通過刪除由nkt細(xì)胞識(shí)別的表位來調(diào)整抗原免疫原性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了一種方法和化合物，其用于阻止針對(duì)外源因子、針對(duì)用于基因療法和基因接種的病毒載體、針對(duì)受治療者天然暴露的蛋白質(zhì)、針對(duì)基因修飾的有機(jī)體和針對(duì)與用于變應(yīng)性或傳染性疾病的疫苗施用有關(guān)的不希望的效應(yīng)的免疫應(yīng)答。
【專利說明】通過刪除由NKT細(xì)胞識(shí)別的表位來調(diào)整抗原免疫原性
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及降低天然免疫原性或誘發(fā)耐受性的肽或多肽，和其在阻止針對(duì)外源因子(allofactors)、用于基因療法或基因接種的病毒載體、用于食品或飼料的環(huán)境抗原而誘發(fā)的免疫應(yīng)答或受治療者通過吸入或接觸暴露的免疫應(yīng)答，或誘發(fā)以降低與由變應(yīng)原或傳染劑接種相關(guān)的副作用的免疫應(yīng)答中用途。
【背景技術(shù)】
[0002]在許多情況下，用于治療目的的蛋白質(zhì)施用導(dǎo)致針對(duì)治療性藥的免疫應(yīng)答，其阻礙所述治療性藥的任何進(jìn)一步施用。這樣的實(shí)例由受血友病A影響的受治療者中凝血途徑的VIII因子的施用提供:約三分之一的接受治療者產(chǎn)生抑制VIII因子作用的抗VIII因子抗體。在罹患糖原代謝缺陷的受治療者中對(duì)酶類如α半乳糖苷酶的施用同樣地帶來阻止任何進(jìn)一步施用的針對(duì)治療性藥的免疫應(yīng)答。第三實(shí)例由用作治療性藥和針對(duì)淋巴細(xì)胞表面分子、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體使用的抗體提供?？偟恼f來，高度需要發(fā)現(xiàn)阻止抗治療性藥的免疫的新治療方法。
[0003]病毒載體用于基因療法或基因接種的用途受以下事實(shí)的嚴(yán)格限制:這種病毒載體誘出的免疫應(yīng)答，其導(dǎo)致由載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞迅速消除和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的迅速損耗。取決于病毒載體的性質(zhì)，病毒載體誘出具有可變程度的強(qiáng)度的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活。因此，腺病毒載體強(qiáng)烈地刺激先天性免疫應(yīng)答，其后是適應(yīng)性免疫應(yīng)答。腺相關(guān)病毒載體觸發(fā)較弱先天性應(yīng)答，但誘出抗體產(chǎn)生?；虔煼ê突蚪臃N的可能性是巨大的。先天性和/或適應(yīng)性應(yīng)答通過其來針對(duì)病毒載體的治療方法將在本領(lǐng)域表現(xiàn)高度顯著的進(jìn)展。
[0004]許多受治療者受到誘出以抵抗他們天然暴露的蛋白質(zhì)的應(yīng)答困擾。變應(yīng)原(空氣傳播的或來自食品)誘出諸如變應(yīng)性鼻炎和哮喘、蕁麻疹、濕疹和過敏性反應(yīng)之類的反應(yīng)。至于為什么所述受治療者呈 現(xiàn)這種反應(yīng)的原因僅被部分地解釋。降低以下的天然免疫原性將是十分有益的:蛋白質(zhì)，諸如各種各樣的食物變應(yīng)原；導(dǎo)致乳糜瀉的小麥；或受治療者出于職業(yè)原因而暴露的諸如酶類的產(chǎn)物。
[0005]在用于變應(yīng)性疾病或抗傳染劑的接種策略中，治療功效經(jīng)常受副作用限制，所述副作用由變應(yīng)原或傳染劑的促炎性質(zhì)誘出。這種炎性效應(yīng)妨礙更高劑量的疫苗的使用，并因此妨礙疫苗功效，并且使免疫應(yīng)答適應(yīng)無用的細(xì)胞應(yīng)答，諸如遲發(fā)型反應(yīng)，以及適應(yīng)對(duì)所考慮狀況不是最理想的同種型的抗體的產(chǎn)生。對(duì)接種中炎癥的更佳控制將提供對(duì)免疫應(yīng)答的更加有效調(diào)整，同時(shí)降低與發(fā)炎有關(guān)的副作用。
[0006]自然殺傷T(NKT)細(xì)胞構(gòu)成識(shí)別由非經(jīng)典MHC絡(luò)合分子⑶Id呈現(xiàn)的抗原的非常規(guī)T淋巴細(xì)胞的不同譜系?，F(xiàn)在描述NKT細(xì)胞的兩個(gè)亞型。I型NKT細(xì)胞，也稱為不變NKT細(xì)胞(iNKT)，是最豐富的。它們的特征在于，存在由不變?chǔ)伶?小鼠中的Va 14和人中的V a 24)構(gòu)成的α-β T細(xì)胞受體(TCR)。該α鏈與變量相關(guān)，但限制β鏈的數(shù)量。2型NKT細(xì)胞具有a-PTCR，但攜帶多態(tài)α鏈。然而，顯而易見的是存在NKT細(xì)胞其它亞型，其表型仍未完全定義，但其特征為由在CDld分子的背景下呈現(xiàn)的糖脂激活。[0007]NKT細(xì)胞一般表達(dá)自然殺傷(NK)細(xì)胞受體(包括NKG2D和NKl.1)的組合。NKT細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的一部分，其可以區(qū)別于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，實(shí)際上它們?cè)诘玫酵耆?yīng)子能力之前不需要擴(kuò)張。NKT細(xì)胞的激活導(dǎo)致各種效應(yīng)。這種細(xì)胞釋放預(yù)形成介體，包括幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的一大列細(xì)胞因子(包括中間白細(xì)胞素(IL)-4，干擾素(IFN)-Y，IL-21和IFN-α )，并且有人提出細(xì)胞因子的釋放也可影響⑶4+T細(xì)胞(Burrows等人，NatureImmunology2009,10:669-671)。在本發(fā)明中，認(rèn)為對(duì)B細(xì)胞激活和主要組織相容性(MHC)II類限制性CD4+T細(xì)胞激活的預(yù)防在降低或消除蛋白免疫原性中起作用。
[0008]用于NKT細(xì)胞的識(shí)別單元(⑶Id分子)具有與MHC I類分子極其類似的結(jié)構(gòu)，包括β-2微球蛋白的存在。其特征為毗連兩個(gè)α鏈的很深裂隙并且含有接收脂質(zhì)鏈的高度疏水的殘基。該裂隙在兩個(gè)末端開放，允許容納較長(zhǎng)鏈。用于CDld的規(guī)范配位體是合成的α半乳糖?；拾贝?a GalCer)。然而，已經(jīng)描述了許多自然替代性配位體，包括糖脂和磷脂，該自然脂質(zhì)硫脂發(fā)現(xiàn)于髓鞘質(zhì)、微生物磷酸肌醇甘露糖苷和α半乳糖醛酸神經(jīng)酰胺中。目前的共識(shí)(參見綜述，諸如Matsuda等人，Current Opinion in Immunology 2008，20:358-368 和 Godfrey 等人，Nature reviews Immunology 2010,11:197-206)在于，CDld僅結(jié)合含脂質(zhì)鏈的配位體，或通常由被嵌入CDld中的脂質(zhì)尾部和從CDld中伸出的糖類殘基首基構(gòu)成的常見結(jié)構(gòu)。
[0009]不認(rèn)為肽能夠通過⑶Id的呈現(xiàn)激活NKT細(xì)胞。然而，有人提出，含龐大氨基酸殘基的長(zhǎng)疏水肽可以結(jié)合至CDlcKCastano等人，Science 1995,269:223-226)。使用表達(dá)具有未定義的生理相關(guān)性的隨機(jī)序列肽的噬菌體呈現(xiàn)文庫進(jìn)行的觀察，允許確立理論共有基序(Castano 等人，Science 1995，269:223-226 并且參見下文)。
[0010]實(shí)際上，Castano等人表明，激活的細(xì)胞是⑶8+T細(xì)胞，也就是MHC I類限制性細(xì)胞，而不是NKT細(xì)胞。這些發(fā) 現(xiàn)教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員不存在疏水肽由⑶Id分子呈現(xiàn)的證據(jù)。因在常規(guī)免疫方案下不能誘出NKT細(xì)胞，Castano等人宣稱的生理相關(guān)性被進(jìn)一步懷疑(Matsuda 等人，Current Opinion in Immunology2008,20:358-368 and BrutkiewiczJournal of Immunology2006，177:769-775)。諸如用被轉(zhuǎn)染以過表達(dá)CDld并在體外加載卵清蛋白衍生肽的細(xì)胞進(jìn)行免疫的人工系統(tǒng)能夠誘出NKT細(xì)胞。同樣地，用質(zhì)粒DNA以及鼠CDld和共刺激分子進(jìn)行的真皮內(nèi)免疫誘發(fā)溶細(xì)胞CDld限制性T細(xì)胞(Lee等人，Journalof Experimental Medicine 1998,187:433-438)。Castano 等人宣稱，含由 Pl 位和 P7 位的芳族殘基和P4位的脂族鏈構(gòu)成的結(jié)構(gòu)基序的疏水妝含有用于CDld結(jié)合表位的核心基序。如上所述，Castano等人達(dá)成的該結(jié)論不受數(shù)據(jù)支持。
[0011]我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)，包圍疏水氨基酸序列的肽實(shí)際上能夠誘出NKT細(xì)胞的激活。
[0012]如果來自用于治療性目的而施用，或受治療者通常暴露的，或在進(jìn)行基因療法或基因接種時(shí)而施用，或在用于變應(yīng)性或傳染性疾病的接種的背景下而施用的蛋白的表位結(jié)合至CDld并因此激活NKT細(xì)胞，則突變所致所述蛋白的變化和/或消除所述表位的刪除將是阻止免疫原性非常需要的。
[0013]鑒別這種表位，隨后突變、添加或刪除氨基酸以阻止NKT細(xì)胞激活形成本發(fā)明的基礎(chǔ)。
[0014]發(fā)明概述[0015]本發(fā)明涉及肽或多肽用于通過阻止針對(duì)外源因子的免疫應(yīng)答治療受治療者中針對(duì)所述外源因子誘出的這種免疫應(yīng)答的用途。
[0016]本發(fā)明還涉及肽或多肽用于通過阻止針對(duì)用于基因療法或基因接種的病毒載體的免疫應(yīng)答治療受治療者中針對(duì)所述病毒載體誘出的免疫應(yīng)答的用途。
[0017]本發(fā)明還涉及由基因修飾的有機(jī)體制備的肽或多肽用于在受治療者中阻止通過暴露于天然蛋白質(zhì)而誘出的免疫應(yīng)答的用途。
[0018]本發(fā)明還涉及肽或多肽在先天性免疫性的激活是有害時(shí)用于接種目的的用途。
[0019]本發(fā)明還涉及鑒別攜帶⑶Id結(jié)合表位的蛋白質(zhì)和通過氨基酸取代或刪除消除這種表位的方法。
