專利名稱：抑制煙曲霉菌粘附角膜的Pc-E多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于感染性眼病的生物防治技術領域，具體涉及抑制煙曲霉菌粘附角膜的多肽。
背景技術：
角膜炎是眼部最常見的多發(fā)病，引起角膜炎的病原微生物包括真菌、細菌、病毒和棘阿米巴等。近年來，隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的濫用，以及角膜接觸鏡的普遍佩戴，角膜炎的發(fā)病幾率大大增加。真菌性角膜炎多見于以農(nóng)業(yè)人口為主的發(fā)展中國家，在我國有逐年増加的趨勢，相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示真菌性角膜炎在我國感染性角膜病中所占比例高達34. 8% 61. 9%，在部分地區(qū)已經(jīng)成為角膜盲的首要原因。真菌性角膜炎常因感染菌屬或菌株不明，對藥物敏感性不一，治療較為棘手?；颊咭坏┰\治不夠及時就有致盲的危險。所以，對角膜炎在發(fā)病初期進行有效的治療是至關重要的。為此，開展真菌與角膜上皮細胞的 相互作用研究，以期尋找可以更早、更快、更強阻斷真菌感染進程的作用靶點，具有重要的臨床意義。病原菌的致病過程是其與宿主相互作用的結果。病原體、宿主細胞相互作用的研究常著眼于單一分子或少數(shù)分子，甚至在某些研究體系中僅觀察到單個基因就判斷為決定宿主對某病原體的敏感性的關鍵因素。但由于雙方各自的復雜性和對對方的適應性，病原體-宿主間的相互作用處于動態(tài)的變化中。目前對于病原菌與角膜細胞的相互作用機制并不十分清楚。已知病原真菌和細菌粘附于宿主的角膜上皮細胞是角膜炎發(fā)生的首要步驟，這其中特異性配體-受體間的結合或非特異性的理化作用產(chǎn)生的粘附都發(fā)揮著重要作用，所以阻斷這些粘附過程是防治角膜炎的一個很好的策略，將疾病控制在萌芽狀態(tài)。煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)作為最常見的真菌性角膜炎的致病菌種之一，其毒性較強，引發(fā)的病情發(fā)展迅速。但目前對于煙曲霉菌粘附角膜上皮細胞的具體機制還并不很清楚，因此對于如何在粘附階段阻斷煙曲霉菌感染角膜細胞的研究還處于起步階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抑制煙曲霉菌粘附角膜的多肽，即可以更早、更快、更強阻斷煙曲霉菌感染角膜的作用靶點，為感染性角膜病的臨床治療提供新的思路，以彌補現(xiàn)有技術的不足。本發(fā)明利用人角膜上皮細胞對噬菌體展示的隨機12肽文庫進行三輪生物親和淘篩，對所得的克隆大量擴增后，進行DNA的提取和序列測定，然后對所篩選的多肽進行人工合成，經(jīng)ELISA方法進ー步驗證人工合成的肽段與人角膜上皮細胞的親和力。接著利用細胞模型和器官模型研究合成肽段對煙曲霉菌與角膜上皮細胞相互作用的影響，從而驗證多肽對感染性角膜病的防治效果。本發(fā)明包括以下幾個部分
本發(fā)明的ー個方面是提供抑制煙曲霉菌粘附角膜的多肽，包括有(I)序列分別為SEQ ID NO 1的多肽，(2)與(I)中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，該多肽的功能與(I)中的多肽功能相同或相似。對于(2)中所述的多肽，可以是與(I)中的多肽具有75%同源性(3個氨基酸的不同)、80%以上同源性(2個氨基酸的不同)和90%以上同源性(I個氨基酸的不同)的多肽，該多肽的功能與⑴中的多肽功能相同或相似。本發(fā)明的另ー個方面是提供包含序列為SEQ ID NO :1多肽的融合多肽。所述的融合多肽可以是通過化學結合方法、酶切方法或物理斷裂方法處理多肽片段所獲得的。例如Pc-E多肽與抗原載體連接形成的蛋白復合體，抗原載體可以是卵清白蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)。
