專利名稱：利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的是涉及一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代分析測試技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的醫(yī)藥化合物具有手性結(jié)構(gòu)特征，即具有相互呈鏡像但彼此不能重合的對映異構(gòu)體；手性藥物的對映異構(gòu)體通常表現(xiàn)出不同的生理行為，具有不同甚至截然相反的藥效[J. Chromat. A，2001，906，3-33]。因此，研究開發(fā)具有光學(xué)純度的手性藥物已成為醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。制備具有光學(xué)純度的手性藥物需要依托不對稱合成和手性拆分技術(shù)，而關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)和研制具 有高立體選擇性的手性拆分劑。目前，優(yōu)先結(jié)晶法、手性膜拆分法、色譜拆分法、酶拆分法等手性拆分技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于手性藥物對映體的研究和制備中[Anal. Chem. 2010,82,4712-4722]。然而現(xiàn)有的這些方法都難以實(shí)現(xiàn)單一對映體的高效制備，通常得到的都是不同對映體的混合物。因此，如何調(diào)控手性拆分劑以實(shí)現(xiàn)對手性藥物不同對映異構(gòu)體的高效分子識別成為當(dāng)今科學(xué)家們亟待研究的一個課題[Nature Materials，2003，2，272-278]。DNA作為生物體內(nèi)儲存遺傳信息的重要物質(zhì)，因其獨(dú)特的手性結(jié)構(gòu)特征和分子識別特性，已成為材料和信息科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[Chirality，2007，19 :658-682 ；Science,2008，321，1795-1799]，特別是利用DNA分子組裝體為模板引導(dǎo)蛋白質(zhì)、量子點(diǎn)、過渡金屬等構(gòu)筑單元的準(zhǔn)確定位，以形成多尺度結(jié)構(gòu)特征的、功能化超分子組裝體[NatureNanotechnol. ,2006,1,190-194]。另一方面,從化學(xué)和生物學(xué)的角度,利用分子納米技術(shù)可以調(diào)控和設(shè)計(jì)具有特定組成和特定功能的DNA序列[Nature Reviews Genetics, 2006, 7,565-576 ；Angew. Chem. Int. Ed.，2007，46，6226-6236]，使其在手性藥物的選擇性合成與特異性識別方面顯露出誘人的應(yīng)用前景?；贒NA 二級結(jié)構(gòu)的多樣性和可調(diào)控性，以及堿基之間相互作用力弱等特點(diǎn)，利用小分子物質(zhì)，特別是某些金屬離子，可以誘導(dǎo)DNA構(gòu)型發(fā)生改變。這種誘導(dǎo)作用與金屬離子的類型和濃度、DNA序列的組成和長度以及溶液離子強(qiáng)度都有關(guān)系[Nucleic AcidsResearch, 2000，28，2439-2445]。例如，特定堿基組成的核酸序列在Ni2+或精氨的誘導(dǎo)下，其雙螺旋結(jié)構(gòu)可以由B型向Z型轉(zhuǎn)變，這種手性結(jié)構(gòu)以及表現(xiàn)出來的光譜特征的改變，為小分子藥物特異性識別提供了依據(jù)[J. Phys. Chem. B，2011，115，10182-10188 ;J. Am. Chem.Soc.，2009，131，2046-2047]。另外，金屬離子的加入，可以改變DNA序列與小分子藥物之間的結(jié)合作用，增大或減少DNA對藥物的結(jié)合能力[J. Fluoresc, 2011, 21,113-118]。到目前為止，利用特定的雙鏈寡核苷酸序列，通過金屬離子的誘導(dǎo)調(diào)控作用，對手性藥物對映體進(jìn)行拆分還未曾報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下—種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為5-9條件下，向50-4000體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 001-0. 5mol/L的二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在10-40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液；(2)在pH為5-9條件下，將1-100體積份數(shù)的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 15-2mmol/L的手性藥物外消旋體溶液混合，吸附15-60分鐘；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體；、所述雙鏈寡核苷酸序列含有d[GxTyAJ/d[CxAyTJ ,其中x = 2-6, y = 1-3, z = 1-2 ;或者含有 d[GxCy]/d[CxGy]，其中 X = 2-6，y = 1-3。所述雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。上述方法還可以包括(3)將所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物加入溶劑配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. 025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為5-9條件下，將1-100體積份數(shù)步驟(3)配制的溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 001-0. 02mol/L的EDTA鹽水溶液混合，脫附15-60分鐘，用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液中含有脫附的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟(4)獲得的雙鏈寡核苷酸加入溶劑配成摩爾濃度為0. 025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為5-9條件下，向50-4000體積份數(shù)步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 001-0. 5mol/L的二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在10-40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為5-9條件下，將1-100體積份數(shù)的步驟(6)獲得的溶液與I體積份數(shù)的步驟(2)獲得的濾液混合，吸附15-60分鐘；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液；所述雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液；所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。