專利名稱：三疣梭子蟹PtCrustin-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種三疣梭子蟹PtCrustin-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Crustin是在甲殼動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種富含半胱氨酸殘基的陽(yáng)離子抗菌肽。它的分子量大小為7_14kDa，等電點(diǎn)在7. 0-8. 7之間，N端包含信號(hào)肽，C端包含WAP (whey acidic protein)結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是由8個(gè)Cys組成的四個(gè)二硫鍵核心(4-DSC)構(gòu)成。根據(jù)在信號(hào)肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間的中間序列區(qū)結(jié)構(gòu),Crustin可分為I-III三種類型。I型Crustin 主要存在于蟹、龍蝦和螯蝦中；11型和III型Crustin主要發(fā)現(xiàn)于對(duì)蝦中。Crustin最初被命名為carcinin,是從Carcinus maenas的顆粒血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),而且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抑制作用。目前已有70多條Crustin序列在不同的甲殼動(dòng)物中報(bào)道，包括蟹、龍蝦、對(duì)蝦和螯蝦等。研究表明這些天然純化或者體外重組的Crustin蛋白都具有明顯的抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的作用，而且都是高水平的組成型表達(dá)，提示Crustin 在甲殼動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。三撫梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)重要海水養(yǎng)殖品種。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大以及集約化程度不斷提高，由細(xì)菌、真菌等引起的各種疾病日趨嚴(yán)重，給梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病害的不斷爆發(fā)和病因的多樣性迫切需要從三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型的抗菌藥物。到目前為止，關(guān)于三疣梭子蟹Crustin的研究尚少。因此，識(shí)別、定性抗菌效應(yīng)分子-Crustin對(duì)研究三疣梭子蟹的免疫防御機(jī)制和進(jìn)行病害防治具有重要的理論和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三疣梭子蟹PtCrustin-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種三疣梭子蟹PtCrustin-2基因?yàn)樾蛄斜鞸EQ ID No. I中的堿基序列所示。三疣梭子蟹PtCrustin-2基因編碼蛋白為序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所三疣梭子蟹PtCrustin-2基因的應(yīng)用所述三疣梭子蟹PtCrustin-2基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物用于制備抗菌藥物、免疫增強(qiáng)劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。所述三疣梭子蟹PtCrustin-2基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物用于制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌藥物。所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌，革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明利用表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)(EST)、RACE技術(shù)從三疣梭子蟹中克隆到 PtCrustin-2基因cDNA全長(zhǎng)序列，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼PtCrustin-2成熟肽的基因片段并將其克隆到pET32a(+)表達(dá)載體中，在大腸桿菌BL21(DE3)-plysS實(shí)現(xiàn)體外重組表達(dá)。 重組蛋白經(jīng)TALON柱純化和透析后，對(duì)革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為24. 75 μ M、 12. 37 μ Μ、49. 51 μ Μ、49. 51 μ M ;而對(duì)真菌畢赤酵母沒(méi)有明顯的抑制作用。本發(fā)明基因及其重組蛋白主要在藥物生產(chǎn)、免疫增強(qiáng)劑、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產(chǎn)中應(yīng)用，另外還可以為進(jìn)一步研究三疣梭子蟹免疫防御機(jī)制提供基礎(chǔ)，并為三疣梭子蟹的病害防治和基因輔助選育提供參考。