[0020]我們意外發(fā)現(xiàn)，顯著比例的肽或多肽攜帶允許它們結(jié)合用于激活天然殺傷T(NKT)細(xì)胞的CDld決定子和由其呈現(xiàn)的氨基酸序列。這種細(xì)胞的激活導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放，并且在一些情況下，導(dǎo)致獲得或增加溶細(xì)胞性。
[0021]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及至少一種分離肽或多肽用作外源因子的用途，所述肽或多肽已經(jīng)被修飾以消除涉及由NKT細(xì)胞識(shí)別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止對(duì)所述外源因子的免疫應(yīng)答的藥物的用途。
[0022]在一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及至少一種分離肽或多肽用作用于基因療法或基因接種的病毒載體的用途，所述肽或多肽已經(jīng)被修飾以消除涉及由NKT細(xì)胞識(shí)別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止對(duì)所述病毒載體的免疫應(yīng)答的藥物的用途。
[0023]在一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及由基因修飾的有機(jī)體產(chǎn)生的至少一種分離肽或多肽的用途，所述肽或多肽被修飾以消除涉及由NKT細(xì)胞識(shí)別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止針對(duì)天然暴露于所述肽或多肽的免疫應(yīng)答的藥物的用途。
[0024]在一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及至少一種分離肽或多肽用作疫苗的用途，所述肽或多肽已經(jīng)被修飾以消除涉及由NKT細(xì)胞識(shí)別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止對(duì)所述疫苗的無用或不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的藥物的用途。
[0025]在另一方面，本發(fā)明還涵蓋至少一種分離肽或多肽用作外源因子、病毒載體、基因修飾的有機(jī)體或疫苗的用途，所述肽或多肽已經(jīng)被修飾以消除涉及由NKT細(xì)胞識(shí)別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止激活、細(xì)胞因子產(chǎn)生、對(duì)由所述受治療者中CD4+NKT細(xì)胞攜帶的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的溶細(xì)胞活性和抑制活性的藥物的用途。
[0026]本發(fā)明涉及包含至少一個(gè)CDld限制性T細(xì)胞表位的疏水的肽或多肽，其中定位為CDld的錨定殘基的氨基酸被替代性氨基酸替換，或被刪除，這導(dǎo)致對(duì)CDld的結(jié)合喪失或顯著減小并且因此導(dǎo)致NKT細(xì)胞激活 喪失或顯著減小。
[0027]CDld分子的結(jié)構(gòu)表明，需要疏水的氨基酸殘基占據(jù)位于CDld裂隙的末端處的兩個(gè)疏水袋，并且脂族殘基應(yīng)該占據(jù)所述裂隙中間的位置。因此，作為CDld結(jié)合序列的一般示例，可以使用基序[FW]-XX-[ILM]-XX-[FWTH]，其中[FW]表明F或W可以占據(jù)第一錨定殘基(P1)，P4位可以由1、L或M占據(jù)并且P7可以由F、W、T或H占據(jù)。在此一般模型基序中X代表任何氨基酸。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，應(yīng)該清楚的是，這些氨基酸殘基的各種組合是可能的。在具體實(shí)施方案中，該一般模型基序可以作為反向序列如[FWTH]-XX-[ILM]-XX-[FW]呈現(xiàn)。在另一具體實(shí)施方案中，將至少一個(gè)氨基酸加入CDld結(jié)合基序內(nèi)，所述氨基酸干擾該基序，阻礙其結(jié)合到CDld的能力并因此阻礙其激活NKT細(xì)胞的能力。
[0028]本發(fā)明更具體來說還涉及肽或多肽，其中Pl位和P7位中的F、W、T、H或Y被非天然氨基酸(例如D氨基酸)或有機(jī)化合物替換。
[0029]在任何上述用途中，所述外源因子可以是用于以下的任何肽或多肽:(1)凝血缺陷或纖維蛋白溶解缺陷的替換療法，包括VDI因子、IX因子和葡萄球菌激酶；(2)激素，例如生長(zhǎng)激素或胰島素；(3)細(xì)胞因子和增長(zhǎng)因子，例如干擾素-α，干擾素-Y，GM-CSF和G-CSF ； (4)用于調(diào)整免疫應(yīng)答的抗體，包括在變應(yīng)性疾病中的抗IgE抗體，在移植物排斥和各種各樣的自身免疫疾病中的抗CD3和抗CD4抗體，在非霍奇金氏淋巴瘤中的抗CD20抗體；(5)腎機(jī)能不全中的促紅細(xì)胞生成素和；(6)基因修飾過的抗原。
[0030]在任何上述用途中，所述病毒載體可以是RNA病毒(Y-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒)或DNA病毒(腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒和痘病毒類)的任何肽或多肽。
[0031 ] 在任何上述用途中，所述基因修飾的有機(jī)體可以是植物或動(dòng)物來源的任何有機(jī)體，其用作食用或飼料，用于生產(chǎn)農(nóng)作物或制造材料，或用于生產(chǎn)食物或飼料、或畜牧業(yè)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
[0032]在任何以上所述中，用于接種的所述肽或多肽可以來自變應(yīng)原或來自傳染劑，包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲。變應(yīng)原可以是空氣傳播的變應(yīng)原，例如衍生自房塵螨、來自花粉或來自家畜那些，食物變應(yīng)原例如花生、卵清蛋白、谷物、水果和豆類，以及接觸性抗原例如膠乳。特征為變應(yīng)原敏化的疾病包括變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性鼻竇炎、過敏性休克、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎和接觸性皮炎。
[0033]本發(fā)明還涉及用于鑒別激活NKT細(xì)胞的肽或多肽和通過取代、添加或刪除氨基酸來改變CDld結(jié)合表位以消除這種激活的方法。所述方法包含以下步驟:用攜帶CDld的細(xì)胞培育所述肽或多肽，隨后添加多克隆`NKT細(xì)胞群并且確定所述NKT細(xì)胞的激活。
[0034]本發(fā)明還涵蓋分離的病毒載體，其特征在于它們包含通過取代或刪除至少一個(gè)疏水的氨基酸來修飾的外源因子的至少一個(gè)肽或多肽，或通過取代或刪除至少一個(gè)疏水的氨基酸殘基來修飾的變應(yīng)原或傳染劑的至少一個(gè)肽或多肽。應(yīng)當(dāng)理解的是，病毒載體其自身也可通過取代或刪除疏水的氨基酸殘基被修飾。
[0035]定義
[0036]術(shù)語"肽"在本文中使用時(shí)是指包含由肽鍵連接的2至200個(gè)氨基酸的氨基酸序列，但其在具體實(shí)施方案中可以包含非氨基酸結(jié)構(gòu)(如連接性有機(jī)化合物)。本發(fā)明的肽可以含有任何常規(guī)的20個(gè)氨基酸或它們的修飾物，或可以含有通過化學(xué)肽合成或化學(xué)或酶修飾摻入的非天然氨基酸。術(shù)語“多肽”當(dāng)在本文中使用時(shí)是指通常較長(zhǎng)的肽或蛋白質(zhì)。
[0037]術(shù)語"表位"當(dāng)在本文中使用時(shí)是指蛋白質(zhì)的一個(gè)或若干個(gè)部分(其可以限定構(gòu)象表位)，其由抗體或其一部分(Fab'、Fab2'等)或B或T細(xì)胞淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面上呈現(xiàn)的受體特異性識(shí)別和結(jié)合，并且其能夠通過所述結(jié)合而誘發(fā)免疫應(yīng)答。
[0038]術(shù)語"抗原"當(dāng)在本文中使用時(shí)是指包含一個(gè)或多個(gè)半抗原和/或包含一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位的大分子結(jié)構(gòu)。一般而言，所述大分子是蛋白質(zhì)或肽(具有或沒有多糖)或由蛋白成分構(gòu)成并且包含一個(gè)或多個(gè)表位；所述大分子在本文可替換地稱為"抗原性蛋白質(zhì)"或“抗原性肽”。
[0039]術(shù)語”變應(yīng)原”是指抗原的特定亞型，特征為其在易感染個(gè)體中誘出IgE同種型的抗體的能力。
[0040]在本發(fā)明的背景下術(shù)語"T細(xì)胞表位"或“T-細(xì)胞表位”是指優(yōu)勢(shì)、次優(yōu)勢(shì)或次要T細(xì)胞表位，即，被T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面上的受體特異性識(shí)別并且結(jié)合的抗原性蛋白質(zhì)的一部分。表位是否為優(yōu)勢(shì)、亞優(yōu)勢(shì)或次要，取決于針對(duì)表位誘出的免疫反應(yīng)。優(yōu)勢(shì)取決于蛋白質(zhì)的所有可能T細(xì)胞表位中，這種表位被T細(xì)胞識(shí)別并且能夠激活所述T細(xì)胞的頻率。特別地，T細(xì)胞表位是由MHC I類或MHC II類分子結(jié)合的表位。
[0041]術(shù)語“NKT細(xì)胞表位”是指被T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面上的受體特異性識(shí)別并且結(jié)合的抗原性蛋白質(zhì)的一部分。特別地，NKT細(xì)胞表位是由CDld分子結(jié)合的表位。
[0042]術(shù)語“⑶4+效應(yīng)子細(xì)胞”是指屬于T-細(xì)胞的⑶4-陽性亞型的細(xì)胞，其功能為向其它細(xì)胞例如B-細(xì)胞提供協(xié)助。這些效應(yīng)子細(xì)胞通常作為Th細(xì)胞(T協(xié)助細(xì)胞)報(bào)告，具有不同的亞型，例如ThO、Thl、Th2和Thl7細(xì)胞。
[0043]術(shù)語“NKT細(xì)胞”是指先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，其特征為實(shí)際上它們攜帶諸如NKl.1和NKG2D的受體，并且識(shí)別由⑶Id分子呈現(xiàn)的表位。在本發(fā)明的背景下，NKT細(xì)胞可以屬于I型(不變)或2型亞型。
