專利名稱：一種乳鐵蛋白肽的制備方法及其在食品抑菌中的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑菌劑的制備和應(yīng)用方法，更具體的說，涉及一種乳鐵蛋白肽的制備及其在食品抑菌中的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
食品安全是關(guān)系國計民生的大事，全天然綠色抑菌劑的開發(fā)與應(yīng)用是中國乃至世界的前沿課題。乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)是一種天然存在、廣泛分布于人和家畜乳汁、唾液、眼淚等外分泌液的鐵結(jié)合糖蛋白，具有安全無害的特點。乳鐵蛋白多肽 (Lactoferricin,Lfcin)是LF在消化道內(nèi)經(jīng)酸性胃蛋白酶水解后的小肽。大量研究表明， Lfcin具有廣譜抗細菌、抗病毒、抗真菌活性，它們雖然沒有鐵離子結(jié)合位點，但殺菌活性卻比LF高，可用于開發(fā)新型的保健食品和綠色食品添加劑。但開發(fā)Lfcin會遇到許多困難， 其中，遇到的最大問題是制造成本太高，大量制造較困難，難以實現(xiàn)商品化。應(yīng)用基因工程技術(shù)將牛乳鐵蛋白肽(Lfcin B)基因轉(zhuǎn)入其他生物中表達，是解決工業(yè)用Lfcin B來源不足的最具潛力的途徑。申請?zhí)枴癈N200610166536.6”，發(fā)明名稱“一種牛乳鐵蛋白工程菌及抗菌肽牛乳鐵蛋白素的制備方法”的中國專利(申請)，公開了通過發(fā)光桿菌基因工程菌制備抗菌肽牛乳鐵蛋白素的制備方法；申請?zhí)枴癈N200810110996.6”，發(fā)明名稱“乳鐵蛋白抗菌肽及其制備方法與他們的用途”的中國專利(申請)，公開了通過酶水解牛初乳中乳鐵蛋白制備乳鐵蛋白抗菌肽的方法和在奶粉、酸奶、飲料中作為抑菌劑的用途；申請?zhí)枴癈N200810116875. 2”， 發(fā)明名稱“牛乳鐵蛋白抗菌肽融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用”的中國專利(申請)，公開了牛乳鐵蛋白抗菌肽融合蛋白的編碼及利用編碼基因培育的植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗菌肽的方法；上述這些專利(申請)均未涉及到利用大腸桿菌重組表達牛乳鐵蛋白肽和重組牛乳鐵蛋白肽用于食品的抑菌處理，特別是牛奶和水產(chǎn)品，以提高食品特別是生食海鮮的食用安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法，該方法易行，操作簡單，高校表達，成本低廉，該方法制備所得的牛乳鐵蛋白肽具有高效廣譜抗菌活性。本發(fā)明的另一目的是提供上述牛乳鐵蛋白肽用于水產(chǎn)品和牛奶中抑菌的使用方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(i)基因工程菌活化基因工程菌在含硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基上活化后，在發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵，3 5小時后乳糖誘導(dǎo)6 10小時；(ii)細菌裂解將誘導(dǎo)后的菌體加入到裂解緩沖液中，混勻后37°C孵育過夜，離心去上清，加入等體積包涵體洗滌緩沖液，37°C孵育2 3小時后，再離心去上清；(iii)包涵體分離和裂解將細菌包涵體加入到蒸餾水中振蕩洗滌0. 5 1. 5小時，離心去上清，然后再在包涵體分離液中振蕩洗滌10 30min，離心去上清，最后再加入到包涵體裂解液中連續(xù)振蕩18 22小時，離心收集上清(含融合蛋白)；(iv)融合蛋白提取和酸水解用0.68倍體積的乙醇沉淀上述上清中的融合蛋白，-20°C預(yù)冷10 30分鐘后，離心收集沉淀和上清，再用3. 5倍體積的乙醇沉淀上清中的融合蛋白，兩次乙醇沉淀均為融合蛋白，將融合蛋白在鹽酸溶液中，40 56°C水解25 35h ；(ν)凝膠色譜分離調(diào)節(jié)步驟(iv)得到的融合蛋白酸水解產(chǎn)物PH與洗脫液基本一致，經(jīng)濾膜過濾后上樣于平衡過的CM52離子交換柱，洗脫液洗脫，收集樣品峰，采用平衡過的kphadex G-25層析柱對樣品進行脫鹽，洗脫液洗脫，收集樣品峰，所得蛋白進行冷凍干燥即為牛乳鐵蛋白肽。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，所述基因工程菌為E. coli-pED-Lfcin B BL21分泌表達牛乳鐵蛋白肽融合蛋白。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(i)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉7g/L， 牛肉膏30g/L，氯化鈉6. 