圖I為本發(fā)明實(shí)例提供的純化的三疣梭子蟹PtCrustin-2編碼成熟肽的基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(其中，M :DNA marker, I :成熟肽的基因擴(kuò)增產(chǎn)物)。圖2為本發(fā)明實(shí)例提供的誘導(dǎo)和純化的三疣梭子蟹PtCrustin-2重組蛋白電泳圖 (其中M :蛋白marker ；1 :未誘導(dǎo)菌體中表達(dá)的蛋白；2 :IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白；3 :純化的重組蛋白)。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。本發(fā)明中的三撫梭子蟹PtCrustin-2的cDNA序列克隆包括下列步驟a)三疣梭子蟹總RNA的提取及mRNA的純化；b)三疣梭子蟹cDNA文庫(kù)構(gòu)建；c)三疣梭子蟹cDNA文庫(kù)EST序列的大規(guī)模測(cè)定；d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtCrustin-2基因片段的篩選；e) RACE擴(kuò)增獲得PtCrustin-2的全序列以及全序列的驗(yàn)證。實(shí)施例I.三疣梭子蟹PtCrustin-2基因?yàn)镾EQ ID No. I中所示的堿基序列。序列表SEQ ID No. I 為:
ggggagcaca aaccctactg cactctcaag ttgcctcgct ctcatctttg
ctccagcatgctttgcatagtgacagtcgccttgttggtgctcgtg gcgCtg3,3,3,gatgccgaggcggggacgCCtCCtatatctgac agetgcaggcactggtgtccaagagcaggatatCCtcatggc gaa gcg ttt tac tgt tgt gat cgt gga att ggg act ata ggg gac gag ttc gac tcg cac cct ggc aaa tgt ccc gac cgt cct ttc tgc ccc aag aat gag tat ctc aga ate gga cca agg ccc acg gta tgt get cat gac ggc cag tgc aaa cgt cac gag aag tgt tgt act gat gcc tgc ctt aac cac cac acc tgc ctg att get gac cca cat taa cctggtgatc aggacctcca tgacatcccc ttcttaacaa gagaaactaa gagggattga gggaacttga caaaagaaga tgaatttaat tgttgctgtt gtttgagtgt ttcatttttt tcttgttcca agtttcgaaa aaagcgtttt gatgtcacta tgattgccct tgaataataa
3,tg3,3,t3,3,tg CSt&&&&&&& 3,3,3,3,3,3,3,3,3,3, 3,3,3,3,3,3,3,3,3,3, 3,3,3,3,(a)序列特征 長(zhǎng)度629bp (有效長(zhǎng)度 58-405) 類型堿基序列籲鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型雙鏈DNA(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源三撫梭子蟹(Portunus trituberculatus)(f)特異性名稱CDS構(gòu)建具體操作如下I.三撫梭子蟹總RNA的提取及mRNA的純化利用Invitrogen公司的Trizol試劑提取三疣梭子蟹總RNA，利用QIAGENE公司的Oligitex mRNA純化試劑盒純化mRNA。2.三撫梭子蟹cDNA文庫(kù)構(gòu)建利用Clontech公司的Creator Smart cDNA Library Construction Kit試劑盒使用說(shuō)明構(gòu)建cDNA文庫(kù)。以純化后的mRNA為模板， SMART IV Oligonucleotide(5' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG 3')和CDS 111/3' PCR Primer (5; ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (T) 30Ν_!Ν 3')為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV reverse transcriptase)作用下轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈。用 5' PCR Primer (5' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3')和CDS 111/3' PCR Primer (5' ATTCTAGAGGCCGAGGC GGCCGACATG-d(T) 30NJN 3')為引物經(jīng) long distance (LD-PCR)合成 cDNA 第二鏈。雙鏈 cDNA(ds cDNA)在45°C條件下經(jīng)蛋白酶K(0. 8mg/ml)消化20min，然后用SfiI酶進(jìn)行酶切， 酶切產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit回收l(shuí)-3kb的片段。將回收的片段與載體pDNR-LIB連接后純化，通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37°C條件下220rpm/min培養(yǎng)lh，加入終體積20%的甘油，即為全長(zhǎng)cDNA 原始文庫(kù)。