[0044]“⑶Id分子”是指由3 α鏈和β鏈的一個(gè)逆平行組構(gòu)成的非MHC衍生分子，所述β鏈被布置到在兩側(cè)開放的深疏水凹槽中，所述非MHC衍生分子能夠向NKT細(xì)胞呈現(xiàn)脂質(zhì)、糖脂或疏水肽。
[0045]術(shù)語"免疫紊亂"或"免疫疾病"是指這樣的疾病，其中免疫系統(tǒng)的反應(yīng)對(duì)有機(jī)體中功能失?；蚍巧硇郧闆r負(fù)責(zé)或者維持所述功能失?；蚍巧硇郧闆r。在本發(fā)明的背景下，免疫紊亂是指由傳染劑和腫瘤監(jiān)視誘發(fā)的病理學(xué)。
`[0046]術(shù)語“外源因子”是指當(dāng)在相同物種的兩個(gè)個(gè)體之間進(jìn)行比較時(shí)呈現(xiàn)多態(tài)性的蛋白質(zhì)、肽或因子(即任何分子)，且更一般說來，是在接受外源因子的受治療者中誘發(fā)(同種異體反應(yīng)性)免疫應(yīng)答的任何蛋白質(zhì)、肽或因子。通過延伸，外源因子還包括用于飼養(yǎng)的基因修飾的蛋白質(zhì)。
[0047]術(shù)語“異體抗原”或“異體移植抗原”當(dāng)在本文中使用時(shí)是指衍生自(脫落自和/或呈現(xiàn)于)細(xì)胞或組織中的抗原，當(dāng)從供體轉(zhuǎn)移到接受者時(shí)，其可以被受體的B或T-細(xì)胞受體的抗體識(shí)別和結(jié)合。異體抗原一般是多態(tài)基因的產(chǎn)物。異體抗原是蛋白質(zhì)或肽，當(dāng)在供體和受體(屬于相同物種)之間比較時(shí)，其呈現(xiàn)輕微結(jié)構(gòu)差異。在接受者的身體內(nèi)這種供體抗原的存在可以誘出接受者中的免疫應(yīng)答。這種同種異體反應(yīng)性免疫應(yīng)答是對(duì)異體抗原特異性的。
[0048]發(fā)明詳述
[0049]本發(fā)明提供在受治療者中阻止針對(duì)外源因子、針對(duì)用于基因療法或基因接種的病毒載體、針對(duì)用于食物或飼料的蛋白質(zhì)、針對(duì)所述受治療者通過吸入或螫傷暴露的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，或在疫苗使用中在受治療者中阻止對(duì)變應(yīng)原或傳染劑的先天免疫性的不希望激活的方法。
[0050]特別地，本發(fā)明提供阻止CD4+NKT細(xì)胞的擴(kuò)張和官能活性的方法。這種細(xì)胞通常分類為兩種不同的亞型，也就是針對(duì)攜帶不變TCRa鏈(小鼠中Vcil4，人中Vci24)的I型，或用不同的α鏈所有組成成分呈現(xiàn)的2型NKT細(xì)胞。然而，近來有證據(jù)提出不適合I型或2型種類的NKT細(xì)胞的替代性亞型。本發(fā)明的目的為包括這些非常規(guī)NKT細(xì)胞，前提是它們攜帶CD4共同受體。在結(jié)合到CDld的抗原呈現(xiàn)之后，NKT細(xì)胞被迅速激活并且分泌被認(rèn)為是影響來自先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞的決定簇的許多細(xì)胞因子。在有些情況下，所述激活的NKT細(xì)胞獲得或增加細(xì)胞毒性。在其它情況下，所述激活NKT細(xì)胞通過與II類限制性CD4+T細(xì)胞的相互作用抑制或減少適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘出。
[0051]在本發(fā)明的背景下，我們意外觀察到肽可以通過⑶Id分子呈現(xiàn)。⑶Id分子的特征在于，其由形成裂縫的兩個(gè)逆平行α鏈構(gòu)成，所述α鏈位于由兩個(gè)逆平行β鏈構(gòu)成的平臺(tái)的頂上。該裂隙狹窄且很深，并且僅接受疏水的殘基，通常認(rèn)為僅接受脂質(zhì)。該裂隙可以容納7個(gè)氨基酸的序列，所述序列的特征為在(P) I和7位置中的疏水殘基，和在Ρ4中的脂族殘基。Pl是專性疏水的殘基，諸如F、W、H或Y。然而，P7是允許的，并且可以含有替代性殘基，前提是它們是非極性的。P4中殘基優(yōu)選是脂族，但為任選的。CDld結(jié)合基序的一般序列因此是[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚的是，該基序是對(duì)稱的并且P7可以被看作P1，而Pl可以被看作P7。此處作為一般指示提供⑶Id結(jié)合基序的一般序列，而無任何限制意圖。考慮用于本發(fā)明的應(yīng)用的肽和多肽是根據(jù)其通過呈現(xiàn)到⑶Id分子中而激活NKT細(xì)胞的能力來定義。
[0052]能夠激活NKT細(xì)胞并因而攜帶CDld結(jié)合基序的疏水肽或多肽發(fā)現(xiàn)于以下中:外源因子，病毒載體，用于食物或飼料的蛋白質(zhì)，所述受治療者通過吸入或螫傷暴露的蛋白質(zhì)，基因修飾的蛋白質(zhì)和變應(yīng)原；因此賦予所述外源因子、病毒載體、基因修飾的蛋白質(zhì)或變應(yīng)原激活CD4+NKT細(xì)胞的能力。
[0053]本發(fā)明涉及含有CDld結(jié)合基序的肽或多肽的產(chǎn)生，所述CDld結(jié)合基序給予所述肽或多肽激活NKT細(xì)胞的能力并且通過取代Pl和/或P7中的疏水的殘基，并且任選地，取代或刪除P4中的脂族殘基，或這些的任何組合來修飾所述CDld結(jié)合基序，這導(dǎo)致肽或多肽結(jié)合至CDld的能力喪失或顯著減小，并因此導(dǎo)致所述肽或多肽激活NKT細(xì)胞的能力喪失或顯著減小。
[0054]在更具體的實(shí)施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由非疏水的氨基酸殘基替換，或任選地，P4位中的1、L、M或V由非脂族殘基代替，或這些替換的任何組合。
[0055]在另一具體實(shí)施方案中，位于Pl位和/或P7位中的疏水的殘基，或任選地，位于P4中的脂族殘基，或這些殘基的任何組合，被不同于非天然F、W、T、H、Y的至少一個(gè)非天然氨基酸或被非芳族有機(jī)化合物替換。
[0056]在另一具體實(shí)施方案中，將至少一個(gè)氨基酸加入⑶Id結(jié)合基序中Pl至P7序列內(nèi)任何位置，所述氨基酸干擾該基序，阻止其結(jié)合到CDld的能力并因此阻止其激活NKT細(xì)胞的能力。
[0057]在優(yōu)選實(shí)施方案中，非天然氨基酸是D-氨基酸。
[0058]本發(fā)明還涉及含有CDld結(jié)合基序的肽或多肽的產(chǎn)生，所述CDld結(jié)合基序給予所述肽或多肽激活NKT細(xì)胞的能力并且通過取代Pl和/或P7中的疏水的殘基，并且任選地，刪除P4中的脂族殘基，或這些的任何組合來修飾所述CDld結(jié)合基序，這導(dǎo)致肽或多肽結(jié)合至CDld的能力喪失或顯著減小，并因此導(dǎo)致所述肽或多肽激活NKT細(xì)胞的能力喪失或顯著減小。[0059]在對(duì)受治療者施用之后，這種肽或多肽不加載于CDld并且因此被阻止激活NKT細(xì)胞。
[0060]在另一方面，本發(fā)明還涵蓋包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一個(gè)取代或刪除的至少一種分離肽或多肽的用途，用于在受治療者中阻止針對(duì)外源因子施用，病毒載體施用，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白質(zhì)，或用于接種目的的變應(yīng)原或傳染劑的免疫應(yīng)答。
[0061]在另一方面，本發(fā)明還涵蓋包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一個(gè)取代或刪除的至少一種分離肽或多肽的用途，用于在受治療者中阻止針對(duì)外源因子施用，病毒載體施用，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白質(zhì)，或用于接種目的的某些變應(yīng)原或傳染劑的NKT細(xì)胞激活。
[0062]在另一方面，本發(fā)明還涵蓋包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一個(gè)取代或刪除的至少一種分離肽或多肽作為藥物的用途，所述藥物用于在受治療者中阻止針對(duì)外源因子施用，病毒載體施用，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白質(zhì)，或用于接種目的的基因修飾的肽或多肽或某些變應(yīng)原或傳染劑的免疫應(yīng)答。
[0063]當(dāng)在肽或多肽中呈現(xiàn)時(shí)，CDld結(jié)合基序的數(shù)量十分有限。這種肽或多肽的實(shí)例在下文提供。一般地，多肽呈現(xiàn)這些基序中的一至五個(gè)。
[0064]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)在于，CDld分子呈現(xiàn)十分有限程度的多態(tài)性。因此對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的相同氨基酸取代、添加或刪除提供可用于所有或大多數(shù)受治療者的肽或多肽。這與結(jié)合至MHC II類分子的肽或多肽基序呈鮮明對(duì)比，其中大量的肽可以描繪成含有合適序列。這是由于施加于MHCII類結(jié)合肽和II類分子大多態(tài)性的極小約束。
[0065]作為本發(fā)明的目的的肽和多肽被確定為:
[0066](I)任選地，針對(duì)含有Pl和P7中疏水的殘基和P4中脂族殘基的至少一個(gè)⑶Id基序的存在，評(píng)價(jià)肽或多肽氨基酸序列。一般序列如[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]可以用于使用本領(lǐng)域熟知的算法，例如
[0067]http://expasy.0rg/tools/scanprosite/
[0068]該一般序列應(yīng)該視為協(xié)助鑒別所述肽或多肽中哪個(gè)序列含有可允許所述肽或多肽激活NKT細(xì)胞的基序的工具。
