專利名稱：抗CD40抗體的沉默的Fc變體的制作方法
抗CD40抗體的沉默的Fe變體本發(fā)明涉及抗CD40抗體的沉默的恒定區(qū)片段(Fe)變體和組合物和所述抗體用于治療病理性病癥(例如自身免疫病和炎性病癥)和/或用于預(yù)防或降低移植時(shí)的移植物排斥風(fēng)險(xiǎn)的用途的方法。雖然一些免疫抑制治療可用于治療自身免疫病，但是，在大部分患者群體中，仍然存在對(duì)更有效和更安全的藥物的大量未滿足的需求。例如，盡管已經(jīng)報(bào)道了 B細(xì)胞耗盡/抑制療法如利妥昔單抗(Rituximab)和貝利木單抗(Belimumab)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、SjGgren綜合癥和多發(fā)性硬化中的功效，但這些療法僅在一部分患病個(gè)體中有效，并且利妥昔單抗還伴隨有進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病的風(fēng)險(xiǎn)。此外，通常有多種其他的白細(xì)胞類型參與這些自身免疫病的病理學(xué)，例如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞，因此，靶向額外的細(xì)胞類型或抑制其功能的關(guān)鍵性免疫學(xué)途徑的療法干預(yù)具有益處。考慮到CD40-CD154在這些細(xì)胞類型的激活和功能中的多種免疫學(xué)相關(guān)作用，抗⑶40抗體可能給予患上述自身免疫病的患者超過現(xiàn)有療法目前所提供的療法益處。此外，CD40-CD154相互作用在腸炎性病癥(例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)中的關(guān)鍵作用，以及CD40途徑與多種罕見病癥(例如自身免疫性血管炎、尋常型天皰疹和ITP)的病理學(xué)的機(jī)制關(guān)聯(lián)，都突出了抗CD40抗體在這些適應(yīng)征中的潛在價(jià)值。目前在實(shí)體器官移植后使用的現(xiàn)有免疫抑制物提供了優(yōu)秀的短期功效。在5%-20%的接受者中,在新生期(de novo period)中觀察到急性排斥(取決于器官、患者群體和方案)，而對(duì)于任何情況，在新生期內(nèi)由于急性排斥而失去的移植物的比例都低于5%。目前，尚未滿足的關(guān)鍵需求是患者對(duì)免疫抑制的耐受性和移植物的長(zhǎng)期存活。在腎移植后，33%患者在5年內(nèi)死亡和/或失去其移植物；移植接受者的平均死亡年齡是58歲。鈣依賴磷酸酶抑制劑(CNI)仍然是絕大部分移植患者的主要免疫抑制療法。盡管與CNI相關(guān)的腎毒性和心血管發(fā)病是慢性同種異體移 植腎病和具有有功能的移植物的患者死亡的驅(qū)動(dòng)因素之一，備選的原發(fā)性免疫抑制尚不能取代CNI?？偠灾?，長(zhǎng)期的移植免疫抑制仍然存在改良的空間。經(jīng)移植的腎臟的B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫學(xué)破壞可導(dǎo)致低下的長(zhǎng)期結(jié)果，并且醫(yī)學(xué)界已逐漸認(rèn)識(shí)到對(duì)靶向B細(xì)胞排斥的新活性劑的需求。Chir 12.12是完全人源化的、非激動(dòng)劑型抗⑶40抗體(IgGl，κ )，其阻斷CD154(也稱為CD40配體；CD40L)介導(dǎo)的白細(xì)胞活化，并可以在體外介導(dǎo)人白細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴瘤的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)(參見W02006/073443)。W02005/044306還描述了抗CD40拮抗劑抗體，包括特別是用于治療自身免疫病癥和炎性病癥的Chirl2.12。此外，當(dāng)在食蟹稱猴(Macaca fascicularis)(食蟹猴(Cynomolgus monkeys))中作為單一療法給藥時(shí)，Chirl2.12有效的延遲了腎同種異體移植排斥[Li等人(2008)Transplantation ;86 (I):10_15]。然而，Chirl2.12還可以在非人靈長(zhǎng)類(NHP)中介導(dǎo)外周B細(xì)胞耗盡。預(yù)測(cè)具有沉默的ADCC活性的抗⑶40 mAb相對(duì)于親代抗⑶40抗體具有改良的安全性譜，并且特別地更加適合非癌癥適應(yīng)征(例如自身免疫病)和用于移植情況。因此，本發(fā)明提供了 Fe沉默的抗CD40單克隆抗體，所述抗體保留了親代抗CD40抗體Chirl2.12的非激動(dòng)性、⑶40L阻斷特性。特別地，本發(fā)明提供了包含針對(duì)靶⑶40多肽(SEQ ID NO:28)的抗體的抗原結(jié)合部分的分離的抗體或蛋白質(zhì)，其特征在于所述抗體或蛋白質(zhì)a.以IOnM或更低的Kd結(jié)合CD40多肽，和b.包含沉默的IgG Fe區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體或蛋白質(zhì)以50ng/ml或更低的IC5tl抑制⑶40L誘導(dǎo)的信號(hào)傳遞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分離的抗體或蛋白質(zhì)沒有或具有低的關(guān)于CD40信號(hào)傳遞的激動(dòng)劑活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID NO:17, SEQID NO: 18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的沉默的IgG Fe區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的抗體或蛋白質(zhì)包含分別與Chirl2.12的Vh(SEQ ID NO:9)和 