專利名稱：一種分離純化凝血因子viii的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液制品分離純化領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種分離純化凝血因子 VIII的方法。
背景技術(shù)：
VIII (FVIII)是一種重要的內(nèi)源性凝血因子，缺失VIII (FVIII)將導(dǎo)致無法治愈的甲型血友病(HA)。該疾病在世界范圍內(nèi)普遍存在，平均每5000個男性中就有I個患有此病(Singleton T,et al,Emergency Department Care for Patients with Hemophilia and Von Willebrand Disease, The Journal of Emergency Medicine,2010,39 (2) :158-165)。 HA傳統(tǒng)的治療方式是給患者輸注新鮮血液或補充富含F(xiàn)VIII的血漿制品，該法具有一定療效，但存在輸注量較大和病毒污染(HIV、HBV)等風(fēng)險，已經(jīng)逐漸被淘汰。已有研究者利用基因工程手段重組表達(dá)FVIII并用于血友病的治療，取得了一定的效果。但歐洲藥物評價署 (EMEA)的監(jiān)測結(jié)果表明，重組FVIII制品在治療過程存在引發(fā)患者免疫應(yīng)答的風(fēng)險(SFDA EMEA警告，重組人凝血因子VIII產(chǎn)生抗體的風(fēng)險，藥物警戒快訊，2006，3 (3) :187)。此外， 重組FVIII產(chǎn)品還存在生產(chǎn)成本高、藥物傳遞途經(jīng)有限等不利因素，導(dǎo)致迄今為止基因療法仍然無法普及(Hongzhi Z, et al, Bioengineering of coagulation factor VIII for improved secretion, Blood, 2004,103(9) :3412-3419)?，F(xiàn)階段，血友病的主流治療方式為注射血漿來源的、高純度的天然FVIII產(chǎn)品。血漿來源的FVIII的生產(chǎn)工藝大多以離子交換層析作為核心技術(shù)步驟。1991年法國的 Burnouf■等(Burnouf T B-R, et a, A highly purified factor VIII concentrate p repared from cryop recip itate by ion exchange chromatography,Vox Sang,1991, 60(1) :8-15)報道了使用陰離子交換劑DEAE-Fractogel TSK 650M制備高純度的FVIII濃制劑，操作簡單、方便。但該方法制備的FVIII溶解性不理想；衛(wèi)生部武漢生物制品研究所應(yīng)用一種改良的離子交換層析法分離高純度的FVIII，這一改良的Burnouf法快速簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)(鄒金森等，用改良的離子交換層析法分離高純度凝血因子FVIII，中國生物制品學(xué)雜志，1994，7 (2) :64-66，96)。成都生物制品研究所增加了進(jìn)樣前冷沉淀處理-酸洗沉淀，從人血漿冷沉淀中制備高純FVIII (羅亮等，離子交換層析法制備人高純FVIII制劑， 華西藥學(xué)雜志，2000,15 (3) :174-176)。Anita Mitico Tanaka 等(Anita Mitico Tanaka, et al,Purification of porcine plasma factor VIII using chromatographic methods, Biotechnology Letters, 2000, 22 :257-260)通過吸附、沉淀、兩步 Q-Sepharose FF 離子交換層析，從豬血漿中分離純化出高活性FVIII。目前FVIII產(chǎn)品的產(chǎn)量嚴(yán)重不足，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足血友病患者的需要，導(dǎo)致這種困境的主要原因是FVIII蛋白結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，分離純化難度極大，使用傳統(tǒng)的分離純化方法往往無法同時得到具有高凝血活性和高收率的FVIII產(chǎn)品。正常人血漿中的FVIII是以其和von Willebrand因子(VWF)形成的復(fù)合體形式存在的(TERRAUBE V, et al, Factor VIII and von Willebrand factor interaction biological,clinical and therapeuticimportance, Haemophilia 2010,16, 3-13), VffF 作為 FVIII 的載體蛋白，在凝血過程中起到了非常重要的作用。