步驟⑴優(yōu)選為在pH為5-9條件下，向100-1000體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 05-0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 01-0. lmol/L的二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在20-30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液。步驟(2)優(yōu)選為在pH為5-9條件下，將4-40體積份數(shù)的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 25-lmmol/L的手性藥物外消旋體溶液混合，吸附20-40分鐘；用截留分子量為3000-8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體。手性藥物優(yōu)選為氧氟沙星、布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾；手性藥物溶液的溶劑優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。步驟(4)優(yōu)選為在pH為5-9條件下，將4_40體積份數(shù)步驟(3)配制的溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 005-0. 01mol/L的EDTA鹽溶液混合，脫附20-40分鐘，用截留分子量為3000-8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液中含有脫附的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體， 濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸。步驟(5)優(yōu)選為將步驟⑷獲得的雙鏈寡核苷酸加入溶劑配成摩爾濃度為0. 05-0. Smmol /I,的溶液。步驟(6)優(yōu)選為在pH為5-9條件下，向100-1000體積份數(shù)步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 01-0. lmol/L的二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在20-30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液。二價金屬離子優(yōu)選為銅離子、鎳離子、錳離子、鎂離子、鈣離子、鋅離子、鋇離子，鈷離子；三價金屬離子優(yōu)選為鐵離子；無機(jī)鹽優(yōu)選為鹽酸鹽、硝酸鹽或硫酸鹽。步驟(7)優(yōu)選為在pH為5-9條件下，將4_40體積份數(shù)的步驟(6)獲得的溶液與I體積份數(shù)的步驟(2)獲得的濾液混合，吸附20-40分鐘；用截留分子量為3000-8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液。EDTA 鹽優(yōu)選 EDTA 二鈉或 EDTA 二鉀。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本方法利用生物相容性好的雙鏈寡核苷酸實(shí)現(xiàn)簡便、安全的手性藥物拆分，是一種綠色、清潔的手性藥物對映異構(gòu)體拆分新方法。拆分出的手性藥物純度提高。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但不對本發(fā)明作任何限制。實(shí)施例I一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為7. 2條件下，向IOOOii L摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d[AG3T2AG3T2AG3T2AG3] /d[TC3A2TC3A2TC3A2TC3])溶液中WAlyL的摩爾濃度為0. 01mol/L的氯化銅水溶液，在20°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-銅離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鈉緩沖液；(2)在pH為7. 2條件下，將400 ii L步驟⑴制備的溶液與40 ii L摩爾濃度為0. 2mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附20分鐘,外消旋氧氟沙星溶液的溶劑為磷酸鈉緩沖液；然后將混合溶液裝入到截留分子量為3000的超濾離心管中，在SOOOrpm下離心20分鐘，濾液為富集的手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-銅離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為42. 60%。實(shí)驗(yàn)證明，用本實(shí)施例的方法也可用于拆分萘普生、酮洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。濾液中萘普生、酮洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾的對映體過量值依次為30. 23%,35. 43%,31. 42%,33. 90%,o實(shí)施例2—種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)-(2)同實(shí)施例 I;(3)將實(shí)施例I的雙鏈寡核苷酸-銅離子復(fù)合物上的吸附物加入磷酸鈉緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上 的吸附物溶液；(4)在pH為7. 2條件下，將400 ii L步驟(3)配制的溶液與IOii L摩爾濃度為0. 001mol/L的EDTA 二鈉水溶液混合，脫附20分鐘，用截留分子量為3000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟⑷獲得的雙鏈寡核苷酸加入磷酸鈉緩沖液配成摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為7. 2條件下，向1000 y L步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I u L摩爾濃度為0. 01mol/L的氯化銅水溶液,在20°C下混合均勻,得到雙鏈寡核苷酸-銅離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為7. 2條件下，將400 U L的步驟(6)獲得的溶液與40 y L的實(shí)施例I步驟(2)獲得的濾液混合，吸附20分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為3000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為80. 