Chirl2.12 抗體的 Vl (SEQ ID NO:10)具有至少 60、70、80、90、95、96、97、98、99或100百分比序列同一性的重鏈(Vh)和輕鏈(')可變區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的抗體的具體實(shí)例是:-包含SEQID NO: 11的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO: 12的輕鏈氨基酸序列的mAbl,-包含SEQID NO: 13的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO: 14的輕鏈氨基酸序列的mAb2，或-包含SEQID NO: 15的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO: 16的輕鏈氨基酸序列的mAb30根據(jù)本發(fā)明的分離的抗體或蛋白質(zhì)可用作藥物。特別地，其適合用于治療自身免疫病癥、炎性病癥和/或預(yù)防或降低移植中的移植物排斥風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明的分離的抗體或蛋白質(zhì)特別可用于治療多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Sjdgren綜合癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥和移植物抗宿主疾病。本發(fā)明還涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含與至少一種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載劑組合的根據(jù)本發(fā)明的上述抗體或蛋白質(zhì)。所述藥物組合物還可以包含其他活性成分。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)的凍干物或液體制劑。本發(fā)明還涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)的分離的核酸，以及包含選自SEQID NO:22至27的至少一種核酸的相應(yīng)的克隆或表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及包含一個(gè)或多個(gè)如上文定義的克隆或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)上文定義的宿主細(xì)胞，純化和回收所述抗體或蛋白質(zhì)。為了更便于理解本發(fā)明，首先定義一些術(shù)語(yǔ)。詳細(xì)的說明書全文還提供了其他定義。術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和由上述細(xì)胞或肝臟生產(chǎn)的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，所述作用導(dǎo)致選擇性破壞、消滅或從人體中清除侵入的病原體、感染了病原體的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞或，在自身免疫病或病理性炎癥的情況下，正常的人細(xì)胞或組織?！靶盘?hào)傳導(dǎo)途徑”或“信號(hào)傳遞活性”指一般由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(如生長(zhǎng)因子與受體的結(jié)合)起始的生物化學(xué)的因果關(guān)系，導(dǎo)致信號(hào)從細(xì)胞的一部分傳遞至細(xì)胞的另一部分。一般而言，傳遞涉及在一系列導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)的反應(yīng)中的一種或多種蛋白質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基的特異性磷酸化。倒數(shù)第2個(gè)過程通常包括細(xì)胞核事件，導(dǎo)致基因表達(dá)的改變。除非另外提及，術(shù)語(yǔ)CD40指人CD40，例如SEQ ID NO:28中定義的。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中包括完整的抗體和任何抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié)合部分”)或其單鏈。天然存在的“抗體”是包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈 由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域:CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為')和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由I個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。V1^P'區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其中散布被稱為框架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域。每個(gè)Vh和'由3個(gè)⑶R和4個(gè)FR組成，從氨基端至羧基端按下列順序排列:FRUDRl、FR2、raR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)中的多種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)單地“抗原部分”)在本文中指保留了與抗原(例如，CD40的一部分)特異性結(jié)合能力的抗體的全長(zhǎng)或一個(gè)或多個(gè)片段。