專利名稱：新型的皮膚橋蛋白活化肽和包括其的化妝品組合物的制作方法
技術領域：
本申請涉及化妝品和皮膚藥物有效組分以及包含它們的組合物的領域。本申請旨在提供對于防止或抵抗皮膚的老化跡象(signs)并且特別是皺紋、松垂以及皮膚體積和彈性的損失有用的新型分子。更具體地,本發(fā)明涉及活化皮膚橋蛋白(dermatopontin)表達的肽、包含這樣的肽的化妝品或藥物組合物、這樣的組合物用于增加胞外基質的蛋白質表達并且防止膠原纖維和彈性纖維的UV降解的用途，并且最后涉及旨在防止和/或處理皮膚的老化和光老化跡象的化妝品護理方法。
背景技術：
皮膚是由多個層(真皮、真皮表皮連接、表皮)組成的覆蓋器官。真皮是支撐皮膚的組織并且由包封于蛋白多糖的間隙基質中的水、彈性纖維和膠原纖維(70%的真皮纖維)組成。成纖維細胞是真皮主要的細胞成分并且是膠原纖維和彈性纖維合成的來源。最外面的部分是表皮，基本上由彼此緊密地連接的角質形成細胞組成的多覆層上皮。表皮的基層由增殖細胞(主要為角質形成細胞和黑素細胞)層組成，其固定于真皮表皮連接(DEJ)上。DEJ是構成真皮和表皮之間的間隙的胞外網絡結構。如所有其它器官一樣，皮膚經受復雜的生理老化過程。作為遺傳程序上衰老的結果的內在或隨時間的老化，不同于因內源因素所致的生化改變。在皮膚中，它由細胞和胞外基質的再生緩慢所表征，這導致真皮和表皮萎縮、干燥、彈性的減少以及細線和皺紋的出現(xiàn)。外在老化是由于在生命中身體經受的環(huán)境壓力，例如污染、陽光、疾病、生活方式習慣等。其效果與長期暴露于陽光的區(qū)域中的內在老化的那些效果結合；這稱為光老化。與光老化相關的主要改變位于真皮處并且包括:色素斑點的出現(xiàn)、引起皺紋的膠原纖維的減少和斷裂以及構成日光性彈性組織變性的營養(yǎng)不良的彈性纖維的積累。開發(fā)了多種研究途徑來確定能夠抵抗皮膚老化的活性劑，其中抗皮膚老化為免于環(huán)境壓力(陽光、污染等)，細胞再生的活化和胞外膠原和彈性基質的增強。該研究導致多種或多或少有效的活性劑的市場釋放。因此，確定新型的能夠防止或抵抗皮膚老化的化合物仍然是重要的。本發(fā)明更具體地旨在的問題是抵抗在老化或光老化期間皮膚的胞外基質的原纖維結構的組織破壞。最近發(fā)明人確定了實現(xiàn)該功能的有益的分子目標。此目標是皮膚橋蛋白，其為小的酸性蛋白質，富含酪氨酸，在真皮中貧乏并且更具體地圍繞膠原纖維。它在膠原原纖維的結構化中起到關鍵作用(Jonathan et al.，J.Biol.Chem.，1993，vol.268，第 19826-19832頁)，其參與經過整聯(lián)蛋白31和蛋白多糖型受體的成纖維細胞、角質形成細胞的粘連過程(Lewandowska et al., J.cell Sc1., 1991, vol.99,第 657-668 頁)。這些性質賦予皮膚橋蛋白在愈合中重要的作用(Akamoto et al., Biochem, 2010, vol.49,第 147-155 頁)。

證實了這些結果，遺傳修飾的老鼠中不存在皮膚橋蛋白導致真皮的厚度和真皮膠原含量的減少以及皮膚減少的彈性(Takeda et al.J.1nvest.Dermatol.2002, vol.119,第678-683 頁)。不依賴于其結構作用，皮膚橋蛋白可結合核心蛋白多糖和轉化生長因子β (TGFP)以形成三聚復合物并且因而加強了轉化生長因子β 的作用(Okamoto etal.，Biochem J.1999Febl;337(3):537-41)。文獻JP2008201777公開了源自皮膚橋蛋白的肽作為促進細胞粘連和愈合的試劑的用途。文獻US20050065089公開了天然皮膚橋蛋白可用于加強盤形疝出的生物處理的背景中轉化生長因子β的活化。然而直到現(xiàn)在，沒有描述用于活化皮膚細胞中的皮膚橋蛋白并且防止或修復皮膚老化和光老化跡象的根據(jù)本發(fā)明的肽。

發(fā)明內容
發(fā)明人驗證了具有以 下通式⑴的肽:R1- (AA) J1-X1-Arg-X2-Trp-X3-X4-X5-X6 (R3) ~ (AA) p-R2為良好的皮膚橋蛋白活化劑。因此，這些肽適用于抵抗皮膚老化和光老化。根據(jù)本發(fā)明的肽由以下事實表征:-活化皮膚橋蛋白表達；-增加I型和III型膠原和纖連蛋白的表達；-防止經受UV輻射的皮膚中膠原和彈性纖維的原纖維結構的降解。術語“活化皮膚橋蛋白或能夠活化皮膚橋蛋白的肽或活性劑”是指具有通式(I)的以下任何肽，其或者通過經過基因表達的直接或間接調節(jié)來增加蛋白質合成，或者通過其它生物方法例如蛋白質的穩(wěn)定化或信使RNA轉錄的穩(wěn)定化來增加細胞中存在的皮膚橋蛋白的量。