本發(fā)明還提供ー種多核苷酸，所述的多核苷酸是I)編碼序列為SEQ ID NO : I多肽的核苷酸2)編碼與(I)中的多肽具有70%或以上同源性的多肽的核苷酸，所編碼的多肽的功能與(I)中的多肽功能相同或相似。所述的核苷酸為DNA或RNA，優(yōu)選DNA。本發(fā)明還提供ー種藥物組合物，包括序列為SEQ ID NO :1的多肽；所述的制品具有預防煙曲霉菌粘附角膜的功能。本發(fā)明所提供的序列為SEQ ID NO :1的多肽用于制備抗體，制備的抗體應用在防治煙曲霉菌粘附角膜的藥物中，同時制備的抗體還可以應用在檢測煙曲霉菌的產(chǎn)品中。本發(fā)明所篩選的多肽對煙曲霉菌與角膜上皮細胞的相互作用都有不同程度的競爭性抑制作用，可以特異性的阻斷煙曲霉菌表面的配體與角膜上皮細胞受體的粘附，成為真菌性角膜炎治療藥物設計的新靶點，從而為其臨床治療提供新的思路。


圖I :本發(fā)明的多肽Pc-E與人角膜上皮細胞、角膜成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞親和力的ELISA檢測效果柱狀圖；圖2 :本發(fā)明的多肽Pc-E對眼科常見致病真菌煙曲霉菌粘附于人角膜上皮細胞的抑制作用；圖3 :本發(fā)明的多肽Pc-E不同濃度對煙曲霉菌粘附角膜上皮細胞的抑制作用；圖4 :本發(fā)明的多肽Pc-E在小鼠模型中對煙曲霉菌粘附角膜上皮的抑制作用；圖5 :本發(fā)明的多肽Pc-E對煙曲霉菌引發(fā)的小鼠角膜炎發(fā)展進程的抑制作用，CK為陰性對照組，Pc-E為多肽處理組，Natacyn為陽性藥物處理組；圖6 :本發(fā)明的多肽Pc-E對煙曲霉菌感染小鼠角膜3天時角膜病變的抑制作用，CK為陰性對照組，Pc-E為多肽處理組，Natacyn為陽性藥物處理組；圖7 :本發(fā)明的多肽Pc-E不同濃度對人角膜上皮細胞的毒性。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的多肽及其它方面的操作進行詳細描述。
一、多肽的篩選噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術，并且表達在噬菌體外売上的蛋白能折疊成天然構象而具有相應的生物學活性。這些載有外源蛋白的噬菌體可組成噬菌體肽庫，其在病原體與宿主相互作用的研究中具有巨大的潛 力。應用噬菌體多肽文庫篩選模擬配體(細胞因子等)的多肽，篩選到的小肽可以與相應的受體結合，競爭性拮抗其配體的活性。噬菌體展示技術是目前應用很廣泛的ー種研究配體-受體相互作用的方法，利用此方法尋找已知受體的配基的模擬物，為研制具有疾病治療的生物技術新藥有著重要的理論意義和潛在的應用價值。實施例I :篩選抑制煙曲霉菌粘附角膜的多肽I)將培養(yǎng)至單層的人角膜上皮細胞(HCEC)與IOuiPfu的噬菌體展示的12肽文庫(New England Biolabs公司產(chǎn)品，在M13噬菌體的pill蛋白中嵌入12氨基酸長的隨機肽)37°C孵育lhr，PBS洗去未結合的噬菌體，甘氨酸洗脫液洗脫下結合在HCEC表面的噬菌體，經(jīng)擴增滴定后再進行同樣的2輪淘篩，最終獲得能夠與HCEC發(fā)生結合的噬菌體14條多肽。挑取噬菌體單克隆進行序列測定，將獲得的核苷酸序列SEQ ID NO 2 (AGCACGCGTAGGATTAGGAAACGGCGACTCCGCATG)翻譯成多肽，其氨基酸序列為 SEQ ID NO I (YALRPGMPQffLE) 2)多肽片段的人工合成與鑒定將從噬菌體展示的12肽文庫中篩選出的對角膜上皮細胞有粘附作用，且通過對應基因功能分析有可能參與病原菌與宿住相互作用的12肽片段進行人工合成，N端生物素化修飾以利于后續(xù)檢測，C端酰胺化修飾以防止降解。