已顯示可以通過全長(zhǎng)抗體的片段實(shí)施抗體的抗原結(jié)合功能。涵蓋在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”中的結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段，由\、VH、Cl和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab)2片段，包括通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；由Vh和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，1989Nature341:544-546);和分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，或包含此類抗原結(jié)合部分的任何融合蛋白。此外，雖然Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域\和Vh由單獨(dú)的基因編碼，可以使用重組方法，通過合成的接頭連接它們，使其能夠以單鏈蛋白質(zhì)的方式制備，其中 '和Vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(被稱為單鏈Fv (scFv);參見例如,Bird等人，1988Science242:423-426 ;和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sc1.85:5879-5883)。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”也旨在涵蓋此類單鏈抗體。這些抗體片段是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得的，并以與完整抗體相同的方式篩選具有用途的片段。在本文中，術(shù)語(yǔ)“IgG Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域，包括天然序列的Fe區(qū)和變體Fe區(qū)。人IgG重鏈Fe區(qū)一般定義為包含從IgG抗體的C226位或P230位至羧基端的氨基酸殘基。Fe區(qū)中的殘基編號(hào)是Kabat的EU索引?？梢栽诶缈贵w生產(chǎn)或純化過程中去除Fe區(qū)的C端賴氨酸(殘基K447)。因此，本發(fā)明的抗體組合物可以包含去除了所有K447殘基的抗體群、沒有去除K447殘基的抗體群，和具有有和沒有K447殘基的抗體混合物的抗體群。“分離的抗體”在本文中指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，特異性結(jié)合CD40的分離的抗體基本不含與非CD40的其他抗原特異性結(jié)合的抗體)。然而，特異性結(jié)合CD40的分離的抗體可以與其他抗原具有交叉反應(yīng)性，如來自其他(非人)物種的CD40分子。此外，分離的抗體可以基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”在本文中指單種分子組成的抗體分子制品。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出針對(duì)特別的表位的單種結(jié)合特異性和親和性。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”在本文中旨在包括含有最少的源自非人免疫球蛋白序列的序列的抗體。在大部分情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區(qū)(也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR)的殘基被具有理想特異性、親和性和能力的來自非人物種(如小鼠、大鼠、兔，或非人靈長(zhǎng)類)的高變區(qū)殘基(供體抗體)替換。詞組“互補(bǔ)決定區(qū)”指共同定義天然免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)的結(jié)合親和性和特異性的氨基酸序列。參見例如，Chothia 等人(1987) J.Mol.Biol.196:901-917:Kabat 等人(1991)US Dept.0f Health and Human Services, NIH Publication N0.91-3242)。詞組“恒定區(qū)”指產(chǎn)生效應(yīng)功能的抗體分子部分。在之前的工作中，為了生產(chǎn)用于人類疾病療法的非免疫原性抗體，用人恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū)。目標(biāo)人源化抗體的恒定區(qū)源自人免疫球蛋白?？梢园凑誛inter 及其同事的方法(Jones 等人(1986)Nature321:522-525 ;Riechmann 等人(1988)Nature332:323-327:Verhoeyen 等人(1988) Science239:1534-1536)，通過用相應(yīng)的人抗體序列取代嚙齒類和突變體嚙齒類的CDR或CDR序列，實(shí)施人源化。在一些情況下，用相應(yīng)的非人殘基替換人免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的框架區(qū)中的殘基(參見例如，美國(guó)專利號(hào)5，585, 089 ;5，693，761 ;5，693，762 ;和6，180，370)。此外，人源化的抗體可以包含未見于受體抗體或供體抗體中的殘基。本發(fā)明的人源化抗體還至少包含一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)。通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)，并且在本發(fā)明的情況下，是沉默的Fe IgG區(qū)。