術語“皮膚”意指形成皮膚、黏膜和皮膚附體的所有覆蓋組織，包括毛發(fā)、睫毛和眉毛。因此，本發(fā)明的第一目的是提供具有通式(I)的肽R1- (AA) J1-X1-Arg-X2-Trp-X3-X4-X5-X6 (R3) ~ (AA) p-R2其中X1表示天冬氨酸或無氨基酸，X2表示谷氨酰胺或谷氨酸，X3表示天冬酰胺或賴氨酸或谷氨酰胺或無氨基酸，X4表示苯丙氨酸或酪氨酸或無氨基酸，X5表示酪氨酸或丙氨酸或無氨基酸，X6表示半胱氨酸或無氨基酸，AA表示任意氨基酸并且η和P為0_2之間的整數(shù)；R1表示具有未取代的或由?；?R-C0-)基團取代的N端氨基酸的伯胺官能團，其中R基為乙?；偷娘柡突蛭达柡虲1-C3tl烷基鏈或苯甲?；?、甲苯磺?；蚱S氧羰基型的芳香基團；
R2表示具有未取代的羥基基團或具有由選自C1-C3tl烷基鏈的基團或NH2、-NHY或-NYY’基團(Y和Y’表示C1-C4烷基鏈)取代的羥基基團的C端氨基酸的羧基官能團；R3表示在X6位置處的半胱氨酸的巰基官能團，該巰基為未取代的或由甲基或乙?；鶊F取代，或通過二硫鍵與另一半胱氨酸共價結合。具有通式(I)的所述序列由3至12個氨基酸殘基構成并且可以為鹽形式。根據(jù)本發(fā)明的一種有利的實施方案，肽優(yōu)選對應于通式(I)R1- (AA) J1-X1-Arg-X2-Trp-X3-X4-X5-X6 (R3) ~ (AA) p-R2其中X1表示天冬氨酸或無氨基酸，X2表示谷氨酰胺或谷氨酸，X3表示天冬酰胺或賴氨酸或谷氨酰胺或無氨基酸，X4表示苯丙氨酸或酪氨酸或無氨基酸，X5表示酪氨酸或丙氨酸或無氨基酸，X6表示半胱氨酸或無氨基酸，AA表示除了精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甘氨酸和谷氨酸以外的任意氨基酸；并且η和ρ=0或1，其中η不等于P。R1表示具有未取代的或由?；?R-C0-)基團取代的N端氨基酸的伯胺官能團(primary amine function),其中R基為乙?；偷娘柡突蛭达柡虲1-C3tl燒基鏈或苯甲?；⒓妆交酋；蚱S氧羰基型的芳香基團；R2表示具有未取代的羥基基團或具有由選自C1-C3tl烷基鏈的基團或NH2、-NHY或-NYY’基團(Y和Y’表示C1-C4烷基鏈)取代的羥基基團的C端氨基酸的羧基官能團。R3表示在X6位置處的半胱氨酸的巰基官能團，該巰基為未取代的或由甲基或乙酰基基團取代，或通過二硫鍵與另一半胱氨酸共價結合。具有通式(I)的所述序列由3至7個氨基酸殘基構成并且可以為鹽形式。根據(jù)本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實施方案，肽具有以下序列:(SEQ ID Nol):Asp-Arg-Gln-Trp-NH2(SEQ ID No2):Asp-Arg-Glu-Trp-NH2(SEQ ID No3):Asp-Arg-Gln-Trp-Asn-Tyr-NH2(SEQ ID No4):Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-Cys-NH2(SEQ ID No5):Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-Cys(Cys) - (NH2)(SEQ ID No6):Asp-Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-NH2(SEQ ID No7):Asp-Arg-Gln-Trp-Asn-Tyr-Ala-Cys-NH2(SEQ ID N08):Asp-Arg-Gln-Trp-Asn-Tyr-Ala-Cys(Cys) - (NH2)
(SEQ ID No9):Asp-Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-Cys-NH2(SEQ ID No10):Asp-Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-Cys(Cys) - (NH2)(SEQ ID Noll):Asp-Arg-Gln-Trp-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NoI2):Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-NH2(SEQ ID Nol3):Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr.