3.三疣梭子蟹cDNA文庫(kù)EST序列的大規(guī)模測(cè)定文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，使用載體通用引物M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')在ABI3730xl測(cè)序儀上進(jìn)行序列測(cè)定，將得到的原始峰圖文件(*. abl, *. abd文件)數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(*. seq) 和質(zhì)量文件(*. seq. qual)，依據(jù)質(zhì)量文件提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除低質(zhì)量的堿基，用cross-match程序屏蔽數(shù)據(jù)中的載體序列，從得到的數(shù)據(jù)中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于Q13(準(zhǔn)確率大于95% )且長(zhǎng)度大于IOObp的序列作為EST數(shù)據(jù)，具體《基因表達(dá)序列(EST)數(shù)據(jù)分析手冊(cè)》(胡松年著，浙江大學(xué)出版社，2005年)。4.三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtCrustin-2基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類拼接，生成Contigs和Singletons,分別將所獲得的Contigs 與Singletons在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn和BLASTx分析,結(jié)果顯示在EST序列中發(fā)現(xiàn)了與遠(yuǎn)海梭子蟹Portunus pelagicus Crustin基因相似性較高(76%)的序列,根據(jù)相似性分析結(jié)果確定了三疣梭子蟹PtCrustin-2基因的EST序列。5.三疣梭子蟹PtCrustin-2基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆根據(jù)與 PtCrustin-2 基因同源的 EST 序列設(shè)計(jì)特異引物 Fl (5 ' GGGACGCCTCCTATATCTGACA 3 ')和Rl(5 ' GGTCCGATTCTGAGATACTCA 3 ')，分別利用載體通用引物 M13F(5/ TGTAAAACGACGGCCAGT 3')和 M13R(5' CAGGAAACAGCTATGACC 3')進(jìn)行 3'和 5'末端的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用Axygen膠回收試劑盒進(jìn)行 PCR產(chǎn)物回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Transl-Tl (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，挑選陽(yáng)性克隆用載體引物M13-47 和RV-M進(jìn)行測(cè)序,所得結(jié)果經(jīng)Phred/Phrap軟件進(jìn)行拼接，得到三撫梭子蟹PtCrustin-2 基因全長(zhǎng)cDNA序列見(jiàn)SEQ ID No. I。6.三撫梭子蟹PtCrustin-2基因cDNA全長(zhǎng)的驗(yàn)證在測(cè)序拼接的 PtCrustin-2 全長(zhǎng)序列上設(shè)計(jì)一對(duì)引物 F2 (5 ' GCCTCGCTCTCATCTTTGCTCCAG 3 ')和 R2(5/ CATAGTGACATCAAAACGC 3')，以cDNA為模板進(jìn)行全長(zhǎng)的驗(yàn)證。測(cè)序及分析同5。3' RACE擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件25 μ I反應(yīng)體系
10XPCR buffer2. 5 μ I
MgCl2 ( 25mM)I. 5 μ I
dNTP (IOmM)O. 5 μ I
引物 Fl ( 5 μΜ)I μ I
引物 M13R ( 5 μΜ)I μ I
cDNA文庫(kù)模板I μ I
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ I )O. 2 μ I
ddH2017. 3 μ I反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為94°C變性3min ;94°C變性30s，56。。退火50s，72。。延伸lmin，34個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 IOmin05' RACE擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件25 μ I反應(yīng)體系
10 X PCR buffer MgCl2 ( 25mM) dNTP (IOmM )
引物 Rl ( 5 μΜ)
引物 M13F ( 5 μΜ) cDNA文庫(kù)模板 Taq DNA 聚合酶(5U/ μ I ) ddH20反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice 行，反應(yīng)條件為94°C變性3min ;94°C變性30s，56。。退火50s，72。。延伸lmin，34個(gè)循環(huán) 72°C延伸 IOmin0
