專利名稱：從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取喜樹堿和9-羥甲基喜樹堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物提取領(lǐng)域，尤其是一種采用萃取技術(shù)從天然藥用植物臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取喜樹堿和9-羥甲基喜樹堿兩種植物抗癌藥物的方法。
背景技術(shù)：
喜樹堿是一種植物抗癌藥物，對腸胃道和頭頸部癌等有較好的近期療效。傳統(tǒng)的喜樹堿是從我國中南、西南的喜樹的果實與根皮中提取得到的。然后喜樹堿在喜樹中的含量極低，單靠從喜樹中提取顯然無法滿足喜樹堿的應(yīng)用需求。1976年，中國化學家高怡生等成功合成了消旋喜樹堿，開啟了國內(nèi)人工合成喜樹堿的新紀元。之后，又陸續(xù)有科學家們改進了喜樹堿人工合成的方法。然而人工合成的喜樹堿畢竟不是天然的，生產(chǎn)工藝與成本也較高，使得人工合成方法根本無法推廣。臭馬比木是一種運用高科技手段在廣東省境內(nèi)人工種植的藥用植物，國外有文獻 (phytochemry, 1972)報道了該植物中含有喜樹堿,并且其含量高達萬分之二點五。這為喜樹堿的人工提取帶來了利好消息。2008年，公開號為CN101289452A公開了一種從臭馬比木中提取喜樹堿的方法，該方法采用萃取技術(shù)，從臭馬比木的枝葉中提取了高純度喜樹堿。 但該方法采用傳統(tǒng)的提取手段，其產(chǎn)量仍然有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
為克服傳統(tǒng)喜樹堿提取量低的缺陷，本發(fā)明提供一種先利用微生物發(fā)酵再進行高純度喜樹堿和9-羥甲基喜樹堿提取的方法。該方法能夠極大提高馬比木嫩葉和嫩枝中的喜樹喊含量，從而提聞喜樹喊的得率。本發(fā)明提供一種從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取喜樹堿的方法，其步驟包括
(1)預處理選取新鮮的臭馬比木嫩葉和嫩枝，干燥后研磨成粉末；
(2)發(fā)酵按酶料比1.5:1 (w/w)加入發(fā)酵液，發(fā)酵廣3天；發(fā)酵溫度為2(T37°C ；
所述發(fā)酵液為安琪高糖干酵母或發(fā)利干酵母，其濃度為廣11%。(w/w)；
(3)提取在發(fā)酵產(chǎn)物中按O.5^3 l(w/w)的比例加入提取液，加熱提取；所述提取液為濃度為1(Γ90%的乙醇溶液；所述加熱提取的溫度控制在4(T75°C之間。(4)過濾濾取上清液，即得提取液；
(5)濃縮在上述提取液中加入O. 5^10% (W/V)的二氧化硫和硫酸亞鐵(抗氧化劑)，濃縮，得濃縮物；
(6 )萃取在濃縮物中加入萃取劑對濃縮物進行萃取，并回收萃取劑，得到萃取濃縮物， 所述萃取劑為石油醚或二氯甲烷；
(7)、純化在萃取濃縮物中加入109Γ90%的丙酮溶液，先采用硅膠柱層析，初步結(jié)晶度達到70%左右；再進行低壓柱層柱，結(jié)晶純度達到80%左右；再采用FLASH中壓柱層析，收集洗脫液，其結(jié)晶純度達到95%左右；最后進行重結(jié)晶，得到純度為99%成品。
