專利名稱：消除腫瘤中的異質(zhì)或混合細胞群體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種消除或殺死異質(zhì)或混合細胞群體的方法。本發(fā)明尤其涉及一種通過擇性地將對應(yīng)于特定細胞群體的專一配體例如抗原、抗原決定基或受體同時還指向并殺死一個缺乏該專一配體的細胞群體，從而殺死腫瘤中的異質(zhì)或混合細胞群體的方法。
背景技術(shù)：
細胞毒素抗癌藥物的療效可以通過提高其對于癌細胞的選擇性而得以增強。實現(xiàn)該目標(biāo)的一種方法為將藥物和與腫瘤細胞具有選擇親和性的單克隆抗體或其他類型的定向劑共價鍵合。這種方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于已經(jīng)被開發(fā)的同時對于殺死目標(biāo)腫瘤細胞具有高強度和高選擇性、較長的循環(huán)保留時間、并且缺乏免疫基因的多種細胞毒素劑、 以及多種可用于人源化(或人體)的抗體-藥物結(jié)合體或免疫結(jié)合體。這種新一代的高效抗癌劑包括抗體和美登木素生物堿(maytansinoid)的結(jié)合體、CC1065的同功異質(zhì)體、紫杉醇(taxol)(紫杉類(taxoids))的衍生物、auristatin的衍生物、以及刺孢霉素 (calicheamycin) Y I的衍生物。多種美登木素生物堿(maytansinoid) (DMl)的結(jié)合體正在進行臨床開發(fā)，并且anti_CD33抗體與刺孢霉素(calicheamycin)的結(jié)合體以及Mylotarg 已經(jīng)被聯(lián)邦食品及藥物管理局批準(zhǔn)作為抗癌藥物用于臨床應(yīng)用。已經(jīng)發(fā)表的很多報道詳細地試圖將單克隆抗體-藥物結(jié)合體特定地指向腫瘤細胞(Sela 等人發(fā)表于 Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987) ;Ghose 等人發(fā)表于 Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983) ;Diener 等人發(fā)表于 Antibody Mediated Delivery Systems 1-23 (J. RodwelI, ed. 1988) ;Pietersz 等人發(fā)表于 Antibody Mediated Delivery Systems 25-53 (J. RodwelI, ed. 1988) ;Bumol 等人發(fā)表于 Antibody Mediated Delivery Systems 55-79 (J. RodwelI，ed. 1988))。細胞毒素藥物例如氨甲蝶呤、柔毛霉素、 阿霉素、長春新堿、長春堿、美法侖、絲裂霉素C、以及瘤可寧已經(jīng)與多種單克隆抗體共軛。 在一些情況下，藥物分子和抗體分子之間的連接是通過中間載體分子例如清蛋白(Garnett 等人發(fā)表于 Cancer Res. 46 :2407-2412 (1986) ;Ohkawa 等人發(fā)表于 Cancer TmmumoI. Immunother. 23 :81-86 (1986) ；Endo 等人發(fā)表于 Cancer Res. 47 1076-1080 (1980))、葡聚糖(Hurwitz 等人發(fā)表于 Appl. Biochem. 2 :25-35 (1980) ;Manabi 等人發(fā)表于 Biochem. Pharmacol. 34 :289-291 (1985) ;DiIIman 等人發(fā)表于 Cancer Res. 46 :4886-4891 (1986)； Shoval 等人發(fā)表于 Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :8276-8280 (1988))、或聚谷氨酸(Tsukada 等人發(fā)表于 J. Natl. Cane. Inst. 73 :721-729 (1984) ；Kato 等人發(fā)表于 J. Med. Chem. 27 1602-1607(1984) ;Tsukada 等人發(fā)表于 &■· J. Cancer 52:111-116(1985))?？贵w-藥物結(jié)合體的藥效通常折衷為在一些腫瘤中的目標(biāo)抗原的異質(zhì)表達，因為通過與抗原-陽性腫瘤細胞結(jié)合的抗體的結(jié)合藥物的定向轉(zhuǎn)送不會傷害無法與抗體結(jié)合的任何抗原-陰性腫瘤細胞。此外，作為一種通過減少其血液供給而使腫瘤縮小的方法，腫瘤脈管系統(tǒng)是個有吸引力的目標(biāo)，越來越引起注意。腫瘤脈管系統(tǒng)通常為腫瘤抗原-陰性。以前有報道發(fā)現(xiàn)幾種抗體一定向細胞毒素劑確實不但能夠根除抗原-陽性細胞而且能夠根除抗原-陰性的鄰近細胞，即所謂的“旁側(cè)效應(yīng)”。在免疫放射性核素、 免疫脂質(zhì)體、以及ADEPT中都觀察到了該旁側(cè)效應(yīng)(Allen TM, Nat Rev Cancer 2(10) 750-63 (2002) ；Muldoon LL, Neurosurgery53 (6) 1406-12 (2003), Muldoon LL 和 Neuwelt EA, J Neurooncol 65(1) :49-62 (2003))。在2000年3月美國癌癥研究協(xié)會學(xué)報第41卷發(fā)表的摘要中，作者描述了通過細胞內(nèi)的P-糖蛋白和其他流出轉(zhuǎn)移劑使分裂的DMl的一部分流出。這是因為在細胞外的環(huán)境中，自由釋放的DMl-硫醇容易與細胞的具有巰基或二硫鍵的分子例如半胱氨酸或胱氨酸、氧化或還原谷胱甘肽、或蛋白質(zhì)(例如血清蛋白)反應(yīng)。