[0069](2)使用表達(dá)⑶Id分子的細(xì)胞系，體外測(cè)試肽或多肽結(jié)合至⑶Id和激活NKT細(xì)胞的能力。這種細(xì)胞系的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的(例如JAWS2細(xì)胞)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該細(xì)胞系不呈現(xiàn)MHC II類分子，并且用含有CDld的DNA序列的病毒載體或本領(lǐng)域已知的在細(xì)胞中引入基因的任何其它方法將其轉(zhuǎn)導(dǎo)用于CDld的超表達(dá)。用于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法是本領(lǐng)域已知的。將該細(xì)胞系加載于具有肽或多肽、或具有包含對(duì)應(yīng)序列的合成肽的培養(yǎng)物中。這種合成肽容易通過合成(例如用本領(lǐng)域熟知的fmoc固相合成法)來產(chǎn)生。隨后通過測(cè)量NKT細(xì)胞的激活，評(píng)價(jià)CDld分子對(duì)肽、多肽或?qū)?yīng)合成肽的有效呈現(xiàn)?？梢詮闹車褐?通過例如磁力分選)獲得這種細(xì)胞并且在細(xì)胞因子例如IL-2、IL-15或IL-7存在下維持于具有刺激劑如a-gal-神經(jīng)酰胺的培養(yǎng)物中。這些方法本領(lǐng)域中已有描述(參見例如Godfrey 等人,Nature Reviews.1mmunology2010,11:197-206)。使用諸如細(xì)胞因子產(chǎn)生的評(píng)價(jià)之類方法，評(píng)估NKT細(xì)胞的激活。[0070]或者，由⑶Id分子中APC實(shí)際呈現(xiàn)的肽可以通過各種色譜法洗提并分離。這種方法的完整描述將見于Scott等人，Immunity，12 =711-720,2000中。隨后對(duì)所述肽測(cè)序以鑒別哪個(gè)氨基酸殘基位于Pl和P7。
[0071]或者，可將所述合成肽加載于⑶Id分子的四聚物上以檢測(cè)對(duì)這種肽特異性的NKT細(xì)胞。一種可能性是使用熒光標(biāo)記的四聚物并且用熒光激活的細(xì)胞分選系統(tǒng)(facs)檢測(cè)。[0072](3)鑒別為能夠激活NKT細(xì)胞并且任選地通過算法鑒別的氨基酸序列隨后通過取代或刪除被修飾。在優(yōu)選實(shí)施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一個(gè)氨基酸替換。天然氨基酸可以通過轉(zhuǎn)錄后修飾來修飾或用諸如甲基的化學(xué)基團(tuán)取代。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由任何適當(dāng)?shù)奶娲苑翘烊话被崽鎿Q。非天然氨基酸殘基的實(shí)例是D-氨基酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一個(gè)氨基酸替換。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，Pl中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一個(gè)氨基酸，由任何適當(dāng)?shù)奶娲苑翘烊话被峄蛴煞欠甲逵袡C(jī)化合物替換。這種氨基酸取代是用本領(lǐng)域熟知的方法獲得。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，Pl位中的F、W、T、H或Y被刪除。在又一個(gè)實(shí)施方案中，Pl位和P7位中的F、W、T、H或Y被刪除。進(jìn)行所述刪除的方法是本領(lǐng)域熟知的。在另一具體實(shí)施方案中，將至少一個(gè)氨基酸加入⑶Id結(jié)合基序中Pl至P7序列內(nèi)任何位置。
[0073]根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想出用于治療其中需要外源因子的施用的疾病的藥物，所述疾病例如
[0074](I)與凝血(例如VIII因子、IX因子或X因子)或纖維蛋白溶解相關(guān)的因子的天生或后天缺陷，伴隨與多糖或糖原的代謝相關(guān)的酶類缺陷(例如龐培氏(Pompe)病)，或伴隨激素(例如糖尿病中的胰島素或侏儒癥中的生長(zhǎng)激素)產(chǎn)生的缺陷
[0075](2)急性或慢性情況，其中有利的是施用治療劑，例如包括葡萄球菌激酶和微纖溶酶的血栓溶解劑，
[0076](3)免疫系統(tǒng)的紊亂，其中需要施用細(xì)胞因子(或其受體)或增長(zhǎng)因子(例如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y、G-CSF> GM-GSF> KGF或促紅細(xì)胞生成素)
[0077](4)特征為慢性炎癥或不適當(dāng)免疫應(yīng)答的疾病，其中應(yīng)該施用治療性抗體包括抗腫瘤壞死因子，自身免疫疾病和移植物排斥中的抗CD3或抗CD4抗體，對(duì)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體(例如非霍奇金氏淋巴瘤中的抗CD20抗體)，或預(yù)防血栓癥的對(duì)VIII因子的抗體。治療性抗體的名單增長(zhǎng)很快，并且本發(fā)明旨在涵蓋用于通常治療性目的的任何抗體的用途。
[0078]根據(jù)本發(fā)明，還設(shè)想出供基因療法和基因接種使用的藥物，其中使用病毒載體并且其中針對(duì)所述載體的免疫應(yīng)答妨礙轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
[0079]根據(jù)本發(fā)明，還設(shè)想出用于通過暴露于環(huán)境蛋白而誘出的疾病的藥物，所述蛋白例如:
[0080](I)所述受治療者通過食物或飼料暴露的蛋白。這些的實(shí)例是谷物如小麥、玉米、大米、大豆和菜籽，蔬菜如馬鈴薯和甜菜根，水果如酒糟(rosacea)、堅(jiān)果和鱷梨，酶類，抗病毒或抗細(xì)菌藥物。
[0081](2)受治療者通過吸入、全身路徑或螫傷暴露的蛋白。這些的實(shí)例是對(duì)花粉的變應(yīng)性反應(yīng)，對(duì)膠乳或膜翅目螫刺的接觸性反應(yīng)。[0082]根據(jù)本發(fā)明，還設(shè)想出用于免疫(接種)的藥物，所述接種例如:
[0083](I)針對(duì)變應(yīng)原的接種
[0084](2)針對(duì)傳染劑的接種，所述傳染劑包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲
[0085]在這兩個(gè)情況下，可能有利的是阻止先天性免疫系統(tǒng)的激活，以便阻止炎癥的過量和其對(duì)所述接種的結(jié)果的有害后果。對(duì)變應(yīng)原或傳染劑的接種的設(shè)定中的另一優(yōu)點(diǎn)在于，NKT細(xì)胞激活的消除阻止激活的NKT細(xì)胞對(duì)針對(duì)所述變應(yīng)原或所述傳染劑的適應(yīng)性應(yīng)答的發(fā)展的抑制作用。
[0086]應(yīng)該承認(rèn)的是，上述名單并非詳盡無遺并且本發(fā)明旨在涵蓋新推出的產(chǎn)品，例如抗體，細(xì)胞因子，在天生或后天缺陷中用于替換的增長(zhǎng)因子或肽和多肽，和基因修飾的蛋白。
[0087]應(yīng)當(dāng)理解的是，上文所列任何肽或多肽可以用于轉(zhuǎn)基因的基因形式施用，所述施用通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的病毒載體或其它方法進(jìn)行。在這種情況下，可以根據(jù)本發(fā)明通過消除CDld結(jié)合基序來修飾病毒載體本身。
[0088]盡管不是必需，本發(fā)明的藥物通常是(藥物)制劑，其包含作為活性成分的至少一種本發(fā)明的肽或多肽或能夠表達(dá)所述肽或多肽的基因治療性載體。除所述活性成分以外，這種制劑將包含至少一種(藥學(xué)上可接受的)稀釋劑。
[0089]該規(guī)則值得注意的例外是使用通過吸入或通過全身路徑暴露的來自用于食物或飼料的基因修飾的有機(jī)體的蛋白。
[0090]一般說來，本發(fā)明的肽或多肽的施用阻止先天性免疫系統(tǒng)的激活，更特別是NKT細(xì)胞的激活，更特別地是與NKT細(xì)胞激活相關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
[0091]用于本發(fā)明的肽 或多肽的施用途徑可以根據(jù)指示和/或肽或多肽的性質(zhì)變化。實(shí)例是凝血因子的靜脈內(nèi)注射，胰島素的皮下注射和基因修飾的蛋白的口服施用。本發(fā)明旨在涵蓋所有其它可能的施用途徑，例如鼻內(nèi)、舌下、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、直腸內(nèi)或陰道內(nèi)。
[0092]如進(jìn)一步詳細(xì)解釋的，本發(fā)明的肽或多肽可以通過化學(xué)合成制備，所述制備還允許非天然氨基酸的摻入。本發(fā)明的肽或多肽也可用本領(lǐng)域已知用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，使用表達(dá)系統(tǒng)如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞來產(chǎn)生。
[0093]本發(fā)明的另一方面涉及用于產(chǎn)生本文所述的本發(fā)明的肽和多肽的方法。這種方法包括對(duì)NKT細(xì)胞表位的鑒別，所述NKT細(xì)胞表位來自外源因子，病毒載體，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白，變應(yīng)原或特異性傳染劑。用于體外的和計(jì)算機(jī)模擬的NKT細(xì)胞表位鑒別的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且某些方面在后文詳細(xì)說明。
[0094]在本發(fā)明的背景下，NKT細(xì)胞表位的鑒別對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。舉例而言，通過(例如)NKT細(xì)胞生物技術(shù)，測(cè)試與外源因子，病毒載體，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白，基因修飾的蛋白，變應(yīng)原或特異性傳染劑分離的肽序列，以確定肽序列是否誘出NKT細(xì)胞應(yīng)答。被發(fā)現(xiàn)誘出NKT細(xì)胞應(yīng)答的那些肽序列定義為具有NKT細(xì)胞刺激活性。還可以通過培養(yǎng)從對(duì)外源因子，病毒載體，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白，基因修飾的蛋白，變應(yīng)原或特異性傳染劑敏化的個(gè)體獲得的NKT細(xì)胞，并且例如根據(jù)通過氚化胸苷的細(xì)胞攝取測(cè)量來確定NKT細(xì)胞的增殖是否響應(yīng)于肽/表位而發(fā)生，測(cè)試哺乳動(dòng)物NKT細(xì)胞刺激活性。NKT細(xì)胞對(duì)肽/表位響應(yīng)的刺激指數(shù)可以按響應(yīng)于肽/表位的最大CPM除以對(duì)照CPM來計(jì)算。將等于或大于背景水平兩倍的NKT細(xì)胞刺激指數(shù)(S.1.)視為"陽性"。陽性結(jié)果用于計(jì)算所測(cè)試肽/表位群組的每個(gè)肽/表位的平均刺激指數(shù)。還可以任選地測(cè)試非天然NKT細(xì)胞表位對(duì)CDld分子的結(jié)合親和力。非天然NKT細(xì)胞表位對(duì)CDld分子的結(jié)合可以不同方法進(jìn)行。舉例而言，獲得可溶⑶Id分子，并且通過合成和/或化學(xué)偶合制備四聚物。通過親合色譜法純化該⑶Id分子。用根據(jù)對(duì)所述CDld分子的強(qiáng)烈結(jié)合親和力產(chǎn)生的生物素標(biāo)記的參考肽，培育可溶CDld分子。隨后在不同濃度下培育待評(píng)估CDld結(jié)合的肽，并且其替代其CDld結(jié)合位點(diǎn)的參考肽的能力通過添加親和素來計(jì)算。在例如Texier等人(2000) J.1mmunologyl64, 3177-3184中可見用于通過MHCII類決定簇呈現(xiàn)肽的方法，但該方法可以容易地應(yīng)用于⑶Id限制性NKT細(xì)胞表位。本發(fā)明的免疫原性肽或多肽具有大于或等于2的平均NKT細(xì)胞刺激指數(shù)。認(rèn)為NKT細(xì)胞刺激指數(shù)大于或等于2的免疫原性肽可用作候選者來進(jìn)行CDld結(jié)合基序的序列中疏水的氨基酸殘基的取代或刪除，或氨基酸的添加，如在本發(fā)明中所述。