而在現(xiàn)有的分離純化過程特別是離子交換層析中，大分子蛋白復(fù)合體容易解離，從而影響最終產(chǎn)品的活性(Zhou WB, et al, Ion-exchange chromatography of hepatitis B virus surface antigen from a recombinant Chinese hamster ovary cell line,Journal of Chromatography A 2005,1095,119-125);此外，離子交換層析是純化FVIII的關(guān)鍵步驟，由于FVIII的半衰期較短，現(xiàn)有離子交換純化操作時間過長，這一步驟導(dǎo)致大量的產(chǎn)品活性損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為了克服上述問題提供了一種分離純化凝血因子VIII的方法。根據(jù)本發(fā)明的分離純化凝血因子VIII的方法，所述方法采用超大孔離子交換層析分離含有凝血因子VIII的層析原料。根據(jù)本發(fā)明的分離純化凝血因子VIII的方法具體的包括如下步驟(I)以血漿或含有FVIII的血漿組分為原料進(jìn)行超大孔離子交換層析分離，獲得高活性的FVIII產(chǎn)品；或者(I)將血漿或含有FVIII的血漿組分進(jìn)行粗分離處理，得到含有FVIII的粗分離樣品;(2)以含有FVIII的粗分離樣品為原料進(jìn)行超大孔離子交換層析分離，獲得高活性的FVIII產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的分離純化凝血因子VIII的方法，其中，所述的層析原料為不同含 FVIII的組分，層析原料為血液、血漿或血漿組分，所述血液為人血或動物血，所述血漿為人血衆(zhòng)或動物血衆(zhòng)，所述血衆(zhòng)組分為人Cohn沉淀組分I、動物Cohn沉淀組分I、人血衆(zhòng)冷沉淀或動物血衆(zhòng)冷沉淀。根據(jù)本發(fā)明的分離純化凝血因子VIII的方法，其中，為了減輕后續(xù)超大孔層析分離的壓力，可以對血漿或含有FVIII的血漿組分進(jìn)行粗分離。具體方法為凝膠過濾層析將血漿或含有FVIII的血漿組分進(jìn)料到分離范圍適宜的凝膠過濾柱中，并使用20mM檸檬酸緩沖液+0. 15M Na2SO4作為運行緩沖液進(jìn)行洗脫，收集分子量大于100KD的流分，得到含有FVIII的血漿組分，其中，分離范圍適宜的凝膠過濾柱包括 Superdex 200 柱、Sephacryl S-300 柱、Sephacryl S-400 柱、Sephacryl S-500 柱、 Sepharose 6FF 柱、Sepharose 4FF 柱、Sepharose CL-4B 柱、Sepharose CL-6B 柱、Superose 6柱，但本發(fā)明的保護(hù)不局限于此；或者PEG沉淀將血漿或含有FVIII的血漿組分調(diào)節(jié)pH到5. O到9. O,優(yōu)選pH為6. O 到8. 0，并向其中加入5-20%的PEG，混勻后，靜置2小時，離心得到含有FVIII的沉淀并進(jìn)行復(fù)溶得到含有FVIII的粗分離樣品；或者硫酸銨沉淀將血漿或含有FVIII的血漿組分調(diào)節(jié)pH到5. O到9. 0，優(yōu)選pH為6. O 到8. 0，并向其中加入5-20%的硫酸銨粉末，混勻后，靜置2小時，離心得到含有FVIII的沉淀并進(jìn)行復(fù)溶得到含有FVIII的粗分離樣品；或者
超濾法調(diào)節(jié)血漿或含有FVIII的血漿組分pH值到5.0-10.0，優(yōu)選pH值為 6. 0-8. 0，優(yōu)選采用截留分子量100-1000KD的超濾膜超濾，收集保留液，得到含有FVIII的粗分離組分，其中，超濾膜截留分子量越大，去除雜蛋白效率越高，但FVIII的回收率較低。根據(jù)本發(fā)明的分離純化凝血因子VIII的方法，其中，所述的超大孔離子交換層析，具體方法為將血漿或含有FVIII的血漿組分或含有FVIII的粗分離組分調(diào)節(jié)pH到5. 0-10. 0， 優(yōu)選PH值為6. 0-8. 0 ;根據(jù)樣品類型選擇合適的超大孔離子交換層析介質(zhì)、進(jìn)樣量和進(jìn)樣速度，將樣品進(jìn)樣到用平衡緩沖液平衡好的超大孔離子交換層析柱中，層析過程使用280nm 紫外吸收波長進(jìn)行蛋白檢測，進(jìn)樣的樣品體積為0. 5-10. 0倍層析柱體積，優(yōu)選為I. 0-3. 0 倍層析柱體積；使用含有0. 15-0. 4M NaCl的緩沖液洗脫雜質(zhì)流分，使用含有0. 