專利名稱：一種高表達(dá)賴氨酸的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及轉(zhuǎn)基因-克隆技術(shù)領(lǐng)域。用于在鼠奶中高表達(dá)賴氨酸重組蛋白，為建立高表達(dá)賴氨酸轉(zhuǎn)基因奶牛，生產(chǎn)賴氨酸含量高的牛奶奠定基礎(chǔ)
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因動物是按人類自己的意愿有目的、有計劃、有預(yù)見的改變動物的遺傳組成形成的一類動物。與動物生產(chǎn)有關(guān)的轉(zhuǎn)基因研究希望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來賦予動物新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)基因動物的制作方法目前主要有原核期胚胎的顯微注射，精子載體法，ES細(xì)胞技術(shù)，體細(xì)胞核移植技術(shù)等。賴氨酸是人體必需的8種氨基酸之一，可以調(diào)節(jié)人體代謝平衡，提高鈣的吸收、力口速骨骼生長，同時有促進(jìn)生長發(fā)育、增加食欲、減少疾病和增強(qiáng)體質(zhì)等作用。但是這樣重要的一種氨基酸，人體自身卻不能合成，必須從食物中獲得。而人類主食中賴氨酸含量普遍較低，是第一限制性氨基酸。因此，尋找高賴氨酸含量外源蛋白，補(bǔ)充賴氨酸攝入量的不足，對于人類健康是非常重要的。牛奶中蛋白質(zhì)、碳水化合物、鈣、鐵以及維生素等含量高，是非常優(yōu)良的天然蛋白，已經(jīng)作為候選蛋白在多種植物中得到表達(dá)，但是牛奶中賴氨酸的含量和比例卻不能彌補(bǔ)谷物中賴氨酸之缺乏，滿足人體對賴氨酸的需要。因此，增加牛奶蛋白中賴氨酸的含量，成為改善膳食營養(yǎng)的重要途徑之一，也一直為科學(xué)家所關(guān)注與重視。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在乳腺中表達(dá)編碼賴氨酸含量較高的外源蛋白，可以增加牛奶中賴氨酸的含量，補(bǔ)充人體必須的賴氨酸。目前，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)有約100種重組蛋白在動物乳腺中得到表達(dá)，但是在乳腺中高表達(dá)賴氨酸蛋白還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種高表達(dá)賴氨酸的基因，以解決在乳腺中還沒有高表達(dá)賴氨酸蛋白的問題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是該高表達(dá)賴氨酸基因的核苷酸序列如SEQ ID NO : I所述。該高表達(dá)賴氨酸的基因編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所述。本發(fā)明高賴氨酸基因的獲得，包括以下步驟利用BioEdit生物學(xué)軟件對牛奶中a -乳白蛋白、乳鐵蛋白、a s-，k-，￠-, y-酪蛋白及乳轉(zhuǎn)鐵蛋白中編碼賴氨酸的基因片段進(jìn)行比對，最終選取牛奶蛋白a-S2酪蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白和3 -酪蛋白中編碼賴氨酸含量高的基因片段，人工合成全長376bp的高表達(dá)賴氨酸基因LR ；乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建賴氨酸基因，連入去磷酸化的乳腺特異表達(dá)載體PBCl (Invitrogen, U. S. A)的多克隆位點，構(gòu)建賴氨酸基因乳腺特異表達(dá)載體(PBCl-LR)，經(jīng)測序后，確定連入序列與賴氨酸基因同源性達(dá)100%，且方向正確；以真核表達(dá)載體pGK-Neo-bpa(Soriano et al. , 1991 ；Invitrogen,U. S. A)為模板(PGK為磷酸甘油酸酯激酶啟動子，以PGK啟動子來驅(qū)動新霉素抗性基因neo的表達(dá)，以此來篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系)，克隆出真核細(xì)胞篩選標(biāo)記新霉素抗性基因(Neo)，并將其插入富含賴氨酸基因乳腺特異表達(dá)載體(PBCl-LR)，構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體 PBCl-neo-LR。 