專利名稱：具有hiv-1蛋白酶抑制活性的寡肽化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域。特別地，本發(fā)明提供了具有氨基酸序列Tyr-Leu-Val-Leu-His (SEQ ID NO: I)的寡肽化合物，其具有HIV-1蛋白酶抑制活性。本發(fā)明的寡肽化合物可以是化學合成的或重組產生的，或可以從微生物(特別是放線菌)提取獲得。本發(fā)明還提供了從微生物(特別是放線菌)獲得的、具有HIV-I蛋白酶抑制活性的提取物以及其制備方法，所述提取物包含本發(fā)明的寡肽化合物。本發(fā)明還提供了用于獲得本發(fā)明的寡肽化合物或提取物的微生物(特別是放線菌，例如放線菌CGMCC 4766)。本發(fā)明的寡肽化合物或提取物可以用于預防和治療與HIV感染相關的疾病，例如艾滋病。
背景技術：
對寡肽的藥用研究在近幾十年來得到不斷發(fā)展。過去一直認為，蛋白質必須水解為游離氨基酸才能被吸收。然而事實上，大量寡肽可逃脫被消化成游離氨基酸的命運，而直接以肽的形式吸收進入體循環(huán)。最近一二十年來，對肽的營養(yǎng)研究主要集中在寡肽的吸收機制，寡肽與游離氨基酸吸收的關系，蛋白質在消化過程中寡肽的釋放規(guī)律，寡肽的轉運和代謝規(guī)律，寡肽對內分泌、氮沉積、組織蛋白質周轉代謝的作用和影響，寡肽的生理活性作用等。天然活性肽可介導細胞與細胞、蛋白質與蛋白質、細胞與蛋白質及其他非肽類物質、蛋白調控因子與基因表達之間的相互作用。因此，雖然生物體中活性肽的含量極少，但其活性強、作用大，是細胞分化、識別、免疫、應激、衰老及分子進化等一切生命過程的參與者或調節(jié)因子。按照其藥理作用，目前寡肽可分為以下幾類腫瘤抗原肽、神經活性寡肽、心血管活性肽、酶抑制劑活性肽。目前已知HI V-I蛋白酶可以裂解難以水解的肽鍵，如Tyr-Pro和Phe-Pro。HIV-I蛋白酶在病毒復制過程中的主要作用是，將gag和gag-pol基因產物裂解成病毒成熟所需要的結構蛋白(基質、殼、核殼)和酶類(蛋白酶、整合酶、逆轉錄酶)。因此，HIV-I蛋白酶已被用作預防和治療與HIV感染相關的疾病的重要靶點。例如，已開發(fā)了多種能防止母體蛋白分裂成新的HIV感染細胞以及病毒復制的HIV-I蛋白酶抑制劑，使得艾滋病的治療有了突破性進展。例如，目前人們已經制備了大量的肽類和非肽類HI V蛋白酶抑制劑。國際上已上市的HI V蛋白酶抑制劑都是擬肽類化合物，例如沙奎那韋、茚地那韋、利托那韋等。非肽類抑制劑中發(fā)展較快的是二氫吡喃酮類和環(huán)脲類化合物。寡肽化合物的分子空間結構與酶的活性中心比較相似，從而成為酶抑制劑的機率較大。因而，從微生物發(fā)酵產物中分離寡肽化合物是發(fā)現(xiàn)新型先導化合物的一個重要方法。然而，由于菌株發(fā)酵液中活性成分一般含量較少，且活性成分對熱不穩(wěn)定，故從菌株發(fā)酵液中提取分離得到活性成分的難度較大。因此，在本領域中，對能夠預防和治療與HIV感染相關的疾病的新型藥物仍然存在著迫切需要。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新的具有HIV-I蛋白酶抑制活性的寡肽化合物，其可從放線菌(例如放線菌CGMCC 4766)分離獲得，并且可用于預防和治療與HIV感染相關的疾病，例如艾滋病。

發(fā)明內容
在本申請中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術術語具有本領域技術人員所通常理解的含義。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關術語的定義和解釋。如本文中使用的，術語“寡肽” 一般是指含有2-10個氨基酸的肽，其中各氨基酸之間通過肽鍵相連。 如本文中使用的，術語“寡肽化合物”是指含有寡肽結構的化合物，其包括但不限于，寡肽以及其修飾形式。如本文中使用的，術語寡肽的“修飾形式”是指經修飾的寡肽。此類修飾包括但不限于，寡肽所包含的氨基酸的烷基化、烷氧基化、?；?、酰氧基化、酯化、