所述的重結(jié)晶是在洗脫液中按3 2 6的比例加入甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺(w/ w)進行重結(jié)晶，收集結(jié)晶體涼干，即得到純度達99%的喜樹堿。本發(fā)明又提供了一種從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取9-羥甲基喜樹堿的方法， 其步驟包括
(1)預處理選取新鮮的臭馬比木嫩葉和嫩枝，干燥后研磨成粉末；
(2)發(fā)酵按酶料比I.5 1加入發(fā)酵液，發(fā)酵f 3天；發(fā)酵溫度為2(T37°C，所述發(fā)酵液為安琪高糖干酵母或發(fā)利干酵母，其濃度為廣11%。(w/w)；
(3)提取在發(fā)酵產(chǎn)物中加入提取液，加熱提?。凰鎏崛∫簽橐掖既芤?，其濃度為 10 90%，所述加熱提取，溫度控制在4(T75°C之間；
(4)濃縮在上述提取液中加入O.5^10%的二氧化硫和硫酸亞鐵(抗氧化劑)，濃縮，得濃縮浸膏；
(5 )萃取在濃縮物中加入萃取劑對濃縮物進行萃取，并回收萃取劑，得到萃取濃縮物。 所述萃取劑為石油醚或二氯甲烷；
(6)分離在萃取濃縮物中加入丙酮溶液，攪拌均勻后靜置12 48小時，抽濾，保留濾液與濾餅；將濾餅用丙酮或乙酸乙酷或氯代甲烷溶解，攪伴后再次抽濾，回收濾液，兩次濾液混合，得到的濾液為含9-羥甲氫基喜樹堿的粗品；
(7)純化將9-羥甲氫基喜樹堿的粗品進行柱層析，分段收集洗脫液進行HPLC檢測， 純度大于98%的組分直接濃縮干燥，粉碎，得到成品；純度小于90%重復柱層析；純度在 909Γ98%間的加丙酮進行重結(jié)晶，直到9-羥甲氫基喜樹堿的純度大于等于98%，晶體干燥粉碎，得到成品。所述洗脫液為丙酮，或脂肪醇，其濃度為2(T90% (w/w)0
具體實施例方式下面的實施案例是對本發(fā)明的進一步詳細描述，但其不意味著對本發(fā)明的任何限制。實施例I:
摘取新鮮的臭馬比木嫩葉500g，放入烘箱中干燥12小時，研磨至粉末后倒入到發(fā)酵池中，加入干酵母的水溶液750g，維持溫度在28°C 30°C，發(fā)酵3天；
將發(fā)酵產(chǎn)物放入5L燒瓶中，加入50%乙醇溶液2L，放入60°C恒溫水浴鍋中保溫12小時，濾除濾渣。在上清液中加入二氧化硫30g，真空濃縮至濃縮液量為300mL ；
加入石油醚300mL，攪拌均勻后靜置24小時后除去上清液層，下層則為萃取濃縮物。按I :1 (w/w)的比例在萃取濃縮物中加入90%丙酮溶液，緩慢倒入到硅膠柱中進行層析；收集洗脫液后再進行低壓柱層析；收集到的洗脫液再加入到FLASH中壓柱進行層析， 收集洗脫液。在洗脫液中按3 2 :6的比例加入甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺(w/w)進行重結(jié)晶，收集結(jié)晶體涼干，即得到純度達99%的喜樹堿。本發(fā)明提供了一種先利用微生物發(fā)酵再進行高純度喜樹堿和9-羥甲基喜樹堿提取的方法。該方法能夠極大提高馬比木嫩葉和嫩枝中的喜樹堿含量，從而提高喜樹堿的得率?？朔藗鹘y(tǒng)喜樹堿提取量低的缺陷，降低了藥物成本，節(jié)省土地資源。
實施例2:
選取新鮮的臭馬比木嫩枝與嫩葉lKg，在烈日下爆曬5天，研磨成粉后倒入到發(fā)酵池中，加入干酵母的水溶液750g，維持溫度在35°C 37°C，發(fā)酵2天；
將發(fā)酵產(chǎn)物放入2L燒瓶中，加入99%乙醇溶液1L，放入70°C恒溫水浴鍋中保溫24小時，濾除濾渣。在上清液中加入硫酸亞鐵50g，真空濃縮至濃縮液量為150mL ；