[0095]如果通過T細(xì)胞生物技術(shù)測(cè)定，共享天然肽或多肽序列中重疊區(qū)域的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列被發(fā)現(xiàn)具有人NKT細(xì)胞刺激活性，則針對(duì)屬于所述序列中的一個(gè)或兩個(gè)的殘基進(jìn)行疏水的氨基酸殘基的突變或刪除。
[0096]可以通過在例如細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)，酵母細(xì)胞(例如畢赤酵母(Pichia)物種，漢遜酵母(Hansenula)物種，釀酒酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬物種)，昆蟲細(xì)胞(例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni))，植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO、COS細(xì)胞)中重組表達(dá)產(chǎn)生本發(fā)明的肽或多肽。同時(shí)，因此所需的合適表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)(包括進(jìn)一步信息，例如啟動(dòng)子和終止序列)涉及標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)。例如，經(jīng)由接近肽或多肽的N-和/或C-末端插入的酶切位點(diǎn)的酶切，隨后適當(dāng)純化，本發(fā)明的重組產(chǎn)生的肽或多肽可以來源于較大前體蛋白。
[0097]考慮到本發(fā)明 某些肽的有限長(zhǎng)度，它們可以通過化學(xué)肽合成法制備，其中肽是通過不同氨基酸彼此偶合來制備?；瘜W(xué)合成特別適于對(duì)例如D-氨基酸、具有非天然側(cè)鏈的氨基酸或具有修飾側(cè)鏈的天然氨基酸例如甲基化半胱氨酸的夾雜?；瘜W(xué)肽合成法已被充分描述，并且肽可以訂購(gòu)自諸如Applied Biosystems公司和其它公司。可以按固相肽合成法(SPPS)或者與液相肽合成法相反，進(jìn)行肽合成。熟知的SPPS方法是技術(shù)人員熟知的t-Boc和 Fmoc 固相化學(xué)法。另外，按 Kent 最初描述(Schnolzer & Kent (1992) Int.J.Pept.Protein Res.40，180-193)和例如在Tam等人(2001)Biopolymers60，194-205 中總結(jié)，可以使用連接策略(兩個(gè)未保護(hù)肽片段的化學(xué)選擇偶合)將肽彼此連接以形成較長(zhǎng)肽。這提供實(shí)現(xiàn)超過SPPS范圍的蛋白合成的可能性。尺寸為100至300個(gè)殘基的許多蛋白已經(jīng)成功通過該方法合成。
[0098]測(cè)驗(yàn)本發(fā)明的肽或多肽的物理和化學(xué)性質(zhì)(例如可溶性、穩(wěn)定性)以確定該肽是否適用于/是否將適用于治療性組合物。一般地，所述性質(zhì)通過調(diào)整肽的序列來優(yōu)化。任選地，該肽可以在合成之后使用本領(lǐng)域已知技術(shù)修飾(化學(xué)修飾，例如添加/刪除官能團(tuán))。
[0099]基因修飾的有機(jī)體的產(chǎn)生依賴于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，包括克隆、定點(diǎn)誘變和生長(zhǎng)。
[0100]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的肽或多肽的核苷酸序列，和它們用于重組表達(dá)或基因療法的方法。特別地，所述核苷酸序列能夠表達(dá)本發(fā)明的肽。[0101]在基因療法中，編碼本發(fā)明的肽或多肽的重組核苷酸分子可以用作裸露DNA，或用于遞送至靶標(biāo)細(xì)胞的脂質(zhì)體或其它脂質(zhì)系統(tǒng)中。用于將質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于人基因療法中的，并且涉及通過將該質(zhì)粒DNA復(fù)合至蛋白而使DNA靶向細(xì)胞上的受體。在其最簡(jiǎn)單的形式中，可以通過顯微注射的方法，簡(jiǎn)單地將微量DNA注射到細(xì)胞的核中，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。一旦重組基因被引入細(xì)胞中，則可以通過轉(zhuǎn)錄和翻譯的細(xì)胞正常機(jī)制將其識(shí)別，并且基因產(chǎn)物將被表達(dá)。也已經(jīng)嘗試了將DNA引入大量細(xì)胞中的其它方法。這些方法包括:轉(zhuǎn)染，其中由磷酸鈣沉淀DNA并且通過胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞；電穿孔，其中細(xì)胞暴露于大電壓脈沖以在膜中開孔；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染/脂質(zhì)體融合，其中DNA被包裝到與靶標(biāo)細(xì)胞融合的親脂性囊泡中；和粒子轟擊，其使用結(jié)合至小轟擊粒子的DNA。將DNA弓丨入細(xì)胞中的另一方法是將DNA偶合至化學(xué)修飾的蛋白。腺病毒蛋白能夠使核內(nèi)體不穩(wěn)定并且增強(qiáng)細(xì)胞中DNA的攝取。將腺病毒混合至含有DNA復(fù)合物的溶液，或使用蛋白交聯(lián)劑將DNA結(jié)合至與腺病毒共價(jià)連接的聚賴氨酸，顯著提高重組基因的攝取和表達(dá)。腺相關(guān)病毒載體也可用于對(duì)血管細(xì)胞的基因遞送。如本文中所用，"基因轉(zhuǎn)移"意思是將外來核苷酸分子引入細(xì)胞中的方法，通常進(jìn)行該方法以允許由該基因編碼的特定產(chǎn)物表達(dá)。所述產(chǎn)物可以包括蛋白、多肽、反義DNA或RNA、或酶活性的RNA?？梢栽谂囵B(yǎng)細(xì)胞中或由直接施用到哺乳動(dòng)物中，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。在另一實(shí)施方案中，提供包含編碼本發(fā)明的肽的核苷酸分子序列的載體。在具體實(shí)施方案中，產(chǎn)生該載體以使得核苷酸分子序列僅在特定組織中表達(dá)。實(shí)現(xiàn)組織特異性基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如，將編碼本發(fā)明的免疫原性肽的序列置于啟動(dòng)子的控制下，所述啟動(dòng)子指導(dǎo)肽在一種或多種組織或器官中的特異性表達(dá)。來源于病毒諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、RNA病毒或牛乳頭瘤病毒的表達(dá)載體可以用于將編碼本發(fā)明的肽、其同系物或衍生物的核苷酸序列(例如cDNA)遞送到靶向組織或細(xì)胞群中。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)造含有這種編碼序列的重組病毒載體?；蛘撸斜景l(fā)明的肽或多肽的核苷酸分子代碼的工程細(xì)胞可以用于基因療法中。
[0102]本發(fā)明的藥物通常是，然而并非必然(例如，由基因修飾的有機(jī)體產(chǎn)生的蛋白，其用于食物、飼料、或所述受治療者經(jīng)全身或吸入路徑暴露的)，(藥物)制劑，其包含作為活性成分的至少一種本發(fā)明的肽或多肽，能夠表達(dá)所述肽或多肽的基因治療性載體。除所述活性成分以外，這種制劑將包含至少一種(藥學(xué)上可接受的)稀釋劑。一般地，藥學(xué)上可接受的化合物可以見于例如藥典手冊(cè)(例如美國(guó)、歐洲或國(guó)際藥典)。本發(fā)明的藥物或藥物組合物通常包含(預(yù)防或治療)有效量的活性成分，其中有效是相對(duì)于待預(yù)防或治療的病況或病癥。
[0103]作為包含多次施用所述藥物或組合物的預(yù)防性或治療性方案的一部分，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可能需要施用至有需要的受治療者。所述多次施用通常順序地發(fā)生，并且兩次施用之間的時(shí)間間隔可以變化并將針對(duì)活性成分的性質(zhì)和待預(yù)防或治療的病況的性質(zhì)進(jìn)行調(diào)整。給予需要單獨(dú)施用的受治療者的活性成分的量也可變化，并且將取決于諸如受治療者的物理狀態(tài)(例如重量和年齡)，待預(yù)防或治療的病況的狀態(tài)，和主治醫(yī)生、醫(yī)師或護(hù)士的經(jīng)驗(yàn)之類因素。[0104]術(shù)語“稀釋劑”是指例如生理鹽水溶液。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"意思是用于配制活性成分以便例如通過溶解、分散或擴(kuò)散所述組合物來促進(jìn)其對(duì)待治療部位的應(yīng)用或傳播，和/或促進(jìn)其存貯、運(yùn)輸或處理而不削弱其有效性的任何材料或物質(zhì)。它們包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等滲劑(例如糖類或氯化鈉)等等?？梢园ㄆ渌煞?，以便控制組合物中活性成分的作用持續(xù)時(shí)間。藥學(xué)上可接受的載體可以是固體或液體或經(jīng)壓縮形成液體的氣體，即，本發(fā)明的組合物可以適當(dāng)?shù)赜米鳚饪s物，乳液，溶液，顆粒，粉劑，噴霧劑，氣溶膠，懸浮體，軟膏，霜?jiǎng)瑒?，小球或粉末。供所述藥物組合物和其制劑使用的合適藥用載劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且在本發(fā)明內(nèi)對(duì)其選擇不存在特別限制。它們也可包括添加劑，例如潤(rùn)濕劑、分散劑、粘著劑、粘合劑、乳化劑、溶劑、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等滲劑(例如糖類或氯化鈉)等等，前提是它們符合藥用實(shí)踐，即，不對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生永久傷害的載體和添加劑。本發(fā)明藥物組合物可以任何已知方式制備，例如將所述活性成分與所選載體材料和在適當(dāng)情況下的其它添加劑如表面活性劑一起單步或多步地均勻混合、涂布和/或研磨。它們也可微分化制備，例如以便獲得通常直徑為約I至10 μ m的微球體形式，即制造用于受控或持續(xù)釋放所述活性成分的微膠囊。