根據(jù)一種特別有利的實施方案，肽對應于序列SEQ ID No5。
根據(jù)另一種特別有利的實施方案，肽對應于序列SEQ ID No9或對應于序列SEQ IDNo 10。根據(jù)另一種甚至更有利的實施方案，肽對應于序列SEQ ID Nol2或對應于序列SEQID Nol3。構成根據(jù)本發(fā)明的肽并且由術語AA表明的氨基酸可以為任何同分異構的L-和D-構型。優(yōu)選地，氨基酸為L形式。術語“肽”意指通過肽鍵彼此結合的兩個或多個氨基酸的鏈。術語“肽”還意指如上所述的本發(fā)明的天然或合成的肽，或者它的片段的至少一部分，不管它是通過蛋白質水解還是合成獲得，或者其序列全部或部分構成上述的肽的序列的任何天然或合成的肽。為了改善抗降解性，使用根據(jù)本發(fā)明的肽的受保護形式可為必要的。優(yōu)選地，為了保護N端氨基酸的伯胺官能團，使用?；?R-C0-)的R1基團取代，其中R基為乙?；偷娘柡突蛭达柡虲1-C3tl烷基鏈或苯甲酰基、甲苯磺?；蚱S氧羰基型的芳香基團、甚至更優(yōu)選乙?；鶊F。優(yōu)選地，為了保護C端氨基酸的羧基官能團，使用C1-C3tl烷基鏈型的R2基團或NH2、-NHY或-NYY’基團(Y和Y’表示C1-C4烷基鏈)、甚至更優(yōu)選NH2基團取代?？梢栽贜端或C端或兩端保護根據(jù)本發(fā)明的肽。為了抑制根據(jù)本發(fā)明的肽的二聚，可由甲基或乙?；鶊F或另一種半胱氨酸取代C端半胱氨酸的巰基官能團。在最后的這種情況中，取代導致在兩種半胱氨酸殘基之間形成~■硫鍵。因此，本發(fā)明涉及如上定義的組合物，其特征在于:根據(jù)本發(fā)明并且有利地具有序列SEQ ID Nol至SEQ I D Nol3的肽處于或不處于受保護的形式，優(yōu)選在C端處于受保護的形式。根據(jù)本發(fā)明具有通式(I)的肽可通過經典化學合成(在固體相或液體均質相中)或通過由組成型氨基酸生化酶合成而獲得(Kullman et al.J.Biol.Chem., 1980, vol.225,第8234頁)。根據(jù)本發(fā)明的肽可為天然或合成來源。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，肽為通過化學合成而獲得的合成來源。根據(jù)本發(fā)明，活性劑可為單一肽或肽的混合物。根據(jù)本發(fā)明的肽有利地溶解于一種或多種生理學上適宜的溶劑中，例如水、丙三醇、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、環(huán)多元醇或這些溶劑的任意混合物。術語“生理學上適宜的”意味著所選擇的溶劑適用于與皮膚接觸，而不引起毒性或不耐性反應。然后通過無菌過濾將稀釋的肽殺菌。在該稀釋步驟后，可將肽包裹或包含在化妝品或藥物載體例如脂質體或在化妝品領域中使用的任何其它微膠囊中，或將肽吸收到粉末狀有機聚合物、礦物質載體如滑石和膨潤土上，并且更通常將肽溶解于或結合至任何生理學上適宜的載體。根據(jù)本發(fā)明的第二主題，具有通式⑴的肽可用作藥物。特別有利地，具有通式(I)的藥物可用作愈合劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種藥物愈合組合物，其包括處于生理學上適宜的介質中的根據(jù)本發(fā)明的肽。根據(jù)本發(fā)明的一個特別方面，所述肽可用于處理與老化或過早的光老化相關的皮膚病癥狀，特別是延時的愈合、松弛和皮膚萎縮、日光性彈性組織變性和減少的真皮表皮粘連。有利地，根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，藥物組合物將適用于局部用途或可以以合適的液體形式用于在皮膚下或在皮膚中注射，特別適用于復合表皮局部中位治療型(mesotherapy-type)注身寸。本發(fā)明的第三目的是提供一種化妝品組合物，其包括處于生理學上適宜的介質中作為皮膚橋蛋白活化劑的具有通式(I)的肽。根據(jù)本發(fā)明的一種有利的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的活性劑相對于最終組合物的總重量以約10_9M和10_3M之間的濃度、并且優(yōu)選以10_8M和10_5M之間的濃度、并且甚至更優(yōu)選以5.10_5M和5.10_6M之間的濃度存在于本發(fā)明的組合物中。該范圍內的濃度表示為了獲得所需的分子效果即活化皮膚橋蛋白、I型和III型膠原和纖連蛋白的 表達的活性劑的必要量。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物為適用于局部施用的形式，其包括生理學上適用于皮膚的介質?！吧韺W上適用”意指適用于與皮膚或人類皮膚附件接觸而沒有毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、過敏反應或其它不利效果的風險。“局部施用”意指將根據(jù)本發(fā)明的活性劑或包含其的組合物施用或涂布在皮膚表面上。