通過篩選牛奶蛋白中編碼賴氨酸含量較高的基因片段，將選定的編碼賴氨酸含量高的基因片段拼接，成為編碼富含賴氨酸的目標(biāo)基因，構(gòu)建賴氨酸基因乳腺特異表達(dá)載體；再通過原核注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠出生后傳代，最后利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、Southern、Western印跡技術(shù)原位雜交及氨基酸成分分析確定轉(zhuǎn)基因整合及表達(dá)情況?？紤]生物安全性并且為了使奶牛乳腺能特異表達(dá)外源基因，本發(fā)明選取牛奶蛋白中a-S2酪蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白和￠-酪蛋白三種蛋白里編碼賴氨酸含量高的cDNA序列，拼接三個片段形成編碼富含賴氨酸的重組目標(biāo)基因(LR)，構(gòu)建高效乳腺特異表達(dá)載體，為了驗證此載體，利用原核注射技術(shù)獲得賴氨酸轉(zhuǎn)基因小鼠，旨在獲得奶中表達(dá)賴氨酸含量高的蛋白產(chǎn)物，從而確定通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在牛奶中表達(dá)高賴氨酸含量外源蛋白，增加提高牛奶中賴氨酸含量的可能性。高表達(dá)賴氨酸轉(zhuǎn)基因載體制備可以幫助我們進(jìn)一步了解哺乳動物乳腺外源蛋白特別是本研究所選賴氨酸外源蛋白的分泌機(jī)制，為賴氨酸轉(zhuǎn)基因牛奶的研制奠定基礎(chǔ)。有益效果轉(zhuǎn)基因小鼠奶中表達(dá)賴氨酸含量高的蛋白產(chǎn)物，使奶中賴氨酸含量顯著提高。賴氨酸轉(zhuǎn)基因小鼠的研究可以為我們進(jìn)一步了解乳腺外源蛋白特別是本研究所選高賴氨酸含量外源蛋白的分泌機(jī)制，為轉(zhuǎn)賴氨酸基因牛奶的研制奠定基礎(chǔ)。


圖I乳腺特異表達(dá)載體、賴氨酸基因和賴氨酸蛋白結(jié)構(gòu)圖A.乳腺特異表達(dá)載體 pBCl-LR-NECf。2XP_globin insulator :2X P 雞珠蛋白絕緣原件；P -casein E1-E2 ^ -酪蛋白外顯子I,內(nèi)含子I和部分外顯子2 (位于起始密碼子之前)；LRgene :賴氨酸基因；casein E7-E9 ^ -酪蛋白外顯子7,內(nèi)含子7,外顯子8,內(nèi)含子 8 和外顯子 9 ;casein 3' genomic DNA : 0-casein 3'基因區(qū)域；pGK_Neor :由憐酸甘油酸酯激酶啟動子驅(qū)動的新霉素抗性基因；Sal I，XhoI為酶切位點。B.賴氨酸基因結(jié)構(gòu)。選擇基因序列Casein beta, ￠-酪蛋白(Genbank :NM_181008. 2,氨基酸 111-129，核苷酸 391-447)，casein alpha_s2，a-s2 酪蛋白(Genbank NM_174528. 2，氨基酸 151-215，核苷酸 507-701)，lactotransferrin,乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(Genbank NM_180998. 2，氨基酸282-310，核苷酸984-1043)，三段拼接形成融合基因LR(5’ a-s2酪蛋白，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，￠-酪蛋白3’)，拼接基因5’端加牛P -酪蛋白信號肽，3’端加終止密碼子TAATAG，基因兩端分別添加兩個XhoI酶切位點及兩個保護(hù)堿基。C.賴氨酸基因及蛋白序列?；騼啥朔謩e我XhoI酶切位點及保護(hù)堿基，氨基酸1-15核苷酸9-53為信號肽,氨基酸16-80核苷酸54-248來源于a -s2酪蛋白，氨基酸 81-100核苷酸249-308及氨基酸101-118核苷酸309-362分別來源于乳轉(zhuǎn)鐵蛋白和P -酪蛋白。圖2利用原核注射的方法制做轉(zhuǎn)賴氨酸基因小鼠A.原核注射B.初生轉(zhuǎn)基因小鼠
圖3轉(zhuǎn)賴氨酸基因小鼠的篩選A.轉(zhuǎn)賴氨酸基因小鼠PCR篩選M :DNA標(biāo)準(zhǔn)2000 ;0、4、10 :原代轉(zhuǎn)基因小鼠0號、4
號及10號；N :非轉(zhuǎn)基因小鼠對照；C :空白對照。B.轉(zhuǎn)賴氨酸基因小鼠Sou thern blot分析。5、25、50為陽性對照拷貝數(shù)5、25和50 ；NC :非轉(zhuǎn)基因鼠對照；1、2、3 0號、4號及10號轉(zhuǎn)基因小鼠基因組。圖4泌乳期轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺LR mRNA表達(dá)RT-PCR檢測A.雌性轉(zhuǎn)基因Tg-4-15 I :心；2 :肝；3 :脾；4 :肺；5 :腎；6 :肌肉；7 :卵巢；8 :乳腺；9 :非轉(zhuǎn)基因鼠乳腺10 :陽性對照；11 :水對照B.