專利名稱：一種胸腺素α1及其類似物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多肽固相合成及純化技術(shù)領(lǐng)域,具體而言,涉及到Tricyclic amidelinker resin樹脂和C端為Asn的多肽，尤其是胸腺素α I及其類似物的固相合成工藝。
背景技術(shù)：
胸腺素a I (Thymosin alphal，T α I)是從胸腺素組分5 (TF5)中分離純化出的，由28個(gè)氨基酸殘基組成的酸性多肽，不含蛋氨酸、半胱氨酸和芳香族氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為3108，pi值為4.2，N末端乙?；鋵?duì)活性影響不顯著，其序列為Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1Ie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
胸腺素α I是由胸腺分泌的免疫功能較強(qiáng)的小分子多肽，在體內(nèi)外試驗(yàn)中，胸腺素α I對(duì)細(xì)胞因子的分泌、淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及淋巴細(xì)胞功能均有影響，在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用，被認(rèn)為是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，臨床上亦已廣泛應(yīng)用于乙型肝炎、丙型肝炎、腫瘤以及免疫功能低下等疾病的治療。采用化學(xué)方法合成的N-乙?；叵偎卅?I已經(jīng)上市，是1997年由意大利賽生(Sciclone)公司開發(fā)的，商品名為“日達(dá)仙”，用于治療病毒性肝炎等，療效顯著。在固相合成法中，2008年I月16日公布的中國(guó)專利(CN101104638A)公開了一種固相合成胸腺素α I的工藝，它以Fmoc-Rink Amide MBHA樹脂為載體，利用Asp側(cè)鏈羧基與樹脂氨基相連接從而使切割后形成Asn的方法；2008年4月23日公布的中國(guó)專利(CN101166761A)公開了以PEG樹脂固相合成胸腺素及其類似物的方法；2009年7月5日，BCN肽類股份有限公司的專利申請(qǐng)CN101484467A公開了以假脯氨酸二肽的形式固相合成的胸腺素；在“化學(xué)學(xué)報(bào)”2004年第55卷第2期胸腺素α I的DIC固相化學(xué)合成與鑒定’中提到，以Wang樹脂為起始載體，通過活化試劑DIC+HOBt將Fmoc-Asn (Trt) -OH與樹脂相連接。除了化學(xué)合成法，還可以采用生物合成技術(shù)，在2010年6月16號(hào)公布的中國(guó)發(fā)明專利(CN101736008A)公開了一種基因工程制備N-乙?；叵偎卅?I的方法。綜合參考國(guó)內(nèi)外關(guān)于胸腺素α I制備專利以及相關(guān)的合成報(bào)道文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其在技術(shù)上主要存在固相合成收率低，純度低等缺點(diǎn)，從而不能用于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有高收率且有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的胸腺素α I及類似物的制備工藝。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:一種制備胸腺素α I及類似物的固相合成及純化方法，包括如下步驟:I)以Tricyclic amide linker resin樹脂為載體,將該樹脂脫去Fmoc保護(hù)基；2)用偶聯(lián)劑將Fmoc-Asp-Y的側(cè)鏈羧基與上述脫保護(hù)的Tricyclic amide linkerresin樹脂的氨基連接,并用乙酰化試劑優(yōu)選Ac2O和DIPEA進(jìn)行封閉處理,其中Fmoc-Asp-Y中的Y為羧基保護(hù)基；3)將步驟2)中所得產(chǎn)物脫Fmoc保護(hù)后，加入Fmoc-AA-Y形式的氨基酸和偶聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)，其中Fmoc-AA-Y中的AA為氨基酸；4)根據(jù)目標(biāo)合成序列重復(fù)進(jìn)行步驟3)以依次偶聯(lián)氨基酸；5)將步驟4)中所得產(chǎn)物用乙酰化試劑優(yōu)選Ac2O和DIPEA進(jìn)行乙酰化處理；6)將步驟5)中所得產(chǎn)物用裂解試劑進(jìn)行切割得到粗肽；7)用沉淀劑優(yōu)選乙醚沉淀步驟6)中所得粗肽；8)用HPLC制備分離粗肽得到純品。