04%。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例的方法也可用于拆分萘普生、酮洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾。濾液中萘普生、酮洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾的對映體過量值依次為57. 21%、64. 89%,52. 43%,59. 85%。實(shí)施例3—種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為8. 5條件下，向IOOOii L摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d[AG6TA2G6TA2G6TA2Vd[TC6AT2C6AT2C6AT2])溶液中加A IOuL的摩爾濃度為0. 001mol/L的硫酸鋅水溶液，在20°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鋅離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；(2)在pH為8. 5條件下，將400 U L的雙鏈寡核苷酸-鋅離子復(fù)合物溶液與10 y L的摩爾濃度為2mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附40分鐘,外消旋氧氟沙星溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；用截留分子量為1000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-鋅離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為43. 50%。實(shí)施例4
一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)-(2)同實(shí)施例 3;(3)將實(shí)施例3的雙鏈寡核苷酸-鋅離子復(fù)合物上的吸附物加入Tris-鹽酸緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸-鋅離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為8. 5條件下，將400 ii L步驟(3)配制的溶液與IOii L摩爾濃度為0. 001mol/L的EDTA 二鉀水溶液混合，脫附40分鐘，用截留分子量為1000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟(4)獲得的雙鏈寡核苷酸加入Tris-鹽酸緩沖液配成摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為8. 5條件下，向IOOOy L步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加A IOii L摩爾濃度為0. 001mol/L的硫酸鋅水溶液，在20°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鋅離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為8. 5條件下，將400 U L的步驟(6)獲得的溶液與10 y L的實(shí)施例3步驟(2)獲得的濾液混合，吸附40分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為1000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為85. 35%。實(shí)施例5一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為8. 5條件下，向1000 u L摩爾濃度為0. 025mmol/L的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d [G2T3AG2T3AG2T3AG3] /d [C2A3TC2A3TC2A3TC3])溶液中加入20 u L的摩爾濃度為0. lmol/L的硝酸鎂水溶液，在30°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鎂離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；(2)在pH為8. 5條件下，將400 ii L的雙鏈寡核苷酸-鎂離子復(fù)合物溶液與400 ii L的摩爾濃度為0. 15mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附15分鐘，外消旋布洛芬溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；用截留分子量為10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物布洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-鎂離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物布洛芬的另一種對映異構(gòu)體。濾液中布洛芬的對映體過量值為26. 54%。實(shí)施例6一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)-(2)同實(shí)施例 5;(3)將實(shí)施例5的雙鏈寡核苷酸-鎂離子復(fù)合物上的吸附物加入Tris-鹽酸緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. 025mmol/L的雙鏈寡核苷酸-鎂離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為8. 5條件下，將400 ii L步驟(3)配制的溶液與IOOii L摩爾濃度為0. 01mol/L的EDTA 二鈉水溶液混合，脫附15分鐘，用截留分子量為10000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物布洛芬的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟(4)獲得的雙鏈寡核苷酸加入Tris-鹽酸緩沖液配成摩爾濃度為0. 025mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為8. 5條件下，向1000 ii L步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入20uL摩爾濃度為0. lmol/L的硝酸鎂水溶液，在30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鎂離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為8. 