雄性轉(zhuǎn)基因Tg-4-30 I :心；2 :肝；3 :脾；4 :肺；5 腎；6 :肌肉；7 :睪丸；8 :非轉(zhuǎn)基因鼠睪丸9 :陽性對照；10 :水對照；C.雄性轉(zhuǎn)基因Tg-4-35 I :心；2 :肝；3 :脾；4 :肺；5 腎;6 :肌肉；7 :睪丸；8 :非轉(zhuǎn)基因鼠睪丸9 :陽性對照；10 :水對照；圖5轉(zhuǎn)賴氨酸基因鼠奶中LR蛋白的表達(dá)分析A.轉(zhuǎn)基因奶樣SDS-PAGE電泳分析。M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1_3 :轉(zhuǎn)基因小鼠Tg-10-16、Tg-4-15、Tg-0-17奶蛋白；NC 非轉(zhuǎn)基因鼠奶陰性對照。B.轉(zhuǎn)基因奶樣 Western blotting 分析。M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1_3 :轉(zhuǎn)基因小鼠Tg-10-16、Tg-4-15、Tg-0-17奶蛋白；NC 非轉(zhuǎn)基因鼠奶陰性對照。C. F0、FI、F2 代轉(zhuǎn)基因小鼠奶樣 Western blotting 分析。圖6不同轉(zhuǎn)基因系轉(zhuǎn)基因奶樣賴氨酸含量分析。A.轉(zhuǎn)基因系(line-0、line-4, line-10)與野生型對照(NC)賴氨酸含量分析，line 10、line 4與對照組相比賴氨酸含量差異極顯著B. XN2011135野生型對照L-8800AAA分析系統(tǒng)報告(賴氨酸含量為0. 667g/100g)，▼所指峰位賴氨酸；C. XN2011137轉(zhuǎn)基因鼠Tg_10_45奶樣中賴氨酸含量(賴氨酸含量為
I.057g/100g)，▼所指峰位賴氨酸。圖7高賴氨酸奶對哺乳期小鼠體重增長的影響組I :飲賴氨酸轉(zhuǎn)基因奶的陽性轉(zhuǎn)基因鼠(n = 56);組2 :飲高賴氨酸奶的同窩陰性小鼠(n = 36);組3:飲普通鼠奶的野生型小鼠(n = 25)。組I、組2與組3相比，差異顯著(*，P < 0. 05)。
具體實施例方式實施例I拼接賴氨酸基因選取天然存在的奶蛋白富含賴氨酸序列￠-酪蛋白(casein beta,aalll_129,bp391-447，外顯子 7，Genbank :NM_181008. 2)，a-S2 酪蛋(casein alpha_s2，aa 151-215，bp 507-701,外顯子 2, Genbank :NM_174528. 2),和乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(lactotransferrin, aa282-310，bp 984-1043，外顯子 8，Genbank :NM_180998. 2)，以 5’ a-S2 酪蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白和￠-酪蛋白3’拼接為賴氨酸基因(圖1B).通過BLAST分析三個肽段與任何毒性蛋白都沒有同源性。賴氨酸基因LRcDNA序列5’ -端再加上?！?酪蛋白信號肽序列。重組LR基因長度為376bp包括一個牛P -酪蛋白信號肽序列(bp 9-53)，LR基因gene編碼區(qū)(bp 54-248，bp 249-308和bp 309-362分別來源于a-S2酪蛋，3 -酪蛋白和乳鐵蛋白)，兩個終止密碼子(TAATAG)，兩個XhoI限制性酶切位點(CTCGAG)和一對保護(hù)堿基(CGand CG)(圖1C). LR蛋白為14. 02Kda(切除信號肽)，賴氨酸含量為25. 24% (26/103)，包括118個氨基酸，其中含15個氨基酸的信號肽(aa 1-15), a-S2酪蛋白肽段(aa 16-80,賴氨酸含量21.54% )，￠-酪蛋白肽段(aa 81-100，賴氨酸含量26. 31 %)，轉(zhuǎn)鐵蛋白肽段(aa 101-118，賴氨酸含量為 30%) ( 0 1C).該LR編碼蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO 2所述。 LR基因片段組成如下(I)XhoI 限制性內(nèi)切酶位點(兩端)(16bp) :5’ -CGCTCGAG-3’ 和 5’ -CTCGAGCG-3’(2) 酪蛋白信號肽序列(45bp) :5’ -ATG AAG TTC TTC ATC TTT ACC TGC CTTTTGGCT GTT GCC CTT GCA-3’(3) a S2-釀蛋白(來源于 casein alpha_s2 的 aa 151-215, bp 507-701, Genbank :NM_174528. 