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟I)中所述Fmoc保護(hù)基是通過20%哌啶/80% DMF或者2%哌啶/2% DBU/96% DMF處理來除去。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟2)中所述羧基保護(hù)基Y為OtBu、ODmab或者OAlI。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟2)中所述的偶聯(lián)劑為DIC+A或B+A+有機(jī)堿，其中A為HOBt,HOAt 或者 Cl-HOBt ；B 為 HBTU、HATU、HCTU 或者 PyBOP ;有機(jī)堿為 NMM、DIPEA 或者 TMP。步驟2)中乙?；^程為以10 % Ac2O和10 % DIPEA的DMF溶液在室溫下反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)中所述Fmoc-AA-Y形式的氨基酸衍生物選自 Fmoc-Asp-Y,其中 Y 為 OtBu、ODmab 或者 OAll ;Fmoc_Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr (tBu) -0H> Fmoc-1le-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
·
在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟6)中裂解試劑以TFA為主要組分并含有適合的捕獲齊 ，裂解切割在室溫下反應(yīng)，用乙醚沉淀粗肽。優(yōu)選地，所述捕獲劑選自水，三甲基硅烷和1，2-乙_■硫醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)和脫保護(hù)過程中每一步都經(jīng)過Kaiser Test檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述HPLC為制備型RP-HPLC。與已有的胸腺素α I合成方法相比，本發(fā)明胸腺素α I的制備工藝具有以下優(yōu)
占-
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1.米用了 Ramage，Tricyclic amide linker 類型樹脂,(Lit.R.Ramage et al.,Tetrahedron Lett.34,6599,1993)，附圖1 為 Ramage，Tricyclic amide linker 結(jié)構(gòu)以及幾種此類型的樹脂。該樹脂的linker中含有二苯并環(huán)庚烯結(jié)構(gòu)，非常適合用于以Fmoc策略(E.ATHERTON,R.C.SHEPPARD,Sold Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach.1RL Press, Oxford, 1989)制備酰胺肽末端，尤其是C末端為Phe，Tyr和lie時(shí)。切割時(shí)采用50% TFA的二氯甲烷或95% TFA均可，適當(dāng)加入捕獲劑。實(shí)驗(yàn)證明，利用此類樹脂為載體的固相合成工藝，可以有效減少固相合成工藝過程中偶聯(lián)的困難度，同時(shí)增加粗肽收率及純度。2.采取了側(cè)鏈錨定策略，以Fmoc-Asp-Y為C末端氨基酸代替Asn末端氨基酸，利用Asp側(cè)鏈羧基與氨基功能樹脂相連有很多優(yōu)點(diǎn):(I)把第一個(gè)氨基酸通過形成酰胺鍵的方式連接到樹脂上有很高的收率，同時(shí)使用的激活劑也可以和以后形成肽鍵所用的試劑相同。此外，把Asn衍生物連接到Wang樹脂上存在著收率低，消旋風(fēng)險(xiǎn)高，如果側(cè)鏈不保護(hù)還有形成β -氰基丙氨酸的可能；(2)側(cè)鏈錨定策略只涉及到t-Bu等類型的保護(hù)基(t-Bu酯可以保護(hù)第一個(gè)殘基的α -羧基，Asp和Asn的ω -羧基以及Ser和Thr的側(cè)鏈羥基)，這樣最后的切割時(shí)僅使用簡(jiǎn)單的捕獲劑如H2O即可。然而,如果使用Asn衍生物如Trt、Xan或Tmob等就需要額外的捕獲劑；(3)在肽主鏈中少了一個(gè)酰胺鍵，從而減少了氫鍵的形成以及分子內(nèi)肽鏈聚集的可能；(4)可以改變肽鏈在樹脂上的空間位置，使肽鏈更具靈活性，從而有利于后面的氨基酸順利連接。本發(fā)明采用Asp的側(cè)鏈羧基與Tricyclic amide linker resin樹脂相連可以使收率大幅度的提高，降低了生產(chǎn)成本，有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為Ramage’ Tricyclic amide linker結(jié)構(gòu)以及幾種此類型的樹脂。圖2是本發(fā)明總的工藝流程圖。圖3為胸腺素α I粗肽、純品HPLC圖譜，以及質(zhì)譜圖。圖4為利用Rink amide MBHA resin合成的胸腺素α I粗肽及純品圖譜，以及質(zhì)譜圖。圖5為胸腺素α I類似物粗肽、純品HPLC圖譜，以及質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明:說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義列如表I所示: 表I縮略詞表