一旦與這些親水的生物分子反應(yīng)，DM-I會變成無活性的、混合二硫化合物，可以消除其滲入隔壁細胞的能力以及保留其特性的能力。因此，如果細胞結(jié)合劑-藥物結(jié)合體可以被設(shè)計成這樣，就會非常有助于多種增殖疾病的治療，從而提供一種更穩(wěn)定并且更有效的游離藥物的形式，不但可以消滅抗原-陽性腫瘤細胞，而且可以消滅周圍的抗原-陰性腫瘤細胞或贅生脈管系統(tǒng)的細胞，因此通過在目標(biāo)細胞內(nèi)由結(jié)合體釋放穩(wěn)定游離的藥物，可以使治療腫瘤的效果最大化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種消除異質(zhì)或混合細胞群體AB的方法，其中A代表選擇性地表達特定配體的細胞群體,并且B代表缺乏由A表達的配體的細胞群體。該方法基本包含轉(zhuǎn)送細胞-結(jié)合劑藥物結(jié)合體，使用含有二硫基團的連接劑連接選擇的表達配體的細胞群體A，使該試劑與細胞群體A中的配體結(jié)合，選擇使該藥物進入包含細胞群體A的細胞中。在結(jié)合體中與細胞-結(jié)合劑連接的藥物表示為前體藥物；前體藥物一旦離開結(jié)合體就轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎舅厮幬锘颉八幬铩保⑶夷軌蜻M行進一步的修飾，例如烷基化。細胞毒素藥物或修飾的細胞毒素藥物是活性藥劑。這樣，在一個實施方式中，藥物一旦離開結(jié)合體，就經(jīng)過烷基化，優(yōu)選為甲基化，可以保護未反應(yīng)的硫醇基團不被進一步修飾而導(dǎo)致藥物失活。游離烷基化的藥物可以有效地殺死細胞群體A中的細胞；并且從細胞群體A中釋放出該“活化”藥物，并導(dǎo)致殺死細胞群體B中的細胞，因此消除了異質(zhì)或混合細胞群體AB。這里使用的術(shù)語“活化”指的是游離的藥物，優(yōu)選為修飾的游離藥物，其中對游離藥物的修飾可以提高其穩(wěn)定性或活性。這種修飾包含了從抗體-藥物結(jié)合體上脫離后藥物的烷基化例如甲基化。因此，意外地發(fā)現(xiàn)，如果藥物一旦脫離結(jié)合體，就在藥物的硫醇基團上進行烷基化 (例如甲基化)，烷基化可以保護藥物不與具有巰基的細胞的分子比如半胱氨酸或蛋白質(zhì) (例如血清蛋白)反應(yīng)而使游離的藥物受阻或滅活。如本發(fā)明所示，烷基化的游離藥物非常穩(wěn)定并且有效，而且可以轉(zhuǎn)移至并殺死抗原陰性的鄰近的細胞，從而殺死腫瘤中的異質(zhì)或混合細胞群體。
除了上述發(fā)現(xiàn)以外，還有一個令人意外的發(fā)現(xiàn)，如果在連接細胞結(jié)合劑和藥物的連接劑中的二硫鍵通過在二硫鍵附近形成空間位阻而被穩(wěn)定化了，優(yōu)選將游離藥物烷基化。在優(yōu)選的實施方式中，通過在連接的藥物一側(cè)形成空間位阻，使二硫鍵被穩(wěn)定化?？臻g位阻通常由烷基的原子形成，例如甲基，但其他烷基也可以使用。這里的“藥物一側(cè)”指的是當(dāng)結(jié)合體的二硫鍵斷裂后二硫鍵的兩個α-碳原子中的會與藥物連接的一個α-碳原子上的取代基?！爱愘|(zhì)或混合細胞群體”指的是腫瘤細胞群體差異，包括不同的表型特征或分子特征，例如配體異質(zhì)性，比如腫瘤細胞表面的抗原、抗原決定基或受體。還表示腫瘤組織中的混合細胞群體，例如腫瘤細胞、腫瘤脈管系統(tǒng)細胞、以及腫瘤基質(zhì)細胞。此外,還表示腫瘤中的腫瘤細胞可能經(jīng)歷了自發(fā)突變，并造成基因異質(zhì)細胞群體由單獨惡性變異的細胞成長形成。表型特征可以包含腫瘤細胞表達配體，例如尤其在腫瘤增長階段在腫瘤細胞表面的抗原、抗原決定基或受體。當(dāng)細胞經(jīng)歷表型改變例如變異時，相同的腫瘤細胞可能會失去表面的配體表達。表型改變還包括將其散入環(huán)境使其失去其配體?！爱愘|(zhì)或混合細胞群體”還可以指病毒感染細胞、微生物感染細胞、以及寄生蟲感染細胞，其中病毒、微生物或寄生蟲可能經(jīng)歷自發(fā)突變，并造成基因或表型異質(zhì)細胞群體由單細胞成長形成。因此在一個方面，本發(fā)明涉及一種將藥物指向選定的腫瘤中的細胞群體的方法， 其中至少一些細胞表達了特定的配體以殺死或消除在同一個腫瘤中缺乏該配體的無關(guān)的細胞群體。該方法包含使用細胞-結(jié)合劑藥物結(jié)合體接觸選定的表達了特定配體的細胞群體或組織，在該結(jié)合體中一種或多種藥物通過連接劑與細胞-結(jié)合劑共價連接，并且選定的細胞群體釋放細胞毒素劑或“活性”藥物以殺死或消除缺乏由目標(biāo)細胞群體所表達的配體的無關(guān)的細胞。本發(fā)明的另一個方面涉及了一種方法，通過將細胞-結(jié)合劑藥物結(jié)合體指向選定的細胞群體從而消除異質(zhì)或混合細胞群體，其中至少一些細胞表達了異質(zhì)或混合細胞群體中的配體。通過結(jié)合體的細胞-結(jié)合劑識別配體，其中結(jié)合體的一種或多種藥物通過連接劑共價連接。細胞-結(jié)合劑與目標(biāo)細胞結(jié)合，并且被內(nèi)在化，從而殺死目標(biāo)細胞?；钚缘乃幬锉会尫诺江h(huán)境中，從而殺死其他選定的缺乏該配體的細胞群體，因此消除了異質(zhì)或混合細胞群體。本發(fā)明還教授了一種殺死腫瘤中的細胞的方法，包含指向在異質(zhì)或混合細胞群體AB的選定的細胞群體A上的最初表達的配體，并且隨時間的進程流入介質(zhì)。這里，細胞結(jié)合劑-藥物結(jié)合體優(yōu)選指向流出配體。細胞結(jié)合劑-藥物結(jié)合體分離以釋放出活性藥物， 分散進入圍繞著流出抗原的鄰近的異常的細胞，并殺死這些在腫瘤中的包含異質(zhì)或混合細胞群體并且缺乏選擇性地被指向的配體的細胞，從而殺死了腫瘤中的細胞。