本發(fā)明的抗體可以包括不由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，由體外隨機(jī)或點(diǎn)特異性誘變或體內(nèi)體細(xì)胞突變所導(dǎo)入的突變)。特別地，術(shù)語(yǔ)“人源化的抗體”包括包含F(xiàn)eIgG區(qū)的沉默的變體的抗體。術(shù)語(yǔ)“人源化單克隆抗體”指表現(xiàn)出單種結(jié)合特異性的抗體，所述抗體具有從非人序列人源化的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“重組抗體”在本文中包括所有通過重組手段制備、表達(dá)、生成或分離的人抗體或人源化抗體，如從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如，小鼠)或從其制備的雜交瘤中分離的抗體；從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體或人源化抗體的宿主細(xì)胞中(例如轉(zhuǎn)染瘤)分離的抗體；從重組體，組合的人抗體文庫(kù)中分離的抗體；和通過涉及將全部或部分人免疫球蛋白基因剪接至其他DNA序列的任何其他手段，制備、表達(dá)、生成或分離的抗體。此類重組人抗體或人源化抗體具有這樣的可變區(qū)，其中框架和CDR區(qū)可源自人種系免疫球蛋白序列。然而，在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)此類重組人抗體或人源化抗體進(jìn)行體外突變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞突變)，并且因此重組抗體的Vh和\區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，所述序列盡管源自并且與人種系Vh和\序列相關(guān)，但是可能并非天然存在于體內(nèi)的人抗體種系庫(kù)中。

在本文中，“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因提供的抗體類別(例如，IgM、IgE、IgG如IgGl或IgG4)。不同的同種型具有不同的效應(yīng)子功能。例如，野生型人IgGl和IgG3同種型介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性。
詞組“識(shí)別抗原的抗體”和“抗原特異性抗體”和“針對(duì)抗原的抗體”在本文中可與術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合抗原的抗體”互換使用。在本文中，“特異性結(jié)合⑶40多肽”的抗體或蛋白質(zhì)意指以IOOnM或更低、IOnM或更低、InM或更低的Kd結(jié)合人CD40多肽的抗體或蛋白質(zhì)?！芭c非⑶40的抗原交叉反應(yīng)”的抗體意指以I μ M或更低，IOOnM或更低，IOnM或更低，InM或更低的Kd結(jié)合抗原的抗體?！安慌c特別的抗原交叉反應(yīng)”的抗體意指以IOOnM或更高的KD，或I μ M或更高的KD，或10 μ M或更高的Kd結(jié)合抗原的抗體。在一些實(shí)施方案中，在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定中，不與抗原交叉反應(yīng)的此類抗體實(shí)質(zhì)上不表現(xiàn)出與這些蛋白質(zhì)可檢測(cè)的
彡口口 術(shù)語(yǔ)“Kg”或“Ka”在本文中意指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而術(shù)語(yǔ)“K解離”或“Kd”在本文中意指特別的抗體-抗原相互作用的解離速率。術(shù)語(yǔ)“KD”在本文中意指解離常數(shù)，所述解離常數(shù)是從Kd與Ka的比(即，Kd/Ka)獲得的并且表示為摩爾濃度(M)。可以使用本領(lǐng)域普遍確立的方法，確定抗體的Kd值。用于確定抗體的Kd的方法是通過使用表面等離子體共振，或使用生物傳感器系統(tǒng)，如BiaetilVsi系統(tǒng)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“親和性”指在單個(gè)抗原性位點(diǎn)上，抗體和抗原之間的相互作用強(qiáng)度。在每個(gè)抗原性位點(diǎn)中，抗體“臂”的可變區(qū)通過弱的非共價(jià)力與抗原在多個(gè)位點(diǎn)相互作用；相互作用越多，親和性越強(qiáng)。在本文中術(shù)語(yǔ)“親合力”指抗體-抗原復(fù)合物的整體穩(wěn)定性或強(qiáng)度的信息化度量。受三種主要因素控制:抗體表位親和性；抗原和抗體兩者的效價(jià)；和相互作用部分的結(jié)構(gòu)排列。這些因素最終定義 抗體的特異性，即，特別的抗體與精確的抗原表位結(jié)合的可能性。在本文中，術(shù)語(yǔ)“ CD40拮抗劑”意指這樣的抗體或蛋白質(zhì)，所述抗體或蛋白質(zhì)在人細(xì)胞測(cè)定(如CD40L介導(dǎo)的PBMC增殖測(cè)定)中，在存在CD40L的條件下，抑制CD40誘導(dǎo)的信號(hào)傳遞活性。下文實(shí)例中更詳細(xì)地描述了此類測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，如在CD40L介導(dǎo)的PBMC增殖測(cè)定中所測(cè)量的，本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)抑制CD40L誘導(dǎo)的信號(hào)傳遞的IC50為500ng/ml或更低，優(yōu)選地IC50為50ng/ml或更低，例如IC50為20ng/ml或更低。在本文中，“無激動(dòng)劑活性”的抗體意指這樣的抗體，所述抗體在基于細(xì)胞的測(cè)定(如CD40L介導(dǎo)的PBMC增殖測(cè)定)中，在缺少CD40L的條件下，不顯著增加CD40介導(dǎo)的信號(hào)傳遞活性。