3-0. 8M NaCl的緩沖液洗脫含有FVIII的流分，使用含有0. 7-2M NaCl的緩沖液洗脫強保留流分； 收集含有FVIII的流分。作為優(yōu)選，所述超大孔離子交換層析中，介質(zhì)選擇可以聚合的材料為基質(zhì)，所述的材料可為乙烯類、苯乙烯類、甲基丙烯酸類、甲基丙烯酸酯類、(甲基)聚丙烯酰胺類、環(huán)氧類、乙酸乙烯酯類以及它們的混合物；作為優(yōu)選，所述超大孔離子交換層析中，介質(zhì)選擇與FVIII存在靜電相互作用的分子作為配基，該介質(zhì)表面的電荷基團(tuán)為季銨化聚乙烯亞胺(HQ)或聚乙烯亞胺(PI)或N， N-二乙基氨基乙基(DEAE)或羧甲基(CM)或N，N-二乙基氨基-2-羥丙基(QAE)或季胺(Q) 或磺丙基(SP)；作為優(yōu)選，所述超大孔離子交換層析中，介質(zhì)選擇親水性化合物作為表面改性物質(zhì)，所述的表面改性物質(zhì)包括多糖類化合物如瓊脂糖或葡聚糖或羥乙基纖維素或羧甲基支鏈淀粉、多醇類化合物如聚乙二醇或聚乙烯醇。作為優(yōu)選，所述超大孔離子交換層析中，介質(zhì)孔徑選擇適于FVIII及FVIII-VWF聚集體進(jìn)出的范圍。所述的孔徑范圍為200nm到60 y m ;作為優(yōu)選，所述超大孔離子交換層析中，緩沖液體系可采用磷酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、檸檬酸緩沖液，優(yōu)選為檸檬酸緩緩沖液；平衡緩沖液為20-100mM， pH 6. 0-8. 0的檸檬酸緩緩沖液；洗脫緩沖液為上述平衡緩沖液另加2MNaCl ；作為優(yōu)選，所述超大孔離子交換層析中，所使用的無因次流速范圍為0.002
0.02s-1 ;其中，所述超大孔離子交換層析中，緩沖液體系可以加入保護(hù)劑以保護(hù)FVIII和 FVIII-VWF聚集體的凝血活性，所加保護(hù)劑可為Gly、CaCl2, HSA，但本發(fā)明的保護(hù)不局限于此。在現(xiàn)有技術(shù)中由于離子交換層析依賴層析介質(zhì)的作用，F(xiàn)VIII和VWF復(fù)合體的解離及過長的層析時間導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活，從而影響最終產(chǎn)品的活性和收率，在本發(fā)明中為了解決該問題，發(fā)明人選用不同的層析介質(zhì)。常規(guī)離子交換介質(zhì)的孔徑較小(5 30nm) (Djuro J, et al, Size-exclusion chromatography of plasma proteins with high molecular masses, Journal of Chromatography A, 796 (1998) 289-298),而蛋白質(zhì)分子較大，有些蛋白尺寸達(dá)到20nm，F(xiàn)VIII和VWF復(fù)合物尺寸也超過了 10nm，這些大蛋白在這些離子交換孔道中的傳遞速率較低，分離操作耗時較長，由于FVIII半衰期很短，過長的分離純化時間會導(dǎo)致FVI11終產(chǎn)品活性較低。同時由于FVIII和VWF復(fù)合物尺寸接近孔道尺寸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和固相表面的作用機會增加，蛋白質(zhì)復(fù)合體容易在固相表面的吸附作用下解離， 從而進(jìn)一步影響FVIII產(chǎn)品的活性。為了解決這些問題，使分離得到的凝血因子VIII產(chǎn)品同時具有高凝血活性和高收率，在本發(fā)明中選用超大孔離子交換層析介質(zhì)取代常規(guī)的離子交換層析介質(zhì)，設(shè)計了新型離子交換分離純化工藝，在本發(fā)明中所選用的超大孔層析介質(zhì)的孔道尺寸可達(dá)600 800nm，F(xiàn)VIII-VWF復(fù)合體蛋白可以快速、便利地進(jìn)入介質(zhì)孔道，從而實現(xiàn)高通量、快速分離純化(Tingyue Gu, et al, Rigid gigaporous chromatographic media and their potential impact on downstream processing, CHINA PARTICU0L0GY, 2005,3(6) :349-353),同時最大限度地保護(hù)聚集體的天然結(jié)構(gòu)，最終得到活性較高的 FVIII產(chǎn)品。本發(fā)明所述方法中FVIII層析回收率穩(wěn)定高達(dá)85%左右，比活高達(dá)154IU/mg 蛋白，工藝穩(wěn)定，易于放大，而現(xiàn)有技術(shù)中FVIII層析回收率穩(wěn)定一般為25%左右，比活為 20-50IU/mg蛋白，因此相對于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明的方法取得了意想不到的技術(shù)效果。


