是在所述文件(以引用的方式并入本文)的第3頁和第4頁。不能排除的是，單倍型M2或Ml所賦予的風(fēng)險可被其他存在于非歐亞人群的其他群體中的ANXA5基因啟動子區(qū)域的SNP (如圖4和圖6所示，SEQ ID N0.3)在一定程度上改變。通過對ANXA5啟動子區(qū)域進行核酸測序，可以將這些群體的代表性樣品中的這些替代和/或額外SNP鑒定出來，所述核酸測序是技術(shù)人員公知的，并在本文中進行描述。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷或檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的方法，所述方法包括:(a)檢查從所述女性獲得的絨毛膜活檢或羊膜穿刺樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)啟動子，以檢測下述的核苷酸交換:( i)(I)與SEQ ID N0.2的核苷酸186對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳，(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，和(4)與SEQ ID N0.2的核苷酸276對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳 ；或(ii)(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，和
(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，(b)確定是否存在(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換，其中存在(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)的傾向；以及其中存在(i)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。以上提到的絨毛膜活檢和/或羊膜穿刺應(yīng)優(yōu)選不是因為女性受試者和/或預(yù)期生物學(xué)父親(和/或各對夫婦)只是為了檢測所述女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的意愿而進行的。本發(fā)明進一步涉及一種用于診斷或檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的方法，所述方法包括:(a)在將體外受精胚胎植入所述女性受試者之前，檢查從體外受精胚胎的桑椹胚期之前或期間獲得的單細(xì)胞樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子，以檢測以下核苷酸交換:(i )(I)與SEQ ID N0.2的核苷酸186對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳，(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，和(4)與SE Q ID N0.2的核苷酸276對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳 ；或(ii)(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，和(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，(b)確定是否存在(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換，其中存在(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)的傾向；以及其中存在(i)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。正如前面提到的，設(shè)想在生物學(xué)母親(或預(yù)期生物學(xué)母親)是非風(fēng)險單倍型Ml或M2攜帶者(在母系樣品中檢測到)的情況下，檢測預(yù)期生物學(xué)父親或生物學(xué)父親。同樣地，還可以設(shè)想在生物學(xué)父親(或預(yù)期生物學(xué)父親)是非風(fēng)險單倍型Ml或M2攜帶者的情況下，檢測預(yù)期生物學(xué)母親或生物學(xué)母親。因此，還設(shè)想本文上述方法可進一步包括以下步驟:(c)檢查從所述女性受試者獲得的母系樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子，以檢測前述權(quán)利要求中任一項的(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換，和(d)確定是否存在前述權(quán)利要求中的(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換。上述方法在(預(yù)期)生物學(xué)父親已被檢測為“陰性”，即父親是非風(fēng)險單倍型Ml或M2攜帶者的情況下，特別有用。在一個進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及一種上文所述的方法，其中所述女性受試者是通過檢查從所述女性獲得的母系樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子來檢測前述權(quán)利要求中任一項的(i)或(ii)中定義的核苷酸交換的方式，已經(jīng)被診斷為具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的受試者。在一個進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及一種上文所述的方法，其中所述女性受試者是通過檢查從所述女性獲得的母系樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子來檢測前述權(quán)利要求中任一項的(i)或(ii)中定義的核苷酸交換的方式，已經(jīng)被診斷為不具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的受試者。