下文實(shí)例中更詳細(xì)地描述了此類測(cè)定。在本文中，術(shù)語(yǔ)“ADCC”或“抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性”活性指細(xì)胞耗盡活性?？梢酝ㄟ^下文實(shí)施例中更詳細(xì)地描述的ADCC測(cè)定來測(cè)量ADCC活性。在本文中，術(shù)語(yǔ)“沉默的”抗體指在實(shí)施例中描述的ADCC測(cè)定中表現(xiàn)出無或低的ADCC活性的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“無或低的ADCC活性”意指如在實(shí)施例中所描述的ADCC測(cè)定中所測(cè)量的，沉默的抗體表現(xiàn)出低于50%特異性細(xì)胞裂解，例如低于10%特異性細(xì)胞裂解的ADCC活性。無ADCC活性意指沉默的抗體表現(xiàn)出低于I %的ADCC活性(特異性細(xì)胞裂解)。在特別的實(shí)施方案中，如在實(shí)施例中所描述的ADCC測(cè)定所測(cè)量的，根據(jù)本發(fā)明的沉默的抗體不表現(xiàn)出任何顯著的ADCC活性?？梢酝ㄟ^突變抗體的Fe區(qū)獲得沉默的效應(yīng)子功能并且已在本領(lǐng)域中描述:LALA 和 N297A(Strohl, ff.,2009, Curr.0pin.Biotechnol.第 20 卷(6):685-691)；和D265A(Baudino 等人，2008，J.1mmunol.181:6664-69 ；Strohl, W.，見上文)。沉默的Fe IgGl抗體的實(shí)例包含所謂的LALA變體，其包含IgGl Fe氨基酸序列中的L234A和L235A突變。沉默的IgGl抗體的另一個(gè)實(shí)例包含D265A突變。沉默的IgGl抗體的另一個(gè)實(shí)例包含N297A突變，所述突變導(dǎo)致aglycosylated/無糖基化的抗體。在本文中，術(shù)語(yǔ)本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)的“選擇性”指抗體或蛋白質(zhì)結(jié)合某些靶多肽而不結(jié)合密切相關(guān)的多肽。在本文中，術(shù)語(yǔ)抗體的“高親和性”指對(duì)靶抗原具有InM或更低的Kd的抗體。在本文中，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”包括任何人或非人動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“非人動(dòng)物”包括所有的脊椎動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。在本文中，術(shù)語(yǔ)“優(yōu)化的”意指使用生產(chǎn)細(xì)胞或生物(一般是真核細(xì)胞，例如，畢赤酵母的細(xì)胞、木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞、中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或人細(xì)胞)中優(yōu)選的密碼子的經(jīng)改變以編碼氨基酸序列的核苷酸序列。改造優(yōu)化的核苷酸序列以完全或盡可能多地保留了由起始核苷酸序列最初編碼的氨基酸序列，其也稱為“親代”序列。本文中的優(yōu)化的序列經(jīng)過改造以具有在CHO哺乳動(dòng)物細(xì)胞中優(yōu)選的密碼子，然而，本文也設(shè)想了這些序列在其他真核細(xì)胞中的優(yōu)化表達(dá)。由優(yōu)化的核苷酸序列編碼的氨基酸序列也被稱為是優(yōu)化的。在本文中，兩條序列之間的百分比同一性是序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，％同一性=相同的位置#/總位置#χ100)，考慮了兩條序列的最佳比對(duì)所需要引入的空位數(shù)和每個(gè)空位的長(zhǎng)度。可以使用如下所述的數(shù)學(xué)算法，實(shí)現(xiàn)序列比較和確定兩條序列的百分比同一性。

可以使用E.Meyers 和 V.Miller 的算法(Comput.Appl.Biosc1.,4:11-17,1988)，確定兩條氨基酸序列之間的百分比同一性，所述算法已經(jīng)整合到ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120權(quán)重殘基表,空位長(zhǎng)度罰分為12,空位罰分為4?？蛇x的,可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48 =444-453,1970)算法，確定兩條氨基酸序列之間的百分比同一性，所述算法已經(jīng)整合到GCG軟件包的GAP程序中(可自http://www.gcg.com獲得)，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，空位權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。還可以使用例如核酸序列的BLASTN程序算法，確定兩條核苷酸氨基酸序列之間的百分比同一性，使用字長(zhǎng)度(W) 11，期望值(E)10，M=5，N = 4作為默認(rèn)值，比較兩條鏈。重組抗體本發(fā)明的抗體包括人源化重組抗體mAbl-mAb3，將其分離并根據(jù)其全長(zhǎng)重鏈和輕鏈氨基酸序列結(jié)構(gòu)性表征，如下表I所述。表1:mAbl-mAb3的全長(zhǎng)重鏈和輕鏈氨基酸序列
權(quán)利要求
1.包含針對(duì)靶⑶40多肽(SEQID NO:28)的抗體的抗原結(jié)合部分的分離的抗體或蛋白質(zhì)，特征在于所述抗體或蛋白質(zhì) a.以IOnM或更低的Kd結(jié)合CD40多肽，和 b.包含沉默的IgGFe區(qū)。