2，位于 LR 基因的 bp 54-248)5， -AAGAAGACCGTTGACATGGAATCAACAGAAGTATTCACTAAGAAAACTAAACTGACTGAAGAAGAAAAGAATCGCCTAAATTTTCTGAAAAAAATCAGCCAGCGTTACCAGAAATTCGCCTTGCCCCAGTATCTCAAGACTGTTTATCAGCATCAGAAAGCTATGAAGCCATGGATTCAACCTAAGACAAAGGTT-3，(4)P_ 釀蛋白(來源于 casein beta 的 aa 111-129, bp 391-447, Genbank NM_181008. 2，位于 LR 基因的 bp 249-308)5，-TCCAAAGTGAAGGAGGCTATGGCTCCTAAGCAAAAAGAAATGCCCTTCCCTAAA-3，(5)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(來源于 lactotransferrin 的 aa 282-310, bp 984-1043,Genbank :NM_180998. 2，位于 LR 基因的 bp 309-362)；5， -AAGGAAGACTTGATCTGGAAGCTTCTCAGCAAGGCGCAGGAGAAATTTGGAAAAAACAAG-3，(6)終止密碼子(6bp) :5’ -TAATAG-3’全長376bp的賴氨酸基因LR序列如SEQ ID NO :1所述。實施例2賴氨酸基因乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建I、實驗過程LR 基因以 XhoI 連入 pBCl 表達(dá)載體(Invitrogen, U. S. A.) ,DNA 測序證明 pBCl-LR的正確性。為獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，真核篩選標(biāo)記Nec/(新霉素抗性基因)，以Not I插入富含賴氨酸基因乳腺特異表達(dá)載體(PBCl-LR)，構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體PBCl-neo-LR。乳腺特異表達(dá)載體包括LR基因編碼區(qū)；羊￠-酪蛋白啟動子；￠-酪蛋白3'基因組序列外顯子1，內(nèi)含子I，部分外顯子2 (位于起始密碼子之前)，外顯子7，外顯子7，外顯子8,內(nèi)含子8,和外顯子9 ;兩個雞P _珠蛋白絕緣子；真核篩選標(biāo)記Neo1X圖1A).2、實驗結(jié)果通過PCR及酶切鑒定得到大小與預(yù)期一致片段，最后，測序分析證明序列同源性為 100%。3、結(jié)論得到了目標(biāo)基因插入方向正確并連入真核細(xì)胞篩選標(biāo)記neo的乳腺特異表達(dá)載體 PBCl-loxp-neo-loxp-LR。實施例3表達(dá)賴氨酸轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立I、昆明白和ICR小鼠購自吉林大學(xué)實驗動物中心,動物飼養(yǎng)按照標(biāo)準(zhǔn)光照規(guī)律(14h光照/IOh黑夜)。2、實驗過程 2. I小鼠原核注射注射6周齡雌性ICR小鼠腹腔注射10 IU孕馬血清(PMSG，Ningbo，China)，隔48小時注射人絨毛膜促性腺激素(hCG，Ningbo, China)進(jìn)行超數(shù)排卵。注射hCG后的超數(shù)排卵雌性ICR小鼠與雄性昆明白以I : I比例合籠，檢栓確定合子準(zhǔn)備情況；檢栓確定后小鼠于0. 5天處死收集合子，0. 2%透明質(zhì)酸酶處理。線性化乳腺特異表達(dá)載體PBCl-loxp-neo-loxp-LR,稀釋至2到3ng/mL,在倒置顯微鏡下顯微注射于受精卵雄原核，顯微注射受精卵于5% C02，37°C過夜培養(yǎng)于KSOM中，二細(xì)胞階段移入同期發(fā)情的假孕ICR鼠輸卵管。本發(fā)明共注射受精卵823個，成活721移植于25個受體，出生后代19個，其中經(jīng)PCR鑒定3只為轉(zhuǎn)基因小鼠，兩只雌鼠一只雄鼠，轉(zhuǎn)基因整合率為15. 3%。原代轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型昆明白回交產(chǎn)生Fl代轉(zhuǎn)基因小鼠13只，后代轉(zhuǎn)基因傳代比例為37. 5%，46. 5%和48. 3%，對轉(zhuǎn)基因小鼠及后代進(jìn)行檢測。賴氨酸轉(zhuǎn)基因小鼠見圖2。2. 2 PCR及Southern blot分析轉(zhuǎn)基因小鼠賴氨酸基因整合情況以載體特異性引物為鑒定引物，P-actin為內(nèi)參引物，篩選轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR反應(yīng)體系為 25 ii L : 10 X PCR Buffer (含 25mmol/L MgCl2) 2. 5 u L, dNTP (2. 5mmol/L) 2 u L,上、下游引物(IOpmoI/L)各 luL，ExTaqDNA 聚合酶(5U/y L) 0. 125 y L，基因組(200ng/U L)0. 