2. 5 μ I I. 5 μ I O. 5 μ I I μ I I μ I I μ I O. 2 μ I 17. 3 μ I
Model ΤΡ600 (Takara Bio Inc.)中進(jìn)
全長(zhǎng)驗(yàn)證的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為 25 μ I反應(yīng)體系
10 X PCR buffer MgCl2 ( 25mM) dNTP (IOmM )
引物 F2 ( 5 μΜ)
引物 R2 ( 5 μΜ) cDNA文庫(kù)模板 Taq DNA 聚合酶(5U/ μ I ) ddH20反應(yīng)在TaKaRaPCR Thermal Cycler Dice
行，反應(yīng)條件為94°C變性3min ;94°C變性30s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán);
72°C延伸 IOmin0序列表SEQ ID No. I從三疣梭子蟹中克隆到PtCrustin-2基因cDNA全長(zhǎng)629p，其
中開(kāi)放閱讀框348bp，5'非翻譯區(qū)57bp，3'非翻譯區(qū)224bp，有多聚腺苷酸尾巴。實(shí)施例2.三疣梭子蟹PtCrustin-2序列表SEQ ID No. I所述堿基序列，所述的氨基酸序列
如序列表SEQ ID No. 2所述。
2. 5 μ I I. 5 μ I O. 5 μ I I μ I I μ I I μ I O. 2 μ I 17. 3 μ I
Model ΤΡ600 (Takara Bio Inc.)中進(jìn)
序列表SEQ ID No. 2為
MetLeuCysHeValThrValAlaLeuLeuValLeuValAlaLeuLysAspAlaGluAlaGlyThrProProHeSerAspSerCysArgHisTrpCysProArgAlaGlyTyrProHisGlyGluAlaPheTyrCysCysAspArgGlyHeGlyThrHeGlyAspGluPheAspSerHisProGlyLysCysProAspArgProPheCysProLysAsnGluTyrLeuArgHeGlyProArgProThrValCysAlaHisAspGlyGlnCysLysArgHisGluLysCysCysThrAspAlaCysLeuAsnHisHisThrCysLeuHeAla
Asp Pro His
其具有完整的編碼蛋白含有98個(gè)氨基酸，其中編碼序列的1-20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，成熟肽包含95個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量為10.581^&，等電點(diǎn)為6.74。成熟肽具有典型的I型Crustin模式結(jié)構(gòu),包含一個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域(Cys_rich region)和一個(gè)WAP 結(jié)構(gòu)域(WAP domain)。其中，富含半胱氨酸的區(qū)域中4個(gè)半胱氨酸殘基排列較為保守,呈 C- (X3) -C- (X8-12) -C-C模式；WAP結(jié)構(gòu)域包含8個(gè)半胱氨酸殘基，它們能夠形成四個(gè)二硫鍵核心(4-DSC)。三疣梭子蟹PtCrustin-2重組蛋白的獲得，具體操作如下根據(jù)SEQ ID No. 2對(duì)應(yīng)的cDNA序列，設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的特異性引物 F3 (5' GGATCCGGGACGCCTCCTATATCTGACA 3')和 R3(5' CTCGAGTTAAT GTGGGTCAGCAATCAGGC 3')，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼PtCrustin-2成熟肽的基因片段(參見(jiàn)圖 I)，反應(yīng)在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為94°C變性3min ;94°C變性30s，58。。退火50s，72。。延伸30s，34個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸lOmin。然后通過(guò)酶切將其克隆到pET32a(+)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)-plysS，測(cè)序確認(rèn)表達(dá)框正確后，接種陽(yáng)性克隆到LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至 O. D. 600 = O. 4-0. 6，加入IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)4小時(shí)后離心收集菌體。菌體在冰浴條件下用超聲波180W處理30-60min (每次2s，間隔2s)，離心去掉上清，收集沉淀(含重組蛋白包涵體)。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON柱純化重組產(chǎn)物。將純化的重組蛋白轉(zhuǎn)移到透析袋中，4°C條件下，在含有2mM還原谷胱苷肽、O. 2mM氧化谷胱苷肽、ImM EDTA、50mM Tris_HCl、50mM NaCl、10 %甘油和I %甘氨酸的及梯度降低的尿素 (6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M)的透析復(fù)性液(pH = 8. O)中透析，使重組蛋白復(fù)性，最后在50mM Tris-HCl (pH = 8. O)的緩沖液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析復(fù)性后的重組蛋白經(jīng)PALL公司的Microsep Advance超濾離心濃縮管進(jìn)行濃縮,用碧云天公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得三疣梭子蟹PtCrustin-2重組蛋白的濃度為2. 