糖基化、聚乙二醇化等。本發(fā)明的寡肽化合物可通過本領域公知的方法來制備。例如，此類寡肽化合物可以通過化學合成方法或基因工程方法來產生。用于產生該寡肽化合物的化學合成方法是本領域技術人員熟知的，參見例如Synthetic Peptides:A User' s Guide (2002),編輯 Gregory A. Grant,第二版；Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (2000),編輯Steven A. Kates和Fernando Albericio。用于產生寡肽化合物的基因工程方法方法也是本領域技術人員熟知的，參見例如J. Samtoook等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989 ;F.M. Ausubel等人，精編分子生物學實驗指南，第3版，John ffiley&Sons， Inc. ，1995。此外，本發(fā)明的寡肽化合物還可通過本領域公知的提取和/或分離方法，例如常規(guī)用于從微生物發(fā)酵液中分離水溶性和/或非水溶性成分的方法(例如大孔吸附樹脂處理、反相ODS-A柱層析、Sephadex LH-20柱層析、制備型高效液相色譜法等)，從各種來源例如微生物(例如放線菌)獲得。這些提取和/或分離方法在本領域技術人員的知識范圍內，并且可參見例如，天然藥物化學，吳立軍主編，人民衛(wèi)生出版社，第五版。在本申請的實施例中給出了本發(fā)明的寡肽化合物的示例性提取和/或分離方法。如本文中使用的，術語“藥學上可接受的鹽”意指在合理的醫(yī)學判斷范圍內適于人類和更低等的動物使用而沒有不適當?shù)母弊饔貌⑴c合理的利益/風險比相稱的化合物的鹽，所述副作用例如，毒性、刺激性、變應性反應等。藥學上可接受的鹽是本領域熟知的。例如，S. M. Berge等人在J. PharmaceuticalSciences, 1977，66，1-19 (其通過引用并入本申請)中詳細描述了藥學上可接受的鹽。本文描述的化合物的藥學上可接受的鹽包括從適合的無機酸與有機酸以及無機堿與有機堿衍生的那些。藥學上可接受的無毒的酸加成鹽的實例是與無機酸(如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或與有機酸(如醋酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的氨基鹽，或通過使用本領域所用的其它方法(如離子交換)形成的氨基鹽。其它藥學上可接受的鹽包括己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、門冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽(digluconate)、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、羥乙酸鹽、葡萄糖酸鹽、羥乙酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽(palmoate)、果膠脂酸鹽、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對-甲苯磺酸鹽、i^一烷酸鹽、戍酸鹽等。堿加成鹽的實例包括藥學上可接受的金屬和胺鹽。適宜的金屬鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋇鹽、鋅鹽、鎂鹽和鋁鹽。通常優(yōu)選 鈉鹽和鉀鹽。在適當時，其它藥學上可接受的鹽包括無毒的銨鹽、季銨鹽和胺陽離子鹽，其利用抗衡離子生成，例如鹵化物、氫氧化物、羧酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、低級烷基磺酸鹽和芳基磺酸鹽。從金屬堿制備適宜的無機堿加成鹽，所述金屬堿包括氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鋅等。從胺制備適宜的胺堿加成鹽。因為它們的低毒性和醫(yī)用可接受性，所述胺經常用于醫(yī)學化學，例如氨、乙二胺、N-甲基-葡萄糖胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽堿、N，N’ - 二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-芐基苯乙基胺、二乙胺、哌嗪、三(羥甲基)_氨基甲烷、四甲基氫氧化銨、三乙基胺、二芐基胺、二苯羥甲胺、脫氫松香基胺、N-乙基哌啶、芐基胺、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、堿性的氨基酸、二環(huán)己基胺等。