[0105]本發(fā)明的肽或多肽、其同系物或衍生物(和其生理上可接受的鹽或藥物組合物，均包括在術(shù)語"活性成分"中)可以通過適合待預(yù)防或治療的病況并適合所述化合物(此處待施用的肽或多肽)的任何路徑來施用。可能的路徑包括區(qū)域，全身，口服(固態(tài)或吸入)，直腸，鼻內(nèi)，局部(包括眼，頰和舌下)，陰道和腸道外(包括皮下，肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)的，真皮內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，鞘內(nèi)和硬膜外)。優(yōu)選的施用途徑可以隨例如接受者的狀況或待預(yù)防或治療的病況而變化。
[0106]該制劑可以方便地以單位劑型呈現(xiàn)，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備。適于口服施用的本發(fā)明制劑可以作為離散單元呈現(xiàn)，例如均含有預(yù)定量的活性成分的膠囊、扁膠囊或片劑；作為粉末或顆粒呈現(xiàn)；作為水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮體呈現(xiàn)；或作為水包油液體乳液或油包水液體乳液呈現(xiàn)。活性成分也可作為大丸劑、藥糖劑或糊劑呈現(xiàn)。片劑可以通過壓縮或模制來制備，并且任選地具有一個(gè)或多個(gè)輔助成分。通過在合適機(jī)器中將活性成分壓縮成自由流動(dòng)形式如粉末或顆粒，并任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性或或分散劑混合，可以制備壓縮片劑。通過在合適機(jī)器中，模塑由惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉狀化合物的混合物，可以制作模制片劑。片劑可以任選地被涂布或刻痕，并且可以經(jīng)配制而提供其中活性`成分的緩釋或受控釋放。
[0107]對(duì)基因療法或基因接種來說，病毒載體非常適合藉由重組核苷酸技術(shù)來修飾。鑒于以上所述，技術(shù)人員將進(jìn)一步容易地設(shè)想出，本發(fā)明的肽或多肽及其用途中應(yīng)用的病毒載體NKT細(xì)胞表位的消除可以立即適用于病毒載體本身。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋修飾的病毒載體，其定義為分離的病毒載體，其特征在于CDld結(jié)合基序已經(jīng)通過氨基酸取代或刪除消除。
[0108]現(xiàn)在將通過以下實(shí)施例說明本發(fā)明，無任何限制意圖地提供所述實(shí)施例。此外，本文所述的所有參考資料明確地以引用方式包括在本文中。
實(shí)施例
[0109]實(shí)施例1:凝血閔子VIII
[0110]罹患血友病A的患者缺乏足夠量的VIII因子(FVIII)，這是出血傾向不受控制的原因。這種患者通過輸注FVIII來治療，所述FVIII純化自血漿來源或通過重組技術(shù)產(chǎn)生。FVIII的施用導(dǎo)致特定抗體的形成，其在幾乎30%的病例中抑制FVIII作為凝血輔因子的功能。
[0111]使用算法，我們?cè)贔VIII分子的序列內(nèi)鑒別出攜帶CDld結(jié)合序列的3個(gè)序列，其與[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]序列基序匹配。這些基序分別位于Al域和A3域中:
[0112]Al 域中的 ECHISSH(氨基酸 309-315，SEQ ID I)
[0113]A3 域中的 EWKYQHH(氨基酸 1816-1822，SEQ ID 2)
[0114]A3 域中的 EHAINGK 氨基酸 1918-1924，SEQ ID 3)
[0115]這些序列共同地具有(下劃線)位置I中的芳族殘基(苯丙氨酸，F(xiàn))，位置4中的脂族殘基(異亮氨酸，I，或纈氨酸，V)，和位置7中的芳族殘基(組胺酸，H，或酪氨酸，Y)。
[0116]為確定這些序列是否可以在體內(nèi)激活NKT細(xì)胞，間隔I周地4次將FVIII (2IU)靜脈內(nèi)地注射至血友病A小鼠。由于引入外顯子16中FVIII基因內(nèi)的終止密碼子，血友病A小鼠不產(chǎn)生FVIII。
[0117]最后注射10天之后，處死小鼠，去除脾臟并且通過磁珠分選制備⑶4+T細(xì)胞。NKT細(xì)胞特征為CD4的表達(dá)和CDld分子呈現(xiàn)的抗原的識(shí)別。CDld的四聚物得自供應(yīng)商，并且加載有15個(gè)氨基酸長(zhǎng)的FVIII肽，其包括含有SEQ ID K SEQ ID 2和SEQ ID 3的肽。觀察到加載有這些肽的⑶Id四聚物的顯著結(jié)合，表明這3種肽能夠結(jié)合至⑶Id并且FVIII的注射誘出NKT細(xì)胞的激活。代表性結(jié)果示于凰！中。
[0118]此外，采用含有CDld基序的肽(SEQ ID USEQ ID 2或SEQ ID 3的肽)的直接免疫足以誘出NKT細(xì)胞的激活并且產(chǎn)生對(duì)FVIII的抗體。用SEQ ID I的肽，觀察到突出的激活。代表性結(jié)果示于里！中。
[0119]構(gòu)造骨髓嵌合體，其中血友病A小鼠首先被輻射，并且與缺乏NKT細(xì)胞的小鼠(即敲除⑶Id的小鼠)的骨髓重構(gòu)。在缺乏NKT細(xì)胞的情況下，小鼠不能產(chǎn)生顯著量的對(duì)FVIII的抗體，并且實(shí)際上沒有抑制FVIII的功能的抗體(圖3)。
[0120]FVIII的Al域通過重組技術(shù)在其天然序列中產(chǎn)生，或用絲氨酸取代F309和H315(SEQ ID 4的多肽)來產(chǎn)生。將天然序列中的FVIII Al域或SEQ ID 4用于使小鼠的單獨(dú)組免疫。該結(jié)果表明，根據(jù)如上所述的脾臟⑶4+T細(xì)胞評(píng)估，通過S取代F309和H315 (SEQID 4)足以阻止NKT細(xì)胞的激活。
[0121]FVIII的A3域通過重組技術(shù)在其天然序列中產(chǎn)生，或用絲氨酸取代F1816和H1822(SEQ ID 5的多肽)來產(chǎn)生。將天然序列中的FVIII A3域或SEQ ID 5用于使小鼠的單獨(dú)組免疫。該結(jié)果表明，根據(jù)如上所述的脾臟⑶4+T細(xì)胞評(píng)估，通過S取代F1816和H1822(SEQ ID 5)足以阻止NKT細(xì)胞的激活。
[0122]在其天然序列中刪除B域的FVIII分子誘出NKT細(xì)胞的激活(參見上文)。制備具有4個(gè)氨基酸取代的FVIII分子，其含有F309S、H315S、F1816S和F1918S(SEQ ID 6)。在血友病A小鼠中靜脈內(nèi)注射這種突變FVIII未導(dǎo)致對(duì)FVIII的抗體的形成，因而，無抑制FVIII功能的抗體形成。
[0123]因此推斷出:
[0124](I)FVIII天然地含有若干⑶Id結(jié)合基序；
[0125](2)這些⑶Id基序是功能性的并且誘出NKT細(xì)胞的激活；[0126](3)NKT細(xì)胞的激活對(duì)產(chǎn)生對(duì)FVIII的抗體是必不可少的；
[0127](4)通過氨基酸取代消除⑶Id基序足以消除抗FVIII抗體的產(chǎn)生。
[0128]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚的是，本發(fā)明也適用于用于產(chǎn)生凝血因子如IX因子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
[0129]附圖詳沭
[0130]圖1
[0131]NKT細(xì)胞識(shí)別由CDld呈現(xiàn)的VIII因子表位
[0132]隔一周地4次用2IUVIII因子使血友病A小鼠免疫。隨后移除脾臟并且通過磁珠分選制備CD4+T細(xì)胞。CDld的熒色物標(biāo)記的四聚物得自供應(yīng)商，并且加載有15個(gè)氨基酸長(zhǎng)的FVIII肽，其包括含有SEQ IDUSEQ ID2和SEQ ID3的肽。在室溫下黑暗中過夜進(jìn)行加載。隨后，在4°C下用⑶4+T細(xì)胞群培育四聚物30分鐘，并且通過Facs分析細(xì)胞懸液。
[0133]該圖顯示加載有SEQ IDl的肽(圖中44p印t)的⑶Id四聚物被NKT細(xì)胞識(shí)別。CDld ctl (-)示出識(shí)別未加載的四聚物的NKT細(xì)胞百分比。CDld ctl (+)示出識(shí)別加載有a -gal神經(jīng)酰胺的四聚物的NKT細(xì)胞的百分比，所述a -gal神經(jīng)酰胺補(bǔ)充所有NKT細(xì)胞。至多45%的NKT細(xì)胞識(shí)別44pept，這與⑶Id水平下多態(tài)性的的缺乏和NKT T細(xì)胞受體水平下十分有限的多態(tài)性不矛盾。
[0134]圖2
[0135]用⑶Id限制性肽使血友病A小鼠免疫誘出抗VIII因子抗體
[0136]用吸附在氫氧化鋁上的SEQ ID I (44pept)的肽和SEQ ID 2 (256pept)的肽的等摩爾混合物50 μ g，皮下3次，使血友病A小鼠免疫。對(duì)照組接受生理血清，而非肽。在最后免疫10天之后提取血漿，并且使用直接結(jié)合檢定，評(píng)估抗VIII因子抗體的存在。簡(jiǎn)單來說，VIII因子(10IU/ml)在聚苯乙烯板上不溶解，將其洗滌并且用1/10稀釋的血漿培育。在進(jìn)一步洗滌之后，添加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗血清，隨后添加酶底物。將彩色顯影讀數(shù)為0D。
[0137]該圖顯示用SEQ ID I和SEQ ID 2的肽免疫的血友病A小鼠發(fā)展出對(duì)VIII因子的抗體。
[0138]圖3
[0139]用來自⑶Id KO小鼠的骨髓重構(gòu)的血友病A小鼠不產(chǎn)生對(duì)VIII因子的抗體
[0140]血友病A小鼠經(jīng)受致命輻射并且用⑶Id KO小鼠(5xl06/小鼠)(其缺乏NKT細(xì)胞)的骨髓重構(gòu)。骨髓重構(gòu)六周之后，小鼠接受相隔一周的4次2IU/mlIV注射。最后免疫10天之后，使小鼠放血，并且使用直接結(jié)合檢定，對(duì)血漿檢定抗VIII因子抗體的存在，如圖2的圖例中所述。用正常骨髓重構(gòu)輻射血友病A小鼠的對(duì)照組。
[0141]該圖表明，雖然對(duì)照小鼠在第四次VIII因子注射之后產(chǎn)生高濃度的抗FVIII抗體(左圖)，但用貧NKT細(xì)胞的小鼠的骨髓重構(gòu)的小鼠未產(chǎn)生高濃度抗FVIII抗體(右圖)。