7g/L。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(ii)，所述菌體裂解緩沖液為溶菌酶，其質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 02%，聚乙醇辛基苯基醚，其體積分?jǐn)?shù)為0. 5%，撲化-!1(1，其？!1值為8. 0，濃度為50mmol/L，所述菌體裂解緩沖液的用量為，每克細菌加入4mL ；在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(ii)中，所述包涵體洗滌緩沖液為 iTritonX-IOO,其體積百分?jǐn)?shù)為 0. 2%，iTris-HCl,其 pH 值為 8. 0，濃度為 50mmol/L。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(ii)中，所述離心速度為8000r/min，時間為 20mino在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(iii)中，所述尿素溶液的濃度為2mol/L。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(iii)中，所述包涵體裂解液含尿素4mol/L， Tris-HCl (pH8. 0) 1 OOmmo 1/L,按Ig包涵體用4mL裂解液的用量進行添加。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(iv)中，所述鹽酸溶液濃度為50mM，水解過程中融合蛋白的質(zhì)量含量為5%。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，步驟(ν)中，所述濾膜為0.45 μ m;平衡和洗脫CM52 離子交換柱的平衡液和洗脫液分別為0. 08mol/L乙酸銨溶液，0. 24mol/L乙酸銨溶液，洗脫條件為0. 5mL/min ；平衡和洗脫kphadex G-25層析柱的平衡液和洗脫液均為0. IM乙酸溶液，洗脫條件為5mL/min。本發(fā)明制備所得的牛乳鐵蛋白肽在水產(chǎn)品抑菌中的應(yīng)用方法為將水產(chǎn)品清洗干凈后，浸沒于新鮮配制的牛乳鐵蛋白肽溶液中(抑菌液配制后至使用間隔時間不宜超過1 小時，低溫保藏可延長其有效期)，在常溫泡在或0-4°C條件下，浸泡0. 5-10小時；在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，所述牛乳鐵蛋白肽溶液的濃度為ΙΟΟΟμ g/mL，水產(chǎn)品質(zhì)量與牛乳鐵蛋白肽溶液的質(zhì)量比為1 1 10。本發(fā)明的牛乳鐵蛋白肽的制備方法具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明所涉及的制備牛乳鐵蛋白肽的方法簡單、安全，可大規(guī)模生產(chǎn)從而解決天然牛乳鐵蛋白肽來源不足的問題，所產(chǎn)生的牛乳鐵蛋白肽不僅表達量高，純度高，且具有高效的抗菌活性。2、所涉及的牛乳鐵蛋白肽為天然可食用成分，對人體無害，對水產(chǎn)品致病菌具有良好的抑制效果，并不會產(chǎn)生抗藥性，在處理過程中也不會產(chǎn)生有害物質(zhì)殘留，可達到安全、衛(wèi)生、綠色與高效的效果。另外，對水產(chǎn)品本身的風(fēng)味等感官特性不會產(chǎn)生負面影響，具備實際開發(fā)應(yīng)用的前景。3、本發(fā)明的復(fù)合抑菌液處理水產(chǎn)品的方法操作方便，設(shè)備要求低，抑菌效果好，使用安全；本方法可應(yīng)用范圍廣，適合于水產(chǎn)品生產(chǎn)與加工環(huán)節(jié)，也可以于流通消費環(huán)節(jié)直接使用。


圖1為不同貯藏溫度下Lfcin B對副溶血性弧菌的抑菌效果，其中，處理濃度為 1000 μ g/mL ；η = 3。圖2為不同貯藏溫度下Lfcin B對單核細胞增生李斯特菌的抑菌效果，其中，處理濃度為1000 μ g/mL ；η = 3。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述。實施例1乳鐵蛋白肽的制備方法(i)基因工程菌活化采用接種環(huán)接種一環(huán)基因工程菌于5mL含硫酸卡那霉素的 LB液體培養(yǎng)基中活化后，再按1.5% (ν/ν)的比例接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，4小時后乳糖誘導(dǎo)7小時；其中，發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉7g/L，牛肉膏30g/L，氯化鈉6. 