圖I為超大孔離子交換層析分離純化FVIII的色譜圖；圖2為SDS-PAGE鑒定FVIII非還原性圖譜，M為分子量Marker，1-4分別為超大孔離子交換層析100% B、50% B、30% B、20% B濃度梯度洗脫峰，其中，50% B為目標(biāo)洗脫峰即FVIII組分。
具體實施例方式本發(fā)明的方法通過以下實施例進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例I取冰凍保存的健康人血漿在37°C水浴融化，并不斷震蕩使FVIII等充分溶解，完全溶解后進(jìn)樣40mL到用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣的檸檬酸鹽緩沖液平衡好的P0R0S 50HQ離子交換層析柱中，柱內(nèi)徑2. 6厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，無因次流速0. 02S—1，進(jìn)樣完畢后用上述檸檬酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM 氯化鈣和IM氯化鈉的檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，濃度梯度分別為20%、30%、50%和 100%，每個梯度洗脫兩個柱體積，并收集50%梯度的洗脫峰35mL，蛋白濃度為0. 73g/L，比活為139. 56IU/mg,活性回收率為79. 44%。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定純度(銀染法)，由附圖 2可見50% B目標(biāo)洗脫峰在相應(yīng)位置清晰的VWF和FVIII條帶。實施例2取健康人血漿Cohn沉淀所得組分I在37°C水浴融化，并不斷震蕩使FVIII等充分溶解，完全溶解后進(jìn)樣20mL到用20mM，pH7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣的檸檬酸鹽緩沖液平衡好的二乙胺-聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-二乙烯基苯-三聚異氰尿酸三烯丙酯) 型陰離子交換層析柱中，柱內(nèi)徑2. 6厘米,柱床高度5厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，無因次流速0. OIS—1，上樣完畢后用上述檸檬酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣和 IM氯化鈉的檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，濃度梯度分別為25%、60%和100%，每個梯度洗脫兩個柱體積，并收集60%梯度洗脫峰39mL，蛋白濃度為0. 43g/L，比活為65. 94IU/mg,活性回收率為85. 44%。實施例3取3g健康人血漿冷沉淀用50ml 20mM, pH7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣的檸檬酸鹽緩沖液溶解，取40mL溶解液進(jìn)樣到用上述檸檬酸鹽緩沖液平衡好的P0R0S50Q離子交換層析柱中，柱內(nèi)徑2. 6厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外 280nm波長吸收檢測，無因次流速0. OOSS'上樣完畢后用上述檸檬酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至 280nm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣和IM氯化鈉的檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，濃度梯度分別為35^^55%和100%，每個梯度洗脫兩個柱體積，并收集50%梯度洗脫峰33mL，蛋白濃度為0. 57g/L，比活為88. 79IU/mg，活性回收率為 80. 19%。實施例4取冰凍保存的健康豬血漿在37°C水浴融化，并不斷震蕩使FVIII等充分溶解，完全溶解后進(jìn)樣40mL到用20mM，pH6. 6含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣的磷酸鹽緩沖液平衡好的POROS 20QE離子交換層析柱中，柱內(nèi)徑I. 6厘米，柱床高度10厘米，層析設(shè)備GE AKTA ExplorerlOO，紫外280nm波長吸收檢測，無因次流速0. OOSS'上樣完畢后用上述檸檬酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH6. 