這些方法特別涉及在確定(預(yù)期)生物學(xué)父親或胚胎(后者可以通過在體外授精過程中檢測單個細(xì)胞的方式，或者通過檢測胚胎來源樣品的方式，所述樣品如絨毛膜活檢等)的風(fēng)險單倍型之前確定母親的風(fēng)險單倍型的情況。本發(fā)明還涉及如上文所述的方法，其中通過核酸檢測技術(shù)來檢測在:(i )(I)與SEQ ID N0.2的核苷酸186對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳，(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，和(4)與SEQ ID N0.2的核苷酸276對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳 ；或(ii)(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，和(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，中定義的核苷酸交換?！昂怂釞z測技術(shù)”是技術(shù)人員所熟知的，并特別包括任何種類的基于PCR的技術(shù)或任何其它允許鑒定表征風(fēng)險單倍型Ml和/或M2的核苷酸交換的適用技術(shù)。這些方法在本文中闡述(參見實施例)，也在例如[8]中或在W02006/053725中公布。所述技術(shù)可非限制性地選自，試舉幾種，雜交技術(shù)、核酸測序、PCR、限制性片段測定，單核苷酸多態(tài)性(SNP)測定、LCR (連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)測定。相應(yīng)的例子和進一步的細(xì)節(jié)可從標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)咨詢文獻(如Sambrook, Russell"MolecularCloning,A Laboratory Manual" ,Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(2001) ;Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green PublishingAssociates and Wiley Interscience, N.Y.(1989),或 Higgins 和 Hames (Eds.))獲得。如W02006/053725的實施例中記載，另外一個適用方法是限制性片段測定或RFLP方法，包括測定BamHI限制性位點。如W02006/053725中所示，確定BamHI限制性位點的存在(BamHI+)或不存在(BamHI’)，這是本文所定義的點突變存在或不存在的指征。該方法的詳細(xì)信息在所附W02006/053725的實施例中給出。在一個實施方式中，相關(guān)DNA區(qū)段(stretch)可以通過PCR技術(shù)從基因組DNA擴增。采用的潛在引物包括但不限于在W02006/053725中的 SEQ ID N0.22 (ANX5.P.F)和 SEQ ID N0.23 (ANX5.exl.R)所提供的引物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易推斷出其他可用于擴增本文所定義的膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子或其片段的相關(guān)區(qū)段的引物對或引物。獲得擴增子之后(也可參見實驗部分)，可用限制性內(nèi)切酶 BamHI (可從不同供應(yīng)商獲得，特別是 Roche Applied Science, Mannheim, Germany;MBIFermentas, St.Leon-Rot, Germany;New England Biolabs, Frankfurt am Main, Germany) 消化(限制性消化)。同樣，詳細(xì)情況在在實驗部分中給出。消化后，按照本領(lǐng)域熟知的方法(特別參見 Sambrook/Russel, 2001, ( (log.cit.)),可用已知技術(shù)對 BamHI/BamHI+酶切位點進行進一步分析，如凝膠電泳分析，例如瓊脂糖凝膠電泳分析。特別在本發(fā)明的上下文中設(shè)想的另一個技術(shù)是由IHG Pharmaco確立的SNP檢測技術(shù)。所述技術(shù)在W02006/038037中充分描述。因此，在優(yōu)選的實施方式中，通過用于對與遺傳獲得的遺傳性障礙(inheritedgenetic disorder)相關(guān)聯(lián)的祀基因序列進行基因分型的方法，檢測(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換，所述方法包括:(a)提供一組與所述靶基因序列對應(yīng)的誘導(dǎo)型異源雙鏈擴增子(inducedheteroduplex generator, IHG)分子,其中IHG分子是合成的DNA序列,其包括至少一個與靶基因序列的基因組DNA序列中已知的多態(tài)位點對應(yīng)的核苷酸位置，且包括相對于所述基因組序列在特定核苷酸位置處的至少一個核苷酸置換、缺失和/或插入(“標(biāo)識符”)，所述特定核苷酸位置距離與所述已知的多態(tài)位點對應(yīng)的核苷酸位置有至少一個堿基的間隔，并且其中，與所述多態(tài)位點對應(yīng)的核苷酸位置和所述標(biāo)識符之間的核苷酸相對于基因組序列而言沒有改變；其中所述至少一個標(biāo)識符包含一個或多個堿基的插入，且通過以下方法選擇IHG分子以提供所解離條帶的分離的改進，所述方法包括將使用IHG分子得到的分離與使用其中標(biāo)識符不被間隔的相應(yīng)IHG得到的分離進行比較；(b)提供一組靶基因序列；(C)在適合于異源雙鏈形成的條件下組合(a)和(b)的相應(yīng)組，以在靶基因序列和與所述靶基因序列對應(yīng)的IHG分子之間獲得誘導(dǎo)型異源雙鏈；(d)將誘 導(dǎo)型異源雙鏈在合適載體上解離成條帶；(e)分析解離的誘導(dǎo)型異源雙鏈，以確定靶基因序列的基因型。