5條件下，將400 U L的步驟(6)獲得的溶液與400 U L的實(shí)施例5步驟(2)獲得的濾液混合，吸附15分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為10000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物布洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中布洛芬的對映體過量值為50. 67%。 實(shí)施例7—種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為5. 0條件下，向4000 U L摩爾濃度為0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d[AG4CG4CG4CG5CVd[TC4GC4GC4GC5G])溶液中加入I y L的摩爾濃度為0. 5mol/L的硝酸鎳水溶液，在15°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鎳離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為MES緩沖液；(2)在pH為5. 0條件下，將1000 U L的雙鏈寡核苷酸_鎳離子復(fù)合物溶液與100 u L的摩爾濃度為lmmol/L的外消旋華法林溶液混合，吸附30分鐘，外消旋華法林溶液的溶劑為MES緩沖液；用截留分子量為3000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物華 法林的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-鎳離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物華法林的另一種對映異構(gòu)體；濾液中華法林的對映體過量值為36. 19%。實(shí)施例8一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)-(2)同實(shí)施例 7;(3)將實(shí)施例7的雙鏈寡核苷酸-鎳離子復(fù)合物上的吸附物加入MES緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸-鎳離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為5.0條件下，將IOOOii L步驟(3)配制的溶液與IOii L摩爾濃度為0. 02mol/L的EDTA 二鈉水溶液混合，脫附30分鐘，用截留分子量為3000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物華法林的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟(4)獲得的雙鏈寡核苷酸加入MES緩沖液配成摩爾濃度為0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液； (6)在pH為5. 0條件下，向4000ii L步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I U L摩爾濃度為0. 5mol/L的硝酸鎳水溶液，在15°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鎳離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為5. 0條件下，將1000 U L的步驟(6)獲得的溶液與100 U L的實(shí)施例7步驟(2)獲得的濾液混合，吸附30分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為3000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物華法林的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中華法林的對映體過量值為62. 12%。實(shí)施例9一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為5. 8條件下，向1000 U L摩爾濃度為lmmol/L的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d[CG4CG3CCG5CG4TVd[GC4GC3GGC5GC4A])溶液中加入I y L的摩爾濃度為0. 005mol/L的氯化錳水溶液，在10°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-錳離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑 為二甲胂酸鈉緩沖液；(2)在pH為5. 8條件下，將500 ii L的雙鏈寡核苷酸-錳離子復(fù)合物溶液與500 ii L的摩爾濃度為lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附30分鐘,外消旋氧氟沙星溶液的溶劑為二甲胂酸鈉緩沖液；用截留分子量為8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-錳離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體；濾液中氧氟沙星的對映體過量值為39. 91 %。實(shí)施例10一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)-(2)同實(shí)施例 9;(3)將實(shí)施例9的雙鏈寡核苷酸-錳離子復(fù)合物上的吸附物加入二甲胂酸鈉緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為lmmol/L的雙鏈寡核苷酸-錳離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為5. 8條件下，將500 ii L步驟(3)配制的溶液與IOii L摩爾濃度為0. 001mol/L的EDTA 二鉀水溶液混合，脫附30分鐘，用截留分子量為8000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟⑷獲得的雙鏈寡核苷酸加入二甲胂酸鈉緩沖液配成摩爾濃度為lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為5. 8條件下，向1000 ii L步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入
IU L摩爾濃度為0. 005mol/L的氯化錳水溶液，在10°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-錳離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為5. 8條件下，將500 U L的步驟(6)獲得的溶液與500 U L的實(shí)施例9步驟(2)獲得的濾液混合，吸附30分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為8000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為79. 23%。實(shí)施例11一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為8. 0條件下，向1000 U L摩爾濃度為0. lmmol/L的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d[C4TC3TCGCGC3GC3G] /d[G4AG3AGCGCG3CG3C])溶液中加入IOuL的摩爾濃度為0. 3mol/L的硝酸鋇水溶液，在40°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鋇離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；