[0142]實(shí)施例2:腺病毒5病毒載體
[0143]病毒載體通常用于基因療法和基因接種。這些病毒載體中最常見的一種來源于腺病毒，血清型5。腺病毒(Ad)是擁有約35kb的直鏈、雙鏈DNA基因組的非包膜病毒。人Ad5具有由3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白組成的衣殼:六鄰體、五鄰體和纖維。針對(duì)六鄰體蛋白的中和抗體升高。由于病毒傳染，這種抗體是人類中十分常見的。這種抗體的存在阻斷病毒載體的進(jìn)入，并因而阻止該載體攜帶的轉(zhuǎn)基因蛋白的表達(dá)?？笰d5抗體在適應(yīng)性應(yīng)答的過程中產(chǎn)生，其取決于對(duì)在MHC II類分子的背景下呈現(xiàn)的表位具有特異性的CD4+T細(xì)胞的激活。
[0144]已知Ad5激活先天性免疫系統(tǒng)，但其發(fā)生的精確機(jī)制和其進(jìn)行的位置尚不清楚。然而，先天性免疫系統(tǒng)的激活可能是需要用于中和待形成抗體的步驟。
[0145]使用算法，我們?cè)诹忬w6中鑒別了與⑶Id結(jié)合序列(SEQ ID7，具有下劃線基序)的一般基序[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]匹配的7個(gè)氨基酸序列。
[0146]間隔10天3次地用IO9PFU Ad5載體靜脈內(nèi)注射小鼠。隨后通過磁珠分選由脾臟制備CD4+T細(xì)胞。用CDld四聚物培育CD4+T細(xì)胞，所述CDld四聚物加載有對(duì)應(yīng)于各個(gè)被鑒別的7個(gè)序列的肽。其顯示，顯著比例(±10%)的⑶4+NKT細(xì)胞被四聚物標(biāo)記，表明Ad5載體注射激活了對(duì)SEQ ID 7的肽具有特異性的NKT細(xì)胞。另外，這種小鼠產(chǎn)生IgG2a同種型的特異性抗體，特征為小鼠中的中和抗體。
[0147]針對(duì)各個(gè)鑒別的7個(gè)氨基酸序列，制備含有[FW]被絲氨酸S取代的病毒載體。該突變病毒載體(SEQ ID 8，具有下劃線基序)用于根據(jù)如上針對(duì)天然序列所述的相同方案使動(dòng)物免疫。根據(jù)使用加載有天然序列(SEQ ID 7)的肽的四聚物評(píng)估，NKT細(xì)胞的比例< I %，并且Ad5病毒特異性抗體的濃度顯著降低(多達(dá)10倍)。
[0148]因此推斷出，⑶Id結(jié)合基序的各Pl位中F至S的取代足以降低NKT細(xì)胞激活并且因此降低抗Ad5抗體的產(chǎn)生。
[0149]實(shí)施例3:基因修飾的蛋白
[0150]受治療者通過吸入或攝取暴露的蛋白在易感染受治療者中頻繁誘出不希望的反應(yīng)。變應(yīng)性哮喘影響全世界幾百萬人。另一方面，食物過敏在一般群體中具有±2.5%的總患病率?？諝鈧鞑サ摹z取的或刺入皮膚的變應(yīng)原可能共享其激活NKT細(xì)胞的性質(zhì)。
[0151]最常見的食物變應(yīng)原之一是蘋`果(Malus domesticus),并且變應(yīng)原性幾乎僅僅由Mal d I蛋白攜帶,所述Mal d I蛋白是一種159個(gè)氨基酸長(zhǎng)的蛋白，其保護(hù)植物抵抗傳染劑。序列基序用電腦算法鑒別，其對(duì)應(yīng)于CDld結(jié)合序列的一般基序[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]。
[0152]對(duì)應(yīng)于Mal dl 的氨基酸 144-150 的 ￡KLIESI(SEQ ID 9)
[0153]通過基因工程產(chǎn)生Mal d I的重組形式，其中F144和Y150在S中突變。Mal d I的重組形式因此包含以下序列的肽:
[0154]SKLIESS (SEQ ID 10)
[0155]產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于SEQ ID 9和SEQ ID 10的合成肽。它們激活NKT細(xì)胞的能力是使用來源于對(duì)Mal d I敏化的個(gè)體的周圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞的人樹狀細(xì)胞來體內(nèi)測(cè)定。加載有所述兩個(gè)肽中每一個(gè)的樹狀細(xì)胞在NKT細(xì)胞存在下培育，所述NKT細(xì)胞通過使用諸如CD4和NKG2D之類特定標(biāo)記分選周圍淋巴細(xì)胞而從相同個(gè)體獲得。觀察到用SEQ ID9的肽培育的NKT細(xì)胞激活顯著比例的NKT細(xì)胞，而SEQ ID 10的突變肽則沒有如此。另外，加載有SEQID 9的肽的人⑶Id四聚物被顯著比例的NKT細(xì)胞識(shí)別，但加載有SEQ ID 10的突變肽的四聚物被小于I %的NKT細(xì)胞識(shí)別。
[0156]F144S和Y150S兩個(gè)突變通過定點(diǎn)誘變直接引入克隆細(xì)胞。隨后通過常規(guī)生長(zhǎng)策略，產(chǎn)生完整有機(jī)體。由該GMO產(chǎn)生的蘋果不誘出變應(yīng)性反應(yīng)。
[0157]本發(fā)明的肽或多肽的一種具體應(yīng)用是乳糜瀉(谷蛋白不耐受)。該疾病是人類最常見的疾病，并且涉及對(duì)在MHC II類決定簇的背景下呈現(xiàn)的麥醇溶蛋白表位的T細(xì)胞激活。遺傳易感性已經(jīng)被描述，其中攜帶HLA-DQ2或DQ8 II類決定簇的人類易患疾病。這些II類決定簇呈現(xiàn)已經(jīng)通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶經(jīng)受脫酰胺作用的肽。然而，這些事件是腸內(nèi)炎性反應(yīng)的結(jié)果，可能與先天性免疫系統(tǒng)有關(guān)。
[0158] 麥醇溶蛋白是250至300個(gè)氨基酸殘基的單體。使用電腦算法搜索CDld結(jié)合序列的一般基序[FW]-XX-[ILM]-XX-[FWTHY]鑒別α麥醇溶蛋白中的這種序列(SEQ ID 11，參見序列表)。隨后產(chǎn)生α麥醇溶蛋白的突變形式，其中基序的F殘基被S殘基取代(SEQID 12，參見附錄)。
[0159]至于Mal d I的相同程序接著顯示，雖然在由呈現(xiàn)抗原的樹狀細(xì)胞呈現(xiàn)時(shí)SEQ ID11的多肽激活顯著比例的NKT細(xì)胞，但多肽(SEQ ID 12)的突變形式?jīng)]能如此。至于Mald 1，加載有表現(xiàn)SEQ ID 11的多肽中識(shí)別的基序的合成肽的人⑶Id四聚物被NKT細(xì)胞識(shí)另O，而加載有如SEQ ID 12中所示基序的突變形式的四聚物則未被識(shí)別。
[0160]所述突變通過定點(diǎn)誘變直接引入克隆細(xì)胞。隨后通過常規(guī)生長(zhǎng)策略，產(chǎn)生完整有機(jī)體。含有麥醇溶蛋白的突變形式的谷物不誘出不耐受的反應(yīng)。
[0161]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)該顯而易見的是，本發(fā)明也可應(yīng)用于被加入(例如)基因修飾的有機(jī)體以增加它們對(duì)殺昆蟲劑、殺蟲劑的耐性或判斷為有益的任何其它修飾的蛋白。這種修飾具有產(chǎn)生新⑶Id結(jié)合基序的風(fēng)險(xiǎn)。
[0162]具有降低的變應(yīng)原性/免疫原性的基因修飾的蛋白的其它實(shí)例是:
[0163].食物變應(yīng)原,例如大豆、花生和薔薇科家族的果實(shí)
[0164].牛奶蛋白
[0165].空氣傳播的變應(yīng)原,例如膠乳(Hevea brasiliensis),草的花粉,例如黑麥草(Lolium perenne)、梯牧草(Phleum pratense)或草地早熟禾(Poa pratensis)
[0166]?魚小白蛋白
[0167]?蜜蜂磷脂酶A2
[0168]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也應(yīng)該清楚的是，本發(fā)明擴(kuò)展至這樣的方法，通過其產(chǎn)生本發(fā)明的肽或多肽，包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物。
[0169]實(shí)施例4:變應(yīng)原Der P I
[0170]Der p I是半胱氨酸蛋白酶,其為所謂房塵螨(HDM),屋塵螨(D.pteronyssinus)的主要變應(yīng)原。HDM過敏是目前全世界最常見的變應(yīng)性哮喘和鼻炎觸因。如使用電腦算法鑒別的，Der P I 含有與一般 CDld 結(jié)合基序[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]匹配的 3個(gè)基序，它們是:
[0171]SEQ ID 13:FSGVAAT, Der p I 的氨基酸 38 至 44
[0172]SEQ ID 14:HSAIAAVI, Der p I 的氨基酸 135 至 141
[0173]SEQ ID 15:YPYVVIL, Der p I 的氨基酸 216 至 222
[0174]合成SEQ ID 13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽并且用于加載CDld四聚物。
[0175]使用含有IOOygDer p I的50 μ I鹽水,使Balb/c小鼠經(jīng)受Der p I的鼻內(nèi)施用。間隔一周連續(xù)三天地兩次重復(fù)該挑戰(zhàn)程序。在最后鼻腔滴注5天之后處死該小鼠，并且移除脾臟。通過磁珠分選純化⑶4+T細(xì)胞，并且在加載有SEQ ID 13,SEQ ID 14或SEQ ID 15的肽的⑶Id四聚物存在下培育。通過熒光激活的細(xì)胞分選儀(facs)測(cè)定，觀察到顯著百分比的細(xì)胞(±10% )被四聚物著色，從而鑒定它們?yōu)棰?+NKT細(xì)胞。因此推斷出，SEQ ID
13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽在結(jié)合至⑶Id和通過NKT細(xì)胞鑒別中發(fā)揮作用。
[0176]得自上述實(shí)驗(yàn)的⑶4+T細(xì)胞在表達(dá)⑶Id分子的呈現(xiàn)抗原的細(xì)胞存在下在培養(yǎng)基中培育。這種細(xì)胞是市售的，例如JAWS2細(xì)胞，其不表達(dá)MHCII類決定簇。JAWS2細(xì)胞加載有Der pi，并且通過測(cè)量作為NKT激活的標(biāo)記的細(xì)胞因子例如IFN- Y和IL-4的產(chǎn)生，評(píng)價(jià)由⑶Id對(duì)Der p I衍生表位的呈現(xiàn)。可觀察到細(xì)胞因子的顯著產(chǎn)生，從而確認(rèn)Der p I含有⑶Id分子呈現(xiàn)的表位。
[0177]接著，通過基因工程制備Der p I的突變形式，其中預(yù)測(cè)處于Pl位的用于SEQ ID
