專利名稱：青蒿AaORA蛋白及編碼基因、轉基因青蒿植株的獲得方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術領域的蛋白，具體涉及一種青蒿AaORA蛋白及編碼基因、轉基因青蒿植株的獲得方法。
背景技術：
植物新陳代謝分為初生代謝和次生代謝，初生代謝產物(如糖類、脂類和核酸)存在于所有植物中，是維持細胞生命活動所必需的，而植物次生代謝產物是指植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產生和分布具有種屬、組織器官和生長發(fā)育特異性。近年來，隨著對中草藥成分研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)很多中草藥的有效成分均為植物的次生代謝產物，如青蒿中的青蒿素，紫草中的紫草素等，具有重要的藥用價值。天然植株中次生代謝產物含量極低，而使用化學合成的方法，工藝流程復雜、成本高。因此，人們開始探索其他的提高植物次生代謝產物含量的方法，在諸多方法之中，植物代謝工程和代謝調控是提高植物次生代謝產物含量的最有效方法之一。植物代謝途徑大多是由多種酶參與的多步反應，受發(fā)育、環(huán)境等因素的影響，對單個基因進行修飾有時難以奏效。而轉錄調控因子可調控多個參與代謝途徑基因的表達，其在植物發(fā)育、適應、進化中的作用研究已取得了不少進展。轉錄因子通常指由核基因編碼的一類蛋白質，它們主要以同源或異源二聚體的形式同順式作用因子發(fā)生特異性的結合，通過和某些輔助調控子發(fā)生作用而影響轉錄復合體的形成，從而調節(jié)植物基因的特異性表達。改變轉錄因子的表達往往可導致植物中該轉錄因子所控制性狀的較大改變，因此，利用基因工程的方法調控轉錄因子是頗具應用價值的植物遺傳操作手段。荷蘭Memelink實驗室在長春花中所做的研究取得重要進展，他們所發(fā)現(xiàn)的0RCA2 和0RCA3轉錄因子是目前所知在植物次生代謝調控中具有重要作用的轉錄因子，且都屬于 AP2/ERF家族，是植物特有的一類轉錄因子。該家族轉錄因子參與植物多種基因的表達，能調節(jié)植物對病原、低溫、干旱及高鹽等分子的應答反應，提高植物對逆境脅迫的耐受作用。 0RCA3應答于MeJA的誘導，可以增強TIAs生物合成代謝途徑上多個基因，包括dxs、as、 tdC、str、d4h的表達。0RCA3不影響催化開聯(lián)番木鱉甙生物合成第一步的酶一香葉醇單加氧酶(GlOH)，盡管GlOH也受甲基茉莉酸調控。在僅過表達0RCA3的轉基因細胞系中生物堿含量并沒有增加。如果在細胞培養(yǎng)介質中加入一定量的開聯(lián)番木鱉甙的前體馬錢苷后，轉 0RCA3基因的細胞系生物堿合成比非轉基因對照細胞系高3倍。如果通過RACE等技術在青蒿中克隆并得到類似長春花中的0RCA2和0RCA3轉錄因子，那么就可以利用其對次生代謝的重要調控作用，使用代謝工程手段提高青蒿植株中重要次生代謝產物青蒿素的含量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種青蒿AaORA蛋白及編碼基因、轉基因青蒿植株的獲得方法。該基因編碼一個乙烯相應的AP2-ERF類轉錄因子 (AaORA)，它參與調控青蒿素的合成代謝途徑；利用轉基因技術將青蒿AaORA轉錄因子干擾載體轉化青蒿可以有效調控青蒿中青蒿素的含量。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的第一方面，本發(fā)明涉及一種青蒿AaORA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。第二方面，本發(fā)明還涉及編碼青蒿AaORA蛋白的核酸序列。優(yōu)選地，所述核酸序列的堿基序列為如(a)SEQ ID NO 5 中第 1 1101 位所示，或者是(b)SEQ ID NO :5序列中第1 1101位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產生的序列。第三方面，本發(fā)明還涉及一種植物干擾表達載體，包含第二方面所述的核酸序列。第四方面，本發(fā)明還涉及一種根癌農桿菌菌株，包含第三方面所述的植物干擾表達載體。第五方面，本發(fā)明還涉及一種轉基因青蒿植株的獲得方法，包括如下步驟(a)克隆第二方面所述的核酸序列；(b)把所述核酸序列可操作性地連接于表達調控序列，得到植物干擾表達載體；(c)將植物干擾表達載體轉化根癌農桿菌EH105 ；(d)利用構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿植株，經(jīng)卡那霉素篩選得到抗性苗，再經(jīng) PCR檢測為陽性的植株，即轉基因青蒿植株。所述的經(jīng)PCR檢測為陽性的植株是指，分別設計合成AaORA基因的檢測引物，進行 DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因青蒿植株。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明從青蒿中克隆AaORA基因，構建含AaORA基因的植物干擾表達載體，用根癌農桿菌EH105介導，將AaORA基因干擾表達載體轉化青蒿；PCR檢測外源目的基因AaORA的整合情況，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量明顯降低的轉基因青蒿植株。在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發(fā)明的青蒿AaORA蛋白多肽時，可以將青蒿AaORA蛋白編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成青蒿AaORA蛋白表達載體。“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性 DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一股，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