圖I所示為抗體-藥物結(jié)合體的結(jié)構(gòu)；圖2所示為huC242抗體與結(jié)腸腺癌細胞系C0L0205和HT-29、胃癌細胞系SNU-16、 黑素瘤細胞系A(chǔ)375、以及Burkitt淋巴瘤細胞系Namalwa結(jié)合的柱狀圖。將細胞與huC242 一起培育，然后用如Materials and Methods所述的突光標(biāo)記抗人體IgG進行染色,實施例I。將結(jié)合了熒光的細胞在熒光活性細胞分選器(FACS)中進行測定，然后以實線柱狀圖表示。虛線表示沒有與huC242 —起預(yù)培育的被熒光標(biāo)記抗人體IgG染色(背景染色)的細胞的柱狀圖?？乖?陽性和抗原-陰性細胞的比例以數(shù)字顯示；圖3所示為通過二硫鍵而不是硫醚鍵連接的免疫結(jié)合體在體外實際殺死位于目標(biāo)細胞附近的非目標(biāo)細胞；A.在3D膠原細胞培養(yǎng)基中在未處理的C0L0205細胞的增殖上用huC242_DMl、甲醛、或UV光處理的C0L0205細胞的效果。未處理的細胞以不同的比例與處理過的細胞混合， 并且將樣品在膠原中培養(yǎng)5天，然后使用MTT化驗測定能存活的細胞。對于各個細胞混合比顯示了存活的細胞的片斷。黑色、灰色、和白色條柱分別表示培養(yǎng)用huC242-DMl、甲醛、或 UV光處理的細胞的結(jié)果。試驗重復(fù)兩次得到類似的結(jié)果；B.在混合3D膠原細胞培養(yǎng)基中生長時在未處理的C0L0205、Namalwa, A375、 以及!fepG2細胞上用huC242-DMl或huC242_SMCC_DMl處理的C0L0205細胞的效果。用 huC242-DMl或huC242-SMCC-DMl處理的C0L0205細胞的樣品與相同數(shù)量的Namalwa、A375、 H印G2、或未處理的C0L0205細胞混合，并且將混合的培養(yǎng)基在膠原基質(zhì)中培養(yǎng)5天，然后使用MTT化驗測定存活細胞的數(shù)量，并且與對照樣品(只有未處理的細胞)相比較。對于各個細胞系顯示了存活的細胞的片斷，黑色條柱表示C0L0205細胞、灰色條柱表示Namalwa細胞、白色條柱表示A375細胞、并且虛線條柱表示H印G2細胞；C.在液體細胞培養(yǎng)基中用 huC242-DMl、huC242_SMCC_DMl、huC242_DCl、或 huC242-SMCC-DCl處理CanAg-陽性C0L0205細胞、CanAg-陰性Namalwa細胞或混合的 C0L0205與Namalwa細胞群體。C0L0205細胞、Namalwa細胞、以及相等數(shù)量的C0L0205與 Namalwa細胞的混合群體在組織培養(yǎng)板的圓底井中在不存在(左列)或存在(右列)InM的一種抗體-藥物結(jié)合體的條件下成長。培養(yǎng)5天后，對井進行拍照；D.類似于C的實驗的結(jié)果，除了抗原-陽性細胞系為SNU-16 ；圖4所示為細胞毒素美登木素生物堿(maytansinoid)在用huC242_DMl處理的抗原-陽性目標(biāo)細胞的上層清液中逐漸積聚；使用huC242-DMl (A、B、D、E)或 huC242_SMCC_DMl (C、F)培養(yǎng) CanAg-陽性 C0L0205 細胞(A、C、D、F)和CanAg-陰性Namalwa細胞(B、E)的樣品。將該培養(yǎng)菌落在開始以及培養(yǎng)6、24和48小時后取出，并且化驗結(jié)合體(黑色條柱)以及釋放的美登木素生物堿 (maytansinoid)藥物(白色條柱)的存在(A、B、C),并且化驗在CanAg-陰性Namalwa細胞 (D、E、F)上的細胞毒素的活性。將存活的細胞碎片對樣品中結(jié)合體的濃度作圖；圖5所示為異種移植腫瘤模型中免疫結(jié)合體的旁側(cè)效應(yīng)細胞毒性；A.在 SCID 小鼠中成長并且用 huC242-DMl 或 huC242_SMCC_DMl 處理的 C0L0205/ Namalwa混合異種移植腫瘤的免疫組織化學(xué)分析。滑片被鼠C242抗體染色以檢測C0L0205 細胞(左欄)或被anti-⑶38抗體染色以檢測Namalwa細胞(右欄)。a和b為未處理腫瘤的連續(xù)切片，c和d為用PBS處理的動物的對照組的腫瘤，e和f為用huC242-SMCC-DMl處理的動物的腫瘤，并且g和h為用huC242-DMl處理的動物的腫瘤。箭頭指向壞死的區(qū)域；B. huC242-DMl 和 huC242_SMCC_DMl 結(jié)合體對于 CanAg-陽性目標(biāo) C0L0205 細胞(a)、抗原-陰性Namalwa細胞(b)、和C0L0205和Namalwa細胞的混合群體(C)的異種移植腫瘤的活性。將具有尺寸大約為IOOcm3的確定腫瘤的動物用PBS( ■、對照組)、huC242-SMCC-DMl (〇、·)、或 huC242_DMl (Δ>Α)以含有 150 μ g/kg 的連接 DMl 的結(jié)合體的每日劑量連續(xù)處理5天。將單位為mm3的腫瘤體積對時間(細胞接種后的天數(shù))作圖；圖6所示為huC242-DMl和huC242_SMCC_DMl結(jié)合體對于表達了目標(biāo)抗原CanAg 的異質(zhì)的HT-29異種移植腫瘤的活性。將具有平均尺寸大約為170cm3的13天的皮下腫瘤的五只小鼠組用 PBS ( ■、對照組)、huC242-DMl (A)、或 huC242_SMCC_DMl (B)以含有 25 μ g/ kg( O ) >75 μ g/kg( )、或150 μ g/kg( O )的連接DMl的結(jié)合體的每日劑量連續(xù)處理5 天。將單位為mm3的腫瘤體積對時間(細胞接種后的天數(shù))作圖；圖7所示為huC242-SPDB-DM4和huC242_SMCC_DMl的細胞毒性以及在溶菌酶抑制劑BafAl存在時其對細胞循環(huán)的影響。