(2)在pH為8.0條件下，將400 i! L的雙鏈寡核苷酸-鋇離子復(fù)合物溶液與IOOiI L的摩爾濃度為lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附30分鐘,外消旋氧氟沙星溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；用截留分子量為10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-鋇離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體；濾液中氧氟沙星的對映體過量值為42. 87%。實(shí)施例12一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)-(2)同實(shí)施例 11 ;(3)將實(shí)施例11的雙鏈寡核苷酸-鋇離子復(fù)合物上的吸附物加入Tris-鹽酸緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. lmmol/L的雙鏈寡核苷酸-鋇離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為8.0條件下，將500 ii L步驟(3)配制的溶液與500 y L摩爾濃度為0. 005mol/L的EDTA 二鉀水溶液混合，脫附30分鐘，用截留分子量為10000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟⑷獲得的雙鏈寡核苷酸加入Tris-鹽酸緩沖液配成摩爾濃度為0. lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為8.0條件下，向IOOOii L步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入IOuL摩爾濃度為0. 3mol/L的硝酸鋇水溶液，在40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鋇離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為8. 0條件下，將400 U L的步驟(6)獲得的溶液與100 U L的實(shí)施例11步驟(2)獲得的濾液混合，吸附30分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為10000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中氧氟沙星的對映體過量值為83. 22%。實(shí)施例13一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為9.0條件下，向IOOOii L摩爾濃度為0.05mmol/L的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d[AG2C3G2C3G2C3Vd[TC2G3C2G3C2G3])溶液中加入5 y L的摩爾濃度為0. 05mol/L的硝酸鈣水溶液，在20°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鈣離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；(2)在pH為9. 0條件下，將500 u L的雙鏈寡核苷酸-鈣離子復(fù)合物溶液與500 u L的摩爾濃度為0. 25mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附60分鐘，外消旋布洛芬溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；用截留分子量為1000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物布洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-鈣離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物布洛芬的另一種對映異構(gòu)體；濾液中布洛芬的對映體過量值為30. 63%。
實(shí)施例14一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟
(1)-(2)同實(shí)施例 13 ;(3)將實(shí)施例13的雙鏈寡核苷酸-鈣離子復(fù)合物上的吸附物加入Tris-鹽酸緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì) 的摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸-鈣離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為9.0條件下，將500 ii L步驟(3)配制的溶液與50 y L摩爾濃度為0. 0025mol/L的EDTA 二鉀水溶液混合，脫附60分鐘，用截留分子量為1000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物布洛芬的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟⑷獲得的雙鏈寡核苷酸加入Tris-鹽酸緩沖液配成摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為9.0條件下，向IOOOii L步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入5 u L摩爾濃度為0. 05mol/L的硝酸鈣水溶液，在20°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鈣離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為9. 0條件下，將500 U L的步驟(6)獲得的溶液與500 U L的實(shí)施例13步驟(2)獲得的濾液混合，吸附60分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為1000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物布洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中布洛芬的對映體過量值為58. 26%。實(shí)施例15一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH = 7. 2下，向10001^摩爾濃度為0.0511111101/1的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d[G6CG6CG6CTVd[C6GC6GC6GA])溶液中加入4 y L的摩爾濃度為0. 