80mg/ml (參見(jiàn)圖2)。實(shí)施例3.三疣梭子蟹PtCrustin-2重組蛋白的體外抑菌試驗(yàn)I.微生物的培養(yǎng)及制備溶藻弧菌用TSB培養(yǎng)基28 V，銅綠假單胞菌用TSB培養(yǎng)基37°C，金黃色葡萄球菌用LB培養(yǎng)基37°C，藤黃微球菌用LB培養(yǎng)基37°C，畢赤酵母用YPD 培養(yǎng)基28°C，上述各菌株用搖床220rpm/min培養(yǎng)使菌濃度達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分別用50mM Tris-HCl (pH = 8. O)緩沖液稀釋菌體，分別使其每毫升菌液中的菌落數(shù)約為IX 103。2.重組蛋白PtCrustin-2抑菌活性測(cè)定利用上述實(shí)施例所得重組蛋白 PtCrustin-2 用 Tris-HCl (50mM, pH = 8. O)梯度稀釋(I、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、 1/128)后，取 50 μ I 加到無(wú)菌平底 96 孔板(Costar, Fisher)中，50 μ I Tris-HCl (50mM, pH = 8. 0)設(shè)為對(duì)照，然后加入50 μ I稀釋好的菌懸液，并且混勻。只加入50 μ I菌液的孔為空白孔。96孔板在菌液的培養(yǎng)溫度下孵育3小時(shí)后,加入相應(yīng)的培養(yǎng)基150 μ I,空白孔加入培養(yǎng)基200 μ 1，孵育過(guò)夜。加溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、畢赤酵母的96孔板在波長(zhǎng)為 560nm的可見(jiàn)光下讀數(shù),加金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的96孔板在波長(zhǎng)為600nm的可見(jiàn)光下讀數(shù)。發(fā)現(xiàn)上述實(shí)施例重組蛋白PtCrustin-2對(duì)革蘭氏陰性菌溶藻弧菌和銅綠假單胞菌、革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度分別為 24. 75 μ M、12. 37μΜ、49. 51μΜ、49. 51 μ M ;而對(duì)真菌畢赤酵母沒(méi)有明顯的抑制作用。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種三疣梭子蟹PtCrustin-2基因，其特征在于三疣梭子蟹PtCrustin_2基因?yàn)樾蛄斜鞸EQ ID No. I中的喊基序列所不。
2.—種權(quán)利要求I所述的三疣梭子蟹PtCrustin-2基因編碼蛋白，其特征在于所述 PtCrustin-2基因編碼蛋白為序列表SEQ ID No. 2中氣基酸序列所不。
3.一種按權(quán)利要求I所述的三疣梭子蟹PtCrustin-2基因的應(yīng)用，其特征在于所述三疣梭子蟹PtCrustin-2基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物用于制備抗菌藥物、免疫增強(qiáng)劑、 飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。
4.按權(quán)利要求3所述的三疣梭子蟹PtCrustin-2基因的應(yīng)用，其特征在于所述三疣梭子蟹PtCrustin-2基因編碼蛋白的重組表達(dá)產(chǎn)物用于制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌藥物。
5.按權(quán)利要求4所述的三疣梭子蟹PtCrustin-2基因的應(yīng)用，其特征在于所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌，革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種三疣梭子蟹PtCrustin-2基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。本發(fā)明利用cDNA文庫(kù)和RACE技術(shù)從三疣梭子蟹中擴(kuò)增到PtCrustin-2基因cDNA，該基因在三疣梭子蟹免疫防御方面發(fā)揮著重要作用。重組的PtCrustin-2蛋白具有顯著的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌活性，對(duì)溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的最小抑菌濃度分別為24.75μM、12.37μM、49.51μM、49.51μM；而對(duì)真菌畢赤酵母沒(méi)有明顯的抑制作用。本發(fā)明為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102586261SQ20121006457
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者劉媛, 宋呈文, 崔朝霞, 李希紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所