應理解本發(fā)明包括不同藥學上可接受的鹽的混合物/組合，以及游離形式的化合物和藥學上可接受的鹽的混合物/組合。如本文中使用的，術語“HIV-1蛋白酶”是指與逆轉錄酶和整合酶一起共同負責HIV-I基因組復制過程的蛋白酶(GenBank登錄號為AF033819)。在本申請中，HIV-I蛋白酶可以是天然來源的或重組產生的，例如采用大腸桿菌重組表達的HIV-I蛋白酶。HIV-I蛋白酶的酶切位點為Tyr-Pix)，其底物例如但不限于，用于高通量熒光底物HIV-I蛋白酶模型的Dabcyl-Y-Abu-Ser-Gln—Asn-Tyr-Pro-IIe-Val-Gln-Edans0關于高通量熒光底物HIV-I蛋白酶模型的詳細描述可參見例如，董飆，硫代反義寡核苷酸在鴨體內外對DHBV DNA復制的影響及高通量熒光底物HIV-I蛋白酶模型的建立，中國協(xié)和醫(yī)科大學，中國醫(yī)學科學院，2004 (該論文可從http://so. med. wanfangdata.com. cn/獲得)。該模型的一個優(yōu)選實施方案如下用Edans和Dabcyl這兩種發(fā)色團分別標記HIV-I蛋白酶的多肽底物的酶切位點兩側。由于Edans的熒光發(fā)色光譜與Dabcyl的吸收光譜是重疊的，因而當Edans和Dabcyl處于鄰近位置(例如位于多肽底物的的酶切位點兩側)時，經激發(fā)的Edans的發(fā)射光將被Dabcyl吸收。在這種情況下，將檢測不到Edans的發(fā)射光(通過FRET由Dabcyl產生熒光淬滅)。相反地，當HIV-I蛋白酶的多肽底物被HIV-I蛋白酶切開后，Edans和Dabcyl將彼此分離,從而將能夠檢測到Edans在490nm處產生的發(fā)射光(脫離了 Dabcyl的熒光淬滅)。該實施方案的示意圖參見圖6，其可用于分析酶系統(tǒng)和研發(fā)酶的抑制劑。如本文中使用的，術語“分離的”是指本發(fā)明的寡肽化合物與其天然環(huán)境相分離，即與其天然環(huán)境中的通常混合或以其他方式結合的物質部分分離或基本上分離。例如，從微生物中提取獲得的和/或化學合成的和/或重組產生的和/或經純化的本發(fā)明的寡肽化合物是分離的。優(yōu)選地，本發(fā)明的寡肽化合物是經純化的，例如，其純度可以為至少50%，優(yōu)選至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或者100%。如本文中使用的，“放線菌CGMCC 4766”是指在2011年04月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC 4766的放線菌菌株。常規(guī)用于放線菌的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基可用于放線菌CGMCC 4766的培養(yǎng)，并且這樣的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基能夠由本領域技術人員從文獻中獲得(參見例如，Shirling E B, Gottlieb D. Methods forcharacterization of streptomycess pecies. Int Syst Bacteriol, 1966,16 :313)。本申請在實施例中示例性提供了此類培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的一個實施方案。