6含120mM甘氨酸、ImM 氯化鈣、IM氯化鈉和1% HSA的磷酸鹽鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，濃度梯度分別為33%、70% 和100%，每個梯度洗脫兩個柱體積，并收集目標(biāo)洗脫峰40mL，蛋白濃度為1.03g/L，比活為 74. 99IU/mg，活性回收率為85. 32%。取離子交換層析目標(biāo)洗脫峰30mL進(jìn)樣到用20mM，pH 7. 4含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 200凝膠過濾層析柱中，柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米， 層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，流速0. 5mL/min，上樣完畢后繼續(xù)用20mM，pH 7. 4含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗，收集80mL處的蛋白峰共50mL， 蛋白濃度為0. 22g/L，比活為148IU/mg，活性回收率為70. 26%。實施例5取冷凍保存的健康人血漿于4°C冰箱靜約24h后，3800r/min離心25min得冷沉淀。將3g冷沉淀用50ml 20mM, pH8. 0含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液溶解，取4mL溶解液進(jìn)樣到用上述檸檬酸鹽緩沖液平衡好的P0R0S50HS離子交換層析柱中，柱內(nèi)徑I厘米，柱床高度5厘米,層析設(shè)備GE AKTA ExplorerlOO,紫外280nm波長吸收檢測，無因次流速0. OieS'上樣完畢后用上述檸檬酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH8. 0含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣、IM氯化鈉的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，濃度梯度分別為20 %、30 %、50 %，每個梯度洗脫兩個柱體積，并收集50%洗脫峰41mL，蛋白濃度為0. 45g/L，比活為80. 39IU/mg，活性回收率為 93. 58%。對比實施例I取冰凍保存的健康人血漿在37°C水浴融化，并不斷震蕩使FVIII等充分溶解，完全溶解后進(jìn)樣40mL到用20mM，pH 7. 5含120mM甘氨酸、ImM氯化鈣的檸檬酸鹽緩沖液平衡好的Q Sepharose FF離子交換層析柱中，柱內(nèi)徑2. 6厘米,柱床高度10厘米,層析設(shè)備 GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波長吸收檢測，無因次流速0. 02S—1，進(jìn)樣完畢后用上述檸檬酸鹽緩沖液繼續(xù)沖洗至280nm紫外吸收信號回到基線，再用20mM，pH 7. 5含120mM 甘氨酸、ImM氯化鈣和IM氯化鈉的檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，濃度梯度分別為20%、 30 %、50 %和100 %，每個梯度洗脫兩個柱體積，并收集50 %梯度的洗脫峰35mL，蛋白濃度為I. 23g/L，比活為27. 32IU/mg，活性回收率為26. 2%0通過本發(fā)明所述FVIII層析方法的回收率穩(wěn)定高達(dá)85%左右，比活高達(dá)154IU/mg 蛋白，工藝穩(wěn)定，易于放大，而現(xiàn)有技術(shù)中FVIII層析回收率穩(wěn)定一般為25%左右，比活為 20-50IU/mg蛋白，因此相對于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明的方法取得了意想不到的技術(shù)效果。
權(quán)利要求