5u L0 PCR 反應(yīng)條件94°C 5min,94°C 30s,58°C 30s,72°C lmin，30 個循環(huán)，最后 72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，回收目的片段。將已純化的目的基因片段連接到PGEM-T載體，轉(zhuǎn)化至ToplO中，挑取單克隆經(jīng)PCR鑒定后，送北京華大基因有限公司測序。pBCl載體特異性引物上游，5'-GATT GACAAGTAATACGCTGTTTCCTC-3'下游，5'-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3'P-actin 引物上游，5' -GATATCGCTTGCGCTGGTCGTC-3'下游，5'-ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGRGG-3' ) EcoRI酶切20 ii g轉(zhuǎn)賴氨酸小鼠肝臟基因DNA(—只非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至Hybond-N膜(Invitrogen，U. S. A.)。利用羅氏PCR DIG探針合成試劑盒(Roche Applied Sciences, Mannheim, Germany)標(biāo)記 277bp LR 特異性探針。標(biāo)記探針 PCR 參數(shù)為94°C 5min,94°C 30s,58 °C 30s,72 °C lmin，30 個循環(huán)，最后 72 °C 延伸7min。探針?biāo)靡镄蛄幸姳?。雜交及免疫分析按照DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit (Roche Applied Sciences, Mannheim, Germany)說明進(jìn)行。southern探針引物如下上游，5'-GAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCA-3'下游，5'-TGCAGAATTCGAAGCTTGAGC-3'
通過PCR及southern blot檢測證明轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶HL基因，而且完整整合于小鼠基因組中，拷貝數(shù)在2到50之間，并且Ftl, F1和F2各世代之間拷貝數(shù)并未發(fā)現(xiàn)明顯丟失，說明轉(zhuǎn)基因整合在各世代之間能夠穩(wěn)定遺傳；(圖3)2. 3RT-PCR 分析 LRmRNA 表達(dá)利用RT-PCR檢測泌乳期轉(zhuǎn)基因小鼠Tg-4-15 (轉(zhuǎn)基因系Tg_4，F(xiàn)l代)乳腺組織中LRmRNA的表達(dá)，取乳腺提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR檢測，產(chǎn)物大小為376bp。對RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，產(chǎn)物序列與我們設(shè)計的賴氨酸基因序列同源性達(dá)到100%。RT-PCR所用引物見表2.分別對雌性(Tg-4-15)和雄性(Tg-4-30)小鼠的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢(雌性)、乳腺(雌性)和睪丸(雄性)mRNA進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果表明在雌性，檢測到所轉(zhuǎn)基因LRmRNA的表達(dá)，且嚴(yán)格限制于乳腺組織即乳腺特異表達(dá)，并無異位表達(dá)現(xiàn)象。但是，在雄性轉(zhuǎn)基因小鼠，睪丸中檢測到了低水平的異位表達(dá)(圖4)。HL 基因上游5'-GCGAGCTCATGAAGTTCTTCATCTTTAC-3'下游5'-GCCTCGAGCTATTATTTAGGGAAGGGCATTTC-3'GAPDH 上游5'-CGACTTCAACAGCGACACTCAC-3'下游5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3')2. 4鼠奶中賴氨酸蛋白表達(dá)檢測將奶樣稀釋10倍后于沸水中煮沸3_5min，冷卻后加入上樣緩沖液，5%的濃縮膠，12%的分離膠，用于SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色、充分脫色。Tg-10、Tg-4出現(xiàn)約14. IkDa的強(qiáng)條帶，初步表明LR蛋白在轉(zhuǎn)基因鼠奶中高水平表達(dá)。