如本文中使用的，術語“菌絲體的裂解液”是指使用本領域公知的裂解方法裂解放線菌菌絲體后獲得的溶液；術語“菌絲體的提取液”是指，用有機溶劑浸泡放線菌菌絲體并將所述有機溶劑去除(例如，揮發(fā))而獲得的溶液，所述有機溶劑包括但不限于，丙酮，甲醇或其任何混合物。如本文中使用的，術語“有效量”是指能夠有效實現(xiàn)預期目的的量。例如，治療疾病(例如艾滋病)有效量是指，能夠有效治療，緩解，減輕或治愈艾滋病的癥狀的量。例如，抑制HIV-I蛋白酶的有效量是指，能夠顯著抑制，降低，或消除HIV-I蛋白酶的活性的量。測定這樣的有效量在本領域技術人員的能力范圍之內。如本文中使用的，術語“受試者”是指哺乳動物，例如靈長類哺乳動物，例如人。如本文中使用的，術語“與HIV感染相關的疾病”是指，由于受試者感染了 HIV而導致的疾病，其包括但不限于艾滋病。本發(fā)明人開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)了一種新的具有HIV-I蛋白酶抑制活性的寡肽化合物，其可從放線菌(例如放線菌CGMCC 4766)分離獲得，并且可用于預防和治療與HIV感染相關的疾病，例如艾滋病。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的寡肽化合物或其藥學上可接受的鹽，所述寡肽化合物具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列Tyr-Leu-Val-Leu-His。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡肽化合物是未經修飾的寡肽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡肽化合物是含有經修飾的氨基酸殘基的寡肽。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡肽化合物含有至少一個(例如2個，3個，4個或5個)經修飾的氨基酸殘基。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡肽化合物含有經取代的酪氨酸殘基(Tyr)，例如N-取代的酪氨酸殘基，N，N- 二取代的酪氨酸殘基或N，N，N-三取代的酪氨酸殘基。酪氣酸殘基上的此類取代基包括但不限于，低級燒基例如CV4燒基(例如甲基，乙基，正丙基，異丙基或丁基)，低級烷氧基例如Cy烷氧基。在一個優(yōu)選的實施方案中，經取代的酪氨酸殘基是N，N，N-三甲基取代的酪氨酸殘基。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡肽化合物含有經修飾的組氨酸殘基(His)0在一個優(yōu)選的實施方案中，經修飾的組氨酸殘基是脫氫組氨酸殘基(-2H-His)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡肽化合物的位置2 — 4的氨基酸殘基都是L 一構型的氨基酸殘基。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡肽化合物具有下式的結構
權利要求
1.一種分離的寡肽化合物或其藥學上可接受的鹽，所述寡肽化合物具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列Tyr-Leu-Val-Leu_His, 優(yōu)選地，所述寡肽化合物是未經修飾的寡肽，或者是含有經修飾的氨基酸殘基的寡肽； 優(yōu)選地，所述寡肽化合物含有至少一個(例如2個，3個，4個或5個)經修飾的氨基酸殘基; 優(yōu)選地，所述寡肽化合物含有經取代的酪氨酸殘基，例如N-取代的酪氨酸殘基，N，N- 二取代的酪氨酸殘基或N，N，N-三取代的酪氨酸殘基；優(yōu)選地，所述酪氨酸殘基上的取代基包括但不限于，低級燒基例如CV4燒基(例如甲基，乙基，正丙基，異丙基或丁基)，低級烷氧基例如Cy烷氧基；優(yōu)選地，經取代的酪氨酸殘基是N，N，N-三甲基取代的酪氨酸殘基; 優(yōu)選地，所述寡肽化合物含有經修飾的組氨酸殘基，例如脫氫組氨酸殘基； 優(yōu)選地，所述寡肽化合物具有下式的結構
2.一種獲自放線菌的提取物，其包含權利要求I的寡肽化合物，優(yōu)選地，所述提取物獲自放線菌CGMCC 4766 ； 優(yōu)選地，所述寡肽化合物具有下式的結構
