專利名稱：具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種乳清蛋白肽與糖進行美拉德反應的改性方法，具體的說，本發(fā)明涉及一種具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽及其制備方法和應用。本發(fā)明屬于食品添加劑領域
背景技術：
蛋白通過與糖進行美拉德反應可以改善蛋白的許多功能性，如水溶性，熱穩(wěn)定性、乳化性、抗氧化性等，可以應用于食品添加劑、保健品、藥物載體等領域。但使用蛋白多肽進行美拉德反應的研究比較少見。乳清蛋白本身就具有一定的抗氧化作用，而水解后的乳清蛋白肽抗氧化效果得到了提升，目前已有關于乳清蛋白水解物在鐵催化卵磷脂脂質氧化體系、銅催化脂質氧化體系中抗氧化作用的研究；還有利用乳清蛋白、α-乳白蛋白和β_乳球蛋白制備抗氧化肽，及將乳清水解物應用于煮制的豬肉餡餅中減少冷藏過程中脂類氧化的報道。既然蛋白的糖基化反應與蛋白的水解反應都有提升抗氧化效果，那么將二者有機的結合，就會制備出高效的抗氧化產(chǎn)品。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種制備具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽的方法；本發(fā)明的目的之二在于提供一種由本發(fā)明方法制備得到的具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽；本發(fā)明的目的之三在于提供本發(fā)明的具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽在制備抗氧化劑中的應用。為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明的一種制備抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽的方法，其特征在于包括以下步驟(I)將乳清蛋白溶液進行熱處理；(2)熱處理后的乳清蛋白溶液降溫后加入堿性蛋白酶進行水解反應；(3)水解反應產(chǎn)物經(jīng)滅酶，加入糖加熱進行糖基化反應；(4)冷卻，離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，即得。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(I)中所述的乳清蛋白溶液的濃度為2-10% (w/w)，優(yōu)選為5% (w/w);所述的熱處理為將乳清蛋白溶液在90-98°C溫度下處理3-8分鐘；更優(yōu)選的，將乳清蛋白溶液在95°C溫度下處理5分鐘，然后冷卻。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中所加入的堿性蛋白酶的體積與乳清蛋白底物的重量比為(I 3) 100，也就是相當于每IOOg的乳清蛋白底物所需要的堿性蛋白酶的體積為l-3mL,優(yōu)選為2mL。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所采用的乳清蛋白溶液的質量濃度為5% (w/w),如果乳清蛋白溶液的總重量為lOOOg，則其中所含有的乳清蛋白底物為50g，按照所加入的堿性蛋白酶的體積與乳清蛋白底物的重量比為2 100計算，應加入堿性蛋白酶的體積為Imlo其中，堿性蛋白的酶活力為1-20萬U/g。堿性蛋白酶是經(jīng)細菌原生質體誘變方法造育的2709枯草桿微生物通過深層發(fā)酵、提取及精制而成的一種蛋白水解酶，屬于一種絲氨酸胞外高堿性蛋白酶，它能水解蛋白質分子肽鏈生成多肽或氨基酸，具有較強的分解蛋白質的能力。主要成分為枯草桿菌蛋白酶，是一種內切酶，催化部位為絲氨酸，分子量約為27300Da。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的水解反應在以下條件下進行水解反應溫 度為50-60°C，pH值為8. 