利用LR特異性單克隆抗體，檢測奶樣中LR蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)Western blot分析,非轉(zhuǎn)基因陰性對照奶樣沒有檢測到任何條帶，轉(zhuǎn)基因小鼠在14. IkDa處出現(xiàn)了 LR蛋白的特異性雜交條帶(圖5)。轉(zhuǎn)基因小鼠Tg-IO，Tg-4和Tg-O出現(xiàn)不同強(qiáng)度的雜交條帶，表明不同轉(zhuǎn)基因之間在LR表達(dá)量之間存在差異。2. 5奶樣中賴氨酸含量分析通過Western blot分析已經(jīng)證明鼠奶中表達(dá)了高水平的LR蛋白，為了確定高表達(dá)的LR蛋白是否導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因鼠奶氨基酸含量的變化，尤其是賴氨酸，我們利用L-8800型氨基酸全自動分析儀對不同世代不同轉(zhuǎn)基因系的鼠奶樣品進(jìn)行了氨基酸含量分析。以非轉(zhuǎn)基因鼠奶樣為陰性對照(NC)，比較氨基酸含量變化。從泌乳期第5天起開始收集奶樣，鼠奶每隔一天采集一次。轉(zhuǎn)基因鼠奶與野生型相比，顏色微黃。轉(zhuǎn)基因系Tg-IO和Tg-4鼠奶 中賴氨酸水平顯著提高，但是轉(zhuǎn)基因系Tg-O與對照相比差異不顯著。轉(zhuǎn)基因系Tg-IO和Tg-4鼠奶中賴氨酸水平(0. 785-1. 057g/100g)顯著高于野生型對照(0. 606-0. 732g/100g)(p < 0. 05)(圖 6)。2. 6高表達(dá)賴氨酸轉(zhuǎn)基因鼠奶對哺乳期小鼠體重增長的影響轉(zhuǎn)基因鼠后代出生后，每天測量其體重變化，確定高表達(dá)賴氨酸鼠奶是否能夠促進(jìn)哺乳期小鼠的生長。共測轉(zhuǎn)基因小鼠后代共10窩(Tg-IO轉(zhuǎn)基因系后代)(n = 92，飲轉(zhuǎn)基因奶)，其中陽性轉(zhuǎn)基因小鼠為56只(group I)，剩余的36只為同窩陰性小鼠(group 2)，3窩非轉(zhuǎn)基因小鼠作為對照(n = 25，飲普通鼠奶，group 3)。結(jié)果表明來源于轉(zhuǎn)基因系Tg-IO的后代轉(zhuǎn)基因小鼠(group I)與來源于Tg-IO的同窩后代非轉(zhuǎn)基因小鼠(group 2)與飲普通鼠奶的野生型小鼠(group 3)相比，體重顯著增加11. 2%和10. 8% (p < 0. 05)(圖7)。groupl和group2之間沒有觀察的明顯差異，說明導(dǎo)致小鼠體重增長差異的主要因素是飲用高賴氨酸奶，而不是轉(zhuǎn)基因本身。3、實驗結(jié)果目前該轉(zhuǎn)基因鼠已經(jīng)傳至第5代，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平并無下降。通過實驗證明賴氨酸基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到小鼠基因組中并穩(wěn)定遺傳，賴氨酸蛋白能夠在奶中高效表達(dá)，并顯著提高了奶中賴氨酸含量，并對小鼠泌乳期體重增加具有顯 著促進(jìn)作用。4、結(jié)論成功構(gòu)建高表達(dá)賴氨酸轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
權(quán)利要求
1.一種高表達(dá)賴氨酸的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所述。
2.如權(quán)利要求I所述的該高表達(dá)賴氨酸的基因編碼蛋白，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO 2 所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高表達(dá)賴氨酸的基因，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。高表達(dá)賴氨酸的基因其核苷酸序列如SEQIDNO1所述，該高表達(dá)賴氨酸的基因編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO2所述。轉(zhuǎn)基因小鼠奶中表達(dá)賴氨酸含量高的蛋白產(chǎn)物，使奶中賴氨酸含量顯著提高。賴氨酸轉(zhuǎn)基因小鼠的研究可以為我們進(jìn)一步了解乳腺外源蛋白特別是本研究所選高賴氨酸含量外源蛋白的分泌機(jī)制，為轉(zhuǎn)賴氨酸基因牛奶的研制奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C07K19/00GK102634530SQ20121007443
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者唐博, 安培培, 張勝, 張鵬, 李子義, 歐陽紅生, 殷玉鵬, 趙志輝, 陳玥, 馬馨 申請人:吉林大學(xué)