13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽的⑶Id結(jié)合的3個(gè)氨基酸殘基被絲氨酸取代。突變DerP I (SEQ ID 16)用于鼻腔滴注，如上文對(duì)天然序列中的Der p I (SEQ ID 17)所述。在這種情況下，觀察到當(dāng)用加載有SEQ ID 13的肽、SEQ ID 14的肽或SEQ ID 15的肽的四聚物培育時(shí)⑶4+T脾細(xì)胞無顯著結(jié)合，從而表明突變Der p I已經(jīng)喪失其激活對(duì)這些肽特異性的NKT細(xì)胞的能力。
[0178]此外，突變Der p I (SEQ ID 16)用于加載JAWS2細(xì)胞并且測(cè)試其激活NKT細(xì)胞的能力。對(duì)于這種實(shí)驗(yàn)，使用從用天然或突變結(jié)構(gòu)的Der P I免疫的小鼠獲得的NKT細(xì)胞。將IFN- Y和IL-4的產(chǎn)生當(dāng)作NKT激活的指示。觀察到，當(dāng)在加載有突變Der p I的JAWS2細(xì)胞存在下培育時(shí)，從用天然序列Der P I免疫的小鼠獲得的NKT細(xì)胞未能被激活。
[0179]因此推斷出，天然序列的Der p I含有激活NKT細(xì)胞的功能性⑶Id限制性T細(xì)胞表位。此外，通過突變消除這種功能性CDld限制性表位足以消除NKT細(xì)胞激活。
[0180]實(shí)施例5:杭體
[0181]抗體作為治療性藥用于許多的指示中，從慢性炎性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(如抗TNF- α抗體)或變應(yīng)性哮喘(如抗IgE`抗體)到腫瘤(如抗CD20抗體)。超過120個(gè)治療性抗體目前在從臨床前到III期試驗(yàn)的各個(gè)階段中用于臨床應(yīng)用，并且為常規(guī)臨床實(shí)踐所接受。
[0182]治療性抗體是嵌合的或完全人源化的，其僅在可變部分的互補(bǔ)性測(cè)定區(qū)域中含有外來來源的序列。少數(shù)這種抗體來源于人所有組成部分，并因此被視為差免疫原性的。然而，即便當(dāng)直接來源于人所有組成部分時(shí)，針對(duì)治療性抗體的抗體由大部分治療中的患者產(chǎn)生，并且，在顯著比例的病例中，抗體的產(chǎn)生中和治療性藥的活性。
[0183]使用電腦算法進(jìn)行對(duì)與人IgG抗體序列中CDld結(jié)合基序匹配的表位的搜索。這種基序之一在4種IgG亞類(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)每一者的CH2區(qū)域(重鏈恒定部分的第二域)中被鑒別，并且第二基序在IgGl、IgG2和IgG4的CH3環(huán)中被鑒別:
[0184]SEQ ID 18:YRVVSVL (IgGl 和 IgG4 的 CH2)
[0185]SEQ ID 19:FRVVSVL (IgG2 和 IgG3 的 CH2)
[0186]SEQ ID 20:HEALHNH(IgGK IgG2 和 IgG4 的 CH3 環(huán))
[0187]產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于SEQ ID 18,SEQ ID 19和SEQ ID 20的合成肽，并且用于加載人CDld四聚物，按照上文實(shí)施例(參見例如針對(duì)變應(yīng)原Der P I的實(shí)施例4)。通過對(duì)已經(jīng)在前5天接受治療性抗體注射的患者靜脈穿刺，獲得周圍血液細(xì)胞。通過磁珠分選純化CD4+T細(xì)胞。隨后用加載有SEQ ID 18、SEQ ID 19或SEQ ID 20的肽的四聚物，培育所述細(xì)胞。通過facs分析鑒定由四聚物標(biāo)記的顯著比例的NKT細(xì)胞(±10% )。[0188]通過用Epstein Barr病毒轉(zhuǎn)化,從周圍血液B淋巴細(xì)胞獲得IgG4同種型的單克隆人抗體。這種抗體的基因組序列得自轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞。構(gòu)造含有對(duì)應(yīng)cDNA序列的病毒載體并且用于CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。所有這些方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Jacquemin等人Blood92:496-506,1998)。
[0189]位于SEQ ID 18和SEQ ID 20的肽中I位的疏水的氨基酸殘基被突變?yōu)榻z氨酸和由轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞產(chǎn)生的突變抗體。
[0190]在培養(yǎng)基中將如上獲得的周圍血液CD4+T細(xì)胞暴露于人樹狀細(xì)胞(通過本領(lǐng)域已知方法來源于人周圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞)并用天然結(jié)構(gòu)(SEQ ID 21)的抗體或其突變對(duì)應(yīng)物(SEQ ID 22)加載。在用⑶4+T細(xì)胞培養(yǎng)5至7天之后，評(píng)價(jià)由天然或突變抗體激活的⑶4+T細(xì)胞的群體。使用NKG2D的抗體(僅與NK或NKT細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)記)將⑶4+NKT細(xì)胞與⑶4+T細(xì)胞分離。
[0191]觀察到，當(dāng)使用天然序列(SEQ ID 21)的抗體時(shí)，⑶4+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞被激活，而抗體的突變形式(SEQ ID 22)僅激活I(lǐng)I類限制性CD4+T細(xì)胞，并不激活NKT細(xì)胞。
[0192]推斷出人IgG抗體含有對(duì)應(yīng)于[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]基序的表位，所述表位具有被NKT細(xì)胞識(shí)別并激活NKT細(xì)胞的能力。此外，這種基序中關(guān)鍵疏水的氨基酸殘基的突變足以阻止NKT細(xì)胞的激活。
[0193]應(yīng)當(dāng)理解的是本文提供的實(shí)施例并非詳盡無遺，并且可能想象出含有各個(gè)數(shù)量的氨基酸取代或刪除的蛋 白或肽的組合。舉例而言，在實(shí)施例1中，可以描繪疏水氨基酸的取代的各個(gè)組合。
[0194]序列表
[0195]SEQ ID I
[0196]VIII 因子氨基酸 309-315(人)
[0197]FCHISSH
[0198]SEQ ID 2
[0199]VIII 因子氨基酸 1816-1822(人)
[0200]FffKVQHH
[0201]SEQ ID 3
[0202]VIII 因子氨基酸 1918-1924(人)
[0203]FHAINGY
[0204]SEQ ID 4
[0205]因子Al域(突變F309S和H315S處有下劃線)(人)
【權(quán)利要求】
1.一種獲得激活NKT細(xì)胞的能力降低的分離肽或多肽的方法，其包含以下步驟: a.鑒別至少一個(gè)NKT細(xì)胞表位，其中所述表位在Pl位和/或P7位包含疏水的氨基酸殘基; b.通過用非疏水的殘基取代Pl位和/或P7位的疏水的氨基酸殘基，消除所述表位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疏水的殘基是F、W、T、H、Y。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中Pl位和/或P7位的至少一個(gè)F、W、T、H、Y由至少一個(gè)任意天然氨基酸、非天然氨基酸或非芳族氨基酸化合物替換，其中所述氨基酸不同于F、W、T、H、Y。
4.根據(jù)任一上述的權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述至少一個(gè)NKT細(xì)胞表位在P4包含脂族殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，P4中的所述脂族殘基是1、L、M。
6.根據(jù)任一上述的權(quán)利要求所述的方法，其中所述NKT細(xì)胞表位包含[FffTHY] -X2X3-[ILMV] -X5X6-[FffTHY]基序，其中 I 位和 / 或 7 位中的至少一個(gè) F、W、T、H、Y 被刪除。
7.一種可以根據(jù)權(quán)利要求1至5獲得的分離肽或多肽，其中所述肽或多肽由化學(xué)合成或由重組表達(dá)產(chǎn)生。
8.可根據(jù)權(quán)利要求1至6的方法獲得的所述肽或多肽，其衍生自外源因子、病毒載體、通過食物、飼料、全身或吸入路徑發(fā)生天然暴露的蛋白質(zhì)、變應(yīng)原或接種中所用傳染劑，其中所述外源因子是凝血或纖維蛋白溶解因子、酶類、激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、增長(zhǎng)因子或治療性抗體，其中所述病毒載體衍生自腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒，其中發(fā)生天然暴露的所述蛋白質(zhì)是用于飼料或食物的蛋白質(zhì)、酶類、抗病毒或抗細(xì)菌藥物、牧草花粉、樹或野草的花粉、接觸性致敏原、昆蟲或膜翅目毒液，其中所述變應(yīng)原是空氣傳播的變應(yīng)原、食物變應(yīng)原、昆蟲或膜翅目毒液，并且其中所述傳染劑是病毒、細(xì)菌或寄生蟲。
9.可根據(jù)權(quán)利要求1獲得的任何肽或多肽用作藥物的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至8的任何肽或多肽用作藥物的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至8的任何肽或多肽用作藥物的用途，所述藥物用于在哺乳動(dòng)物中阻止或治療針對(duì)外源因子、針對(duì)用于基因療法或基因接種的病毒載體、針對(duì)通過食物、飼料、全身或吸入路徑發(fā)生天然暴露的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至8的任何肽或多肽用于變應(yīng)性疾病中接種或用于傳染劑的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求7至8的任何所述肽或多肽用作藥物的用途，所述用于在哺乳動(dòng)物中減少NKT細(xì)胞激活。
14.根據(jù)權(quán)利要求7至8中任一項(xiàng)的任何肽的用途，其中施用能夠表達(dá)所述肽或多肽的核苷酸序列。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK103596971SQ201180064053
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月25日
【發(fā)明者】圣雷米·吉恩瑪麗 申請(qǐng)人:伊姆耐特有限責(zé)任公司