2.權(quán)利要求1的分離的抗體或蛋白質(zhì)，其中所述抗體或蛋白質(zhì)以50ng/ml或更低的IC50抑制⑶40L誘導(dǎo)的 信號(hào)傳遞。
3.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的分離的抗體或蛋白質(zhì)，其中所述抗體或蛋白質(zhì)沒有或只有低的關(guān)于CD40信號(hào)傳遞的激動(dòng)劑活性。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的分離的抗體或蛋白質(zhì)，其中所述抗體或蛋白質(zhì)包含沉默的 IgG Fe 區(qū)，所述沉默的 IgG Fe 區(qū)選自 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO: 18 或 SEQ ID NO:19的氨基酸序列所組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的分離的抗體或蛋白質(zhì)，所述抗體或蛋白質(zhì)包含重鏈(Vh)和輕鏈(VJ可變區(qū)，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)分別與SEQ ID NO:9的SEQ ID NO:10的Vl具有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或100百分比序列同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的分離的抗體或蛋白質(zhì)，所述抗體或蛋白質(zhì)選自: a.包含SEQID NO:11的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:12的輕鏈氨基酸序列的mAbl抗體， b.包含SEQID NO:13的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:14的輕鏈氨基酸序列的mAb2抗體，和 c.包含SEQID NO:15的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:16的輕鏈氨基酸序列的mAb3抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的分離的抗體或蛋白質(zhì)，所述抗體或蛋白質(zhì)用作藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的分離的抗體或蛋白質(zhì)，所述抗體或蛋白質(zhì)用于治療自身免疫病癥和/或炎性病癥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的分離的抗體或蛋白質(zhì)，所述抗體或蛋白質(zhì)用于預(yù)防或降低移植中移植物排斥的風(fēng)險(xiǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的分離的抗體或蛋白質(zhì)，所述抗體或蛋白質(zhì)用于治療多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Sjiigren綜合癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥和移植物抗宿主病。
11.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的抗體或蛋白質(zhì)，所述抗體或蛋白質(zhì)與至少一種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載劑組合。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，其還包含其他活性成分。
13.液體藥物制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的抗體或蛋白質(zhì)與至少一種緩沖劑。
14.分離的核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的抗體或蛋白質(zhì)。
15.克隆或表達(dá)載體,所述克隆或表達(dá)載體包含根據(jù)權(quán)利要求14的一種或多種核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的克隆或表達(dá)載體，所述克隆或表達(dá)載體包含與合適的啟動(dòng)子序列有效連接的下列編碼序列(a)-(c)中的至少一種:(a)SEQID NO:22 和 SEQ ID NO:23 ；(b)SEQID NO:24 和 SEQ ID NO:25 ;或(c)SEQ ID NO:26 和 SEQ ID NO:27。
17.宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求15或16的一種或多種克隆或表達(dá)載體。
18.用于生產(chǎn)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的抗體或蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞, 純化和回收所述抗體或蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗CD40抗體的沉默的Fc變體和組合物，和使用所述抗體治療病理性功能障礙的方法，例如自身免疫和炎性病癥，和/或預(yù)防或降低移植時(shí)的移植物排斥風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C07K16/28GK103209996SQ201180054907
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者C·厄塞, J·拉什, K·文森特 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司