將一定量的合成肽段與封閉后的人角膜上皮細胞孵育，采用HRP直標的親和素通過ELISA方法檢測合成的12肽片段與人角膜上皮細胞、角膜成纖維細胞(HTK)和血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)的親和カ(圖I)。所篩選的Pc-E多肽可以與人角膜上皮細胞結合。3)合成多肽抑制病原菌粘附角膜上皮細胞的實驗培養(yǎng)至單層的人角膜上皮細胞先與IOOuM的多肽孵育lhr，然后加入適量煙曲霉菌孢子在37°C孵育Ihr后，PBS洗去未結合的真菌，將作用后的細胞和粘附的病原菌在顯微鏡下檢測粘附于細胞表面的真菌數(shù)目；同時將作用后的體系用裂解液裂解，對其中粘附的真菌進行計數(shù)。然后同樣方法進ー步研究不同濃度的候選多肽對煙曲霉菌粘附角膜上皮細胞的抑制作用，從而計算半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。并利用角膜的器官模型研究候選多肽對煙曲霉菌粘附角膜的抑制作用，最終確定能夠抑制煙曲霉菌粘附角膜上皮細胞的多肽。篩選出的Pc-E多肽對眼科常見致病真菌煙曲霉菌粘附于人角膜上皮細胞的抑制作用將培養(yǎng)至80%的人角膜上皮細胞先分別與10條IOOuM的多肽37°C孵育lhr，然后各加入106cfu的煙曲霉菌再37°C孵育lhr，PBS洗去未結合的病原菌，裂解液裂解后顯微鏡下直接計數(shù)，不加多肽處理的作為陰性對照(圖2)?？梢娕c對照相比，Pc-E多肽可抑制煙曲霉菌粘附于角膜上皮細胞，抑制率可達90%。選擇通過噬菌體展示篩選出的多肽，進行半數(shù)抑菌濃度(IC50)的測定，即采用上述方法檢測不同濃度多肽(lOOuM，IOuM, IuM, O. IuM和O. OluM)對煙曲霉菌粘附角膜上皮細胞的抑制作用(圖3)。結果表明Pc-E多肽對煙曲霉菌粘附角膜上皮細胞的抑制表現(xiàn)一定的劑量依賴性，隨著多肽濃度的升高，對粘附的抑制率升高。
4)合成多肽抑制病原菌粘附小鼠角膜上皮的實驗將麻醉后的BALB/c小鼠角膜用濾紙刮擦損傷角膜上皮，然后在表面滴加IOOuM的多肽與IO7Cfu的煙曲霉菌的混合液，塑料套管套眼球保證液體充分與眼球接觸，作用Ihr后，PBS沖洗未結合的真菌孢子，剪下角膜勻漿，梯度稀釋鋪板計數(shù)，不加多肽處理的作為陰性對照(圖4)。結果表明Pc-E多肽對煙曲霉菌粘附小鼠角膜抑制作用，與對照相比粘附的菌量顯著減少。 5)合成多肽抑制煙曲霉菌感染小鼠角膜的實驗利用BALB/c小鼠的真菌性角膜炎模型進ー步檢測多肽對煙曲霉菌感染角膜進程的抑制作用。即感染前Ihr用IOOuM的多肽點眼4次，間隔15min，然后滴加IO7Cfu的煙曲霉菌，繼續(xù)用用IOOuM的多肽每小時點眼I次，點5次。在感染后1，3，5，7和10天時，對小鼠角膜病變情況在裂隙燈顯微鏡下觀察進行臨床評分(圖5)。同時對感染后第三天的小鼠角膜進行組織病理染色觀察(圖6)。實驗中利用真菌性角膜炎臨床治療常用藥物那他霉素滴眼液(含5%的那他霉素)作為陽性對照。結果表明多肽Pc-E對煙曲霉菌引發(fā)的角膜炎有抑制作用。6)合成多肽對角膜上皮細胞的毒性實驗利用MTT法測定合成多肽對人角膜上皮細胞的毒性。測定多肽的濃度范圍為0，O. 01，O. 1，1，10和IOOuM,結果發(fā)現(xiàn)多肽對人角膜上皮細胞毒性較低(圖7)。ニ、與SEQ ID NO 1的多肽具有同源性的多肽、多肽片段及其融合蛋白本發(fā)明還保護與SEQ ID NO 1中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，該多肽的功能與SEQ ID NO :I的多肽功能相同或相似。