(A)在暴露在不同濃度的huC242-SroB-DM4 (菱形) 或huC242-SMCC-DMl (方形)下4天之后使用MTT化驗測定存活的抗原-陽性C0L0205 (實心符號)和抗原-陰性Nalmawa細胞(空心符號)，并且對結(jié)合體濃度作圖。(B)在具有HT-29人體克隆異種移植腫瘤的SCID小鼠中的huC242-SH)B-DM4和huC242_SMCC_DMl 的抗腫瘤活性。劑量基于結(jié)合的DM4和DMl的量。用PBS(實心園形)、單劑量SOyg/ kg 的 huC242-SPDB-DM4 (空心菱形)、150 μ g/kg 的 huC242_SPDB_DM4 (實心菱形)、或以 150 μ g/kg的劑量注射5天huC242-SMCC-DMl (空心方形)處理具有腫瘤的小鼠。(C)FACS 柱狀圖(FL2-A)顯示了在30μΜ的氯喹、30nM的BafAl的存在下用O. 66μΜ的諾考達唑 (nocodazole)、1(Γ8Μ 的 DMl_SMe、3X 1(Γ9Μ 的 huC242_SPDB_DM4 處理 20 小時或不做處理的異步指數(shù)生長的C0L0205細胞的DNA含量；圖8所示為由huC242-SMCC-DMl誘導(dǎo)的有絲分裂抑制的氯喹的效果。FACS柱狀圖(FL2-A)顯示了存在或不存在在30 μ M的氯喹的條件下用1(Γ8Μ的DMl-SMe、3Xl(T9M的 huC242-SMCC-DMl處理20小時或不做處理的異步指數(shù)生長的C0L0205細胞的樣品的DNA含量。在氯喹存在時，由huC242-SMCC-DMl誘導(dǎo)的G2/M抑制幾乎完全失效(G2為14% )，同時氯喹只有一個適度的由DMl-SMe (G2為51% )造成的G2/M抑制的效果；圖9 所示為當(dāng)用 huC242-SMCC-[3H]DMl(A)或 huC242_SPDB_ [3H] DM4 (B)處理 C0L0205細胞時形成的美登木素生物堿(maytansinoid)代謝物。使用丙酮從細胞小球和所消耗的介質(zhì)中分別萃取出代謝物，然后通過HPLC進行分析。使用在線的的流動閃爍分析儀以mV2的輸出對柱中的流出物進行氚監(jiān)控；因此色譜顯示了橫坐標(biāo)為保留時間并且縱坐標(biāo)為測得的[3H]的 mV2。面板 a f 為使用 huC242-SMCC-[3H]DMl (A)或 huC242_SPDB-[3H] DM4(B)處理了 5、9以及26小時的與C0L0205細胞的介質(zhì)和細胞小球相關(guān)的色譜。(A) 的面板g和(B)的面板h為由丙酮分別萃取在實驗中使用的huC242-SMCC- [3H] DMl和 huC242-SPDB-[3H]DM4結(jié)合體樣品所得的色譜。面板g (B)中的色譜源自與9_h培養(yǎng)的細胞小球相同處理的細胞(如面板c)，除了在色譜分離之前將該樣品另外暴露于NEM以使巰基燒基化；圖10所示為使用DTT和硒醇處理在由huC242-SPDB-[3H]DM4處理的C0L0205細胞的介質(zhì)中的代謝物。在細胞暴露于結(jié)合體26小時之后使用丙酮在所消耗的介質(zhì)中萃取代謝物。將該萃取液分為相等的兩部分。一部分直接進行色譜分析(a)并且另一部分(b) 在色譜分析前用DTT和硒醇進行處理以還原所有的二硫鍵。使用在線的流動閃爍分析儀以 mV2的輸出對柱中的流出物進行氚監(jiān)控；因此色譜顯示了橫坐標(biāo)為保留時間并且縱坐標(biāo)為測得的[3H]的mV2 ；
圖11所示為在使用[3H]結(jié)合體處理的C0L0205細胞內(nèi)外的美登木素生物堿 (maytansinoid)代謝物的積聚及其與有絲分裂抑制的相互關(guān)系。(A)如Materials and Methods中所述，將圖9中的代謝物的放射性的峰的面積量化，并且轉(zhuǎn)換成pmol，實施例2。 面板a c顯示了經(jīng)過26小時的培養(yǎng)期后在樣品中的各種代謝物的量的變化。面板a :在使用huC242-SMCC-[3H]DMl處理C0L0205細胞之后在介質(zhì)(空心圓形)和細胞(實心圓形) 中賴氨酸-N ‘-SMCC-DMl的積聚。面板b :俥用huC242_SPDB_[3H]DM4 S-甲基-DM4(方形)、賴氨酸-N ‘-SPDB-DM4 (圓形)、S_半胱氨酰-DM4 (菱形)處理C0L0205細胞后，在細胞小球(實心符號)和在介質(zhì)(空心符號)中的美登木素生物堿(maytansinoid)代謝物量的變化。面板c :在細胞小球(實心符號)或在細胞小球和介質(zhì)一起(空心符號)中，兩種結(jié)合體huC242-SMCC-[3H]DMl (圓形)和huC242-STOB-[3H]DM4 (方塊)中存在的所有代謝物總量的變化。(B)用2 μ g/mL的阿非迪霉素(aphidicolin)處理24小時使C0L0205細胞在S相中同步化。通過除去阿非迪霉素(aphidicolin)使細胞從S相中釋放出來,并且用 1(Γ8Μ 的 DMl-SMe、3 X 1(Γ9Μ 的 huC242_SMCC_DMl、3 X 1(Γ9Μ 的 huC242_SPDB_DM4 進行培養(yǎng)， 或不做任何處理。在阿非迪霉素(aphidicolin)釋放后5、10、和18小時進行FACS分析；圖12所示為由細胞表面-結(jié)合的huC242-SroB_ [3H] DM4產(chǎn)生美登木素生物堿(maytansinoid)代謝物量。將增生的C0L0205細胞置于冰上并且用飽和量的 huC242-SroB-[3H]DM4(10_7M)進行培養(yǎng)，以使結(jié)合體與受體表面結(jié)合而沒有被內(nèi)在化。然后清洗細胞，并且通過對樣品的小片斷進行閃爍計算，使結(jié)合的放射性的量被量化。