專利名稱：根據(jù)蛋白質(zhì)-dna復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計新型tale的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及根據(jù)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計新型TALE的方法。
背景技術(shù)：
TALEs (Transcription Activator Like Effectors,轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子)是植物致病菌(Xanthomonas)細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)。當(dāng)病原菌侵染植株時，病菌會通過其自身的III型分泌系統(tǒng)將包括TALE在內(nèi)的一系列效應(yīng)分子注入到植物細(xì)胞內(nèi)。這些效應(yīng)分子通過影響宿主細(xì)胞的信號傳遞，基因表達(dá)等方式來協(xié)助病菌進(jìn)一步擴(kuò)增。TALE則是這些效應(yīng)分子中最大的一類，它像植物基因的轉(zhuǎn)錄激活子一樣行使功能。TALE家族蛋白一般由3個主要的功能結(jié)構(gòu)域組成，N端結(jié)構(gòu)域與TALE的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；C端具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和入核信號肽片段；位于TALE中部的區(qū)域是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但它的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域不同于其他已知的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它是由一段串聯(lián)的重復(fù)單元組成，大多數(shù)情況下每個重復(fù)單元由34個氨基酸組成，個別重復(fù)單元由33或35個氨基酸殘基組成。這34個氨基酸中除了第12，13位的氨基酸變化較大之外，其他氨基酸高度保守。這兩個不保守的氨基酸被命名為RVD (Repeat variable ^residue,重復(fù)可變雙殘基)。2009年的兩篇文章分別 通過實驗和生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)每個重復(fù)序列中12，13位的氨基酸和識別的核苷酸種類有特殊的對應(yīng)關(guān)系，比如:
權(quán)利要求
1.設(shè)計特異識別DNA的TALE蛋白的方法，包括以下步驟: 1)位于組裝單元第16、17位的殘基采用側(cè)鏈含有氫鍵受體基團(tuán)或堿性的氨基酸，例如Arg, Lys, His，Asn, Gln ； 2)位于組裝單元第12位的殘基采用側(cè)鏈含有氫鍵供體基團(tuán)，例如His，Asn，Gin,Ser’Thr, Tyr, Lys, Arg ； 3)對于堿基腺嘌呤A,組裝單元第13位的殘基選自Asn,Asp, Gin, Glu, Ser, Thr ； 4)對于堿基鳥嘌呤G,組裝單元第13位的殘基選自Asn,Gin, Asp, Glu, His, Lys, Arg,Ser, Thr ； 5)對于堿基胞卩密唳C,組裝單元第13位的殘基選自Asp,Asn, Glu, Gin, Ser, Thr, Tyr。
6)對于堿基胸腺嘧啶T，組裝單元第13位的殘基選自Gly，Ser,Ala ； 7)對于堿基5-甲基胞嘧啶5mC，組裝單元第13位的殘基選自Gly，Ser,Ala。
2.制備特異識別DNA的TALE蛋白的方法，包括以下步驟: 按照權(quán)利要求1的 方法設(shè)計所述蛋白，和對所述蛋白進(jìn)行表達(dá)。
3.融合蛋白，包含權(quán)利要求1或2中所述的TALE蛋白或其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求3的融合蛋白，其中所述TALE蛋白或其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N端或C端與熒光類蛋白、DNA水解酶或DNA-RNA雜合鏈水解酶(nuclease)、或任何靶向基因的轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)域(activation domain)融合。
5.對細(xì)胞生命過程進(jìn)行干涉的方法，包括利用權(quán)利要求1或2中所述的TALE蛋白或權(quán)利要求3或4的融合蛋白對特定基因表達(dá)進(jìn)行激活或抑制。
6.對細(xì)胞生命過程進(jìn)行干涉的方法，包括利用權(quán)利要求1或2中所述的TALE蛋白或權(quán)利要求3或4的融合蛋白對基因組中的特定基因進(jìn)行敲除、引入定點(diǎn)突變或插入新基因片段。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述DNA還包含修飾的DNA衍生物，包括但不限于甲基化喊基、輕甲基化喊基。
8.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述RNA還包含修飾的RNA衍生物，包括但不限于甲基化喊基、輕甲基化喊基。
9.權(quán)利要求5或6的方法，其用于抑制RNA病毒的復(fù)制。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述RNA病毒包括正鏈RNA，反鏈RNA等單鏈RNA病毒和雙鏈RNA病毒,例如HIV、流感病毒、丙肝病毒、腦灰質(zhì)炎病毒、腸胃炎病毒。
11.權(quán)利要求5或6的方法，其用于抑制哺乳動物中的腫瘤細(xì)胞增殖。
12.權(quán)利要求5或6的方法，其用于治療或預(yù)防由逆轉(zhuǎn)錄病毒感染引起的疾病或用于治療或預(yù)防腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及根據(jù)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計新型TALE的方法。本發(fā)明提供了設(shè)計特異識別DNA的TALE蛋白的方法。
文檔編號C07K14/195GK103193871SQ20121002101
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者顏寧, 施一公, 鄧東, 閆創(chuàng)業(yè) 申請人:清華大學(xué)