所述的具有同源性多肽，可以是與序列為SEQ ID NO 1的多肽具有75%同源性(3個氨基酸的不同)、80%以上同源性(2個氨基酸的不同)和90%以上同源性(I個氨基酸的不同)的多肽，該多肽的功能與與序列為SEQ ID NO :1的任一條多肽功能相同或相似。例如，序列為SEQ ID NO 3 (SGSYALRPGMPQffLE)的多肽，其與位點名稱為Pc-E的多肽相比，是在N端加上了 Ser-Gly-Ser (SGS)，而抑制病原菌粘附角膜上皮細胞的實驗表明序列為SEQ ID NO 3的多肽也具有抑制煙曲霉菌粘附的功能。所述的同源性多肽可以用Applied biosystem合成儀或Pioneer 肽合成儀等多肽合成儀器按固相化學技術合成。也可以通過插入目的核苷酸片段的表達載體表達出所需要的多肽。本發(fā)明所述的十條多肽還可以與蛋白載體連接制成完全抗原，蛋白載體可以是卵清白蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)，通過碳化ニ亞胺法，將多肽N末端的氨基與載體蛋白上的羧基相連，然后再采用梯度法透析后得到高純度的完全抗原。實施例2 :完全抗原的制備(I)將本發(fā)明所述的Pc-E多肽溶于ニ甲基亞砜(DMSO)中配制成O. I μ g/μ L的多肽母液；將水溶性碳化ニ亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和卵清白蛋白(OVA)用O. OlM磷酸鹽緩沖液(PBS，ρΗ7. 5)分別配制成lmg/mL的工作液；(2)取100 μ L多肽母液，加入20 μ L EDC工作液和12 μ L NHS工作液，STX、EDC、NHS反應的摩爾比為I : 2-3 1-2，室溫震蕩反應3h，獲得最初反應液；(3)將蛋白載體用O. OlM磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7. 5)配成lmg/mL的工作液。
(4) STX和載體蛋白反應的最佳摩爾比為10 I ;將⑵步驟中的反應物加入到100 μ L的載體蛋白工作液中，4°C震蕩反應12h，獲得最終反應液；(5)將上述的最終反應液轉移到透析卡中，用300mL0. OlM pH7. 5的PBS緩沖液和DMSO的混合液透析72h，每12h換液I次，透析采用梯度透析法，透析完后取出反應物，最終得到完全抗原，并可用于后續(xù)實施例的抗體制備。三、包含Pc-E多肽的藥物組合物本發(fā)明所述的多肽可以用來制備藥物組合物，用于預防煙曲霉菌對宿主細胞的粘附。所述的藥物組合物含有治療有效量的Pc-E多肽，以及ー種或幾種的藥品エ業(yè)上可接受的載體或溶劑等輔料。實施例3 :復合多肽滴眼液的制備及其防治煙曲霉菌感染效果檢測 取一定量Pc-E多肽凍干粉溶解于滴眼液常用溶劑硼酸鹽緩沖液，配制成多肽濃度各為O. I %的滴眼液，并且利用碳酸氫鈉調(diào)pH值至5. 5-7. 5，利用葡萄糖調(diào)節(jié)滲透壓為270-310m0sm/kg，使其符合常規(guī)滴眼液的標準。于感染前Ihr用復合多肽滴眼液對健康BALB/c小鼠滴眼，15min/次，連續(xù)5次，然后利用角膜劃傷配合角膜接觸鏡法建立煙曲霉菌(IO7Cfu)感染的小鼠模型，感染后繼續(xù)用復合多肽滴眼液進行點眼防治，15min/次，連續(xù)5次，Shr后取下角膜，勻漿裂解后梯度稀釋鋪板計數(shù)，只感染不進行復合多肽滴眼液防治的同步實驗小鼠作為對照。結果發(fā)現(xiàn)此滴眼液對煙曲霉菌的感染有較好的防治效果，抑菌率可達80%。四、本發(fā)明的Pc-E多肽用于制備抗體實施例4 :抗體的制備免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200 μ L Pc-E多肽(含5 μ g多肽)與等體積弗氏完全佐劑，充分乳化后制成乳濁液，腹腔注射小鼠，之后每隔兩周取同量Pc-E多肽與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，腹腔注射。