以下實施例中涉及的農桿菌為根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EH105,該菌株可以從市場上公開購買(來源于澳大利亞CAMBIA公司，菌株編號為Gambar 1)。實施例1、青蒿AaORA基因的克降1. 1、青蒿基因組總RNA的提取取青蒿葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL Eppendorf(EP)離心管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。1 · 2、青蒿AaORA基因的RACE克隆根據(jù)擬南芥中相關基因所編碼的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech 公司 SMART RACE 試劑盒) 進行cDNA全長克隆，分三個階段進行1.2.1、首鏈 cDNA 的合成利用SMART RACE試劑盒所提供的 5，-CDS primer A和 SMART II A oligo 引物， 以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成5’ -RACE-Ready cDNA ； 利用Clontech試劑盒所提供的3’ -OTS primer A為引物，以所提取的總RNA為模板，在 PowerScript反轉錄酶的作用下合成3’ -RACE-Ready cDNA。1· 2. 2、3，-RACE用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用青蒿中與orca3同源性最高的保守片段(EY074653)設計的基因特異引物3-GSPl(SEQ ID NO 1), 3-GSP2 (SEQ ID N0: 2)；進行3’-RACE PCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMDIS-Tsimple載體上進行測序。1. 2. 3、5，-RACE用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用青蒿保守片段設計的基因特異引物 5-GSPl(SEQ ID NO :3)，5-GSP2 (SEQ ID NO 4)；進行 5，-RACE PCR 反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMDIS-Tsimple載體上進行測序。將測序結果的重疊區(qū)拼接，得到該基因的完整編碼區(qū)序列(SEQ ID NO :5)。BLAST分析結果證明從青蒿中得到的基因為AP2-ERF類轉錄因子。通過上述步驟，獲得了青蒿中該轉錄因子的全長編碼序列并推導出其蛋白編碼序列(SEQ ID N0:6)，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。實施例2、含AaORA基因的植物雙元干擾表達載體的構建2. 1、中間載體 pBlucescript: AaORA 的構建選用pBlucescriptSK+和gus基因片段為基本元件，構建干擾表達盒 pBlucescriptSK+: :gus。具體地，SmaI 單醇切 pBlucescriptSK+ 禾口含 gus 基因的質粒；回收gus片段和pBlucescriptSK+大片段；連接回收產物，轉化篩選，抽質粒 pBlucescriptSK+: :gus 酶切驗證。將AaORA特異性片段正反向分別插入到pBlucescriptSK+: gus載體中。具體地，Xhol/Hindlll 雙酶切 pGEM T-easy+AaORA 和 pBlucescriptSK+: gus， 回收AaORA和pBlucescriptSK+: gus大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質
5粒pBlucescriptSK+: FAaORA,并做PCR檢測和酶切驗證。用BamHI/Xbal雙酶切 pGEMT-easy+AaORA和pBlucescriptSK+: FAaORA,回收AaORA和pBlucescriptSK+: FAaORA 大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒pBlucescriptSK+: =AaORAi，并做PCR檢測和酶切驗證。2. 2、植物表達干擾載體 pCAMBIA2300 :p35S-Aa0RAi-nos 的構建使用pCAMBIA2300: :p35S-Aa0RAi-nos為表達載體，用中間載體 pBlucescriptSK+: AaORAi中AaORA基因發(fā)卡結構，插入到pCAMBIA2300載體中。具體地， BamHI/SacI 雙酶切 pBlucescriptSK+: AaORAi 和 pCAMBIA2300 :p35S-gus_nos，回收AaORA 發(fā)卡結構和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR 檢測和酶切驗證。本實施例將青蒿AP2-ERF類轉錄因子AaORA可操作性地連接于表達調控序列，形成含AaORA發(fā)卡結構的植物表達干擾載體，該載體可用于通過代謝工程策略來調控青蒿中
青蒿素的含量。棚列3、謹傾賺馳AaORA籠體·株3. 1、含AaORA干擾表達載體的根癌農桿菌工程菌的獲得將實施例2中含AaORA的植物雙元干擾表達載體采用凍融法轉入根癌農桿菌 (EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為 Gambar 1)，并進行PCR驗證。結果表明，含AaORA的植物雙元干擾表達載體已成功構建到根癌農桿菌菌株中。3. 2、根癌農桿菌介導AaORA基因轉化青蒿3.2. 1、外植體的預培養(yǎng)青蒿種子用75%乙醇浸泡lmin，再用20% NaCHO浸泡20min，無菌水沖洗3_4次， 用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固體培養(yǎng)基中，25°C、16h/8h (light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉化。3. 2. 2、農桿菌與外植體的共培養(yǎng)將所述的葉片外植體，轉到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS 100ymol/L)中，滴加含活化好的所述含AaORA植物雙元干擾表達載體的根癌農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3d。以滴加在不帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。3. 2. 3、抗性再生植株的篩選將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 0. 5mg/ L+NAA0. 05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于 25°C、16h/8h 光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養(yǎng)基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。3. 2. 4、轉基因青蒿植株的PCR檢測根據(jù)目的基因所在表達盒p3k-Aa0RAi_nos序列和AaORA分別設計正向引物設計和反向引物對目的基因進行檢測。結果表明，利用所設計的PCR特異引物，能擴增出 927bp的特異DNA片段。而以非轉化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。