加入二氯甲烷200mL，攪拌均勻后靜置10小時后除去上清液層，下層則為萃取濃縮物。按I :2(w/w)的比例在萃取濃縮物中加入50%丙酮溶液，緩慢倒入到硅膠柱中進行層析；收集洗脫液后再進行低壓柱層析；收集到的洗脫液再加入到FLASH中壓柱進行層析， 收集洗脫液。在洗脫液中按3 2 :6的比例加入甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺(w/w)進行重結(jié)晶，收集晶體涼干，即得到純度達99%的喜樹堿。實施例3:
摘取新鮮的臭馬比木嫩葉500g，放入烘箱中干燥12小時，研磨至粉末后倒入到發(fā)酵池中，加入干酵母的水溶液IKg ，維持溫度在20°C 23°C，發(fā)酵2天；
將發(fā)酵產(chǎn)物放入IOL燒瓶中，加入提50%乙醇溶液5L，放入50°C恒溫水浴鍋中保溫48 小時，濾除濾渣。在上清液中加入二氧化硫80g，真空濃縮至濃縮液量為500mL ；
加入石油醚500mL，攪拌均勻后靜置24小時后倒出上清液層，下層則為萃取濃縮物。上清液再按I :1比例加入石油醚溶液，攪拌均勻后靜置24小時后倒出上清液層，得到下層萃取濃縮物與之前的萃取濃縮物合并。在萃取濃縮物中按I :1 (w/w)比例加入70%丙酮溶液，攪拌均勻后靜置12 24小時，抽濾，收集濾液加入適量50%丙酮進行柱層析，分段收集洗脫液進行HPLC檢測，純度大于98%的組分直接濃縮干燥，粉碎，得到9-羥甲氫基喜樹堿成品；純度小于90%重復柱層析；純度在909Γ98間的加丙酮進行重結(jié)晶，直到9-羥甲氫基喜樹堿的純度大于等于98%， 晶體干燥粉碎，得到成品。實施例4:
取新鮮的臭馬比木嫩枝與嫩葉10Kg，在烈日下爆曬5天，研磨成粉后倒入到發(fā)酵池中， 加入干酵母的水溶液15Kg，維持溫度在32°C 35°C，發(fā)酵I天；
將發(fā)酵產(chǎn)物放入IOL提取罐中，加入99%乙醇溶液5L，加熱至70°C后保溫24小時，過濾，收集濾液。在濾液中加入硫酸亞鐵500g，真空濃縮至濃縮液量為500mL ；
加入50% 二氯甲烷溶液1L，攪拌均勻后靜置48小時后除去上清液層，下層則為萃取濃縮物。上清液再按I :l(w/w)比例加入70% 二氯甲烷溶液，攪拌均勻后靜置24小時后倒出上清液層，得到下層萃取濃縮物與之前的萃取濃縮物合并。在萃取濃縮物中按I :2(w/w)比例加入75%丙酮溶液，攪拌均勻后靜置12 24小時，抽濾，收集濾液加入適量75%脂肪醇進行柱層析，分段收集洗脫液進行HPLC檢測，純度大于98%的組分直接濃縮干燥，粉碎，得到9-羥甲氫基喜樹堿成品；純度小于90%重復柱層析；純度在909Γ98%間的加90%脂肪醇進行重結(jié)晶，直到9-羥甲氫基喜樹堿的純度大于等于98%，晶體干燥粉碎，得到成品。
權(quán)利要求
1.一種從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取喜樹堿的方法，其步驟包括預處理選取新鮮的臭馬比木嫩葉和嫩枝，干燥后研磨成粉末；發(fā)酵按酶料比I. 5 l(w/w)加入發(fā)酵液，發(fā)酵f 3天；發(fā)酵溫度為2(T37°C，所述發(fā)酵液為安琪高糖干酵母或發(fā)利干酵母，其濃度為廣11%。