7g/L(ii)細菌裂解20g誘導(dǎo)后的菌體中加入約SOmL裂解緩沖液，混勻后37°C孵育過夜，離心去上清(8000r/min、20min)，加入等體積包涵體洗滌緩沖液，37°C孵育2 3小時后，再離心去上清(8000r/min、20min)；其中，菌體裂解緩沖液為溶菌酶(Lysozyme)，其質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.02%，聚乙醇辛基苯基醚(Triton X-100)，其體積百分?jǐn)?shù)為0.5%，Tris-HCl (pH8. 0)，其濃度為50mmol/ L ；包涵體洗滌緩沖液為Triton X-100其體積百分?jǐn)?shù)為0. 2%, Tris-HCl (pH8. 0)其濃度為 50mmol/L。(iii)包涵體分離和裂解10g細菌包涵體中加入約IOOmL蒸餾水，振蕩洗滌1小時后離心去上清(8000r/min、20min)，然后再加入IOOmL 2mol/L尿素溶液振蕩洗滌20min， 離心去上清(8000r/min、20min)，最后再加入40mL包涵體裂解液、連續(xù)振蕩20小時，離心 (8000r/min,20min)收集上清(含融合蛋白)；其中，包涵體裂解液含尿素4mol/L，Tris-HCl (ρΗ8· 0) IOOmmol/L0(iv)融合蛋白提取和酸水解用0. 68倍體積的乙醇沉淀步驟(iii)上清中的融合蛋白，-20°C預(yù)冷20分鐘后，9000r/min離心收集沉淀和上清，再用3. 5倍體積乙醇沉淀上清中的融合蛋白，兩次乙醇沉淀均為融合蛋白，將5g融合蛋白在IOOmL 50mM鹽酸溶液中， 48°C 水解 30h ；(ν)凝膠色譜柱分離調(diào)節(jié)步驟(iv)得到的融合蛋白酸水解產(chǎn)物PH與洗脫液基本一致，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾后上樣于經(jīng)150mL 0. 08mol/L乙酸銨平衡過的CM52離子交換柱，0. 24mol/L乙酸銨進行洗脫，洗脫條件為0. 5mL/min,收集樣品峰，采用IOOmL 0. IM乙酸溶液平衡過的kphadex G-25層析柱對樣品進行脫鹽，洗脫液洗脫，洗脫液為0. IM乙酸溶液，洗脫條件為5mL/min，收集樣品峰，所得蛋白進行冷凍干燥即為牛乳鐵蛋白肽。將實施例1制備所得的牛乳鐵蛋白肽通過體外抑菌試驗表明其對副溶血性弧菌和單核細胞增生李斯特菌具有良好的抑菌性能，結(jié)果見圖1和圖2。實施例2將接種副溶血性弧菌北極貝肉25g置于225mL抑菌液[實施例1中分離的牛乳鐵蛋白肽2000μ g/mL]中處理30分鐘后低溫4°C下貯藏3天，采用國標(biāo)法測定副溶血性弧菌與細菌總數(shù)，并用生理鹽水作為空白對照。結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)抑菌液處理的北極貝肉中副溶血性弧菌含量降低了 4. lX105CFU/g。實施例3將接種副溶血性弧菌北極貝肉25g置于225mL抑菌液[實施例1中分離的牛乳鐵蛋白肽濃度3000yg/mL]中處理30分鐘后低溫4°C下貯藏3天，采用國標(biāo)法測定副溶血性弧菌與細菌總數(shù)，并用生理鹽水作為空白對照。結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)抑菌液處理的北極貝肉中副溶血性弧菌含量降低了 5. lX105CFU/g。實施例4將接種副溶血性弧菌北極貝肉25g置于225mL抑菌液[實施例1中分離的牛乳鐵蛋白肽濃度4000yg/mL]中處理30分鐘后低溫4°C下貯藏3天，采用國標(biāo)法測定副溶血性弧菌與細菌總數(shù)，并用生理鹽水作為空白對照。結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)抑菌液處理的北極貝肉中副溶血性弧菌含量降低了 5.4X105CFU/g。實施例520mL純牛奶中加入40mg實施例1中分離的牛乳鐵蛋白肽(Lfcin B終濃度^ig/ mL)，室溫下放置5天，參照GB4789. 2-2010計算細菌總數(shù)。結(jié)果顯示，對照組細菌總數(shù)增長量為 2. 7X 109CFU/g，處理組為 1. 6X 105CFU/g。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(i)基因工程菌活化基因工程菌在含硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基上活化后，在發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵，3 5小時后乳糖誘導(dǎo)6 10小時；( )細菌裂解將誘導(dǎo)后的菌體加入到裂解緩沖液中，混勻后37°C孵育過夜，離心去上清，加入等體積包涵體洗滌緩沖液，37°C孵育2 3小時后，再離心去上清；(iii)包涵體分離和裂解將細菌包涵體加入到蒸餾水中振蕩洗滌0.5 1. 