本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化青蒿的含AaORA 植物雙元干擾表達載體的根癌農桿菌菌株，利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉基因青蒿植株。轉基因青蒿植株的獲得為篩選獲得較高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。^MM 4、利用HPLC-ELSD測丨定轉某因青蒿中青蒿素含量
4. 1、HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標準溶液的配制HPLC 采用water alliance 2695系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相硅膠柱 (SymmetryShieldTM C18, 5 μ m, 250 X 4. 6mm, Waters)，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫300C，流速1. OmL/min,進樣量10 μ L，靈敏度(AUFS =1.0)，理論塔板數(shù)按青蒿素峰計算不低于2000。ELSD 采用water alliance M20系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)(gain)為7，載氣壓力^ar ；精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2. Omg用ImL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素標準品溶液，保存于_20°C備用。本發(fā)明中流動相為甲醇(methanol)水，比例為70% 30%時，青蒿素的保留時間為5. lmin，峰型良好。理論塔板數(shù)按青蒿素計算不低于2000。4. 2、標準曲線的制作將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2 μ 1，4 μ 1，6 μ 1，8 μ 1，10 μ 1記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X，μ g)進行回歸分析。通過研究，本發(fā)明中青蒿素在4-20 μ g范圍內呈現(xiàn)良好的log-log線性關系。青蒿素對照品的log-log 線性回歸方程為:Y = 1. 28e+000X+4. 71e+000, R = 0. 979546。4. 3、樣品的制備和青蒿素含量的測定在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鮮的青蒿葉片，于45°C烘箱中烘至恒重。然后從烘干的枝條上敲下葉和花蕾，磨成粉末。稱取約0. Ig干粉于2mL Eppendorf管中，力口入2mL乙醇，用40W超聲波處理30min，5000rpm離心lOmin，取上清用0. 22 μ m濾膜過濾，即可用于HPLC-ELSD測定青蒿素的含量。采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 μ 1，根據(jù)峰面積代入線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)，從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。轉AaORAi干擾載體的轉基因植株可顯著降低了青蒿中青蒿素含量。在非轉化普通青蒿含量為9. 30mg/g Dff時，同時期轉AaORAi干擾載體青蒿中青蒿素的含量平均達到 6. 31mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的0. 678倍。本實施例采用HPLC-ELSD法測定了轉基因青蒿中青蒿素含量，采用轉化AaORAi干擾載體代謝工程策略發(fā)現(xiàn)AaORA基因的表達與青蒿素的含量具有較為明顯的關系，為利用該基因進行過表達研究進而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的基礎資料。
權利要求
1.一種青蒿AaORA蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
2.一種編碼權利要求1所述青蒿AaORA蛋白的核酸序列。
3.如權利要求2所述的核酸序列，其特征在于，其堿基序列如(a) SEQ ID NO 5中第1 1101位所示，或者是(b)SEQ ID NO :5序列中第1 1101位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產生的序列。
4.一種植物干擾表達載體，其特征在于，包含如權利要求2所述的核酸序列。
5.一種根癌農桿菌菌株，其特征在于，包含如權利要求4所述的植物干擾表達載體。
6.一種轉基因青蒿植株的獲得方法，其特征在于，包括如下步驟(a)克隆權利要求2所述的核酸序列；(b)把所述核酸序列可操作性地連接于表達調控序列，得到植物干擾表達載體；(c)將植物干擾表達載體轉化根癌農桿菌EH105；(d)利用構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿植株，經(jīng)卡那霉素篩選得到抗性苗，再經(jīng)PCR 檢測為陽性的植株，即轉基因青蒿植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種青蒿AaORA蛋白及編碼基因、轉基因青蒿植株的獲得方法；所述青蒿AaORA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示；同時，本發(fā)明還涉及編碼青蒿AaORA蛋白的核酸序列、植物干擾表達載體、根癌農桿菌菌株以及一種轉基因青蒿植株的獲得方法。本發(fā)明從青蒿中克隆AaORA基因，構建含AaORA基因的植物干擾表達載體，用根癌農桿菌EH105介導，將AaORA基因干擾表達載體轉化青蒿；PCR檢測外源目的基因AaORA的整合情況，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量明顯降低的轉基因青蒿植株。
文檔編號C07K14/415GK102558325SQ201210006769
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權日2012年1月11日
發(fā)明者呂宗友, 唐克軒, 張凌, 張利達, 張芳源, 江偉民, 沈乾, 陸續(xù), 高爾娣 申請人:上海交通大學