如上文所述，W02006/038037中詳盡地披露了所述技術(shù)，而W02006/038037在本文中公開了它的全部內(nèi)容(包括上述實施方式中所用的術(shù)語的各自定義)。將理解，所述“靶基因序列”是人ANXA5啟動子或其片段。將會理解，本發(fā)明的方法在“體外”進行(等同于“離體”)。因此，設(shè)想本文所公開的方法，優(yōu)選不包括獲得各樣品的步驟。而是，樣品已經(jīng)獲得，并提供于合適的容器中，即優(yōu)選容器中含有樣品，該容器(包括樣品)隨后在本發(fā)明的方法中使用。本發(fā)明還涉及可在上文表征的并在W02006/038037中說明的IHG方法中使用的IHG,即通過采用上文確定的IHG方法的方式能夠檢測風(fēng)險單倍型Ml或M2的IHG。技術(shù)人員知道如何設(shè)計這種IHG，因為文獻W02006/038037 (以及本說明書)在這方面提供了足夠的指導(dǎo)。在進一步的實施方式中，所述IHG包含在緩沖液中。優(yōu)選地，所述緩沖液允許形成根據(jù)上文和W02006/038037所述的IHG方法的異源雙鏈。本發(fā)明還涉及包含人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子或其片段的核酸序列，其中啟動子或其片段包含以下定義的、可用于本發(fā)明方法的核苷酸交換:⑴(I)與SEQ ID N0.2的核苷酸186對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳，(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，和
(4)與SEQ ID N0.2的核苷酸276對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳 ；或(ii)(2)與SEQ ID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，和(3)與SEQ ID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃。所述包含人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子的核酸序列由SEQ ID N0.2例證，但本發(fā)明決不限于此。其它合適的核苷酸序列已在例如W02006/053725中公開(參見例如第4頁的SEQ ID N0.1、3或4，這在下文中也有所描述)。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷或檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的方法，所述方法包括: (a)檢查非母系樣品、特別是從(預(yù)期)生物學(xué)父親獲得的樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)啟動子，或檢查從所述女性獲得的絨毛膜活檢或羊膜穿刺樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)啟動子,或在將體外受精胚胎植入所述女性受試者之前,檢查從所述體外受精胚胎的桑椹胚期之前或期間獲得的單細(xì)胞樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子，以檢測下述的核苷酸交換: ⑴ (1)與SEQID N0.2的核苷酸186對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳， (2)與SEQID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃， (3)與SEQID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，和 (4)與SEQID N0.2的核苷酸276對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳 ； 或(ii) (2)與SEQID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃，和 (3)與SEQID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃， (b)確定是否存在(i)和/或 (ii)中定義的核苷酸交換， 其中存在(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)的傾向；以及其中存在(i)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括以下步驟: (c)檢查從所述女性受試者獲得的母系樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)啟動子，以檢測前述權(quán)利要求中任一項的(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換，和 Cd)確定是否存在前述權(quán)利要求的(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述女性受試者是通過檢查從所述女性獲得的母系樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子來檢測前述權(quán)利要求中任一項的(i)或(ii)中定義的核苷酸交換的方式，已經(jīng)被診斷為具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的受試者。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述女性受試者是通過檢查從所述女性獲得的母系樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子來檢測前述權(quán)利要求中任一項的(i)或(ii)中定義的核苷酸交換的方式，已經(jīng)被診斷為不具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的受試者。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述從預(yù)期生物學(xué)父親、生物學(xué)父親獲得的樣品和/或所述母系樣品是血液樣品、組織樣品或細(xì)胞樣品。