權(quán)利要求
1.一種胸腺素α I及其類似物的固相合成及純化方法，包括以下步驟: 1)以Tricyclicamide linker resin樹脂為載體,將該樹脂脫去Fmoc保護(hù)基； 2)用偶聯(lián)劑將Fmoc-Asp-Y的側(cè)鏈羧基與上述脫保護(hù)的Tricyclicamide linkerresin樹脂的氨基連接,并用乙?；噭﹥?yōu)選Ac2O和DIPEA進(jìn)行封閉處理,其中Fmoc-Asp-Y中的Y為羧基保護(hù)基； 3)將步驟2)中所得產(chǎn)物脫Fmoc保護(hù)后，加入Fmoc-AA-Y形式的氨基酸和偶聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng),其中Fmoc-AA-Y中的AA為氨基酸； 4)根據(jù)目標(biāo)合成序列重復(fù)進(jìn)行步驟3)以依次偶聯(lián)氨基酸； 5)將步驟4)中所得產(chǎn)物用乙?；噭﹥?yōu)選Ac2O和DIPEA進(jìn)行乙?；幚?； 6)將步驟5)中所得產(chǎn)物用裂解試劑進(jìn)行切割得到粗肽； 7)用沉淀劑優(yōu)選乙醚沉淀步驟6)中所得粗肽； 8)用HPLC制備分離粗肽得到純品。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)中所述Fmoc保護(hù)基是通過20%哌啶/80% DMF或者2%哌啶11% DBU/96% DMF處理來除去。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2)中所述羧基保護(hù)基Y為OtBiuODmab或者OAlI。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述的偶聯(lián)劑為DIC+A或B+A+有機(jī)堿，其中 A 為 H0Bt、H0At 或者 Cl-HOBt ；B 為 HBTU、HATU、HCTU 或者 PyBOP ;有機(jī)堿為 NMM、DIPEA 或者 TMP。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)中乙?；^程為以10%Ac2O和10%DIPEA的DMF溶液在室溫下反應(yīng)。
6.權(quán)利要求1所 述的方法，其特征在于:步驟3)中所述Fmoc-AA-Y形式的氨基酸衍生物選自 Fmoc-Asp-Y,其中 Y 為 OtBu、ODmab 或者 OAll ;Fmoc_Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟6)裂解試劑以TFA為主要組分并含有適合的捕獲劑，裂解切割在室溫下反應(yīng)，用乙醚沉淀粗肽。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述捕獲劑選自水，三甲基硅烷和1，2_乙二硫醇。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述偶聯(lián)和脫保護(hù)過程中每一步都經(jīng)過Kaiser Test 檢測(cè)。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HPLC為制備型RP-HPLC。
全文摘要
本發(fā)明公開一種胸腺素α1及其類似物的固相合成及純化工藝，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，屬于多肽合成技術(shù)領(lǐng)域。工藝包括以下幾個(gè)步驟1)以Tricyclic amide linker resin樹脂為載體；2)將該樹脂脫Fmoc保護(hù)后，將Fmoc-Asp-Y的側(cè)鏈羧基與樹脂氨基連接；3)采用Fmoc策略依次固相合成剩余氨基酸；4)去掉N末端氨基酸Fmoc保護(hù)基后用Ac2O，DIPEA的DMF溶液乙?；疦末端氨基；5)采用裂解試劑切割得到粗肽并用乙醚沉淀粗肽；6)粗肽經(jīng)HPLC制備分離得到純品。
文檔編號(hào)C07K14/575GK103242443SQ20121002536
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者王麗鳳, 殷玉和, 李紀(jì)龍, 代麗萍 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春百克生物科技股份公司