0-9. 0，水解反應時間為4_6小時；更優(yōu)選的，在以下條件進行水解反應水解反應溫度為65°C，pH值為8. 5，水解反應時間為5小時。本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)，采用此水解條件進行水解反應，水解度(DH)可以達到35. 30%。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(3)中所述的糖基化反應在以下條件下進行pH值8. O 9. 0，水解得到的多肽混合液加入糖，使加入的糖的終濃度為6 10% (w/w)，在50 90°C溫度下攪拌加熱3 5小時，其中，所述的糖優(yōu)選為葡萄糖。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中所述的離心步驟所采用的離心力為1000 1200 X g，離心的時間為10 15min。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，還包括在糖基化反應結束后，冷卻，離心之前將糖基化的產(chǎn)物進一步進行分離，得到分子量在800-5000Da之間的多肽混合物，得到的混合物再經(jīng)過冷卻，離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，即得。優(yōu)選的，所述的將糖基化的產(chǎn)物進一步進行分離，采用的是超濾的方法，優(yōu)選采用中空纖維膜進行，膜孔徑分別為800Da、5000Da，超濾的溫度為20°C，壓力為O. IMPa0采用中空纖維超濾膜對糖基化產(chǎn)物進行分離，所得到的產(chǎn)物主要含有分子量為800-5000Da的糖基化乳清蛋白多肽，具有高的抗氧化活性和清除自由基的能力。本發(fā)明還提供了由本發(fā)明所述的方法制備得到的糖基化乳清蛋白多肽，優(yōu)選的，所述的糖基化乳清蛋白多肽主要由分子量在800-5000Da之間的混合糖基化乳清蛋白多肽組成。進一步的，本發(fā)明還提供了所述的糖基化乳清蛋白多肽在制備抗氧化劑中的應用。實驗證明，本發(fā)明所述的糖基化乳清蛋白多肽，其抗氧化活性穩(wěn)定，在加熱溫度為50-95°C、pH值為4-8、光照以及防腐劑(苯甲酸鈉)的作用下都能夠保持非常穩(wěn)定的抗氧化活性。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的制備方法操作簡單，與其他合成抗氧化劑相比安全可靠，適合工業(yè)化生產(chǎn)，能夠大幅度提高乳清蛋白資源的利用率，提高乳清綜合利用的水平。所制備的糖基化乳清蛋白抗氧化肽抗氧化活性高，穩(wěn)定性強。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實驗材料購買來源堿性蛋白酶購自西安沃爾森生物技術有限公司；產(chǎn)品編號E⑶063，酶活力1-20萬 U/g ；乳清蛋白購買自美國Hilmar公司；產(chǎn)品編號9410乳清分離蛋白，蛋白含量92. 8%。
中空纖維膜為美國FS-TFC流體膜實施例I乳清蛋白溶液濃度為5% (w/w)，在95°C，5min的熱處理之后，降到60°C溫度，加入堿性蛋白酶進行水解，所加入的堿性蛋白酶的體積與乳清蛋白底物的重量比為2 100，也就是相當于每IOOg的乳清蛋白底物所需要的堿性蛋白酶的體積為2mL，在溫度為60°C、pH值為8. 5的條件下，水解5h(經(jīng)檢測，水解度(DH)達到了 35. 30% );將水解產(chǎn)物經(jīng)煮沸滅酶，再加入葡萄糖，使加入的葡萄糖的終濃度達到8% (w/w)，在90°C下攪拌加熱3h，反應后迅速降溫，經(jīng)1200Xg離心lOmin，除去沉淀，上清液濃縮，冷凍干燥，即得。