在 (TC下與結(jié)合體結(jié)合后涉及細胞樣品的放射性的總量顯示在縱坐標(biāo)T = O處(空心三角， 78pmol)，并且培養(yǎng)22小時后(空心三角，57pmol)。該曲線顯示了對于培養(yǎng)了 5、9、22和30 小時的樣品，在細胞(實心符號)和在介質(zhì)(空心符號)中的各種代謝物的累積。美登木素生物堿(maytansinoid)代謝物為S-甲基_DM4(方形)、賴氨酸-N ‘_SPDB_DM4(圓形)、 S-半胱氨酰_DM4(菱形)；圖13所示為細胞代謝物的抗原依賴性。研究了美登木素生物堿(maytansinoid) 代謝物以及沒有結(jié)合C0L0205細胞的結(jié)合體。面板A (a、b)顯示了用Tras-SMCC-[3H] DMl 處理C0L0205細胞26小時后細胞(a)和介質(zhì)(b)的丙酮萃取液的色譜。相應(yīng)的，面板A(C) (細胞)和(d)(介質(zhì))對應(yīng)于結(jié)合體huC242-SroB-[3H]DM4。面板B顯示了 Tras-SMCC-[3H] DMl (a)和huC242-SroB-[3H]DM4(b)的丙酮萃取液的色譜；圖14所示為細胞毒素中主要代謝物的作用。(A)在存在或不存在BafAl的情況下BafAl對huC242-SMCC-[3H]DMl和huC242_SPDB_[3H]DM4的細胞代謝物的影響。色譜取自在存在 BafAl 的情況下用 huC242-SMCC-[3H]DMl 或 huC242_SPDB_[3H]DM4 處理了 22 小時或不做任何處理的C0L0205細胞的丙酮萃取液。(B)比較用huC242-SroB-2_[3H]DM4和 huC242-SPDB-[3H]DM4處理C0L0205細胞所形成的美登木素生物堿(maytansinoid)代謝物的累積。由 huC242-SPDB-2-[3H]DM4(實心方形)和 huC242_SPDB_[3H]DM4 (實心圓形)所產(chǎn)生的美登木素生物堿(maytansinoid)代謝物的總量。如圖9所述對代謝物進行定量；圖15所示為由huC242-SroB-2_[3H]DM4處理C0L0205細胞形成的美登木素生物堿(maytansinoid)代謝物。用 huC242-SPDB_I2-[3H]DM4 處理 C0L0205 細胞并且在 5、9、22 和30小時時對細胞和介質(zhì)進行取樣，并且如圖7所述對代謝物進行分析。(A)左面板顯示了四個連續(xù)時間點的細胞萃取液的色譜，并且右面板顯示了相對應(yīng)的介質(zhì)樣品的色譜。(B)如圖9所述對細胞(實心圓形)和介質(zhì)(空心方形)中由huC242-SroB-2_[3H]DM4所產(chǎn)生的美登木素生物堿(maytansinoid)代謝物的總量進行定量；圖16所示為在目標(biāo)癌細胞中huC242_美登木素生物堿(maytansinoid)的活化的模型。結(jié)合體活化的起始步驟與二硫-被連接的結(jié)合體比如huC242-SroB-DM4、以及非二硫-被連接的結(jié)合體比如huC242-SMCC-DMl類似。首先都是通過抗原-介質(zhì)化細胞內(nèi)吞作用由目標(biāo)癌細胞進行內(nèi)在化，通過小泡傳遞傳送至溶酶體，然后降解為賴氨酸-衍生物賴氨酸-N ‘-SMCC-DMl和賴氨酸-N ‘-SPDB-DM4。這些賴氨酸衍生物很可能與細胞內(nèi)的目標(biāo)微管蛋白結(jié)合，并且通過抑制微管聚合造成細胞毒性。與賴氨酸-N ^-SMCC-DMl不同，賴氨酸-N ‘-SPDB-DM4可以承受進一步的細胞內(nèi)修飾、還原和S-甲基化，從而最后形成S-甲基-DM4。當(dāng)賴氨酸-衍生物一旦離開目標(biāo)細胞就不再具有活性，中性的親脂性S-甲基-DM4 化合物仍然具有活性，并且能夠重新進入目標(biāo)細胞或進入相鄰的細胞(旁側(cè)效應(yīng))；以及圖17所示為合成硫甲基美登木素生物堿(maytansinoid)的示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明者意外地發(fā)現(xiàn)如果藥物一旦從結(jié)合體上釋放，就在藥物的硫醇基團上進行烷基化(例如甲基化)，藥物烷基化可以保護藥物不與具有巰基的細胞分子比如半胱氨酸、或蛋白質(zhì)(例如血清蛋白)、或具有二硫基團的細胞分子比如胱氨酸、氧化谷胱甘肽反應(yīng)而使游離的藥物受阻或滅活。此外，本發(fā)明者還意外地發(fā)現(xiàn)在細胞結(jié)合劑-藥物結(jié)合體中的藥物的強度依賴于在細胞毒素藥物和細胞結(jié)合劑之間連接處的位阻。通過在鄰近二硫鍵的兩個α-碳上加入烷基例如甲基以阻隔結(jié)合體。該位阻如果在結(jié)合體的藥物一側(cè)， 則會誘導(dǎo)游離的藥物烷基化(例如甲基化)，一旦藥物在其目標(biāo)中釋放，可以在細胞內(nèi)或細胞外。在連接硫原子的α-碳上具有一個或兩個烷基取代基的空間位阻硫醇和含有二硫的美登木素生物堿(maytansinoid)的制備如2004年11月25日公布的美國專利申請 No. 2004/0235840所述，其中全部內(nèi)容弓I入本文以作參考。這樣，在一個實施方式中，當(dāng)細胞結(jié)合劑-藥物結(jié)合體的二硫鍵斷裂時，會在目標(biāo)細胞內(nèi)或附近釋放藥物。此外，藥物的硫醇基團經(jīng)過烷基化(例如甲基化或增加了一個或多個CH3基團)會使藥物穩(wěn)定并且有效力，不但能夠殺死例如在腫瘤中的異質(zhì)或混合細胞群體中的目標(biāo)細胞還能殺死非目標(biāo)細胞，或者在目標(biāo)細胞周圍的細胞。在細胞結(jié)合劑-藥物結(jié)合體中的受阻的硫醇基團比起在同樣結(jié)合體中的未受阻的硫醇基團的優(yōu)勢在于，由于與未受阻的硫醇基團相比，對于分離的藥物更易進行烷基化， 從而可以防止藥物遭受修飾反應(yīng)并造成失去其功能。