免疫三次后取尾血測定小鼠血清效價，若效價不高，繼續(xù)免疫。待效價大于要求值后，殺死小鼠取血，取出的血室溫放置30min，8000r/min離心20min,取上層血清,用蛋白A抗體離心純化試劑盒純化血清,制成抗Pc-E多肽的抗體。所制備的抗體用間接競爭ELISA法測其效價，以陽性血清的OD值大于陰性的2倍為參照，小鼠血清效價達到2400，實驗證明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗體。用實施例2制備的Pc-E多肽的完全抗原免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，間接競爭ELISA法測其效價，結果表明，連接了蛋白載體的Pc-E多肽的小鼠血清效價達到了 3500，遠高于Pc-E多肽半抗原的效價。制備的抗體可以用于制備藥品或檢測試劑盒，用于檢測煙曲霉菌。利用所制備的抗體與煙曲霉菌表面多肽對應抗原的特異性反應，來對煙曲霉菌進行檢測。首先在利用煙曲霉菌構建的BALB/c小鼠的真菌性角膜炎模型中進行實驗，刮取病變角膜表面病灶組織，鋪片后利用制備的抗體行免疫組織化學檢測，若顯陽性則說明病變角膜上有煙曲霉菌存在。另外可以在臨床上疑似真菌性角膜炎的病變角膜的病灶組織刮片中通過免疫組化方法進行檢測試劑盒的有效性驗證，若可檢測到陽性抗原，則說明是煙曲霉菌感染角膜所致病變。
權利要求
1.一種抑制煙曲霉菌粘附角膜的多肽，包括有 (1)序列為SEQID NO :I的多肽； (2)與⑴中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，該多肽的功能與⑴中的多肽功能相同或相似。
2.一種融合蛋白，是將權利要求I所述的多肽與載體蛋白連接形成的。
3.如權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述的載體蛋白為卵清白蛋白或牛血清白蛋白中的任一種或幾種。
4.一種多核苷酸,所述的多核苷酸是 1)編碼序列為SEQID NO :I多肽的核苷酸； 2)編碼與⑴中所述的多肽具有70%或以上同源性的多肽的核苷酸，所編碼的多肽的功能與⑴中所述的多肽功能相同或相似。
5.如權利要求4所屬的多核苷酸，其特征在于核苷酸的序列分別為SEQID NO 20
6.一種抑制煙曲霉菌粘附角膜的藥物組合物，其特征在于，包含有權利要求I所述的多肽。
7.一種單克隆或多克隆抗體，其特征在于是由權利要求I所述的多肽作為抗原制備的。
8.一種單克隆或多克隆抗體，其特征在于是由權利要求2所述融合蛋白作為抗原制備的。
9.如權利要求7或8所述的抗體，應用在防治煙曲霉菌粘附角膜的藥物中。
10.如權利要求7或8所述的抗體，應用在檢測煙曲霉菌的產(chǎn)品中。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制煙曲霉菌粘附角膜的多肽Pc-E，包括有(1)序列為SEQ ID NO1的多肽；(2)與(1)中的多肽具有70％或以上同源性的多肽，該多肽的功能與(1)中的多肽功能相同或相似。本發(fā)明還涉及一種多核苷酸，所述的多核苷酸用于編碼Pc-E多肽。本發(fā)明所篩選Pc-E多肽對煙曲霉菌與角膜上皮細胞的相互作用都有不同程度的競爭性抑制作用，可以特異性的阻斷煙曲霉菌表面的配體與角膜上皮細胞受體的粘附，成為真菌性角膜炎治療藥物設計的新靶點，從而為其臨床治療提供新的思路。
文檔編號C07K16/14GK102659926SQ20121000616
公開日2012年9月12日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權日2011年3月21日
發(fā)明者李思媛, 王宜強, 趙格 申請人:山東省眼科研究所