這些組合物可特別為以下形式:水、水醇或油溶液；水包油型或油包水型乳劑或復合乳劑；水或非水凝膠；膠體。這些組合物也可為適用于施用在皮膚、黏膜、唇和/或皮膚附件上的乳膏、懸浮液、或粉末形式。這些組合物可為或多或少的流體并且具有乳膏、洗液、乳、漿液、蠟、乳膏、漿料或泡沫的外觀。它們還可為固體形式例如條，或可以以氣溶膠形式將它們施用至皮膚。它們還可用作護理產品和/或用于皮膚的化妝產品。此外，所有的這些組合物包括設想的使用領域中通常使用的任何添加劑以及對于它們的配制必要的佐劑，例如助溶劑(乙醇、丙三醇、苯甲醇、濕潤劑等)、增稠劑、稀釋劑、乳化劑、抗氧化劑、著色劑、遮光劑、顏料、填料、防腐劑、香水、氣味吸收劑、香精油、痕量元素、必需脂肪酸、表面活性劑、成膜聚合物、化學或礦物過濾介質、水合劑或熱水等。例如可以引用天然型的水溶性聚合物例如多糖、或多肽、甲基纖維素或羥丙基纖維素型的纖維素衍生物、或合成的聚合物、泊洛沙姆、卡波姆、硅氧烷、PVA或PVP并且特別是由ISP公司銷售的聚合物。在任何情況中，本領域技術人員將確保:選擇這些佐劑以及它們的比例使得不抵消在根據(jù)本發(fā)明的組合物中尋求的有利性質。這些佐劑例如可以基于組合物總重量的0.01-20%的濃度存在。當本發(fā)明的組合物為乳劑時，相對于組合物的總重量，脂肪相可代表5-80重量％并且優(yōu)選5-50重量％。將從所考慮的領域中常規(guī)使用的那些乳化劑和輔助乳化劑中選擇組合物中使用的乳化劑和輔助乳化劑。例如，可以基于相對于組合物總重量的
0.3-30重量％的比例使用它們。當然，根據(jù)本發(fā)明的活性劑可單獨使用或與其它活性劑組合物結合使用。
有利地，根據(jù)本發(fā)明可使用的組合物還包括旨在防止和改善皮膚老化跡象的領域中增強根據(jù)本發(fā)明的活性劑作用的至少一種其它的活性劑，或者使其能夠擴展所考慮的組合物的性質范圍的另一種活性劑?？梢砸苑窍拗菩缘姆绞揭靡韵骂悇e的成分:再生劑、抗老化劑、抗皺劑、增稠劑、抗自由基劑、抗糖化劑、水合劑、抗細菌劑、抗真菌劑、角質軟化劑、肌肉松弛劑、脫落劑和調色劑、刺激真皮大分子的合成或能量代謝的試劑、調節(jié)皮膚分化、色素沉著或除色素的試齊U、刺激指甲或毛發(fā)生長的試劑、刺激微循環(huán)的試劑、遮光劑或金屬蛋白酶抑制劑。在本發(fā)明的一種特別的實施方案中，除了根據(jù)本發(fā)明的肽以外，根據(jù)本發(fā)明的組合物還將包括:-至少一種細胞色素c活化化合物，和/或-至少一種水合化合物，例如水通道蛋白活化化合物，和/或-至少一種沉默調節(jié)蛋白活化化合物，和/或-至少一種增加細胞粘連的化合物，和/或至少一種增加基質蛋白質例如膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、糖胺多糖的產生的化合物，和/或-至少一種蛋白酶體活性調節(jié)化合物，和/或-至少一種晝夜節(jié)律調節(jié)化合物，和/或-至少一種HSP蛋白質調節(jié)化合物，和/或

-至少一種提高細胞能量的化合物，和/或-至少一種皮膚色素沉著調節(jié)化合物，和/或-至少一種輔酶QlO活化化合物，和/或-至少一種改善屏障功能的化合物，例如谷氨酰胺轉移酶或HMG-CoA還原酶活化化合物，和/或-至少一種線粒體保護化合物。所述上述化合物可為天然來源例如植物的肽水解產物，或為合成來源例如肽。不依賴于它們的功能，與根據(jù)本發(fā)明的活性劑結合的其它活性劑可具有非常不同的化學結構?？梢砸苑窍拗频姆绞揭秒?、維他命C及其衍生物，B族維他命，DHEA( 二氫表雄甾酮)、植物留醇、水楊酸及其衍生物、類維生素A、黃酮類化合物、糖胺、唑類、金屬鹽、植物來源的肽提取物或聚合物。本發(fā)明的第四目的涉及包括作為活性劑的具有通式(I)的肽的化妝品組合物的以下用途:增強真皮表皮連接、刺激真皮表皮連接的成分表達、增加支撐真皮表皮連接的區(qū)域的致密化、或甚至改善基體角質形成細胞和/或黑素細胞至真皮表皮連接的錨定。本發(fā)明的第五目的涉及包括作為活性劑的具有通式(I)的肽的化妝品組合物的用途，從而通過皮膚的成纖維細胞增加胞外基質的蛋白質表達。根據(jù)本發(fā)明的一個有利的方面，活性劑使得能夠增加真皮的密度和彈性，并且因此增加皮膚的穩(wěn)固性，防止或抵抗面部線條的松垂、體積損失、皮膚減薄、張力缺失、細線條、深皺紋和真皮萎縮。本發(fā)明的第六目的涉及包括作為活性劑的具有通式(I)的肽的化妝品組合物的用途，從而防止經受外部壓力的皮膚中膠原纖維和彈性纖維的降解。