08mol/L的氯化鈷水溶液，在35°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鈷離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為ffiRES緩沖液；(2)在pH為7. 2條件下，將1000 U L的雙鏈寡核苷酸-鈷離子復(fù)合物溶液與10 y L的摩爾濃度為2mmol/L的外消旋氟比洛芬溶液混合,吸附40分鐘,外消旋氟比洛芬溶液的溶劑為HERES緩沖液；用截留分子量為8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物氟比洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-鈷離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物氟比洛芬的另一種對映異構(gòu)體；濾液中氟比洛芬的對映體過量值為35. 14%。實(shí)施例16一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)-(2)同實(shí)施例 15 ;(3)將實(shí)施例15的雙鏈寡核苷酸-鈷離子復(fù)合物上的吸附物加入HERES緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸-鈷離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為7. 2條件下，將IOOOii L步驟(3)配制的溶液與50 y L摩爾濃度為0. 01mol/L的EDTA 二鈉水溶液混合，脫附40分鐘，用截留分子量為8000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物氟比洛芬的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；
(5)將步驟⑷獲得的雙鏈寡核苷酸加入HERES緩沖液配成摩爾濃度為0. 05mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為7.2條件下，向IOOOyL步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入4UL摩爾濃度為0. 08mol/L的氯化鈷水溶液，在35°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鈷離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為7. 2條件下，將1000 U L的步驟(6)獲得的溶液與10 y L的實(shí)施例15步驟(2)獲得的濾液混合，吸附40分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為8000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物氟比洛芬的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中氟比洛芬的對映體過量值為60. 67%。實(shí)施例17一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(I)在pH為7. 2條件下，向IOOOii L摩爾濃度為0. 2mmol/L的雙鏈寡核苷酸(本實(shí)施例的雙鏈寡核苷酸的序列為d[AG6TA2G6TA2G6TA2Vd[TC6AT2C6AT2C6AT2])溶液中加入2 y L的摩爾濃度為0. 02mol/L的氯化鐵水溶液，在25°C混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鐵離子復(fù)合物溶液；雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；(2)在pH為7. 2條件下，將1000 U L的雙鏈寡核苷酸-鐵離子復(fù)合物溶液與50 y L的摩爾濃度為lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附20分鐘,外消旋氧氟沙星溶液的溶劑為Tris-鹽酸緩沖液；用截留分子量為3000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-鐵離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體；濾液中氧氟沙星的對映體過量值為40. 43%。實(shí)施例18一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟(1)-(2)同實(shí)施例 17 ;(3)將實(shí)施例17的雙鏈寡核苷酸-鐵離子復(fù)合物上的吸附物加入Tris-鹽酸緩沖液配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. 2mmol/L的雙鏈寡核苷酸-鐵離子復(fù)合物上的吸附物溶液；(4)在pH為7. 2條件下，將IOOOii L步驟(3)配制的溶液與IOy L摩爾濃度為0. 008mol/L的EDTA 二鈉水溶液混合，脫附20分鐘，用截留分子量為3000的超濾膜進(jìn)行超濾離心20分鐘，濾液中含有脫附的手性藥物氧氟沙星的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸；(5)將步驟⑷獲得的雙鏈寡核苷酸加入Tris-鹽酸緩沖液配成摩爾濃度為0. 2mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液；(6)在pH為7.2條件下，向IOOOyL步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入 2u L摩爾濃度為0. 02mol/L的氯化鐵水溶液，在25°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-鐵離子復(fù)合物溶液；(7)在pH為7. 2條件下，將1000 U L的步驟(6)獲得的溶液與50 y L的實(shí)施例17步驟(2)獲得的濾液混合，吸附20分鐘；然后將混合溶液裝入到截留分子量為3000的超濾離心管中，在8000rpm下離心20分鐘，濾液為手性藥物氧氟沙星的一種對映異構(gòu)體溶液。濾液中氧氟 沙星的對映體過量值為79. 54%。
權(quán)利要求
1.一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，其特征包括如下步驟 (1)在pH為5-9條件下，向50-4000體積份數(shù)的摩爾濃度為0.025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 001-0. 5mol/L的二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在10_40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液； (2)在pH為5-9條件下，將1-100體積份數(shù)的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 15-2mmol/L的手性藥物外消旋體溶液混合，吸附15-60分鐘；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體； 所述雙鏈寡核苷酸序列含有d[GxTyAJ/d[CxAyTz],其中x = 2-6, y = 1-3, z = 1-2 ;或者含有 d[GxCy]/d[CxGy]，其中 X = 2-6，y = 1-3。