1.一種分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述方法采用超大孔離子交換層析分離含有凝血因子VIII的層析原料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述方法還包括在超大孔離子交換層析分離前進(jìn)行粗分離處理的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述粗分離處理的方法為凝膠過濾層析血漿或含有凝血因子VIII的血漿組分進(jìn)料到凝膠過濾柱中，收集分子量大于100，000的流分，得到含有凝血因子VIII的血漿組分；或PEG沉淀血漿或含有凝血因子VIII的血漿組分中加入5-20%的PEG，混勻后，靜置2 小時，離心得到含有凝血因子VIII的沉淀并進(jìn)行復(fù)溶得到含有凝血因子VIII的粗分離樣品；或硫酸銨沉淀血漿或含有凝血因子VIII的血漿組分中加入5-20%的硫酸銨粉末，混勻后，靜置2小時，離心得到含有凝血因子VIII的沉淀并進(jìn)行復(fù)溶得到含有凝血因子VIII的粗分離樣品；或超濾調(diào)節(jié)血漿或含有凝血因子VIII的血漿組分pH值為5. 0-10. O,采用截留分子量 100-1000KD的超濾膜超濾，收集濃縮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述含有凝血因子VIII的層析原料為血液、血漿或血漿組分，所述血液為人血或動物血，所述血衆(zhòng)為人血衆(zhòng)或動物血衆(zhòng)，所述血衆(zhòng)組分為人Cohn沉淀組分I、動物Cohn沉淀組分I、人血楽； 冷沉淀、動物血漿冷沉淀、PEG沉淀FVIII組分或甘氨酸沉淀FVIII組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述血漿為人血衆(zhòng)，血液組分人Cohn沉淀組分I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述超大孔離子交換層析的介質(zhì)為多孔固相介質(zhì)，孔徑范圍為100-2000nm，孔隙率為10-90%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述的多孔固相介質(zhì)的孔徑范圍為200-1000nm，孔隙率為50-90 %。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述超大孔離子交換層析的介質(zhì)為圓柱形，該圓柱形介質(zhì)為整體柱，直徑范圍為lO-lOOOmm，高度范圍為1Q-SOOOmm ;或所述超大孔離子交換層析的介質(zhì)為顆粒，該顆粒為球形顆粒，直徑范圍為3-2000 μ m。
9.根據(jù)權(quán)利要8所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述球形顆粒直徑范圍為20-500 μ m。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、5或7所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述超大孔離子交換層析的介質(zhì)表面材料為多糖類化合物或多醇類化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述多糖類化合物為瓊脂糖、葡聚糖、羥乙基纖維素或羧甲基支鏈淀粉，所述多醇類化合物為聚乙二醇或聚乙烯醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、5或7所述的分離純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述超大孔離子交換層析的介質(zhì)表面電荷基團(tuán)為季銨化聚乙烯亞胺或聚乙烯亞胺或N，N- 二乙基氨基乙基或羧甲基或N，N- 二乙基氨基-2-羥丙基或季胺或磺丙基。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，其特征在于，所述超大孔離子交換層析中所使用的無因次流速為O. 002 O. 02sP'
全文摘要
本發(fā)明涉及血液制品分離純化領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種分離純化凝血因子VIII的方法。所述方法采用超大孔離子交換層析分離含有凝血因子VIII的層析原料，所述方法還包括在超大孔離子交換層析分離前進(jìn)行粗分離處理的步驟。本發(fā)明所述方法中FVIII層析回收率穩(wěn)定高達(dá)85％左右，比活高達(dá)154IU/mg蛋白，工藝穩(wěn)定，易于放大，而現(xiàn)有技術(shù)中FVIII層析回收率穩(wěn)定一般為25％左右，比活為20-50IU/mg蛋白，因此相對于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明的方法取得了意想不到的技術(shù)效果。
文檔編號C07K1/30GK102584983SQ20121002220
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月1日
發(fā)明者康麗梅, 張焱, 羅堅, 蘇志國, 馬光輝 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所