術語“外部壓力”意指通過環(huán)境可產生的壓力。例如，可以引用壓力例如污染、UV輻射或刺激。污染同時意指由例如柴油機顆粒、臭氧或重金屬所致的“外部”污染和可特別是來自涂料溶劑、膠水或壁紙的散發(fā)物(例如甲苯、苯乙烯、二甲苯或苯甲醛)或香煙煙霧所致的“內部污染”。已經驗證活性劑使得能夠限制彈性纖維的降解和組織破壞并且刺激在UV輻射、并且更特別是UVA福射后膠原纖維的改組(reorganization)?！皬椥岳w維的改組”意指由于反復的暴露于陽光的所有改性以及日光性彈性組織變性典型的營養(yǎng)不良的彈性纖維的積累。這些難以逆轉并且部分對老化相關的皮膚下垂或松垂負責的改變主要是由深深地透過真皮的UVA輻射所致。本發(fā)明的一種特別的實施方案涉及包括根據(jù)本發(fā)明的肽的化妝品組合物的以下用途:防止或抵抗由暴露于UV輻射、并且特別是UVA輻射而引起的彈性纖維的日光性彈性組織變性和/或組織破壞(disorganization)相關的非美感跡象。本發(fā)明的第七目的涉及包括作為活性劑的具有通式(I)的肽的化妝品組合物在增加表皮和真皮的再生中的用途。短語“表皮和真皮的再生”意味著:根據(jù)本發(fā)明該有利的方面，本發(fā)明的肽引起角質形成細胞和成纖維細胞較大 的增殖和遷移，從而促進表皮的加速更新和皮膚更全面較好的再生。本發(fā)明的第八目的涉及用于旨在防止和/或處理皮膚老化和光老化的跡象的化妝品護理的方法，其特征在于:將根據(jù)本發(fā)明的組合物局部施用至待處理的皮膚。短語“皮膚的老化跡象”意指由老化所致的皮膚和皮膚附件的外部外觀的所有改性，例如皮膚減薄、松垂、彈性損失和張力缺失、深線條和皺紋、穩(wěn)固性和色調的損失、真皮萎縮或由暴露于UV輻射所致的皮膚的任何其它內部降解。特別地，本發(fā)明涉及用于旨在保護皮膚免于由UV輻射所致的壓力的化妝品處理的方法。在一種具體實施方案中，在暴露于陽光前施用該組合物，作為防止彈性纖維的組織破壞的陽光前護理處理。在本發(fā)明的第二實施方案中，在陽光暴露后施用該組合物，作為修復膠原和彈性纖維經受的損害的陽光后護理處理?？紤]到出于說明性和非限制性目的而提供的以下實施例，本發(fā)明的其它優(yōu)勢和特征將變得更加清楚。實施例1:駘證SEQ ID No5和SEQ ID No9狀對皮膚撟蛋白表汰的活化效果該研究的目的是確定SEQ ID No5肽和SEQ ID No9肽對成纖維細胞中皮膚橋蛋白表達的影響。對于這個目的，在正常的人類成纖維細胞培養(yǎng)物上和在體外培養(yǎng)物中保存的皮膚上進行特定的免疫熒光標記。實施方案:培養(yǎng)正常的人類成纖維細胞24或48小時并且用肽SEQ ID No5或肽SEQ ID No9的10_6M溶液每天將其處理一次。隨后清洗這些細胞并且在環(huán)境溫度下用3.7%甲醛將其固定10分鐘。在空氣/液體界面處將人類皮膚樣品置于培養(yǎng)物中。局部施用肽SEQ ID No5或肽SEQ ID No9的KT6M溶液，然后孵浴樣品24小時或48小時。隨后用甲醛固定這些皮膚樣品，然后將其包埋在石蠟中或用OCT通過在-20°c下冷凍固定。然后制備3-4 μ m的切片(對于冷切片為6μπι)。在未掩蔽的特定位置后進行包埋在石蠟中的樣品的免疫標記。在37°C下固定后并且用冷丙酮進行包埋在OCT中的樣品的免疫標記。在特定的兔子皮膚橋蛋白多克隆抗體(Proteintech group, Ref: 10537-1-AP)存在下孵浴固定的細胞或切片，然后更換為與熒光標記偶聯(lián)的第二抗體。在將細胞安裝在adhoc介質中后，然后用Ep1-fluorescene顯微鏡(Nikon Eclipse E600顯微鏡)檢查細胞。結果:在所測試的所有備件下，在由在KT6M下的SEQ ID No5肽或SEQ ID No9肽處理的成纖維細胞中觀察到比對照物條件下更強烈的熒光。在用SEQ ID No5肽或SEQ ID No9肽處理的樣品中的真皮處人類皮膚顯示了更強烈的突光。結論:SEQ ID No5肽和SEQ ID No9肽通過真皮的成纖維細胞非常顯著地刺激了皮膚橋蛋白的表達。實施例2:研究用SEQ ID No5肽處理的皮膚細胞的超微結構本研究的目的是觀察通過在1(Γ6Μ下的SEQ ID Νο5肽處理的角質形成細胞和成纖維細胞的亞細胞結構。實駘方案:在盤子中或在Transwell系統(tǒng)中培養(yǎng)NHEK或成纖維細胞，或者用SEQID Νο5肽的10_6Μ溶液處理體外培養(yǎng)的皮膚48小時(每24小時更換介質)。用PBS清洗皮膚細胞或樣品，然后通過Karnosky高張力固定裝置(處于0.08Μ磷酸鹽緩沖劑中的4%多聚甲醛、5%戊二醛)將其在環(huán)境溫度下固定I小時，然后在4°C下固定24小時。在4°C下在IOOOrpm下離心5分鐘，通過刮擦將細胞從基材分離。移除上清液并且將0.1M卡可基酸鈉緩沖劑沉積在圓顆粒(pellet)上。將細胞與2%瓊脂混合，然后通過四氧化鋨將其后固定I小時。隨后通過在醇系列中(50-100%)連續(xù)的通過而將試樣脫水。然后用樹脂涂覆皮膚細胞或樣品。在60°C下進行聚合約12小時。用超薄切片機進行0.5μπι的半薄切片。在受熱下將該切片沉積在底部(subbed)載玻片上然后用甲苯胺藍染色。然后再次將載玻片脫水并且將其安裝在合適的介質中。在選擇最佳的研究區(qū)域后，調整塊的大小至所需的尺寸并且制備超細切片。