(w/w)；提取在發(fā)酵產(chǎn)物中按O. 5^3 l(w/w)的比例加入提取液，加熱提取；所述提取液為濃度為1(Γ90%的乙醇溶液；所述加熱提取的溫度控制在4(T75°C之間；過濾濾取上清液，即得提取液；(5)、濃縮在上述提取液中加入O.5^10% (W/V)的二氧化硫和硫酸亞鐵，濃縮，得濃縮物；(6)、萃取在濃縮物中加入萃取劑對濃縮物進行萃取，并回收萃取劑，得到萃取濃縮物，所述萃取劑為石油醚或二氯甲烷；(7)、純化在萃取濃縮物中加入109Γ90%的丙酮溶液，先采用硅膠柱層析，初步結(jié)晶度達到70%左右；再進行低壓柱層柱，結(jié)晶純度達到80%左右；再采用FLASH中壓柱層析，收集洗脫液，其結(jié)晶純度達到95%左右；最后進行重結(jié)晶，得到純度為99%成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取喜樹堿的方法，其步驟(I)所述的發(fā)酵液為安琪高糖干酵母或發(fā)利干酵母，其濃度為廣11%。(w/w) 0
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取喜樹堿的方法，其步驟(6)所述的萃取劑為石油醚或二氯甲烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取喜樹堿的方法，其步驟(7)所述的重結(jié)晶是在洗脫液中按3 :2 :6的比例加入甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺(w/w) 進行重結(jié)晶。
5.一種從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取9-羥甲基喜樹堿的方法，其步驟包括(1)預處理選取新鮮的臭馬比木嫩葉和嫩枝，干燥后研磨成粉末；(2)發(fā)酵按酶料比I.5 1加入發(fā)酵液，發(fā)酵f 3天；發(fā)酵溫度為2(T37°C，所述發(fā)酵液為安琪高糖干酵母或發(fā)利干酵母，其濃度為廣11%。(w/w)；(3)提取在發(fā)酵產(chǎn)物中加入提取液，加熱提??；所述提取液為乙醇溶液，其濃度為 10 90%，所述加熱提取，溫度控制在4(T75°C之間；(4)濃縮在上述提取液中加入O.5^10%的二氧化硫和硫酸亞鐵(抗氧化劑)，濃縮，得濃縮浸膏；(5 )萃取在濃縮物中加入萃取劑對濃縮物進行萃取，并回收萃取劑，得到萃取濃縮物，所述萃取劑為石油醚或二氯甲烷；(6)分離在萃取濃縮物中加入丙酮溶液，攪拌均勻后靜置12 48小時，抽濾，保留濾液與濾餅；將濾餅用丙酮或乙酸乙酷或氯代甲烷溶解，攪伴后再次抽濾，回收濾液，兩次濾液混合，得到的濾液為含9-羥甲氫基喜樹堿的粗品；(7)純化將9-羥甲氫基喜樹堿的粗品進行柱層析，分段收集洗脫液進行HPLC檢測， 純度大于98%的組分直接濃縮干燥，粉碎，得到成品；純度小于90%重復柱層析；純度在 909Γ98%間的加丙酮進行重結(jié)晶，直到9-羥甲氫基喜樹堿的純度大于等于98%，晶體干燥粉碎，得到成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物提取領(lǐng)域，尤其是從臭馬比木的嫩葉和嫩枝中提取喜樹堿和9-羥甲基喜樹堿兩種植物抗癌藥物的方法。本發(fā)明提供一種先利用微生物發(fā)酵再進行高純度喜樹堿和9-羥甲基喜樹堿提取的方法。該方法能夠極大提高馬比木嫩葉和嫩枝中的喜樹堿含量，從而提高喜樹堿的得率?？朔藗鹘y(tǒng)喜樹堿提取量低的缺陷，降低了藥物成本，節(jié)省土地資源。
文檔編號C07D491/22GK102603758SQ201210030118
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月12日
發(fā)明者張德坤, 張苑金, 張超, 李常青, 李悅山, 黃翀胤 申請人:張苑金