實施例2乳清蛋白溶液濃度為2% (w/w)，在90°C，8min的熱處理之后，降到60°C溫度，力口入堿性蛋白酶進行水解，所加入的堿性蛋白酶的體積與乳清蛋白底物的重量比為2 100，也就是相當于每IOOg的乳清蛋白底物所需要的堿性蛋白酶的體積為2mL，在溫度為50°C、pH值為8. O的條件下，水解4h ;將水解產(chǎn)物經(jīng)煮沸滅酶，再加入葡萄糖，使加入的葡萄糖的終濃度達到6% (w/w),在60°C下攪拌加熱4h,反應后迅速降溫,經(jīng)IOOOXg離心15min,除去沉淀，上清液濃縮，冷凍干燥，即得。實施例3乳清蛋白溶液濃度為5% (w/w)，在95°C，5min的熱處理之后，降到60°C溫度，加入堿性蛋白酶進行水解，所加入的堿性蛋白酶的體積與乳清蛋白底物的重量比為2 100，也就是相當于每IOOg的乳清蛋白底物所需要的堿性蛋白酶的體積為2mL，在60°C溫度、pH值8. 5的條件下，水解5h(經(jīng)檢測，水解度(DH)達到了 35. 30% );將水解產(chǎn)物經(jīng)煮沸滅酶，再加入葡萄糖，使加入的葡萄糖的終濃度達到8% (w/V)，90°C下攪拌加熱3h，反應后迅速降溫，經(jīng)1200 Xg離心15min，除去沉淀，上清液經(jīng)過超濾再進行冷凍干燥而制成，超濾采用中空纖維膜進行，膜孔徑分別為800Da、5000Da，超濾的溫度為20°C，壓力為0. IMPa0得到主要含有分子量為800-5000Da之間的糖基化乳清蛋白多肽的混合物。實施例4乳清蛋白溶液濃度為10% (w/w)，在98°C，8min的熱處理之后，降到60°C溫度，力口入堿性蛋白酶進行水解，所加入的堿性蛋白酶的體積與乳清蛋白底物的重量比為3 100，也就是相當于每IOOg的乳清蛋白所需要的堿性蛋白酶的體積為3mL，在60°C溫度、pH值9.0的條件下，水解6h ;將水解產(chǎn)物經(jīng)煮沸滅酶，再加入葡萄糖，使加入的葡萄糖的終濃度達到10% (w/w), 75°C下攪拌加熱4h,反應后迅速降溫,經(jīng)1000 Xg離心15min,除去沉淀，上清液經(jīng)過超濾再進行冷凍干燥而制成，超濾采用中空纖維膜進行，膜孔徑分別為800Da、5000Da，超濾的溫度為20°C，壓力為O. IMPa0得到主要含有分子量為800_5000Da之間的糖
基化乳清蛋白多肽的混合物。試驗例I本發(fā)明糖基化乳清蛋白多肽的抗氧化活性試驗I、供試樣品實施例I和實施例3所制備的糖基化乳清蛋白多肽；2、試驗方法及結果抗氧化活性在卵磷脂脂質氧化體系(簡稱Lipsome氧化體系)中進行，Lipsome氧化體系配制方法為稱取O. 89472g氯化鉀，O. 0776g組氨酸，加水稀釋到IOOmL,調其pH值到6. 8，再取純度20 %的大豆卵磷脂Ig溶于氯化鉀-組氨酸緩沖溶液中，制成2mg/mL的脂質體。進行抗氧化試驗時取稀釋10倍的脂質體5mL，加入樣品lmL，以及加入O. ImL50mm Fecl3溶液和O. ImL IOmm抗壞血酸鹽溶液，37°C水浴lh，糖基化乳清蛋白抗氧化肽的TBARS (硫代巴比妥酸值)2. 03mg/L,與乳清蛋白相比降低40-50%，與水解后的乳清蛋白肽相比降低10-20% ;還原能力(FRAP值)1873μπι0Ιν1，與乳清蛋白相比提高了 6_8倍，與水解后的乳清蛋白肽相比提高了 2-3倍；對ABTS自由基的清除率84. 23%，與乳清蛋白相比提高7-8倍，與水解后的乳清蛋白肽相比提高了 3-4倍；羥基清除率59. 31%，與乳清蛋白相比提高8-10倍，與水解后的乳清蛋白肽相比提高了 4-5倍。將所得到的糖基化乳清蛋白抗氧化肽經(jīng)過中空纖維超濾膜分為分子量分布范圍不同的三段0. 8KDa以下，O. 8-5KDa，5KDa以上。其中O. 8_5KDa效果最好，TBARS(硫代巴比妥酸值)1.86 (mg/L);還原能力(FRAP值)2118 μ moL/L J^ABTS自由基的清除率99. 08%;羥基清除率66. 23%, Cu2+螯合能力達88. 28%, Fe2+螯合能力達41.47%.試驗例2本發(fā)明糖基化乳清蛋白多肽的抗氧化活性穩(wěn)定試驗供試樣品實施例1-4所制備的糖基化乳清蛋白多肽； 在加熱溫度為50_95°C、pH值為4-8、光照以及防腐劑(苯甲酸鈉)的作用下測定抗氧化活性(還原能力FRAP值，對ABTS自由基的清除率)。結果表明糖基化乳清蛋白多肽在以上條件變化下，抗氧化活性變化極小，仍然具有較強的抗氧化活性。