此外，烷基化的藥物在一段時間內(nèi)有效，并且能夠指向腫瘤中的鄰近細胞從而殺死鄰近的細胞。有效的烷基化藥物如實施例所述可以被化學(xué)合成，并且發(fā)現(xiàn)它們在體外效力至少強100倍。本發(fā)明還提供了一種改進的在混合或異質(zhì)細胞群體中指向細胞的方法，尤其是需要被殺死的細胞，例如腫瘤細胞(尤其是實心的腫瘤細胞)、病毒感染細胞、微生物感染細胞、以及寄生蟲感染細胞，以上皆包括在非正常細胞的異質(zhì)或混合群體中。本發(fā)明方法中的結(jié)合體具有一個或多個美登木素生物堿(maytansinoid)、紫杉烷類(taxane)或CC-1065類似物，通過二硫連接劑與細胞-結(jié)合劑連接。在一種制備結(jié)合體的方法中，首先用異雙功能交聯(lián)劑例如SPP、SPDP、STOB、或SSNPP修飾細胞-結(jié)合劑例如抗體。列出的交聯(lián)劑都使用N-羥基琥珀酰亞胺酯化學(xué)與抗體反應(yīng)。列出的化合物在鏈的長度上和在與游離的硫醇反應(yīng)的二硫代吡啶周圍的位阻程度上不同。在第二步中，修飾的試劑與藥物反應(yīng)，例如，具有硫醇基團的美登木素生物堿(maytansinoid)、紫杉燒類(taxane) 或CC-1065類似物，從而制備細胞-結(jié)合劑藥物結(jié)合體。因此，最終由兩部份組合成連接劑，引入細胞-結(jié)合劑的交聯(lián)劑和藥物的巰基例如DMl或DM4。作為選擇，藥物例如美登木素生物堿(maytansinoid)在與細胞-結(jié)合劑反應(yīng)之前可以用交聯(lián)劑進行修飾。參見例如美國專利 No. 6，441，163B1。雖然對于分離的藥物優(yōu)選進行烷基化，并且對于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)熟練人員來說可以分離出該體內(nèi)烷基化的美登木素生物堿(maytansinoid)(例如，體內(nèi)甲基化的美登木素生物堿(maytansinoid)),但美登木素生物堿(maytansinoid)也可以如圖8所示在體外進行烷基化。該體外甲基化的美登木素生物堿(maytansinoid)對于殺死腫瘤細胞具有很高的效力。細胞-結(jié)合劑本發(fā)明的化合物作為治療藥劑的效果依賴于對合適細胞-結(jié)合劑的仔細選擇。細胞-結(jié)合劑可以是任何已知的種類，或正在研究的并且包括肽和非肽。通常，這些可以是抗體(尤其是單克隆抗體及其碎片)、淋巴因子、激素、增長因子、維生素、營養(yǎng)傳送分子(轉(zhuǎn)鐵蛋白)、或任何其他細胞-結(jié)合分子或結(jié)合特定目標(biāo)的物質(zhì)。目標(biāo)通常在腫瘤中但不一定在腫瘤細胞的細胞表面，例如，目標(biāo)最初也可以存在于細胞表面并且分離而流入環(huán)境介質(zhì)中。可以使用的細胞-結(jié)合劑的更具體的例子包括多克隆和單克隆的抗體，包括人體抗體；單鏈抗體(多克隆和單克隆);抗體碎片(多克隆和單克隆)例如Fab、Fab’、F(ab’)2、以及Fv(Parham, 131 J. Immunol. 2895-2902 (1983) ；Spring 等人，113 J. Immunol. 470-478 (1974) ；Nisonoff 等人，89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244(1960))；嵌合(chimeric)抗體及其抗原-結(jié)合碎片；域(domain)抗體(dAbs)及其抗原-結(jié)合碎片，包括camelid抗體(Desmyter等人，3Nature Struct. Biol,752,1996)；S (shark)抗體即新抗原受體(IgNAR) (Greenberg 等人，374 Nature, 168,1995 ； Stanfield 等人，305 Science 1770-1773，2004)；干擾素(例如alpha、beta、gamma)；淋巴激活素例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6 ；激素例如胰島素、TRH(促甲狀腺素釋放的激素)、MSH(黑素細胞-刺激激素)、類固醇激素例如雄激素和雌激素；增長因子和群體刺激因子例如EGF、TGF-alpha、FGF、VEGF, G-CSF, M-CSF和 GM-CSF(Burgess,5 Immunology Today 155-158 (1984))；轉(zhuǎn)鐵蛋白(O，Keefe等人，260 J. Biol. Chem. 932-937 (1985));以及維生素例如葉酸。單克隆抗體技術(shù)使得特定單克隆抗體形式的極端特定的細胞結(jié)合劑的制備成為可能。該領(lǐng)域內(nèi)最為熟知的技術(shù)為通過使用相關(guān)的抗原例如完整目標(biāo)細胞、與目標(biāo)細胞隔離的抗原、完整的病毒、減弱的完整病毒、以及病毒蛋白例如病毒外殼蛋白，使小鼠、老鼠、 倉鼠或任何其他哺乳動物免疫而制備形成單克隆抗體。過敏的人體細胞也可以使用。另一種形成單克隆抗體的方法為使用抗體碎片例如Fab和scFv (單鏈可變區(qū)域)尤其是人體 scFv (參見例如 Griffiths 等人，美國專利 Nos. 5，885，793 和 5，969，108 ；McCafferty 等人，WO 92/01047 ;Liming等人，WO 99/06587)的噬菌體庫。此外，也可以使用美國專利 No. 5，639，641公開的表面重整的抗體作為可以用于人體的抗體。合適的細胞-結(jié)合劑的選擇依賴于需要指向的特定細胞群體，但如果合適的細胞-結(jié)合劑是可得到的，通常優(yōu)選人體單克隆抗體。