5小時，離心去上清，然后再在包涵體分離液中振蕩洗滌10 30min，離心去上清，最后再加入到包涵體裂解液中連續(xù)振蕩18 22小時，離心收集上清(含融合蛋白)；(iv)融合蛋白提取和酸水解用0.68倍體積的乙醇沉淀上述上清中的融合蛋白，-20°C預(yù)冷10 30分鐘后，離心收集沉淀和上清，再用3. 5倍體積的乙醇沉淀上清中的融合蛋白，兩次乙醇沉淀均為融合蛋白，將融合蛋白在鹽酸溶液中，40 56°C水解25 35h ；(ν)色譜柱分離調(diào)節(jié)步驟(iv)得到的融合蛋白酸水解產(chǎn)物pH與洗脫液基本一致， 經(jīng)濾膜過濾后上樣于平衡過的CM52離子交換柱，洗脫液洗脫，收集樣品峰，采用平衡過的 Sephadex G_25層析柱對樣品進行脫鹽，洗脫液洗脫，收集樣品峰，所得蛋白進行冷凍干燥即為牛乳鐵蛋白肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)中，所述基因工程菌為 E. coli-pED-Lfcin B BL21分泌表達牛乳鐵蛋白肽融合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉7g/L，牛肉膏30g/L，氯化鈉6. 7g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(ii)，所述菌體裂解緩沖液為溶菌酶，其質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 02%，聚乙醇辛基苯基醚，其體積分?jǐn)?shù)為0.5%，Tris-HCl，其pH值為 8. 0，濃度為50mmol/L，所述菌體裂解緩沖液的用量為，每克細菌加入4mL ；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中，所述包涵體洗滌緩沖液為 Triton X-100，其體積百分?jǐn)?shù)為 0. 2%, Tris-HCl，其 pH 值為 8. 0，濃度為 50mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中，所述離心速度為SOOOr/ min，時間為 20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(iii)中，所述包涵體分離液為 2mol/L的尿素溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(iii)中，所述包涵體裂解液為尿素-Tris-HCl溶液(pH8. 0)，其中尿素的濃度為4mol/L，Tris-HCl的濃度為100mmol/L、pH 為8. 0，按Ig包涵體添加4mL裂解液的比例進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(iv)中，鹽酸溶液濃度為50mM，水解過程中融合蛋白的質(zhì)量含量為5%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(V)中，所述濾膜為0.45μ m;平衡和洗脫CM52離子交換柱的平衡液和洗脫液分別為0. 08mol/L乙酸銨溶液，0. 24mol/L乙酸銨溶液，洗脫條件為0. 5mL/min ；平衡和洗脫kphadex G-25層析柱的平衡液和洗脫液均為 0. IM乙酸溶液，洗脫條件為5mL/min。
11.權(quán)利要求1-10任一項所述的方法制備所得的牛乳鐵蛋白肽在食品抑菌中的應(yīng)用方法，將水產(chǎn)品清洗干凈后，浸沒于新鮮配制的牛乳鐵蛋白肽溶液中，在常溫泡在或0-4°C 條件下，浸泡0. 5-10小時，
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述牛乳鐵蛋白肽溶液的濃度為 1000 μ g/mL，水產(chǎn)品質(zhì)量與牛乳鐵蛋白肽溶液的質(zhì)量比為1 1 10。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛乳鐵蛋白肽的制備方法及其在食品抑菌中的應(yīng)用方法，該制備方法包括步驟(i)基因工程菌活化；(ii)細菌裂解；(iii)包涵體分離和裂解；(iv)融合蛋白提取和酸水解；(v)色譜柱分離。該方法易行，操作簡單，成本低廉，其制備所得的牛乳鐵蛋白肽可用于水產(chǎn)品的抑菌，其應(yīng)用方法為將水產(chǎn)品清洗干凈后，常溫或0-4℃，在牛乳鐵蛋白肽溶液中浸泡0.5-10小時。
文檔編號C07K1/18GK102505033SQ20121000146
公開日2012年6月20日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者劉承初, 巴特, 李家樂, 鄧強, 魯建章 申請人:上海海洋大學(xué)