權利要求
1.一種制備具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將乳清蛋白溶液進行熱處理； (2)熱處理后的乳清蛋白溶液降溫后加入堿性蛋白酶進行水解反應； (3)水解反應產(chǎn)物經(jīng)滅酶后，加入糖，加熱，進行糖基化反應； (4)冷卻，離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，即得。
2.按照權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述的乳清蛋白溶液的濃度為2-10% (w/w)，優(yōu)選為5% (w/w);所述的熱處理為將乳清蛋白溶液在90-98°C溫度下處理3-8分鐘；優(yōu)選的，將乳清蛋白溶液在95°C溫度下處理5分鐘，然后冷卻。
3.按照權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中所加入的堿性蛋白酶的體積與乳清蛋白底物的重量比為(I 3) 100，即每IOOg的乳清蛋白底物所需要的堿性蛋白酶的體積為l_3ml，優(yōu)選為2ml。
4.按照權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的水解反應在以下條件下進行水解反應溫度為50-60°C，pH值為8. 0-9. 0，水解反應時間為4_6小時；優(yōu)選的，在以下條件進行水解反應水解反應溫度為65°C，pH值為8. 5，水解反應時間為5小時。
5.按照權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的糖基化反應在以下條件下進行pH值8. O 9. 0，水解得到的多肽混合液加入糖，使加入的糖的終濃度為6 10% (w/w),在50 90°C溫度下攪拌加熱3 5小時,其中，所述的糖為葡萄糖。
6.按照權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述的離心步驟所采用的離心力為1000 1200 X g，離心的時間為10 15min。
7.按照權利要求I所述的方法，其特征在于還包括在糖基化反應結束后，將糖基化的產(chǎn)物進一步進行分離，得到分子量在800-5000Da之間的多肽混合物。
8.按照權利要求7所述的方法，其特征在于所述的將糖基化的產(chǎn)物進一步進行分離，采用的是超濾的方法，優(yōu)選采用中空纖維膜進行，膜孔徑分別為800Da、5000Da，超濾的溫度為20°C，壓力為O. IMPa0
9.由權利要求1-8任一項所述的方法所制備得到的糖基化乳清蛋白多肽，優(yōu)選的，所述的糖基化乳清蛋白多肽主要由分子量在800-5000Da之間的混合糖基化乳清蛋白多肽組成。
10.權利要求9所述的糖基化乳清蛋白多肽在制備抗氧化劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽及其制備方法和應用。本發(fā)明的一種制備具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白抗氧化肽的方法，是將乳清蛋白先通過堿性蛋白酶水解為蛋白肽后，經(jīng)煮沸滅活酶活力、冷卻、再與糖混合一定溫度攪拌加熱，進行美拉德反應一定時間后迅速降溫、離心除去沉淀，上清液可直接進行冷凍干燥，或經(jīng)過超濾再進行冷凍干燥。按照本發(fā)明的方法制備得到的糖基化乳清蛋白多肽，其具有較強的抗氧化作用，較許多天然抗氧化劑穩(wěn)定性強，并且使用的原料均為可食用的食品，所以安全性高。
文檔編號C07K1/107GK102628073SQ20121008571
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權日2012年3月28日
發(fā)明者刁新平, 孔保華, 孫常雁, 孫瑤 申請人:東北農業(yè)大學