所述雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是還包括 (3)將所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物加入溶劑配成以雙鏈寡核苷酸摩爾計(jì)的摩爾濃度為0. 025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物溶液； (4)在pH為5-9條件下，將1-100體積份數(shù)步驟(3)配制的溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 001-0. 02mol/L的EDTA鹽水溶液混合，脫附15-60分鐘，用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液中含有脫附的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸； (5)將步驟(4)獲得的雙鏈寡核苷酸加入溶劑配成摩爾濃度為0.025-lmmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液； (6)在pH為5-9條件下，向50-4000體積份數(shù)步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加A I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 001-0. 5mol/L的二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在10-40°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液； (7)在pH為5-9條件下，將1-100體積份數(shù)的步驟(6)獲得的溶液與I體積份數(shù)的步驟(2)獲得的濾液混合，吸附15-60分鐘；用截留分子量為1000-10000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液； 所述雙鏈寡核苷酸溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液；所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是所述步驟(I)為在pH為5-9條件下，向100-1000體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 05-0. 5mmol/L的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 01-0. lmol/L的二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在20-30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是所述步驟(2)為在pH為5-9條件下，將4-40體積份數(shù)的所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為0.25-lmmol/L的手性藥物外消旋體溶液混合，吸附20-40分鐘；用截留分子量為3000-8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的方法，其特征是所述手性藥物為氧氟沙星、布洛芬、華法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普蘭或普萘洛爾；所述手性藥物溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述步驟(4)為在pH為5-9條件下，將4-40體積份數(shù)步驟(3)配制的溶液與I體積份數(shù)的摩爾濃度為0. 005-0. 01mol/L的EDTA鹽水溶液混合，脫附20-40分鐘，用截留分子量為3000-8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液中含有脫附的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體，濾膜上截留物為雙鏈寡核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述步驟(5)為將步驟(4)獲得的雙鏈寡核苷酸加入溶劑配成摩爾濃度為0. 05-0. 5mmol/L的溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述步驟(6)為在pH為5-9條件下，向100-1000體積份數(shù)步驟(5)配制的雙鏈寡核苷酸溶液中加入I體積份數(shù)的摩爾濃度為0.01-0. lmol/L的二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，在20-30°C下混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3或8所述的方法，其特征是所述二價金屬離子為銅離子、鎳離子、錳離子、鎂離子、鈣離子、鋅離子、鋇離子，鈷離子；所述三價金屬離子為鐵離子；所述無機(jī)鹽為鹽酸鹽、硝酸鹽或硫酸鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述步驟(7)為在pH為5-9條件下，將4-40體積份數(shù)的步驟(6)獲得的溶液與I體積份數(shù)的步驟(2)獲得的濾液混合，吸附20-40分鐘；用截留分子量為3000-8000的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液為手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用寡核苷酸拆分手性藥物的方法，包括如下步驟向雙鏈寡核苷酸溶液中加入二價或三價金屬離子無機(jī)鹽的水溶液，混合均勻，得到雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液；將所述雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物溶液與手性藥物外消旋體溶液混合，吸附；超濾，濾液為富集的手性藥物的一種對映異構(gòu)體溶液，雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物上的吸附物為富集的手性藥物的另一種對映異構(gòu)體；所述雙鏈寡核苷酸序列含有d[GxTyAz]/d[CxAyTz]，其中x＝2-6，y＝1-3，z＝1-2，本發(fā)明的方法利用生物相容性好的雙鏈寡核苷酸實(shí)現(xiàn)簡便、安全的手性藥物拆分，是一種綠色、清潔的方法。拆分出的手性藥物純度提高。
文檔編號C07D307/87GK102659495SQ20121012384
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者付雁, 張金利, 李韡, 段小麗, 陳雄飛 申請人:天津大學(xué)