3.制備權利要求I的寡肽化合物的方法，其包括以下步驟 (1)培養(yǎng)放線菌，并分別收集上清液和菌絲體； (2)對步驟I獲得的上清液和/或獲得的菌絲體的裂解液和/或提取液進行層析，跟蹤并收集具有HIV-I蛋白酶抑制活性的洗脫級分； (3)使用制備型高效液相色譜法對步驟2獲得的洗脫級分進行純化，從而獲得所述寡肽化合物； 優(yōu)選地，步驟I中的放線菌是放線菌CGMCC 4766 ； 優(yōu)選地，在步驟2中對上清液和/或菌絲體的裂解液和/或提取液進行一次或多次層析，例如使用大孔吸附樹脂和反相或者正相硅膠對所述溶液進行層析(例如柱層析); 優(yōu)選地，使用高通量熒光底物HIV-I蛋白酶模型對各個洗脫級分進行活性跟蹤，以收集具有HI V-I蛋白酶抑制活性的洗脫級分； 優(yōu)選地，通過用丙酮浸泡菌絲體，然后將菌絲體和丙酮去除來獲得菌絲體的提取液； 優(yōu)選地，在低溫環(huán)境下進行步驟2，以避免所述寡肽化合物的活性喪失。
4.制備權利要求2的提取物的方法，其包括以下步驟 (1)培養(yǎng)放線菌，并分別收集上清液和菌絲體； (2)對步驟I獲得的上清液和/或獲得的菌絲體的裂解液和/或提取液進行層析，跟蹤并收集具有HIV-I蛋白酶抑制活性的洗脫級分，從而獲得本發(fā)明的提取物； 任選地，所述方法還包括下述步驟 (3)對步驟2獲得的提取物進行進一步的純化； 優(yōu)選地，步驟I中的放線菌是放線菌CGMCC 4766 ； 優(yōu)選地，在步驟2中對上清液和/或菌絲體的裂解液和/或提取液進行一次或多次層析，例如使用大孔吸附樹脂和反相或者正相硅膠對所述溶液進行層析(例如柱層析);優(yōu)選地，使用高通量熒光底物HIV-I蛋白酶模型對各個洗脫級分進行活性跟蹤，以收集具有HIV-I蛋白酶抑制活性的洗脫級分； 優(yōu)選地，通過用丙酮浸泡菌絲體，然后將菌絲體和丙酮去除來獲得菌絲體的提取液； 優(yōu)選地，在低溫環(huán)境下進行步驟2，以避免所述提取物中所包含的寡肽化合物的活性喪失; 優(yōu)選地，在步驟3中使用制備型高效液相色譜法，對步驟2獲得的提取物進行進一步的純化。
5.一種藥物組合物，其包含權利要求I的寡肽化合物或其藥學上可接受的鹽，或權利要求2的提取物，或者通過權利要求3的方法獲得的寡肽化合物，或通過權利要求4的方法獲得的提取物，以及藥學上可接受的載體、助劑或賦形劑。
6.權利要求I的寡肽化合物或其藥學上可接受的鹽，或權利要求2的提取物，或者通過權利要求3的方法獲得的寡肽化合物，或通過權利要求4的方法獲得的提取物用于制備藥物的用途，所述藥物用于預防或治療與HI V感染相關的疾病，例如艾滋病。
7.權利要求I的寡肽化合物或其藥學上可接受的鹽，或權利要求2的提取物，或者通過權利要求3的方法獲得的寡肽化合物，或通過權利要求4的方法獲得的提取物用于制備藥物的用途，所述藥物用于抑制HIV-I蛋白酶的活性。
8.抑制HIV-I蛋白酶活性的方法，其包括給有此需要的細胞或受試者施用有效量的權利要求I的寡肽化合物或其藥學上可接受的鹽，或權利要求2的提取物，或者通過權利要求3的方法獲得的寡肽化合物，或通過權利要求4的方法獲得的提取物，或權利要求5的藥物組合物。
9.放線菌(例如放線菌CGMCC4766)用于制備權利要求I的寡肽化合物，或權利要求2的提取物的用途。
10.放線菌CGMCC4766，其能產生權利要求I的寡肽化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有氨基酸序列Tyr-Leu-Val-Leu-His(SEQ ID NO:1)的寡肽化合物，其具有HIV-1蛋白酶抑制活性。本發(fā)明的寡肽化合物可以是化學合成的或重組產生的，或可以從微生物(特別是放線菌)提取獲得。本發(fā)明還提供了從微生物(特別是放線菌)獲得的、具有HIV-1蛋白酶抑制活性的提取物以及其制備方法，所述提取物包含本發(fā)明的寡肽化合物。本發(fā)明還提供了用于獲得本發(fā)明的寡肽化合物或提取物的微生物(特別是放線菌，例如放線菌CGMCC 4766)。本發(fā)明的寡肽化合物或提取物可以用于預防和治療與HIV感染相關的疾病，例如艾滋病。
文檔編號C07K1/20GK102766194SQ20121013546
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月3日 優(yōu)先權日2011年5月3日
發(fā)明者余利巖, 劉曉, 司書毅, 姜威, 樊秀勇, 白碩可, 章天, 董飆, 蔣建東, 陶佩珍, 魏玉珍 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所