僅將具有“銀-灰”色和合適的尺寸的切片安裝在用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重標記的電子顯微鏡網格中，并且用透射顯微鏡在60或80KV下檢查。結果:超微結構研究顯示了細胞器、并且特別是通過SEQ ID No5肽處理的角質形成細胞中的線粒體的富集。在Transwell 系統(tǒng)中的培養(yǎng)物中，角質形成細胞之間的細胞間接觸比未處理的對照物似乎為更有黏性的并且并指似乎染色更強。類似地，在體外皮膚培養(yǎng)物中，觀察到基層的細胞之間較窄的細胞接觸。在通過SEQ ID No5肽處理的培養(yǎng)物中的成纖維細胞中，觀察到胞窩(caveeolar)主體、粗糙的內質網和高爾基體比在對照物細胞中顯著染色得更多。與未處理的對照物相t匕，還觀察到胞外基質的成分的更強烈的分泌。結論:在培養(yǎng)物中的角質形成細胞中，在IQ-6M下的SEQ ID No5肽引起細胞活性的一般刺激，特別是具有線粒體密度的增加。在成纖維細胞中，SEQ ID No5肽誘發(fā)了胞外基質的成分合成的增加。在體外皮膚培養(yǎng)物中，SEQ ID No5肽增加了基體角質形成細胞的細胞間接觸。
實施例3:驗證SEQ ID No5肽對纖連蛋白表汰的活化效果
該研究的目的是確定SEQ ID No5肽對纖連蛋白(通過成纖維細胞合成的胞外基質蛋白質)表達的影響。對于這個目的，在成纖維細胞培養(yǎng)物上和在體外的皮膚培養(yǎng)物上進行特定的免疫熒光標記。實施方案:用SEQ ID No5肽的1(Γ6Μ溶液每天處理培養(yǎng)物中的人類真皮成纖維細胞一次(每24小時更換包含活性劑的介質)。然后清洗這些細胞并且在環(huán)境溫度下用3.7%甲醛將其固定10分鐘。在空氣/液體界面處將人類皮膚樣品置于培養(yǎng)物中。局部施用10_6M溶液SEQ IDNo5肽或SEQ ID No9肽，然后孵浴樣品24小時或48小時。隨后用甲醛固定這些皮膚樣品，然后將其包埋在石蠟中或用OCT通過在-20°C下冷凍固定。隨后制備3-4 μ m的切片(對于冷切片為6 μ m)在未掩蔽的特定位置后進行包埋在石蠟中的樣品的免疫標記。在37°C下固定后并且用冷丙酮進行包埋在OCT中的樣品的免疫標記。在特定的兔子纖連蛋白多克隆抗體(Sigma，Ref:F_3648)存在下孵浴固定的細胞或切片，然后在連接至熒光記號的第二抗體存在下孵浴固定的細胞或切片。然后用Ep1-fluorescene 顯微鏡(Nikon Eclipse E600 顯微鏡)檢查細胞。結果:在用在1(Γ6Μ下的SEQ ID Νο5肽處理的成纖維細胞中觀察到比對照物細胞中更強烈的細胞質熒光。在體外皮膚中，熒光主要位于乳頭狀真皮的上部中，僅在真皮表皮連接之下。結論:SEQ ID No5肽非常顯著地刺激了成纖維細胞中纖連蛋白的表達。在人類皮膚中，SEQ ID No5肽刺激了支撐真皮表皮連接的區(qū)域的致密化。實施例4:驗證SE Q ID No5肽對膠原I和膠原III真皮胞外基質的分子表達的活化效果該研究的目的是確定SEQ ID No5肽對真皮胞外基質的分子表達的影響。對于這個目的，研究了由真皮獲得的人類成纖維細胞中膠原I和III的表達。實施方案:培養(yǎng)ιΗ常的人類成纖維細胞24或48小時并且用SEQ ID No5肽或SEQID No9肽的10_6M溶液每天將其處理一次。然后清洗這些細胞并且在環(huán)境溫度下用3.7%甲醛將其固定10分鐘。在空氣/液體界面處將人類皮膚樣品置于培養(yǎng)物中。局部施用SEQ ID No5肽或SEQ ID No9肽的IO-6M溶液，然后孵浴樣品24小時或48小時。隨后用甲醛固定這些皮膚樣品，然后將其包埋在石蠟中或用OCT通過在-20°C下冷凍固定。然后制備3-4 μ m的切片(對于冷切片為6μπι)。在未掩蔽的特定位置后進行包埋在石蠟中的樣品的免疫標記。在37°C下固定后并且用冷丙酮進行包埋在OCT中的樣品的免疫標記。在特定的兔子膠原I多克隆抗體(Rockland，Ref:600-401-103)或特定的兔子膠原III多克隆抗體(Rockland，Ref:600-401-105)存在下孵浴固定的細胞或切片，然后更換為與突光標記偶聯(lián)的第二抗體。在將細胞安裝ad hoc介質中后,然后用Ep1-fluorescene顯微鏡(Nikon Eclipse E600顯微鏡)檢查細胞。結果:在用在10_6M下的SEQ ID No5肽處理的培養(yǎng)物中和皮膚切片上觀察到比對照物條件下更強烈的熒光。結論:在IO-6M下的SEQ ID No5肽增加了膠原I和膠原III (真皮胞外基質的兩種基本原纖維蛋白質)的表達。