例如，單克隆抗體J5是特定于普通急性淋巴細胞白血病抗原(CALLA) (Ritz等人， 283Nature 583-585(1980))的鼠類IgG2a抗體，并且如果目標(biāo)細胞表達了 CALLA例如在急性淋巴細胞白血病中則可以使用。單克隆抗體MY9是與特定的CD33抗原(J. D. Griffin等人,8 Leukemia Res., 521(1984))結(jié)合的鼠類IgGl抗體，并且如果目標(biāo)細胞表達了 CD33抗原例如在急性髓細胞性白血病(AML)中則可以使用。與之類似，單克隆抗體anti_B4也可以被稱為B4，是與B細胞的⑶19抗原(Nadler 等人，131 J. Immunol.，224-250 (1983))結(jié)合的鼠類IgGl抗體，并且如果目標(biāo)細胞為B細胞或表達了該抗原的患病細胞例如在non-Hodgkin’ s淋巴瘤或慢性淋巴細胞白血病中則可以使用。同樣，也可以使用鼠類單克隆抗體N901，這是與在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中包括小細胞肺腫瘤中發(fā)現(xiàn)的CD56(神經(jīng)細胞粘連分子)抗原結(jié)合的抗體。這些抗體在使用前優(yōu)選進行表面重整或人源化。例如,在藥物-抗體結(jié)合體中優(yōu)選表面重整或人源化的MY9、anti-B4或 N901作為抗體。這些抗體的表面重整或人源化如Roguska等人Proc Natl Acad Sci美國1994年 2月I日；91(3) :969-973所述，其中全部內(nèi)容引入本文以做參考。此外，與CanAg抗原結(jié)合的單克隆抗體C242(美國專利No. 5，552，293)可以被用于處理CanAg表達的腫瘤，例如結(jié)腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、以及胃癌。huC242是單克隆抗體C242的人源化的形式，如美國專利No. 5，552，293所述，并且用ECACC沉積雜種瘤，標(biāo)識編號90012601。可以通過采用CDR-嫁接法(美國專利No. 5，585，089、5，693，761、以及 5，693，762)或表面重整法(美國專利No. 5，693，641)制備人源化的形式。huC242也可以被用于處理CanAg表達的腫瘤，例如結(jié)腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、以及胃癌。此外,抗體曲妥單抗(trastuzumab)可以被用于治療表達Her2抗原的乳腺癌及其他癌癥，例如前列腺癌和卵巢癌。結(jié)合胰島素增長因子受體的Anti-IGF-IR抗體也非常有用。卵巢癌和前列腺癌可以分別用例如anti-MUCl抗體比如 anti-HMFG-2 (Taylor-Papadimitriou 等人，28. Int. J. Cancer 17-21,1981)或 hCTM01(56 Cancer Res. 5179-5185，1996)或DS6以及anti-PSMA (前列腺-特定隔膜抗原)比如 J591(Liu 等人，57 Cancer Res. 3629-3634，1997)成功地定向治療。非抗體分子也可以被用于指向特定細胞群體。例如，與骨髓細胞結(jié)合的GM-CSF可以被作為細胞-結(jié)合劑使用以指向急性髓細胞性白血病的患病細胞。此外，與活性T-細胞結(jié)合的IL-2可以被用于防止移植排斥，用于治療并防止移植病毒感染疾病，并且用于治療急性T-細胞白血病。與黑素細胞結(jié)合的MSH可以被用于治療黑素瘤。葉酸可以被用于指向卵巢和其他腫瘤表達的葉酸受體。表皮增長因子(EGF)能夠被用于指向鱗狀上皮癌例如肺部、頭部和頸部。生長激素抑制素可以被用于指向成神經(jīng)細胞瘤(neuiOblastomas)和其他腫瘤類型。使用雌激素(或雌激素類似物)或雄激素(或雄激素類似物)作為細胞-結(jié)合劑可以分別成功地指向乳腺癌和睪丸癌。交聯(lián)劑在這里使用的“連接劑”是任何可以將細胞-結(jié)合劑與藥物共價連接的化學(xué)成分， 例如美登木素生物堿(maytansinoid)、紫杉燒類(taxane)、或CC1065類似物。部分交聯(lián)劑配有藥物。例如DM1，一種含有硫醇的美登木素生物堿(maytansinoid)，是一種美登素的衍生物。為了形成DM1，美登素的C-3羥基的側(cè)鏈被修飾為具有一個自由的SH。這個硫醇化的美登素可以與修飾的細胞-結(jié)合劑反應(yīng)以形成結(jié)合體。因此，最終連接劑是由兩部分組合而成，一部分來自引入細胞-結(jié)合劑的交聯(lián)劑，并且另一部分來自DMl的側(cè)鏈?？蓴嗔训倪B接劑為能夠在適度條件下斷裂的連接劑，例如在藥物例如美登木素生物堿(maytansinoid)、紫杉燒類(taxane)、或CC1065的活性不會受影響的條件下以及在細胞內(nèi)的條件下。很多滿足這些條件的連接劑如下所述。含有二硫化物的連接劑為能夠通過在生理條件下發(fā)生的二硫交換而斷裂的連接劑。酸解連接劑為在酸性pH下斷裂的連接劑。例如，一些細胞內(nèi)隔膜比如核內(nèi)體和溶酶體具有酸性pH (pH為4 5)，并且具有適合酸解連接劑斷裂的條件。光解連接劑可以用于身體表面以及很多能接收到光的體腔。此外，紅外光可以穿透組織。—些連接劑可以被肽酶所斷裂。只有特定肽酶可以在細胞內(nèi)或細胞外發(fā)生斷裂， 參見例如 Trouet 等人，79 Proc. Natl. Acad. Sci.美國，626-629 (1982)以及 Umemoto 等人， 43 Int. J. Cancer,677-684(1989)。細胞毒素齊1丨本發(fā)明的細胞毒素結(jié)合體中使用的細胞毒素劑可以是任何會造成細胞死亡的化合物，或?qū)е录毎劳觯蛞阅撤N方式降低細胞存活力。