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，通過核酸檢測技術(shù)進行前述權(quán)利要求的(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換的檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，通過用于對與遺傳獲得的遺傳性障礙相關(guān)聯(lián)的靶基因序列進行基因分型的方法，進行(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換的檢測，所述方法包括:(a)提供一組與所述靶基因序列對應(yīng)的誘導(dǎo)型異源雙鏈擴增子(IHG)分子，所述IHG分子是合成的DNA序列，其包括至少一個與靶基因序列的基因組DNA序列中已知的多態(tài)位點對應(yīng)的核苷酸位置，且所述IHG分子包括相對于所述基因組序列在特定核苷酸位置處的至少一個核苷酸置換、缺失和/或插入(“標(biāo)識符”)，所述特定核苷酸位置距離與所述已知的多態(tài)位點對應(yīng)的核苷酸位置有至少一個堿基的間隔，并且其中，與所述多態(tài)位點對應(yīng)的核苷酸位置和所述標(biāo)識符之間的核苷酸相對于所述基因組序列而言沒有改變；其中所述至少一個標(biāo)識符包含一個或多個堿基的插入，且通過以下方法選擇所述IHG分子以提供所解離條帶的分離的改進，所述方法包括將使用所述IHG分子得到的分離與使用其中所述標(biāo)識符不被間隔的相應(yīng)IHG得到的分離進行比較； (b)提供一組靶基因序列； (c)在適合于異源雙鏈形成的條件下組合(a)和(b)的相應(yīng)組，以在所述靶基因序列和與所述靶基因序列對應(yīng)的IHG分子之間獲得誘導(dǎo)型異源雙鏈； Cd)將所述誘導(dǎo)型異源雙鏈在合適載體上解離成條帶；和 Ce)分析解離的誘導(dǎo)型異源雙鏈，以確定所述靶基因序列的基因型。
8.一種包含人膜聯(lián)蛋白A5 (ANXA5)啟動子的核酸序列，所述啟動子包含用于根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述方法的在前述權(quán)利要求的(i)或(ii)中定義的核苷酸交換。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸序列，其處于適合用于擴增所述核酸序列的條件下。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸序列，其特征在于，通過PCR的方式進行所述擴增。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸序列，其處于適合于異源雙鏈形成的條件下。
12.用于根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述診斷方法的試劑盒，所述試劑盒包括: Ca)表明所述試劑盒用于根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述方法的包裝說明書和/或說明標(biāo)記；和 (b)實施根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述方法的工具；和 (c)可選地，根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其還包括含有人膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)啟動子的核酸序列，所述啟動子包含以下四個核苷酸交換中的少于四個: (1)與SEQID N0.2的核苷酸186對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳， (2)與SEQID N0.2的核苷酸203對應(yīng)的位置上A變?yōu)镃， (3)與SEQID N0.2的核苷酸229對應(yīng)的位置上T變?yōu)镃，和 (4)與SEQID N0.2的核苷酸276對應(yīng)的位置上G變?yōu)锳。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于，權(quán)利要求12(b)中定義的所述工具包括IHG。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項所述的試劑盒，其進一步包括一個或多個能夠擴增權(quán)利要求8中定義的核酸序列的至少一個區(qū)段的引物對，所述區(qū)段包括權(quán)利要求8中定義的核苷酸交換中的至少一個。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于診斷或檢測女性受試者患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向的方法，所述方法包括檢查從預(yù)期生物學(xué)父親或生物學(xué)父親獲得的樣品中的人膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)啟動子，并檢測其中的核苷酸交換，其中存在(i)和/或(ii)中定義的核苷酸交換表明所述女性受試者具有患復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)、先兆子癇(PE)和/或胎兒生長受限(FGR)的傾向。本發(fā)明還涉及包含人膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)啟動子的核酸序列，該啟動子包含本文所定義的特定核苷酸交換，其用于本文所公開的方法。本發(fā)明進一步涉及一種用于本文所公開的診斷方法的試劑盒。
文檔編號C07K14/47GK103221421SQ201180052050
公開日2013年7月24日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者A·馬可夫, N·博格達(dá)諾娃, V·格爾克 申請人:明斯特大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院