實施例5:駘證SEQ ID No5狀對經等UV輻射的彈件纖維的保護效果該研究的目的是確定SEQ ID No5肽對真皮中存在的彈性纖維的影響。為了完成這個目的，在體外培養(yǎng)的皮膚樣品上進行彈性纖維的特定染色。實施方案:在空氣/液體界面處將人類皮膚樣品置于培養(yǎng)物中。局部施用SEQ IDNo5肽的10_6M溶液，然后在樣品受5J/cm2的UVA輻射前，孵浴樣品24小時或48小時。同時制備未處理的經輻射的對照物。隨后用甲醛固定這些皮膚樣品，然后將其包埋在石蠟中。隨后制備4μπι的切片。從石蠟先后移出這些皮膚部分，然后在不同的二甲苯和醇浴中脫水。使用Elastika vanGieson染色試劑盒(VWR，Ref:l.15974)將彈性纖維染色。將染色的皮膚切片脫水，然后安裝在Eukitt安裝介質中并且在顯微鏡下觀察。結果:在顯微鏡下的觀察經輻射并且通過在1(Γ6Μ下的SEQ ID Νο5肽處理的樣品中顯示比對照物條件下顯示彈性纖維的較少降解以及彈性纖維的組織的較好保護。結論:在IO-6M下的SEQ ID Νο5肽保護由UV輻射引起改變的彈性纖維。實施例6:駘證SEQ ID Νο5狀的再牛效果該研究的目的是確定SEQ ID Νο5肽對真皮成纖維細胞和正常的人類角質形成細胞(NHEK)的再生效果。為了完成這個目的，使用Ibidi體外愈合模型(Integrated BioDiagnostics, Munich, Germany)。實施方案:該測試包括在細胞層中間處維持無細胞的區(qū)域并且評估在“疤痕”的任一側上布置的細胞遷移和增殖并且填充間隙所需的時間。將自粘連性的硅樹脂培養(yǎng)物插入物置于培養(yǎng)物板的容器基底處。這些插入物具有特別的特征:由通過具有500μπι厚度的不可滲透膜分隔的兩個不同的 腔室構成。用相同細胞類型的細胞接種兩個腔室中的每一個并且培養(yǎng)直至匯合。隨后用無菌鑷子將該插入物移除，在兩個細胞層之間產生400 μ m寬的無細胞區(qū)域。然后將SEQ ID No5肽的10_6M或3.10_6M溶液添加到培養(yǎng)物介質來處理細胞，每24小時更新肽。在不同的時間(0、6、24、30和48小時)下進行相差顯微鏡方法觀察(與Olympus E-510照相機連接的Olympus CK40顯微鏡X5)直至增殖和遷移過程導致間隙的填充。結果:顯微鏡觀察顯示30小時后由用在10_6M下的SEQ ID No5肽處理的人類角質形成細胞的間隙完全填充。與此同時，在對照物條件下細胞間隙沒有被填充。對于用在IO-6M下的SEQ ID No5肽處理的人類成纖維細胞，間隙完全填充在48小時后。與此同時，在對照物條件下細胞間隙沒有被填充。肽的效果是取決于劑量的，因為當用在10_6M下的SEQ ID No5肽處理細胞時，間隙填充更快。結論:與對照物條件相比，在SEQ ID No5肽的存在下培養(yǎng)成纖維細胞和正常的人類角質形成細胞(NHEK)時，它們填充間隙更快。SEQ ID No5肽刺激了成纖維細胞和NHEK的增殖和遷移，從而促進皮膚再生。實施例7:組合物的制備1-陽光防護膏
權利要求
1.具有通式⑴的肽 R1- (AA) J1-X1-Arg-X2-Trp-X3-X4-X5-X6 (R3) - (AA) p-R2 其中 X1表示天冬氨酸或無氨基酸， X2表示谷氨酰胺或谷氨酸， X3表示天冬酰胺或賴氨酸或谷氨酰胺或無氨基酸， X4表示苯丙氨酸或酪氨酸或無氨基酸， X5表示酪氨酸或丙氨酸或無氨基酸， X6表示半胱氨酸或無氨基酸， AA表示任意氨基酸，并且η和P為0-2之間的整數(shù)； R1表示具有未取代的或由?；?R-CO-)基團取代的N端氨基酸的伯胺官能團，其中R基為乙?；偷娘柡突蛭达柡虲1-C3tl烷基鏈，或苯甲?；?、甲苯磺酰基或芐氧羰基型的芳香基團； R2表示具有未取代的或由選自C1-C3tl烷基鏈的基團或NH2、-NHY或-NYY基團取代的C端氨基酸的羧基官能團的羥基基團或其鹽，其中Y表示C1-C4烷基鏈， R3表示在X6位置處的半胱氨酸的巰基官能團，所述巰基為未取代的或由甲基或乙?；鶊F或另一半胱氨酸取代，在最后一種情況下此鍵為二硫鍵。
2.根據(jù)權利要求1的肽，其特征在于其對應于式(I) 其中 X1表示天冬氨酸或無氨基酸， X2表示谷氨酰胺或谷氨酸， X3表示天冬酰胺或賴氨酸或谷氨酰胺或無氨基酸， X4表示苯丙氨酸或酪氨酸或無氨基酸， X5表示酪氨酸或丙氨酸或無氨基酸， X6表示半胱氨酸或無氨基酸， AA表示除了精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甘氨酸和谷氨酸以外的任意氨基酸，并且η和P=O或I,其中η不等于P。
R1表示具有未取代的或由?；?R-CO-)基團取代的N端氨基酸的伯胺官能團，其中R基為乙?；偷娘柡突蛭达柡虲1-C3tl烷基鏈，或苯甲酰基、甲苯磺酰基或芐氧羰基型的芳香基團； R2表示具有未取代的羥基基團或具有由選自C1-C3tl烷基鏈的基團或NH2、-NHY或-NYY’基團取代的羥基基團的C端氨基酸的羧基官能團，其中Y和Y’表示C1-C4烷基鏈； R3表示在X6位置處的半胱氨酸的巰基官能團，該巰基為未取代的或由甲基或乙?；鶊F取代，或通過二硫鍵與另一半胱氨酸共價結合。