優(yōu)選的細胞毒素劑包括，例如美登木素生物堿(maytansinoid)和美登木素生物堿(maytansinoid)類似物、紫杉類(taxoid)、 CC-1065和CC-1065類似物、多拉司他汀(dolastatin)和多拉司他汀(dolastatin)類似物，定義如下。這些細胞毒素劑與這里公開的抗體、抗體碎片、功能等價物、改進的抗體及其類似物結(jié)合。細胞毒素結(jié)合體可以通過體外的方法進行制備。為了將藥物或藥物前體與抗體連接，使用了二硫基團。可以通過抗體和藥物或藥物前體之間的二硫交換反應(yīng)形成結(jié)合體。美登木素生物堿(Maytansinoids)在本發(fā)明可以使用的用以形成細胞毒素結(jié)合體的細胞毒素劑為美登木素生物堿(maytansinoid)和美登木素生物堿(maytansinoid)類似物。合適的美登木素生物堿 (maytansinoid)的例子包括美登木醇(maytansinol)和美登木醇(maytansinol)類似物。 美登木素生物堿(Maytansinoid)為可以抑制微管形成的藥物，并且對于哺乳動物細胞具有很大的毒性。合適的美登木醇(maytansinol)類似物包括那些具有被修飾的芳環(huán)和在其他位置被修飾的化合物。這樣的合適的美登木素生物堿(maytansinoid)如美國專利 No. 4，424，219 ;4，256，746 ;4，294，757 ;4，307，016 ;4，313，946 ;4，315，929 ;4，331，598 ； 4，361，650 ;4，362，663 ;4，364，866 ;4，450，254 ;4，322，348 ;4，371，533 ;6，333，410 ； 5，475，092 ;5，585，499 ;以及 5，846，545。合適的具有芳環(huán)修飾的美登木醇(maytansinol)的類似物的具體例子包括(1)C-19-脫氯(美國專利 No. 4，256，746)(由安莎霉托素(ansamytocin) P2 的 LAH 還原制得)；(2)C-20-羥基(或 C-20-脫甲基)+/_C_19_ 脫氯(美國專利 No. 4，361，650 和 4，307, 016)(由使用鏈霉菌(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)脫甲基化或使用LAH 脫氯化制得)；以及(3)C-20-脫甲氧基、C-20-酰氧基(-0C0R)、+/-脫氯(美國專利 No. 4，294，757)
(由使用酰氯?；频?。合適的具有其他位置修飾的美登木醇(maytansinol)的類似物的具體例子包括(1)(>9-5!1(美國專利如.4，424，219)(由美登木醇(maytansinol)與 H2S 或 P2S5 反應(yīng)制得)；(2)C-14_烷氧基甲基(脫甲氧基/CH2OR)(美國專利No. 4，331，598)；(3) C-14-羥甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利No. 4，450，254)(由諾卡氏菌制得)；(4)C-15_羥基/酰氧基(美國專利No. 4，364，866)(由用鏈霉菌轉(zhuǎn)化美登木醇 (maytansinol)制得)；(5) C-15-甲氧基(美國專利 No. 4, 313, 946 和 4, 315, 929)(由 trewia nudifIora 離析制得)；(6)C-18-N-脫甲基(美國專利No. 4，362，663和4，322，348)(由用鏈霉菌對美登木醇(maytansinol)脫甲基化制得)；以及(7) 4, 5-脫氧(美國專利No. 4，371，533)(由美登木醇(maytansinol)的三氯化鈦 /LAH還原制得)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的細胞毒素結(jié)合體利用了含有硫醇的美登木素生物喊(Maytansinoid)DMl作為細胞毒素劑，分子式為N2’ _脫乙酸基-N2’ -(3-疏基-I-氧丙基)_美登素。DMl如下列結(jié)構(gòu)式⑴所示
權(quán)利要求
1.一種烷基化的美登木素生物堿，其中美登木素生物堿在未反應(yīng)的硫醇基團處進行了烷基化。
2.如權(quán)利要求I所述的烷基化的美登木素生物堿，其特征在于，所述烷基為甲基、乙基、丙基、或丁基。
3.如權(quán)利要求I所述的烷基化的美登木素生物堿，其特征在于，所述烷基化的美登木素生物堿為具有如下分子式的化合物MayO (C = O) CH (Me) N (CH3) COCH2CH2 (CMe2) nSMe 其中，η = O或I,并且May為美登木素生物堿。
4.分離出的賴氨酸-N’-SMCC-DMl。
5.分離出的賴氨酸-N’-SPDB-DM4。
6.分離出的S-半胱氨酸-DM4。
7.分離出的S-甲基-DM4。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種殺死或抑制包含異質(zhì)或混合細胞群體的腫瘤的方法。實現(xiàn)所述的殺死或抑制腫瘤是通過選擇性地指向被認為表達在特定細胞群體上的特定的配體，從而還能殺死缺乏該特定配體的細胞群體。這些結(jié)合體的治療作用是由于其被傳送至特定的細胞群體以殺死這些細胞，并且釋放細胞毒性藥物以殺死非目標(biāo)細胞，因此消除了腫瘤。
文檔編號C07D498/18GK102603770SQ20121003128
公開日2012年7月25日 申請日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者麗塔·斯蒂夫斯, 拉維·V·J·查里, 漢斯·K·埃里克森, 約翰·M·蘭伯特, 維克托·S·戈德馬克赫爾, 羅伯特·J·盧茨, 耶樂娜·V·科夫通 申請人:免疫基因公司