3.根據(jù)權利要求1或2的肽，其特征在于其對應于以下序列中的一種:(SEQ ID Nol):Asp-Arg-Gln-Trp-NH2(SEQ ID No2):Asp-Arg-Glu-Trp-NH2(SEQ ID No3):Asp-Arg-Gln-Trp-Asn-Tyr-NH2(SEQ ID No4):Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-Cys-NH2(SEQ ID No5):Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-Cys(Cys) - (NH2)(SEQ ID No6):Asp-Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-NH2(SEQ ID No7):Asp-Arg-Gln-Trp-Asn-Tyr-Ala-Cys-NH2(SEQ ID N08):Asp-Arg-Gln-Trp-Asn-Tyr-Ala-Cys(Cys) - (NH2)(SEQ ID No9):Asp-Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-Cys-NH2(SEQ ID No10):Asp-Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-Cys(Cys) - (NH2)(SEQ ID Noll):Asp-Arg-Gln-Trp-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NoI2):Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr-NH2(SEQ ID Nol3):Arg-Glu-Trp-Gln-Phe-Tyr。
4.根據(jù)前述權利要求之一的肽，其特征在于其溶解于一種或多種生理學上適宜的溶劑中，例如水、丙三醇、乙醇、丙 二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、環(huán)多元醇或這些溶劑的任意混合物。
5.如權利要求1-4之一定義的具有通式(I)的肽，用作藥物。
6.根據(jù)前述權利要求的肽，用作愈合劑。
7.化妝品組合物，其包含處于生理學上適宜的介質中作為皮膚橋蛋白活化劑的至少一種如權利要求1-4之一定義的肽。
8.根據(jù)權利要求7的組合物，其特征在于所述肽相對于最終組合物的總重量以KT9M和10_3M之間的濃度、并且優(yōu)選以10_8M和10_5M之間的濃度存在。
9.根據(jù)權利要求7或8的組合物，其特征在于其旨在局部施用。
10.根據(jù)權利要求7-9中任一項的組合物，其特征在于其還包含至少一種其它的活性劑。
11.根據(jù)權利要求10的組合物，其特征在于所述其它的活性劑選自:再生劑、抗老化劑、抗皺劑、增稠劑、抗自由基劑、抗糖化劑、水合劑、抗細菌劑、抗真菌劑、角質軟化劑、肌肉松弛劑、脫落劑和調色劑、刺激真皮大分子的合成或能量代謝的試劑、調節(jié)皮膚分化、色素沉著或除色素的試劑、刺激指甲或毛發(fā)生長的試劑、刺激微循環(huán)的試劑、遮光劑或金屬蛋白酶抑制劑。
12.包含處于生理學上適宜的介質中作為活性劑的如權利要求1-4之一定義的肽的組合物的化妝品用途，其用于通過皮膚的成纖維細胞增加胞外基質的蛋白質表達。
13.包含處于生理學上適宜的介質中作為活性劑的如權利要求1-4之一定義的肽的組合物的化妝品用途，其用于增加真皮的密度和皮膚的彈性，防止或抵抗面部線條的松垂或體積損失、皮膚減薄、張力缺失、細線條、深皺紋和真皮萎縮。
14.包含處于生理學上適宜的介質中作為活性劑的如權利要求1-4之一定義的肽的組合物的化妝品用途，其用于防止或抵抗經受UV輻射的皮膚中膠原纖維和彈性纖維的降解。
15.如權利要求14的化妝品用途，其用于防止或抵抗由暴露于UV輻射、并且特別是UVA輻射而引起的彈性纖維的日光性彈性組織變性和/或組織破壞相關的非美感跡象。
16.包含處于生理學上適宜的介質中作為活性劑的如權利要求1-4之一定義的肽的組合物的化妝品用途，其用于增加表皮和真皮的再生。
17.用于防止和/或處理皮膚老化和光老化的跡象的化妝品護理方法，其特征在于:將如權利要求7-11之一的組合物局部施用至待處理的皮膚。
18.如前述權利要 求的化妝品護理方法，其特征在于:在暴露于陽光前施用所述組合物以防止彈性纖維的組織破壞，或者在陽光暴露后施用所述組合物以修復膠原和彈性纖維經受的損害。
全文摘要
本發(fā)明涉及活化皮膚中的皮膚橋蛋白的肽。本發(fā)明還涉及一種化妝品化合物，其包括處于生理學上適宜的介質中的皮膚橋蛋白活化肽。本發(fā)明還涉及所述組合物用于增加胞外基質的蛋白質表達并且防止經受UV輻射的膠原和彈性纖維的降解的用途。本發(fā)明最后還涉及旨在防止和/或處理皮膚的老化和光老化跡象并且特別是皺紋、松垂、皮膚體積和彈性的損失的化妝品護理方法。
文檔編號C07K7/08GK103201282SQ201180053810
公開日2013年7月10日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權日2010年11月9日
發(fā)明者C·達爾法拉, N·東洛熱, J-M·博托 申請人:Isp投資公司